Конфокальна мікроскопія – це один із методів оптичної мікроскопії, який має суттєвий контрастом у порівнянні зі звичайними класичними мікроскопами. Відмінною особливістю даного методу є використання діафрагми, здатної відсікати потік розсіяного фонового світла.

У конфокальному мікроскопі у кожний час відбувається реєстрація зображення однієї струми об'єкта. Повноцінне зображення виходить за рахунок сканування пересування зразка або розбудови оптичної системи. Після об'єктивної лінзи розташована діафрагма невеликого розміру так, щоб світло, що випускається точкою, що досліджується, проходив через неї і реєструвався, а світло, що виходить від інших точок, затримувався діафрагмою.

Описаний метод дослідження дає змогу вивчати внутрішню структуру різних клітин. З його допомогою можна ідентифікувати окремі молекули та структури клітини, мікроорганізми, а також динамічні процеси, що протікають у клітинах.

Опис методу конфокальної мікроскопії

Завдяки конфокальній флуоресцентній мікроскопії з'явилася можливість отримувати тривимірне субмікронне розширення об'єктів, а також значно розширилася можливість проведення неруйнівного аналізу прозорих зразків. Завдяки використанню в зазначених мікроскопах як джерела світла лазерів, досягається підвищення їх роздільної здатності.

У порівнянні з ксеновими або ртутними лампами лазери відрізняються суттєвими перевагами, так як мають здатність монохроматичності, а також високої паралельності пучка світла, що випускається. Такі властивості лазерного випромінювання забезпечують оптичній системі ефективнішу роботу, а також знижують кількість відблисків і збільшують точність фокусування пучка світла.

На досліджуваному зразку лазер висвітлює в повному обсязі поле зору, а фокусується у певній точці. Конфокальна діафрагма дозволяє позбавитися позафокусної флуоресценції, при цьому змінюючи діаметр діафрагми, можна точно визначати товщину оптичного шару біля фокусу лазерного променя. Завдяки описаній властивості конфокальна мікроскопія дозволяє отримувати поліпшену роздільну здатність вздовж осі Z.

Спеціальні програми, якими оснащені конфокальні мікроскопи, дозволяють із серії оптичних зрізів створювати об'ємні зображення об'єктів, а також розглядати їх під різними кутами зору.

Застосування мультиспектрального лазерного конфокального скануючого мікроскопа дає можливість вивчати колоколізацію в клітині різних речовин. Мультиспектральний режим дозволяє проводити на конфокальному мікроскопі дослідження методом FISH.

Приклади досліджень, які проводяться за допомогою конфокального мікроскопа

Конфокальна мікроскопія допомагає вивчати здатність різних речовин накопичуватися в ядрі, цитоплазмі або інших клітинних структурах. Ці здібності найчастіше застосовують у процесі проведення досліджень механізмів дії канцерогенів, протипухлинних сполук, лікарських препаратів, і навіть дозволяють розраховувати їх ефективні концентрації.

Летальне вивчення інтенсивності, а також форми спектрів власної флуоресценції дає можливість розпізнавати запалені та нормальні клітини. Цей метод використовується на ранніх термінах діагностики раку шийки матки.

Правильно підібрана комбінація різних фільтрів, призначених для кількох типів власної флуоресценції, може виходити без трудомісткого дослідження множини зрізів. Таким чином, можна швидко та точно виявляти злоякісні тканинні структури та відрізняти їх від нормальних.

Методи конфокальної мікроскопії досить широко використовуються в гідробіології та ембріології, в ботаніці та зоології у процесі вивчення структури гамет, а також розвитку та формування організмів.

Конфокальні лазерні мікроскопи в сучасному світі знайшли широке застосування в галузі біології, біофізики, медицини, клітинної та молекулярної біології. Конфокальна мікроскопія – унікальна безконтактна методика, яка сьогодні використовується для вивчення рогівки ока. Вона дозволяє максимально точно оцінити наявний ступінь клітинних змін та позаклітинних структур, а також зробити висновки про можливе пошкодження рогівки загалом.

Лазерні конфокальні мікроскопи мають високу роздільну здатність, тому дозволяють досліджувати структуру флуоресцентно мічених клітин і навіть окремих генів. Застосування різноманітних технологій специфічного багатобарвного флуоресцентного забарвлення для біологічно активних молекул, а також надмолекулярних комплексів дає можливість вивчати складні механізми функціонування не лише окремих клітин, а й цілих систем. Ця технологія широко використовується в експериментальній біології, а також у медицині.

