Визначення якісного складу вітамінів. Кількісне визначення водорозчинних вітамінів. Неферментативна антиоксидантна система

Кількісне визначення аскорбінової кислоти у досліджуваному матеріалі часто здійснюють за допомогою розчину 2,6-дихлофеноліндофенолу натрію, який у лужному середовищі має синє забарвлення, у кислому – рожеве. Хімізм реакції можна виразити у вигляді наступного рівняння.

Принцип методу ґрунтується на здатності аскорбінової кислоти відновлювати індофеноловий реактив. При титруванні витяжки досліджуваного матеріалу розчином 2,6-дихлорфеноліндофенолу відбувається окислення аскорбінової кислоти в дегідроаскорбінову та відновлення індофенолового реактиву. Кінець титрування можна встановити зміни кольору. Окислена форма 2,6-дихлорфеноліндофенолу має синє забарвлення в нейтральному та лужному середовищі, відновлена ​​форма – набуває рожевого забарвлення в кислому середовищі.

Аскорбінову кислоту вилучають з досліджуваного матеріалу 1% розчином соляної кислоти та титрують розчином індофенолового реактиву. За кількістю фарби, витраченої на титрування, розраховують вміст аскорбінової кислоти.

Слід зазначити, що точному визначенню вмісту аскорбінової кислоти в біологічних об'єктах заважають інші речовини, що легко окислюються: глютатіон, цистеїн і т.п.

7.7.1. ВИЗНАЧЕННЯ ЗМІСТ ВІТАМІНУ З В

РОСЛИННИЙ МАТЕРІАЛ

Беруть навішення досліджуваного матеріалу 5-20 г (залежно від передбачуваного вмісту аскорбінової кислоти), нарізають дрібними шматочками (картопля, морква, черемша, яблука тощо) ретельно розтирають у ступці зі щіпкою скла або кварцового піску, додаючи порціями -5 мл розчину з масовою часткою метафосфорної або соляної кислоти 2% до отримання рідкої однорідної кашки. Суміш зі ступки кількісно, ​​за допомогою розчину, що використовується при розтиранні кислоти, переносять у мірну колбу місткістю 100 мл і загальний обсяг екстракту доводять до мітки тим же розчином кислоти. Вміст добре перемішують, настоюють 5-7 хв та фільтрують через паперовий фільтр. Отриманий фільтрат має бути абсолютно прозорим.

Використовувані для екстракції кислоти (соляна, метафосфорна, щавлева) витягують з досліджуваного матеріалу як вільну, так і пов'язану аскорбінову кислоту, а також сприяють стійкості аскорбінової кислоти в екстрактах.

Беруть дві конічні колбочки місткістю 100-150 мл і одну піпеткою вносять 20 мл отриманого фільтрату, в іншу – 20 мл розчину кислоти, використовуваної для розтирання досліджуваного матеріалу. Вміст колб титрують індофеноловим реактивом до слабо-рожевого кольору, що утримується 30 секунд. Результати записують і титрування повторюють з новими порціями того ж фільтрату. На підставі середньої величини, одержаної з 2-3 визначень, розраховують вміст аскорбінової кислоти за формулою:

,

(a-b)- Різниця між обсягами індофенолового реактиву, що пішли на титрування дослідної (а) та контрольної (b) проб, мл;

u - загальний обсяг екстракту, мл;

u 1 - об'єм фільтрату, взятого для титрування, мл;

m - маса досліджуваного матеріалу, г,

100 - перерахунок на 100г матеріалу.

У рослинних тканинах у деяких кількостях містяться й інші редукуючі речовини, що відновлюють 2,6-дихлорфеноліндофенол, тому при необхідності проведення особливо точного аналізу слід зважити на це. Для цього до двох інших порцій по 10-20 мл досліджуваної витяжки додають по 0,1 або 0,2 мл 10% розчину сірчанокислої міді і нагрівають у термостаті або сушильній шафі 10 хв при температурі 110? Охолоджують та титрують індофеноловим реактивом. У присутності солей міді та при нагріванні аскорбінова кислота руйнується повністю. Отриману поправку віднімають із даних титрування дослідних проб.

При аналізі багатьох плодів та ягід, деяких овочів отримують забарвлені екстракти, що ускладнює визначення аскорбінової кислоти. Для визначення аскорбінової кислоти, пофарбовану витяжку переносять у широку пробірку, доливають 2-5 мл дихлоретану або хлороформу і титрують при збовтуванні розчином індофенолового реактиву до появи в шарі дихлоретану або хлороформу рожевого фарбування, що не зникає.

При визначенні необхідно враховувати здатність редукції застосовуваних для екстракції кислот (суміш 20 мл 1 % соляної кислоти і 80 мл 2 % метафосфорної або 1 % щавлевої кислоти). Для цього дві порції суміші кислот 10 мл титрують індофеноловим реактивом до рожевого фарбування. Отриману поправку (зазвичай не перевищує 0,08-0,10 мл розчину фарби) віднімають із даних титрування дослідних розчинів.

2,6-ДИХЛОРФЕНОЛІНДОФЕНОЛУ НАТРІЮ (ПО АСКОРБІНОВІЙ КИСЛОТІ)

Мaccy аскорбінової кислоти (мг), відповідну 1 мл індофенолового реактиву (розчину 2,6-дихлорфеноліндофенолу натрію), розраховують за формулою:

де М – маса аскорбінової кислоти мг, відповідна 1 мл індофенолового реактиву;

(u-u 1) - різницю між обсягами індофенолового реактиву, що пішли на титрування проби з аскорбіновою кислотою (u) та проби без аскорбінової кислоти (u 1), мл;

2 - маса аскорбінової кислоти в мг, що міститься в дослідній пробі (основний досвід).

7.7.3. ВИЗНАЧЕННЯ ЗМІСТ ВІТАМІНУ З У МОЛОКУ

Для визначення аскорбінової кислоти в молоці попередньо беруть в облогу білки.