Устаткування - конфокальні мікроскопи

Сучасні надточні конфокальні мікроскопи, такі як Leica TCS SP8, дозволяють отримати максимально чіткі та достовірні дані при проведенні різних досліджень. Широкий інтерес до таких приладів виник у вісімдесятих роках минулого століття через швидкий розвиток комп'ютерної техніки та лазерних технологій.

Конфокальна лазерна скануюча мікроскопія є різновидом оптичної мікроскопії. Її особливістю є те, що лазерний промінь фокусується на певну область по осях Х і У і формує таким чином зображення. Відбите світло демонструється на екрані у вигляді растру. Розміри зображення безпосередньо залежать від роздільної здатності сучасної електроніки, а також від розмірів растру, що сканується.

Вимірювальні прилади, які створені за допомогою сучасного методу конфокальної лазерної мікроскопії, що сканує, в наш час набули найширшого поширення в різних сферах. У порівнянні зі звичайною світловою мікроскопією конфокальна мікроскопія має такі переваги:

• покращена роздільна здатність;
• висока контрастність зображення;
• можливість проводити мультиспектральні дослідження з високим ступенем поділу сигналів;
• можливість отримання «оптичних зрізів» із тривимірною реконструкцією;
• можливості використання способів цифрової обробки отриманих зображень;

З недоліків описаної апаратури можна виділити:

• складність налаштування приладу;
• відсутність оптичного зображення;
• висока вартість приладів, а також дорожнеча їх обслуговування.

У конфокальному мікроскопі керувати всією системою використовується спеціальний комп'ютер. Він дозволяє зберігати зображення та детально вивчати отримані дані. Для якісної обробки отриманих зображень часто потрібні досить великі обчислювальні потужності, тому комп'ютер повинен мати досить велику оперативну пам'ять. Для подальшого зберігання інформації потрібна також велика дискова пам'ять. Для передачі зображень комп'ютер повинен мати USB-порт або CD/DVDRW. Також комп'ютер має можливість підключення до глобальної Інтернету або локальної мережі.

Програмне забезпечення, встановлене на таких комп'ютерах, може бути базовим. Воно поставляється разом із технікою і дозволяє керувати всією системою та контролювати її основні функції. Також для вказаних комп'ютерів спеціально розробляються пакети прикладних завдань, які додатково замовляються. Багато моделей конфокальних мікроскопів мають спеціальний пульт управління, що дозволяє налаштовувати їхню роботу дистанційно.

Встановлюють описані прилади у звичайних лабораторних відвідин. Найважливішою процедурою в процесі експлуатації конфокальних мікроскопів є контроль за вібраціями. Для таких цілей застосовують спеціальний пристрій, який вимірює рівень вібрації. Процедура контролю схожа на процедуру вимірювання аксіальної роздільної здатності ЛСКМ за допомогою дзеркала.

Конфокальна мікроскопія швидко розвивається. Відомі компанії-виробники репрезентують на ринку новітні зразки конфокальних мікроскопів, які дозволяють ефективно розділяти лазерний промінь збудження, а також люмінесценцію. За допомогою комп'ютера в таких приладах керується світлодільник. Його спектральні властивості за необхідності можуть досить швидко перебудовуватись на кілька лазерних ліній.

Конфокальні мікроскопи у мікробіології

Конфокальний мікроскоп також незамінний у біології для детального дослідження клітини. Сьогодні на цю тему публікується безліч різних наукових статей. Найчастіше з допомогою конфокальних мікроскопів вивчають структуру клітин, і навіть їх органоїдів. Також досліджується колокалізація в клітині для того, щоб зрозуміти, чи є причинно-наслідковий зв'язок між речовинами клітини.

Під час вивчення білків конфокальними мікросокпами вони попередньо маркуються антитілами з різними флуорохромами. За допомогою звичайного класичного мікроскопа досить важко розібрати, чи розташовані вони поруч або один під одним, а от конфокальний мікроскоп дозволяє це зробити без особливих проблем. У пам'яті комп'ютера записуються дані про серію оптичних зрізів і, таким чином, проводиться об'ємна реконструкція об'єкта, а також виходить його тривимірне зображення.

Також за допомогою конфокальних мікроскопів досліджують динамічні процеси, що протікають у живих клітинах, наприклад, пересування іонів кальцію або інших речовин крізь клітинні мембрани. Використовують конфокальні мікроскопи для вивчення рухливості біоорганічних молекул за допомогою іонізації фотохімічного розкладання флуорохрому в зоні опромінення, а також подальшого його роз'єднання з молекулами. Такі молекули маркуються двома флуорохромами, які мають спектр випускання донора, який перекривається спектром поглинання акцептора. Таким чином, енергія передається від донора до акцептора на невеликих відстанях та в результаті резонансу між енергетичними рівнями. Після цього акцептор у видимій ділянці спектра випромінює енергію, яка згодом реєструється за допомогою конфокального мікроскопа.

Розвиток конфокальної мікроскопії продовжується. Компанії-виробники зазначеного обладнання щорічно представляють на ринку все більш сучасні, функціональні та вдосконалені мікроскопи, що дозволяють вченим робити нові корисні відкриття в різних сферах. Удосконалюється програмне забезпечення, призначене для комп'ютерів, якими оснащені конфокальні мікроскопи. Воно дозволяє втілювати у життя найскладніші завдання, які дозволяють проводити дослідження на молекулярному і клітинному рівні. Сьогодні з упевненістю можна сказати, що за конфокальними мікроскопами майбутнє, оскільки за своїми функціональними характеристиками та технічними можливостями вони суттєво перевершили звичайні мікроскопи. Серед досить широкого асортименту оптичної контурної апаратури кожен користувач зможе підібрати для себе саме торт мікроскоп, який дозволить йому активно розвивати свої дослідження.

Двофотонний мікроскоп є різновидом мультифотонного флуоресцентного мікроскопа. Його переваги в порівнянні з конфокальним мікроскопом - велика проникаюча здатність і низький ступінь фототоксичності.

Двофотонний мікроскоп був вперше сконструйований Вінфредом-Денком в лабораторії В. В. Вебба в Корнеллському університеті. Він скомбінував ідею двофотонного збудження із лазерним скануванням.

Процес двофотонного збудження відбувається наступним чином: два фотони, що мають низьку енергію, збуджують флюорофор (здатну до флюоресценції молекулу або частину молекули) протягом однієї квантової події. Результатом цього збудження є подальше випромінювання збудженими молекулами флюоресцентного фотона. Енергія флуоресцентного фотона більше енергії збудливих фотонів.

Імовірність того, що обидва фотони збудження будуть поглинені однією молекулою, дуже мала. Тому необхідний великий потік збудливих фотонів, який можна отримати за допомогою лазера, що випромінює фотони з великою частотою імпульсів (80 МГц). Флюорофори, що найчастіше використовуються, мають спектр збудження в проміжку 400-500 нм, у той час як довжина хвилі збуджуючого лазера знаходиться в проміжку 700-1000 нм (область інфрачервоних хвиль). Якщо флюорофор поглине одночасно два фотони, то він отримає достатньо енергії, щоб перейти у збуджений стан. Далі збуджений флюорофор випустить один фотон (у видимій частині спектра), довжина хвилі якого залежить від флюорофору.

Оскільки для того, щоб флюорофор перейшов у збуджений стан, необхідно поглинання двох фотонів, ймовірність випромінювання флюорофором вторинного фотона пропорційна квадрату інтенсивності збудження. Тому флуоресценція буде сильнішою у разі, коли промінь лазера чітко сфокусований, а не розсіяний. Максимальна флуоресценція спостерігається у фокальному обсязі (обсязі, де сфокусовано промінь лазера) і демонструє різке зменшення в області поза фокусом.

Конструкція

У двофотонному мікроскопі промінь інфрачервоного лазера сфокусований за допомогою лінзи об'єктива , що збирає . Зазвичай використовується високочастотний 80 МГц сапфіровий лазер, що випромінює імпульс з тривалістю 100 фемтосекунд, що забезпечує високу щільність фотонного потоку, яка необхідна для двофотонного поглинання.

Світло, що випускається флюоресцентним зразком, посилюється за допомогою високочутливого фотопомножувача. Оскільки приймач світла є одноканальним, інтенсивність світла, що спостерігається в даному фокальному об'ємі, формує один піксел зображення. Для того щоб отримати двовимірне піксельне зображення, проводиться сканування у фокальній плоскості зразка.