У колбочку наливають 50 мл молока і додають 4 мл насиченого розчину щавлевої кислоти, збовтують, доливають 10 мл насиченого розчину натрію хлориду, збовтують і залишають при кімнатній температурі на 5 хв. Потім вміст колбочки фільтрують через паперовий складчастий фільтр, відмірюють піпеткою 20 мл фільтрату і титрують його індофеноловим реактивом до рожевого кольору, що зберігається 30 секунд. Беруть ще 20 мл фільтрату та титрування повторюють. Для розрахунку беруть середній результат.

Паралельно проводять контрольне визначення, для чого в колбі змішують 50 мл води, 4 мл насиченого розчину щавлевої кислоти і 10 мл насиченого розчину хлориду натрію. Далі надходять як у основному досвіді.

,

де (a-b)- Різниця між обсягами індофенолового реактиву, що пішов на титрування дослідної та контрольної проб, мл;

64 – загальний обсяг молока після додавання осаджувачів білка та жиру;

М – маса аскорбінової кислоти, що відповідає 1 мл індофенолового реактиву (див. пункт 7.7.2), мг;

u - об'єм фільтрату, взятого для титрування, мл;

u 1 - обсяг молока, взятого для аналізу, мол.

РЕАКТИВИ. Вода дистильована; молоко свіже; картопля (лимони, морква, яблука, капуста, черемша тощо); розчин з масовою часткою метафосфорної чи соляної кислоти 2 %; насичений розчин щавлевої кислоти; насичений розчин хлориду натрію; свіжоприготовлений стандартний розчин аскорбінової кислоти (у мірну колбу місткістю 100 мл вносять 100 мг аскорбінової кислоти кваліфікації «медична» і, розчиняючи, об'єм доводять до мітки розчином з масовою часткою метафосфорної або соляної кислоти 2 %; індофеноловий реактив 140-150 мг 2,6-дихлорфеноліндофенолу натрію і 200-300 мл води, енергійно струшують до розчинення фарби, об'єм доводять до мітки водою, перемішують і фільтрують через паперовий фільтр у суху склянку з темного скла, розчин зберігають у холодильнику не більше ).

ГОСТ Р 54635-2011

Група Н59

НАЦІОНАЛЬНИЙ СТАНДАРТ РОСІЙСЬКОЇ ФЕДЕРАЦІЇ

ПРОДУКТИ ХАРЧОВІ ФУНКЦІОНАЛЬНІ

Метод визначення вітаміну А

Functional food products. Method of vitamin A determination

ГКС 67.050
ОКСТУ 9109

Дата введення 2013-01-01

Передмова

Цілі та принципи стандартизації в Російській Федерації встановлені Федеральним законом N 184-ФЗ "Про технічне регулювання" від 27 грудня 2002 р., а правила застосування національних стандартів Російської Федерації - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизація в Російській Федерації. Основні положення"

Відомості про стандарт

1 РОЗРОБЛЕН Установою Російської академії медичних наук Науково-дослідним інститутом харчування

2 ВНЕСЕН Технічним комітетом зі стандартизації ТК 36 "Функціональні харчові продукти"

3 ЗАТВЕРДЖЕНИЙ І ВВЕДЕНИЙ У ДІЮ Наказом Федерального агентства з технічного регулювання та метрології від 12 грудня 2011 р. N 784-ст

4 ВВЕДЕНО ВПЕРШЕ


Інформація про зміни до цього стандарту публікується в інформаційному покажчику "Національні стандарти", що щорічно видається, а текст змін і поправок - у щомісячно видаваних інформаційних покажчиках "Національні стандарти". У разі перегляду (заміни) або скасування цього стандарту відповідне повідомлення буде опубліковане у щомісячному інформаційному покажчику "Національні стандарти". Відповідна інформація, повідомлення та тексти розміщуються також в інформаційній системі загального користування - на офіційному сайті Федерального агентства з технічного регулювання та метрології в мережі Інтернет

1 Область застосування

1 Область застосування

Цей стандарт поширюється на функціональні харчові продукти та встановлює метод визначення масової частки вітаміну А у вигляді ретинолу, ацетату ретинолу, пальмітату ретинолу за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (далі – ВЕРХ).

Діапазон вимірів масової частки вітаміну А становить від 0,5 до 10,0 млн.

Примітка - Цей стандарт дозволяється розповсюджувати на продукти харчування за умови дотримання діапазону вимірювань.

2 Нормативні посилання

У цьому стандарті використано нормативні посилання на такі стандарти:

ГОСТ Р 8.563-2009 Державна система забезпечення єдності вимірів. Методики (методи) вимірів

ГОСТ Р 12.1.019-2009 Система стандартів безпеки праці. Електробезпека. Загальні вимоги та номенклатура видів захисту

ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точність (правильність та прецизійність) методів та результатів вимірювань. Частина 6. Використання значень точності практично

ГОСТ Р ІСО/МЕК 17025-2006 * Загальні вимоги до компетентності випробувальних та калібрувальних лабораторій
________________
ГОСТ ІСО/МЕК 17025-2009

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт етиловий ректифікований із харчової сировини. Технічні умови

ГОСТ Р 52062-2003 Олії рослинні. Правила приймання та методи відбору проб

ГОСТ Р 52179-2003 Маргарини, жири для кулінарії, кондитерської, хлібопекарської та молочної промисловості. Правила приймання та методи контролю

ГОСТ Р 52349-2005 Продукти харчові. Продукти харчові функціональні. терміни та визначення

ГОСТ Р 53228-2008 Ваги неавтоматичної дії. Частина 1. Метрологічні та технічні вимоги. Випробування

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартів безпеки праці. Пожежна безпека. Загальні вимоги

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартів безпеки праці. Загальні санітарно-гігієнічні вимоги до повітря робочої зони

ГОСТ 12.1.007-76. Система стандартів безпеки праці. Шкідливі речовини. Класифікація та загальні вимоги безпеки