Переваги і недоліки

Використання інфрачервоного світла для збудження флюорофору в досліджуваних тканинах має свої переваги:

• Довгі хвилі розсіюються менше, ніж короткі, що забезпечує високу просторову роздільну здатність.
• Збудливі фотони мають невелику енергію, отже, вони менш руйнівні для тканин (що продовжує життя досліджуваної тканини).

Але є й деякі недоліки:

• Для роботи лазера потрібні дорогі оптичні прилади для забезпечення інтенсивності імпульсу.
• Двофотонний спектр поглинання флюорофору може сильно змінюватись на відміну від однофотонного спектра поглинання.
• Промінь із довжиною хвилі понад 1400 нм значно поглинається водою у живих тканинах.

Антоні ван Левенгука найчастіше називають винахідником мікроскопа. З історичної точки зору це не зовсім правильно: задовго до нього і знаменитий Галілей, і батько і син Янсени, і Корнеліус Дреббель представили публіці свої оптичні прилади. Однак слава Левенгука зовсім не є безпідставною: саме йому вперше вдалося розглянути одноклітинні організми, клітини крові, будову очей комах — тобто справді вийти на мікрорівень.

Змусити краплю повиснути і не впасти - найскладніше завдання. Для цього підійде олівець чи корпус від кулькової ручки. Варто поекспериментувати з кутами нахилу та кількістю води.

Всупереч поширеному уявленню, мікроскоп Левенгука зовсім не був схожим на сучасний. Він був однією-єдиною лінзою, затиснутою в спеціальному штативі. Людина необізнана швидше назвала б цей прилад лупою.

Потрапити лазером у краплю води не так просто. Можливість надійно закріпити вказівку дуже важлива. Ми використовували кронштейни для паяння з радіомагазину.

Крапля води – це та сама лінза. Погляньте на визначення: лінза - це деталь із прозорого однорідного матеріалу, обмежена двома полірованими заломлюючими поверхнями обертання (сферичними поверхнями). Крапля має форму сфери, вода однорідна, поверхневий натяг працює на ній краще за будь-яке полірування, і, нарешті, коефіцієнт заломлення води не дорівнює такому у повітря. Отже, крапля — це лінза, хоча й не дуже хороша.

Площа зображення на екрані багаторазово перевищує переріз лазерного променя. Тому, щоб зображення було яскравим, варто роздобути потужну лазерну указку із зеленим променем.

Якщо направити на краплю промінь лазерної указки та спроектувати його на білий аркуш паперу, ми побачимо, що відбувається усередині краплі. Лазер пропонує когерентне (образно кажучи, паралельне) випромінювання, тому можна сказати, що його промінь спочатку ідеально сфокусований. Теоретично можна було б використовувати і звичайну лампу, але для точного фокусування її світла в краплі знадобилася б більш складна оптична система. Не варто тішитись: це непоганий досвід з оптики, але не з біології. Коефіцієнт збільшення краплі невеликий, тому об'єкти, які ви побачите на екрані, це зовсім не мікроорганізми, а просто частинки пилу або дрібні волоски. Ефект руху створюється з допомогою перемішування води всередині краплі. І все ж у видовищності досвіду не відмовиш.

Знову сконструйований багатопараметричний мікроскоп фірми Leitz дозволяє одночасно проводити аналіз поглинання гемоглобіну еритроцитів і флуоресценції мічених ФІТЦ клітин, що містять гемоглобін S, причому можна аналізувати мільйони клітин. Система (LEYTAS), з'єднана з аналізуючим зображення комп'ютером, спочатку фокусується і вважає всі еритроцити вздовж одного ряду полів зору, використовуючи нижнє освітлення фіолетовим світлом (415 нм). Після сканування по одній лінії довжиною 8 см освітлення по команді комп'ютера змінюється з проходить на падаюче, і всі поля зору вздовж лінії сканування аналізуються повторно, причому сканування для визначення об'єктів флуоресціюють ведеться відповідно до кривої раніше визначених положень фокусу. Для кожного певного об'єкта його флуоресцентне та поглинаюче зображення зберігаються у пам'яті у вигляді рівнів сірого. З пам'яті зображення виводиться на екран, що дозволяє візуально оцінити вибрані об'єкти (рис. 6.9). Від кожного підозрілого сигналу в пам'яті зберігається одне флуоресцентне і два зображення, що поглинають. Візуальне порівняння флуоресцентного та поглинаючого зображень при великому збільшенні дозволяє визначити природу цього сигналу. Таким чином артефакти можна відрізнити від клітин, що заслуговують на увагу. Те, що сигнал дійсно відповідає мутантній клітині, підтверджується мікроскопом. Оскільки всі координати зберігаються у пам'яті, виставлення клітин проводиться автоматично. Більшість сигналів є артефактами. На рис. 6.9 тільки кадр № 79 відноситься, ймовірно, до мутантної клітини, що можна було б підтвердити мікроскопом.