ГОСТ 427-75 Лінійки вимірювальні металеві. Технічні умови

ГОСТ 1770-74 (ІСО 1042-83, ІСО 4788-80) Посуд мірний лабораторний скляний. Циліндри, мензурки, колби, пробірки. Загальні технічні умови

ГОСТ 4166-76 Реактиви. Натрій сірчанокислий. Технічні умови

ГОСТ 4517-87 Реактиви. Методи приготування допоміжних реактивів та розчинів, що застосовуються при аналізі

ГОСТ 6709-72 Вода дистильована. Технічні умови

ГОСТ 9293-74 Азот газоподібний та рідкий. Технічні умови

ГОСТ 12026-76 Папір фільтрувальний лабораторний. Технічні умови

ГОСТ 13496.0-80 * Комбікорми, сировина. Методи відбору проб
________________
* На території Російської Федерації документ не діє. Діє ДСТУ ISO 6497-2011, тут і далі за текстом. - Примітка виробника бази даних.

ГОСТ 14919-83 Електроплити, електроплитки та гарячі електрошафи побутові. Загальні технічні умови

ГОСТ 16317-87 Холодильні прилади електричні побутові. Загальні технічні умови

ГОСТ 18300-87 Спирт етиловий технічний ректифікований. Технічні умови

ГОСТ 19627-74 Гідрохінон (парадіоксибензол). Технічні умови

ГОСТ 24363-80 Реактиви. Калію гідроокис. Технічні умови

ГОСТ 25336-82 Посуд та обладнання лабораторні скляні. Типи, основні параметри та розміри

ГОСТ 26809-86 Молоко та молочні продукти. Правила приймання, методи відбору та підготовка проб.

ГОСТ 27025-86 Реактиви. Загальні вказівки щодо проведення випробувань

ГОСТ 28498-90 Термометри скляні рідинні. Загальні вимоги. Методи випробувань

ГОСТ 29227-91 (ІСО 835-1-81) Посуд лабораторний скляний. Піпетки градуйовані. Частина 1. Загальні вимоги

Примітка - При користуванні цим стандартом доцільно перевірити дію стандартів посилань в інформаційній системі загального користування - на офіційному сайті Федерального агентства з технічного регулювання та метрології в мережі Інтернет або за щорічно видається інформаційному покажчику "Національні стандарти", який опублікований станом на 1 січня , та за відповідними інформаційними покажчиками, що щомісяця видаються, опублікованими в поточному році. Якщо стандарт посилається (змінений), то при користуванні цим стандартом слід керуватися замінним (зміненим) стандартом. Якщо стандарт зв'язку скасовано без заміни, то положення, в якому дано посилання на нього, застосовується в частині, що не зачіпає це посилання.

3 Терміни та визначення

У цьому стандарті застосовані терміни за ГОСТ Р 52349 а також наступний термін з відповідним визначенням:

4 Сутність методу

Визначення вітаміну А в екстракті, отриманому з аналізованої проби, проводять поділом методом ВЕРХ з подальшим фотометричним або флуориметричним детектуванням. При необхідності екстракт отримують після лужного гідролізу проби, що аналізується.

Кількісний аналіз проводять методом зовнішнього стандарту з використанням площі або висоти піків ретинолу, ацетату ретинолу, пальмітату ретинолу.

5 Вимоги безпеки

5.1 Умови безпечного проведення робіт

При виконанні випробувань необхідно дотримуватись вимог пожежної безпеки, встановлені ГОСТ 12.1.004, електробезпеки - ГОСТ Р 12.1.019, техніки безпеки при роботі з реактивами - ГОСТ 12.1.007, а також вимоги, викладені в технічній документації на спектрофотометр, хроматограф, інші прилади та обладнання.

Приміщення, в якому проводять випробування, має бути забезпечене припливно-витяжною вентиляцією. Контроль за вмістом шкідливих речовин у повітрі робочої зони слід проводити відповідно до вимог ГОСТ 12.1.005.

Під час роботи з газовими балонами необхідно керуватися.

5.2 Вимоги до кваліфікації оператора

До виконання випробувань та опрацювання результатів допускаються особи з вищою або середньою спеціальною освітою за професіями: хімік, інженер-хімік, технік, лаборант, з досвідом роботи в хімічній лабораторії. Перше застосування методу в лабораторії слід проводити під наглядом кваліфікованого спеціаліста в галузі ВЕРХ.

6 Умови виконання випробування

6.1 Загальні умови

Випробування проводять у нормальних лабораторних умовах: температура навколишнього середовища – (25±5) °С; відносна вологість – (65±15)%; частота змінного струму – (50±5) Гц; напруга у мережі - (220±10) Ст.

При приготуванні та зберіганні розчинів слід виконувати вимоги ГОСТ 27025, ГОСТ 4517.

Для запобігання руйнації вітаміну А аналіз випробуваного матеріалу та стандартів проводять у присутності антиоксиданту (аскорбінової кислоти, гідрохінону, пірогалолу), оберігаючи проби від попадання на них прямого сонячного світла.

6.2 Умови фотометричних вимірів

Умови фотометричних вимірювань наведено у таблиці 1.


Таблиця 1 - Умови фотометричних вимірів

6.3 Умови хроматографічного аналізу

Температура хроматографічної колонки: 25 ° С або температура навколишнього середовища.

Швидкість потоку рухомої фази: 0,7 см/хв (орієнтовне значення).

Об'єм проби, що вводиться: 50·10 см.

Рухома фаза: суміш ацетонітрилу, метилового спирту, метилену хлористого в об'ємному співвідношенні 50:45:5.