Мал. 6.9. Виявлення за допомогою системи LEYTAS підозрілих зображень у препараті, пофарбованому міченою ФІТЦ сироваткою проти S-гемоглобіну. Ці зображення відображаються на моніторі. Зліва направо: номер кадру, його флуоресцентне зображення та зображення того ж кадру, що формується за рахунок поглинання при більшому збільшенні

Інші антитіла проти мутантних еритроцитів були використані Ленглейсом з співавт. визначали мутантні клітини за допомогою проточної цитометрії Можна припустити, що частота виявлених у цій роботі мутантів була значно вищою, ніж частота народження клітин з HbS.

Крім визначення рідкісних мутантів, аналіз зображення може бути застосований для визначення рідкісних ракових клітин у період ремісії, а також інфікованих вірусом клітин на ранній стадії інфекційного захворювання.

7. Скануюча лазерна мікроскопія

Зазвичай у мікроскопії зображення дуже дрібних структур одержують шляхом освітлення всього препарату та збільшення зображення об'єктивом. При використанні разом із мікроскопом телевізійної камери принцип отримання зображення не змінюється – зображення також створюється об'єктом, і лише потім сканується телекамерою. Фактично всі методи сканування застосовувалися в основному в дуже обмеженій ділянці мікрофотометрії - для визначення величини поглинання, флуоресценції або відображення. Нещодавно техніка сканування була застосована для створення високоякісних зображень за допомогою потужних та добре сколімованих лазерних пучків. В оптичній лазерній скануючій мікроскопії об'єкт не висвітлюється повністю, а сканується крок за кроком . У кожній освітленій точці вимірюється минуле, відбите або випромінюване світло. Зображення створюється за рахунок накопичення результатів цих вимірювань для кожної точки після аналогової або цифрової обробки, як матриця в пам'яті комп'ютера.

У приладі, який є в нашій лабораторії (Zeiss, ФРН), сканування виконується за допомогою гальванометрів із сервоприводами. Час сканування порівняно короткий (2 с на полі 512x512 пікселів). Процес сканування контролюється процесором. Як фотодетектор використовується ФЕУ. Його сигнал проходить через блок аналогової обробки, який контролює яскравість та контрастність.

Після оцифрування цей сигнал потрапляє в буферну пам'ять, куди записується з відеочастотою. Відповідно, стаціонарне зображення на моніторі виходить за умови, що під час зчитування столик стоїть нерухомо. Плавно змінюється може бути отримано за допомогою блоку змінного збільшення. Скануючий лазерний мікроскоп можна використовувати як із звичайним, так і з лазерним джерелом світла. За допомогою лазера можна отримати як падаюче освітлення (для відображення і флуоресценції), так і проходить освітлення (для поглинання, фазового або диференціального інтерференційного розмаїття). Як звичайне джерело світла можна використовувати тільки лампу розжарювання, забезпечену світловодом. Для забезпечення кращого фокусування та можливостей пошуку на препараті, а також для дослідження препаратів із подвійним фарбуванням, ми додали до лазерного сканера звичайний блок епіосвітлення. Принциповими перевагами лазерного сканування є:

1) низький рівень аутофлуоресценції в оптичному шляху, що досягається завдяки точковому освітленню;

2) висока чутливість мікроскопа, що виникає внаслідок використання потужного лазерного світла, сфокусованого у точці. Можна спостерігати навіть слабо флуоресцентніДНК-зонди;

3) використання оптики із малим збільшенням. Інтенсивність флуоресценції є досить високою, що дозволяє працювати з об'єктивом Х2,5. Це важлива перевага при проведенні досліджень мозку;

4) низький рівень вицвітання, оскільки час висвітлення кожної точки дуже короткий;

5) можливість проведення багатофакторного аналізу;

6) послідовне сканування на різних рівнях при конфокальній скануючій мікроскопії. Даний метод застосовується у тих дослідженнях, де треба працювати з дуже слабкою флуоресценцією,

наприклад, при проведенні реакції гібридизації. Лазерна мікроскопія, що сканує, багато дала також для досліджень мозку, оскільки вона дозволяє використовувати оптику з малим збільшенням, необхідну при дослідженні зв'язків в нервових мережах. На рис. 6.10 представлені нервові клітини з гіпокампу щура. Ці клітини були марковані виявлення специфічних молекул. У порівнянні з нормальною флуоресцентною мікроскопією контраст між зображенням та фоном, що отримується за допомогою лазерного сканування, набагато вищий: тут залишається лише дуже низький рівень небажаного фонового свічення. За допомогою лазерного сканування реакцію можна також оцінити кількісно, ​​оскільки дана техніка дозволяє встановити поріг між клітинами і тлом для поліпшення розмаїття зображення, одержуваного з препаратів дуже низьким вмістом продукту реакції.

Крім того, лазерне сканування відкриває нові можливості для дослідження за допомогою світлової мікроскопії без додаткового фарбування ультратонких зрізів, виготовлених для електронної мікроскопії.

Мал. 6.10. Флуоресцентне зображення гіпокампа щура, отримане за допомогою лазерного мікроскопа, що сканує. Зрізи були оброблені флуоресцентно міченими антитілами до гуанінмонофосфату. Збільшення: об'єктив Х40; окуляр ХЮ. Шкала 100 мкм.

8. Література

1. Yong, M. R. (1961) Quart. J. Microsc. Sci., 102, 419.

2. Price, Z. H. (1965) Am. J. Med. Technol., 31, 45.

3. Rost, F. W. (1972) В історіїхемії, театральних і застосованих. Everson Pearse, AG (ed.), Churchill Livingstone, Edinburgh, Vol. 2, p. 1171,

4. Siegel, J. I. (1982) Int. Lab., 12, 46.

5. Ploem, J. S. and Tanke, H. (1987) Introduction to Fluorescence Microscopy. Royal Microscopical Society, University Press, Oxford.

6. Lansing Taylor, D., Waggoner, A. S., Murphy, R. F., Lanni, F. and Birge, R. R. (1986) Applications of Fluorescence in the Biomedical Sciences. Alan Liss, Нью-Йорк.

7 Patzett, W. (1972) Lietz-Mitt. Wiss. und Techn., Bd V, Nr 7, 226.

8 Giloh, H. and Sedat, J. W. (1982) Science, 217, 1252.

9 Джонсон, Г. Д. і де С. Ногуейра Аруйо, Г. М. (1981) J. Immunol. Methods, 43, 349.

10 Ploem, J. S. (1967) Zeitschrift Wiss. Microskopie, 68, 129.

11 Nairn R. З (1976) Fluorescent Protein Tracing. Livingstone, Едінбург.

12. Kraft, W. (1973) Leitz Techn. Inform., 2, 97.

Конфокальний лазерний мікроскоп, що сканує, з унікальною оптичною схемою і системою детектування, які дозволяють отримувати оптичні зрізи з максимальною ефективністю. Ви можете працювати з мультиканальною флуоресценцією до десяти барвників і використовувати безперервну спектральну детекцію у всьому видимому діапазоні довжин хвиль.

LSM 710на інвертованому штативі мікроскопа Axio Observe Z1– це неперевершений конфокальний мікроскоп для клітинної біології та біології розвитку. Спільно із прямим штативом AxioImagerабо AxioEmainer - LSM 710перетворюється на інструмент для роботи в нейробіології, фізіології та вивченні біовзаємодії в найширшому спектрі експериментів.

Оптична схема передбачає використання до восьми лазерних портів та будь-яку комбінацію лазерних ліній від близького УФ спектру до ІЧ. 34-канальний модуль детекції QUASARдозволяє оптимальну стратегію захоплення для різних спектрів випромінювання, без прив'язки до фільтрів та дихроічним дзеркалам. Ви завжди можете направити будь-яку частину спектра сигналу на будь-який обраний детектор.

Спектральне сканування передбачає експерименти з високою роздільною здатністю та виявленням до 10 каналів одночасно.

У скануючому модулі LSM 710використовується передове технічне рішення: зворотний контур спектральної переробки (Spectral Recycling Loop), що забезпечує посилення сигналу за рахунок багаторазового повторного пропускання через спектральну решітку всіх нерозділених частин флуоресцентного сигналу. Корекція поверхні поляризації частини флуоресценції збільшує сумарний емісійний сигнал в середньому на 15 -17 %!