Перевірку оптимальності умов хроматографічного поділу здійснюють шляхом хроматографічного аналізу змішаного розчину ретинолу, ацетату ретинолу, пальмітату ретинолу з масовою концентрацією кожної речовини не менше ніж 0,4 мкг/см. Даний змішаний розчин готують з основних розчинів ретинолу, ацетату ретинолу, пальмітату ретинолу за аналогією з методикою приготування робочих розчинів 8.1.2. Ефективність хроматографічного поділу визнається задовільною, якщо коефіцієнт поділу сусідніх піків ретинолу, ацетату ретинолу, пальмітату ретинолу не менше 1,3. В іншому випадку для досягнення необхідної ефективності поділу експериментальним шляхом підбирають швидкість потоку рухомої фази або проводять випробування інших колонок.

7 Засоби вимірювань, допоміжні пристрої, реактиви та матеріали

7.1 Для визначення вмісту масової частки вітаміну А застосовують такі засоби вимірювань, допоміжне обладнання та матеріали:

- ваги по ГОСТ Р 53228, що забезпечують точність зважування з межами абсолютної похибки, що допускається ±0,1 мг;

- спектрофотометр із спектральним діапазоном роботи від 190 до 1100 нм, основною похибкою вимірювань коефіцієнта пропускання не більше 1%;

- кювети кварцові із довжиною оптичного шляху 1 см;

- хроматограф високоефективний рідинний, що включає такі елементи: насос; пристрій для введення проб; флуориметричний детектор (довжини хвиль, нм: збудження - 325 нм, емісії - 470 нм) або спектрофотометричний детектор (довжина хвилі детектування - 325 нм) з рівнем шумів не більше 10 одиниць оптичної щільності та відносною похибкою вимірювань не більше колонку аналітичну для ВЕРХ діаметром 0,30-0,46 см, довжиною 10-25 см, заповнену октадецилсилікагелем з розміром частинок 5 мкм; реєструючий пристрій - інтегратор або самописець, що дозволяє проводити вимірювання площі (або висоти) піку з похибкою трохи більше 1%; програмне забезпечення для обробки одержаних результатів вимірювань;

- фільтри для фільтрування рухомої фази та аналізованих розчинів (наприклад, з розміром пор 0,45 мкм);

- мікрошприц типу "Гамільтон" місткістю 0,1 см для введення проб у рідинний хроматограф;

- піпетки градуйовані 1(2,3)-1(2)-1-0,5(1,2,5,10,25) за ГОСТ 29227 або автоматичні дозатори з аналогічними або змінюваними обсягами доз з відносною похибкою дозування не більше ± 1%;

- циліндри 1-50(100,250)-1(2) за ГОСТ 1770;

- Колби мірні 2-50(100,250,500,1000)-2 за ГОСТ 1770;

- пробірки мірні з притертими пробками П-2-5(10,15,20,25)-0,1(0,2)ХС за ГОСТ 1770;

- склянки В(Н)-1-50(100,150,250)ТХС за ГОСТ 25336;

- колби круглодонні К-1-100(250,500)-29/32ТС за ГОСТ 25336;

- воронки В-36(56)-80ХС, В-75-110(140)ХС, В-100-150ХС за ГОСТ 25336;

- Лінійка металева з ціною розподілу 1 мм за ГОСТ 427;

- струшувач для колб та пробірок з діапазоном частот коливань платформ 100-150 коливань за хвилину;

- центрифуга, що забезпечує 4-6 тис. об/хв;

- баня водяна з регулятором нагріву, що підтримує температуру від 40° до 100°С;

- Лазня ультразвукова лабораторна робочим об'ємом не менше 2 дм;

- Випарник ротаційний з діапазоном робочого тиску від 7 мм рт.ст. до 760 мм рт.ст. (від 9 · 10 Па до 10 · 10 Па) або насос водоструминний за ГОСТ 25336;

- холодильники скляні лабораторні за ГОСТ 25336;

- термометр лабораторний рідинний діапазоном температур від 0 ° С до 100 ° С, ціною розподілу шкали 1 ° С за ГОСТ 28498;

- Балон з газоподібним азотом за ГОСТ 9293, ос.ч., і по;

- папір фільтрувальний лабораторний за ГОСТ 12026;

- плитка електрична закритого типу за ГОСТ 14919;

- млин лабораторний електричний;

- холодильник побутовий за ГОСТ 16317.

7.2 При виконанні вимірювань застосовують наступні реактиви та матеріали:

- спирт етиловий абсолютний () масовою часткою основної речовини не менше 99,9%;

- спирт етиловий ректифікований () масовою часткою основної речовини не менше 96% або за ГОСТ Р 51652, ГОСТ 18300;

- спирт метиловий () масовою часткою основної речовини не менше 99,9%;

- ацетонітрил () масовою часткою основної речовини не менше 99,8%;

- метилен хлористий () масовою часткою основної речовини не менше 99,8%;

- н-гексан () масовою часткою основної речовини не менше 99%;

- етилацетан () масовою часткою основної речовини не менше 99% або за ГОСТ 8981;

- пропанол-2() масовою часткою основної речовини не менше 99%;

- петролейний ефір, перегнаний при температурі (50±10) °С, очищений від перекисів;

- Діетиловий ефір, очищений від перекисів, що містить 0,1% пирогаллола, по ;

- калію гідроокис (КОН) за ГОСТ 24363, х.ч. або ч.д.а., розчин КОН масовою часткою 50%;

- натрій сірчанокислий () безводний масовою часткою основної речовини не менше 99,5% або за ГОСТ 4166, х.ч.;

- воду дистильовану за ГОСТ 6709;

- кислоту аскорбінову () або , х.ч.;

- гідрохінон () масовою часткою основної речовини не менше 99% або за ГОСТ 19627;

- пирогаллол () масовою часткою основної речовини не менше 99%;

- бутилгідрокситолуол () масовою часткою основної речовини не менше 99%;

- ретинол ()=286,5 г/моль, масовою часткою основної речовини не менше ніж 90%;

- ретинолу ацетат ()=328,5 г/моль, масовою часткою основної речовини не менше 90% або ;

- ретинолу пальмітат ()=524,9 г/моль, масовою часткою основної речовини не менше 90% або .

7.3 Допускається застосування інших засобів вимірювань, допоміжного обладнання, що не поступаються вищевказаним за метрологічними та технічними характеристиками та забезпечують необхідну точність вимірювання, а також реактивів та матеріалів за якістю не гірше за вищевказані.

8 Підготовка до виконання вимірювань

8.1 Приготування розчинів

8.1.1 Основні стандартні розчини

Розчиняють близько 50 мг ретинолу (або ретинолу ацетату, або ретинолу пальмітату) у 50 см абсолютного етилового спирту. Масова концентрація ретинолу (або ретинолу ацетату, або ретинолу пальмітату) у розчині становить приблизно 1,0 мг/см. Далі 2 см розчину ретинолу (або ретинолу ацетату, або ретинолу пальмітату) за допомогою піпетки поміщають у мірну колбу об'ємом 50 см і доводять до мітки спиртом абсолютним етиловим. Масова концентрація сполук отриманих основних стандартних розчинах становить приблизно 40 мкг/см.

8.1.2 Градуювальні розчини

З основних стандартних розчинів готують не менше чотирьох градуювальних розчинів ретинолу (або ретинолу ацетату, або ретинолу пальмітату) в діапазоні масових концентрацій 0,4-4,0 мкг/см шляхом точного розведення основних стандартних розчинів етиловим абсолютним спиртом в мірній колбі місткістю 50.

Визначення масової концентрації ретинолу (або ретинолу ацетату, або ретинолу пальмітату), (мкг/см) проводять після вимірювання оптичної щільності градуювальних розчинів у кварцовій кюветі з товщиною поглинаючого шару 1 см на спектрофотометрі при оптимальній довжині хвилі і обчислюють за формулою

де - значення оптичної щільності градуювального розчину;

- значення оптичної щільності градуювального розчину в абсолютному етиловому спирті або 2-пропанолі масової концентрації 1 г в 100 см при товщині шару поглинаючого 1 см, наведене в таблиці 1;

10 – коефіцієнт перерахунку;

- Коефіцієнт, що враховує поглинання супутніх компонентів при вимірюванні , що обчислюється за формулою

де - площа піку стандартної речовини при проведенні ВЕРХ аналізу, mAU с (AU с);

- сума площ піків супутніх компонентів при проведенні ВЕРХ аналізу стандартної речовини, mAU с (AU с).

Всі розчини під час приготування та аналізу ретельно захищають від впливу ультрафіолетового випромінювання. Розчини ретинолу зберігають за температури нижче 4 °С протягом 2 міс. Свіжоприготовані розчини ретинолу ацетату або ретинолу пальмітату використовують для вимірювань протягом 2-3 годин при кімнатній температурі.

8.2 Відбір та підготовка проб

8.2.1 Відбір проб проводять за ГОСТ 13496.0, ГОСТ 26809, ГОСТ Р 52062, ГОСТ Р 52179.

8.2.2 Великі частинки середньої проби, виділеної методом квартування з лабораторної проби, подрібнюють з використанням відповідного обладнання (наприклад, лабораторного млина) до такого стану, щоб весь продукт проходив через сито з отворами діаметром 1 мм. Розмелену пробу ретельно перемішують.

Аналізовані проби гомогенізують, уникаючи впливу підвищеної температури.

8.2.3 Харчові продукти на олійно-жировій основі з масовою часткою води 1% і менше, збагачені ацетатом ретинолу або пальмітатом ретинолу

2-5 г аналізованої проби переносять у мірну колбу місткістю 25 см, розчиняють у 10-15 см н-гексану, використовуючи ультразвукову баню для прискорення розчинення. Розчин доводять до мітки н-гексаном. При необхідності розчин можна використовувати для подальшого розведення н-гексаном. Потім аліквоту гексанового розчину упарюють у струмі азоту і сухий залишок перерозчиняють в елюенті.

8.2.4 Харчові продукти на олійно-жировій основі з масовою часткою води не більше 20%, збагачені ацетатом ретинолу або пальмітатом ретинолу

2-5 г аналізованої проби розчиняють при інтенсивному перемішуванні 10-15 см н-гексану, використовуючи ультразвукову баню для прискорення розчинення. видаляють надлишок води додаванням безводного сульфату натрію. Вміст колби фільтрують через паперовий фільтр для відділення осаду, що не розчинився. Колбу промивають двічі 5 см н-гексану. Фільтрати збирають у мірну колбу місткістю 25 см. Розчин доводять до мітки н-гексаном. Потім аліквоту гексанового розчину упарюють у струмі азоту і сухий залишок перерозчиняють в елюенті.

8.2.5 Інші продукти харчування, збагачені ацетатом ретинолу або пальмітатом ретинолу

Для проведення лужного гідролізу 1-30 г аналізованої проби сухого або рідкого матеріалу поміщають у круглодонну колбу місткістю 100-500 см. До сухого матеріалу додають 5-20 см води і нагрівають на водяній бані при температурі 60 - 70 °С при перемішуванні в протягом 5 хв. Потім додають 50-150 см етилового спирту ректифікованого (або метилового спирту), 0,2-1,0 г антиоксиданту (аскорбінової кислоти, гідрохінону, бутилгідрокситолуолу), 4-40 см 50%-ного розчину гідроксиду калію і нагрівають протягом 15- 45 хв на водяній бані із зворотним холодильником при температурі 80 °С-100 °С.

Рекомендовані співвідношення випробуваного матеріалу та реактивів наведено у таблиці 2.


Таблиця 2 - Рекомендовані співвідношення випробуваного матеріалу та реактивів

При проведенні лужного гідролізу при кімнатній температурі протягом не менше 16 год використовують вищезгадані співвідношення матеріалу та реактивів.

Якщо після охолодження на поверхні суміші залишається шар олії або жиру, то обсяг доданого розчину KОН і час проведення лужного гідролізу збільшують.