Модифікація LSM 710 NLO- це лазерний мікроскоп, що сканує мікроскоп, оснащений фемтосекундним мультифотонним лазером, що генерує випромінювання високої щільності в інфрачервоній області 680-1080 нм. Завдяки властивостям такого лазера ми можемо проникати на глибину до 500 мкм, при цьому збудження відбувається тільки всередині фокального мікрооб'єму, менше 0,1 мкм 3 що дозволяє дбайливо впливати на живу тканину.

Технічні характеристики:

• Скануючий модуль із двома, трьома одноканальними високочутливими детекторами або з 34-х канальним спектральним детектором для швидкого паралельного захоплення повного емісійного профілю;
• Довільний вибір спектрального діапазону реєстрації сигналу з роздільною здатністю до 3 нм (послідовне сканування) та 10 нм (паралельне сканування);
• Детектор світла, що проходить;
• Незалежні гальванометричні скануючі дзеркала Два;
• Роздільна здатність від 4 х 1 до 6144 х 6144 пікселів;
• Швидкість сканування – 14 х 2 швидкостей сканування; 5 рамок/сек при 512 х 512 пікселів; 0.38 мсек/лінію з 512 пікселів (2619 ліній/сек);
• Скануюче збільшення ZOOM від 0.6 до 40х з кроком 0.1х;
• Вільне обертання на 360 ° скануючої рамки;
• Конфокальний pinhole - моторизований конфокальний pinhole плавним регулюванням діаметра та координат;
• Розрядність даних – 8, 12 або 16 біт;
• Лазерні лінії – 355, 405, 458, 488, 514, 543, 561, 594, 633; перебудовується 488-640;
• Варіанти штативів – інвертований AxioObserver; прямий AxioImager; прямий з фіксованим столиком AxioExaminer.

Розвиток генної інженерії, протеоміки, біотехнології, сучасної фармацевтики та біомедицини сприяло швидкому впровадженню нових методів конфокальної мікроскопії, і в даний час вони широко використовуються в клітинній біології.

Конфокальну флуоресцентну мікроскопію можна розглядати як різновид традиційної флуоресцентної мікроскопії, яка дозволяє досліджувати внутрішню мікроструктуру клітин, причому не лише фіксованих, а й живих, ідентифікувати мікроорганізми, структури клітини та окремі молекули, спостерігати динамічні процеси у клітинах. Конфокальна флуоресцентна мікроскопія на додаток до цього забезпечила можливість тривимірного субмікронного дозволу об'єкта та суттєво розширила можливість неруйнівного аналізу прозорих зразків. Підвищення роздільної здатності досягається завдяки використанню в конфокальних мікроскопах лазерів як джерела світла та конфокальної діафрагми для фільтрації позафокусної флуоресценції. Перевага лазерів у порівнянні з ртутними або ксеноновими лампами полягає в монохроматичності і високій паралельності пучка світла, що випускається. Ці властивості лазерного випромінювання забезпечують ефективнішу роботу оптичної системи мікроскопа, зменшують кількість відблисків, покращують точність фокусування пучка світла. На зразку лазер висвітлює не все поле зору, як у флуоресцентному ламповому мікроскопі, а фокусується в точку. Звичайно, при цьому лазерний промінь збуджує флуоресценцію як у точці фокусу, так і у всіх шарах зразка, через які проходить. І якщо ця позафокусна флуоресценція, що випромінюється шарами, розташованими вище і нижче фокальної площини, реєструється разом з основним сигналом з фокусу об'єктива, це погіршує роздільну здатність оптичної системи. Позбутися позафокусної флуоресценції дозволяє конфокальна діафрагма. Змінюючи діаметр конфокальної діафрагми, можна визначати товщину оптичного шару поблизу фокусу лазерного променя, тому флуоресценція, що випускається вище і нижче фокусу, виявляється дефокусованою на конфокальній діафрагмі і не реєструється. Завдяки цьому конфокальна мікроскопія забезпечує поліпшену роздільну здатність, в першу чергу вздовж осі Z.

Сучасна конфокальна мікроскопія дозволяє вирішувати три основні завдання: вивчення тонкої структури клітини, колоколізації (просторового взаєморозташування) у клітині двох або більше речовин, а також дослідження динамічних процесів, що протікають у живих клітинах.