Після закінчення гідролізу вміст колби швидко охолоджують до (20±5) °З кількісно переносять у ділильну вирву. Колбу обполіскують водою, обсяг якої дорівнює обсягу доданого етилового спирту (або метилового), і воду зливають у ту ж лійку. Вітамін А екстрагують діетиловим (або петролейним) ефіром, н-гексаном, н-гексаном з добавкою діетилового (або петролейного) ефіру в об'ємному співвідношенні 1:1 протягом двох хвилин. Для урахування можливої ​​неповної екстракції вітаміну А слід використовувати метод добавок до стандартів.

Екстракцію повторюють три-чотири рази порціями екстрагента 50-100 см. Об'єднаний екстракт відмивають від лугу три-чотири рази порціями води 50-150 см до зникнення лужної реакції промивних вод (за універсальним індикаторним папером).

Для видалення води екстракт фільтрують через фільтр 2-5 г безводного сульфату натрію. Далі екстракт упарюють насухо, використовуючи випарник роторний при температурі не вище 50 °С і потім перерозчиняють в елюенті. При необхідності розчин можна використовувати для подальшого розведення.

Розчин, отриманий за 8.2.3 (8.2.4, 8.2.5), аналізують методом ВЕРХ. Масу аналізованої проби і об'єм розчинника підбирають таким чином, щоб концентрація речовин, що визначаються в аналізованому розчині знаходилася в діапазоні від 0,4 до 4,0 мкг/см.

8.3 Підготовка рідинного хроматографа

Підготовку рідинного хроматографа до роботи здійснюють відповідно до інструкції з експлуатації обладнання. Перед початком роботи колонку промивають елюентом.

8.4 Побудова градуювальної залежності

Процедури побудови градуювальної залежності виконують відповідно до посібника з експлуатації обладнання. Проводять хроматографічний аналіз усіх градуювальних розчинів, приготованих за 8.1.2.

Градуювальний графік будують у координатах "аналітичний сигнал" - "масова концентрація вітаміну в градуювальному розчині, мкг/см". Для кожного аналізованого градуювального розчину проводять два паралельні виміри і знаходять середньоарифметичне значення. Відмінність між виміряними значеннями аналітичних сигналів та значеннями часу утримання не повинна перевищувати 5% від середніх значень. Лінійні ділянки градуювального графіка повинні відповідати всьому діапазону масових концентрацій вітаміну А, що визначаються.

Коефіцієнт градуювального графіка , мкг/см/(mAU·с) або мкг/см/(AU·с) визначають як середньоарифметичне значення коефіцієнтів , що обчислюються за формулою

де - масова концентрація стандартних речовин у -му градуювальному розчині, мкг/см;

- площа (висота) аналітичного сигналу при аналізі -го градуювального розчину, mAU с (AU с) або висота піку, мм.

Правильність побудови градуювальної залежності контролюється значенням достовірної апроксимації 0,997.

Градуювання проводиться у таких випадках: на етапі освоєння методу, за зміни умов хроматографічного аналізу чи виявлення невідповідності метрологічним вимогам результатів оперативного контролю чи внутрішнього аудиту.

9 Виконання вимірювань

У колонку хроматографа послідовно вводять рівні обсяги випробуваного та градуювального розчинів. Як градуювальний вибирають розчин, висота піку якого найменше відрізняється від висоти піку випробуваного розчину. Концентрацію вітаміну А() у розчині, який використовується для градуювання, уточнюють у день його використання за 8.1.2.

Для ідентифікації піків зіставляють час утримання ретинолу (або ретинолу ацетату або ретинолу пальмітату) випробуваного розчину та розчину стандарту, а також додають до випробуваного розчину розчин стандарту з близьким вмістом вітаміну А.

10 Обробка та оформлення результатів

Масову частку вітаміну А, млн, обчислюють за формулами:

де - Коефіцієнт градуювального графіка по 8.4;


- Об'єм розведення, см;

- Маса аналізованої проби, р.

З використанням градуювального розчину

де - масова концентрація градуювального розчину, мкг/см;

- Об'єм розведення, см;

- середньоарифметичне значення результатів вимірювань площі (висоти) піку аналізованого компонента для двох паралельних хроматографічних аналізів випробуваного розчину, mAU с (AU с) або висота піку, мм;

- Маса аналізованої проби, г;

- середньоарифметичне значення результатів вимірювань площі (висоти) піку аналізованого компонента для двох паралельних хроматографічних аналізів градуювального розчину, mAU с (AU с) або висота піку, мм.

Результат обчислюють до третього десяткового знака та округляють до другого десяткового знака.

При аналізі кожної проби виконують два паралельні визначення, починаючи з взяття навішення випробуваної проби.

Розбіжність між результатами двох паралельних вимірювань (у відсотках від середнього значення), виконаними одним оператором з використанням ідентичних реактивів та обладнання та в мінімально можливий проміжок часу, не повинна перевищувати (межа повторюваності наведена в таблиці 3) з довірчою ймовірністю 95%.

При дотриманні цієї умови за остаточний результат випробування набувають середньоарифметичного значення.

Межі відносної похибки визначення масової частки вітаміну А(), у відсотках від результату випробування, і за довірчої ймовірності 95% не повинні перевищувати значень, зазначених у таблиці 3.

Результат визначення вітаміну А подають у такому вигляді:

млн при 95%, (6)

де - Середньоарифметичне значення результатів двох паралельних визначень, млн;

- значення межі абсолютної похибки визначень, млн, що обчислюється за формулою

Результати випробувань заносять у протокол, у якому вказують:

- Посилання на цей стандарт;

- вид, походження та назва проби;

- спосіб та дату відбору проби;

- дату надходження та випробування проби;

- результати дослідження;

- Причини відхилень у процедурі визначення від встановлених умов.

Вступ

Визначення вітаміну В 1(огляд літератури)

1 Історична довідка

2 Класифікація вітамінів

4 Синтез вітаміну В1

Методи визначення вітамінів

1 Біологічні методи

2 Хімічні методи

3 Фізичні методи

4 Фізико-хімічні методи

Аналітичне визначення вітаміну В 1(експериментальна частина)

1 Потенціометричне визначення вітаміну В1

2 Аргентометричне визначення вітаміну В1

Висновок

Вступ

В даний час на ринку з'явилася величезна кількість вітамінізованих продуктів харчування для людини і кормів для тварин, що є сухими багатокомпонентними сумішами. Асортимент таких продуктів представлений досить широко. Це насамперед біологічно активні добавки до їжі, комбікорми для тварин та птахів, полівітамінні препарати. Критерієм якості таких продуктів може бути їх аналіз на вміст вітамінів і, особливо, таких життєво необхідних, як водорозчинні та жиророзчинні вітаміни, кількість яких регламентується нормативними документами та санітарними нормами якості.

Вітаміни належать до різних класів органічних сполук. Тому їм можуть існувати загальні групові реакції; кожен із вітамінів потребує особливого аналітичного підходу.

Хімічна структура вітаміну В 1(антиневритичний вітамін, аневрин, бері-бері вітамін, анти-бері-бері вітамін), дозволяє застосувати різні методи хімічного та фізико-хімічного кількісного визначення:

кислотно-основне титрування, осадове титрування (аргентометрія), фізико-хімічні методики (спектрофотометричні), гравіметрія.

Метою даної курсової роботи є кількісне визначення вітаміну В 1. Було обрано два способи кількісного визначення - хімічний та фізико-хімічний методи.

Завдання курсової роботи: Провести аналіз літератури, виконати два кількісні визначення тіаміну-потенціометричним титруванням та аргентометричним методом.

1. Визначення вітаміну В1 (огляд літератури)

1 Історична довідка

Всім відоме слово "вітамін" походить від латинського "vita" – життя. Таку назву ці різноманітні органічні сполуки отримали не випадково: роль вітамінів у життєдіяльності організму надзвичайно велика.

Вітаміни є групою різноманітних за будовою хімічних речовин, що беруть участь у багатьох реакціях клітинного метаболізму. Вони не є структурними компонентами живої матерії і не використовуються як джерела енергії. Більшість вітамінів не синтезуються в організмі людини та тварин, але деякі синтезуються мікрофлорою кишечника та тканинами у мінімальних кількостях, тому основним джерелом цих речовин є їжа.

До другої половини XIX століття було виявлено, що харчова цінність продуктів харчування визначається вмістом у них переважно наступних речовин: білків, жирів, вуглеводів, мінеральних солей та води.

Проте практика які завжди підтверджувала правильність укорінених поглядів на біологічної повноцінності їжі.

Експериментальне обґрунтування та науково-теоретичне узагальнення цього багатовікового практичного досвіду вперше стали можливими завдяки дослідженням російського вченого Миколи Івановича Луніна.

Він провів експеримент із мишами, розділивши їх на 2 групи. Одну групу він годував натуральним незбираним молоком, а іншу тримав на штучній дієті, що складається з білка-казеїну, цукру, жиру, мінеральних солей та води.

Через 3 місяці миші другої групи загинули, а перші залишилися здоровими. Цей досвід показав, що крім поживних речовин, для нормальної життєдіяльності організму необхідні ще якісь компоненти. Це було важливе наукове відкриття, що спростовувало становище в науці про харчування.

Блискучим підтвердженням правильності виведення М. І. Луніна встановленням причини хвороби бері-бері.

У 1896 році англійський лікар Ейкман помітив, що кури, які харчувалися полірованим рисом, страждали на нервове захворювання, що нагадувало бері-бері у людей. Після надання курям неочищеного рису захворювання припинилося. Він зробив висновок, що вітамін міститься в оболонці зерен. У 1911 році польський вчений Казимир Функ виділив вітамін у кристалічному вигляді. Остаточна будова вітаміну В 1було встановлено 1973 року.

За своїми хімічними властивостями ця речовина належала до органічних сполук та містила аміногрупу. Функ, вважаючи, що у всіх подібних речовин обов'язково повинні входити амінні угруповання, запропонував називати ці невідомі речовини вітамінами, тобто. амінами життя. Надалі було встановлено, що багато з них амінних груп не містять, але термін «вітамін» прижився у науці та практиці.

Згідно з класичним визначенням, вітаміни - це необхідні для нормальної життєдіяльності низькомолекулярні органічні речовини, які не синтезуються організмом цього виду або синтезуються у кількості, недостатній для забезпечення життєдіяльності організму. Вітаміни необхідні нормального протікання практично всіх біохімічних процесів у нашому організмі.

2 Класифікація вітамінів

Сучасна класифікація вітамінів не є досконалою. Вона ґрунтується на фізико-хімічних властивостях (зокрема, розчинності) або на хімічній природі. Залежно від розчинності у неполярних органічних розчинниках або у водному середовищі розрізняють жиророзчинні та водорозчинні вітаміни. У класифікації вітамінів, крім літерного позначення, в дужках вказаний основний біологічний ефект, іноді з приставкою «анти», що вказує на здатність даного вітаміну запобігати або усувати розвиток відповідного захворювання.

Вітаміни, розчинні у жирах

Вітамін Л (антиксерофгальмічний); ретинол

Вітамін D (антирахітичний); кальцифероли

Вітамін Е (антистерильний, вітамін розмноження); токофероли

Вітамін К (антигеморагічний); нафтохінони

Вітаміни, розчинні у воді

.Вітамін В 1(антиневритний); тіамін

.Вітамін В 2(Вітамін росту); рибофлавін

.Вітамін В 6(Антидерматитний, адермін); піридоксин

.Вітамін В 12(антианемічний); ціанкобаламії; кобаламін

.Вітамін РР (антипелагричний, ніацин); нікотинамід

.Вітамін Н (антисеборейний, фактор росту бактерій, дріжджів та грибків); біотин

.Вітамін С (антискорбутний): аскорбінова кислота

3 Будова та властивості вітаміну В1

Вітамін В 1-тіамін є хлористоводневою сіллю 4-метил-5- ?-оксиетил-N - (2-метил-4-аміно-5-метилпіримідил)-тіазолійхлориду, виходить синтетично зазвичай у вигляді хлористо-або бромистоводневої солі. У його структуру входять такі гетероциклічні системи, як піримідил та тіазол.