Завдяки покращеній роздільній здатності, особливо підвищеній роздільній здатності по осі Z, та можливості створювати серії «оптичних» зрізів, конфокальний мікроскоп дозволяє досліджувати тонку структуру об'єкта в тривимірному просторі. Спеціальні програми дозволяють створити з серії оптичних зрізів об'ємне зображення об'єкта (3D) і як би розглядати його під різними кутами зору, що може дати цінну інформацію про форму клітин, цитоскелет, структуру ядра, хромосоми і навіть локалізації в них окремих генів, а так само про взаєморозташування цих елементів.

Використання мультиспектрального (з декількома флуорохромами) режиму роботи лазерного скануючого конфокального мікроскопа дозволяє досліджувати колоколізацію (просторове взаєморозташування) у клітині двох або більше різних речовин, наприклад, білків, помічених різними флуоресцентними барвниками. Досліджуючи такі препарати у звичайному флуоресцентному мікроскопі, не можна з упевненістю стверджувати, чи знаходяться ці речовини поряд або одна під одною. За допомогою методу оптичних зрізів та подальшої 3D-реконструкції об'єкта можна відтворити об'ємний розподіл речовин. Мультиспектральний режим дозволяє проводити на конфокальном мікроскопі дослідження методом FISH.

Можливість отримувати тимчасові серії зображень з високою просторовою роздільною здатністю дозволяє досліджувати зміни, що відбуваються у клітинах та їх структурах у часі (4D реконструкція). Крім того, завдяки наявності лазерів і системи сканування можна здійснювати не тільки реєстрацію тимчасових змін, але і впливати на клітинні структури лазерним випромінюванням з одночасним спостереженням процесів, що протікають.

Нові методи лазерної скануючої конфокальної мікроскопії набули широкого поширення в фундаментальних науках, а також все ширше застосовуються в практичних дослідженнях та діагностичній медицині.

Методи конфокальної мікроскопії дозволяють виявити здатність речовин накопичуватися в цитоплазмі, ядрі або інших структурах клітини, зареєструвати утворення метаболітів, виміряти кінетику накопичення та метаболізму речовин у клітині, швидкість виведення речовин із клітини, порівняти інтенсивність метаболізму в різних клітинних лініях та в різних умовах. Ці методи все ширше застосовуються в дослідженнях механізмів дії як канцерогенів, так і лікарських препаратів та протипухлинних сполук, що дозволяють розраховувати їх ефективні концентрації.

Аналіз інтенсивності та форми спектрів власної флуоресценції дозволяє розпізнавати нормальні та запалені клітини, і такий метод, зокрема, запропонований як новий спосіб ранньої діагностики шийки матки.

Підібравши комбінацію фільтрів для кількох типів власної флуоресценції, можливо без проведення гістохімічного фарбування та трудомісткого отримання та дослідження безлічі зрізів розрізняти злоякісні та нормальні тканинні структури у біопсійних пробах лімфовузлів пацієнтів із лімфоаденопатією різного походження.

Методи конфокальної мікроскопії широко застосовуються в ембріології та гідробіології, ботаніці, зоології щодо структури гамет, розвитку та формування організмів.

Конфокальна мікроскопія постійно розвивається, і в практику впроваджуються нові методи досліджень для вивчення механізмів функціонування організмів на клітинному, субклітинному і молекулярному рівнях, які з кожним днем ​​стають все більш затребуваними в прикладних дослідженнях і діагностиці. Поява персонального конфокального лазерного скануючого мікроскопа FV10iдозволяє розширити межі застосування конфокальних методик. Мікроскоп FV10iвиконує ті ж функції, що і високотехнологічні дослідні конфокальні системи сканування FV1000. У компактний корпус інтегровані всі основні компоненти: 4 діодні лазери, спектральний детектор, що сканує, інтуїтивно зрозуміле програмне забезпечення, інкубатор, моторизований столик, антивібраційна платформа і навіть «темна кімната». Цей мікроскоп ідеальний для тих, хто тільки починає працювати з конфокальними методиками, для тих, хто хотів би звільнити дослідні конфокальні мікроскопи від рутинних завдань, для діагностичних лабораторій, лабораторій з обмеженим бюджетом, для навчальних завдань та випадків проведення досліджень в умовах обмеженого комфорту, наприклад на біологічних станціях.