Вітамін В1- білий кристалічний порошок гіркого смаку, з характерним запахом, добре розчиняється у воді (1г на 1 мг), крижаній оцтовій кислоті, в етиловому спирті. У сильнокислому водному середовищі тіамін має високу стійкість і не руйнується під дією таких енергійних окислювачів, як перекис водню, марганцевокислий калій і озон. При рН=3,5 тіамін може нагріватися до температури 120 º З помітних ознак розкладання.

Вітамін В1 здатний окислюватись. У лужному середовищі під дією червоної кров'яної солі тіамін перетворюється на тіохром. Перетворення тіаміну на тіохром кількісний незворотний процес.

Ця реакція покладена основою одного з кількісних методів визначення вітаміну В1. Перетворення тіаміну на тіохром супроводжується втратою вітамінної здатності.

1.4 Синтез

Враховуючи особливості будови вітаміну В 1, його синтез може бути здійснено трьома шляхами: конденсацією піримідинового та тіазольного компонентів, на основі піримідинового компонента та на основі тіазольного компонента.

Розглянемо перший варіант. Обидва компоненти синтезуються паралельно, а потім з'єднуються у молекулу тіаміну. Конкретно 2-метил-4-аміно-5 хлорметилпіримідин взаємодіє з 4-метил-5-оксиэтиазолом, утворюючи четвертинну тіазолеву сіль:

Конденсація проходить за температури 120 0З толуолі або бутиловому спирті. Далі отриманий тіамін виділяють з реакційної суміші осадженням ацетоном і очищають перекристалізацією метанолу.

5 Поширення в природі та застосування

Тіамін поширений повсюдно і виявляється у різних представників живої природи. Як правило, кількість його в рослинах та мікроорганізмах досягає величин значно вищих, ніж у тварин. Крім того, у першому випадку вітамін представлений переважно вільною, а в другому – фосфорильованою формою. Вміст тіаміну в основних продуктах харчування коливається у досить широких межах залежно від місця та способу отримання вихідної сировини, характеру технологічної обробки напівпродуктів тощо.

У злаковому насінні рослин тіамін, подібно до більшості водорозчинних вітамінів, міститься в оболонці та зародку. Переробка рослинної сировини (видалення висівок) завжди супроводжується різким зниженням рівня вітаміну в отриманому продукті. Шліфований рис, наприклад, зовсім не містить вітаміну.

Вітамін В1 широко застосовується в медичній практиці для лікування різних нервових захворювань (неврозів, поліневритів), серцево-судинних розладів (гіпертонія) та ін.

Вітамінізація хлібобулочних виробів та комбікормів у тваринництві та птахівництві.

Добова потреба дорослої людини в середньому становить 2-3 мг вітаміну В 1. Але потреба в ньому дуже великою мірою залежить від складу і загальної калорійності їжі, інтенсивності обміну речовин і інтенсивності роботи. Переважна більшість вуглеводів у їжі підвищує потребу організму у вітаміні; жири, навпаки, різко зменшують цю потребу.

2. Методи визначення вітамінів

Усі методи дослідження вітамінів поділяються на біологічні (мікробіологічні), фізичні, хімічні та фізико-хімічні.

1 Біологічні методи

Незважаючи на те, що біологічні методи визначення деяких вітамінів відрізняються високою чутливістю і можуть використовуватися для дослідження зразків з незначним вмістом цих сполук, нині вони становлять головним чином історичний інтерес. Точність цих методів невисока, крім того, біологічні методи вимагають великих витрат часу та коштів і незручні для проведення серійних аналізів.

Мікробіологічні методи засновані на вимірюванні швидкості росту бактерій, яка пропорційна концентрації вітаміну в об'єкті, що досліджується.

2.2 Хімічні методи

Специфічність властивостей вітамінів обумовлена ​​наявністю у молекулах функціональних груп. Ця властивість широко використовується при кількісному та якісному хімічному аналізі.

Хімічні методи аналізу:

) Фотометричний;

) Титриметричний (полягає в тому, що всі речовини реагують між собою в еквівалентних кількостях С * V = З *V );

3) Гравіметричний (полягає у виділенні речовини в чистому вигляді та його зважуванні. Найчастіше таке виділення проводять осадженням. Рідше визначається компонент виділяють у вигляді летючого з'єднання (метод відгону). Аналітичний сигнал-маса);

) Оптичний (заснований на поглинанні системою деякої кількості променистої енергії атомами. Кількість енергії поглинання знаходиться у прямій залежності від концентрації речовини в розчині).

3 Фізичні методи

Застосування фізичних методів у аналізі вітамінів (наприклад, ПМР) обмежено високою вартістю приладів.

Кондуктометричний - заснований на вимірі електропровідності розчину.

Потенціометричний (в основі методу лежить вимір залежності рівноважного потенціалу електрода від активності (концентрації) іона, що визначається іона. Для вимірювань необхідно порівнювати елемент з відповідного індикаторного електрода і електрода порівняння).

Мас-спектральний - застосовується за допомогою сильних елементів та магнітних полів, відбувається поділ газових сумішей на компоненти відповідно до атомів або молекулярних мас компонентів. Застосовується для дослідження суміші ізотопів, інертних газів, сумішей органічних речовин.

4 Фізико-хімічні методи

В даний час у практиці фармацевтичного аналізу знаходять все більше застосування фізико-хімічні методи аналізу, як найбільш точні та експресні за своїм виконанням. До них відносяться оптичні, електрохімічні та хроматографічні методи аналізу.

Серед оптичних методів найбільшого поширення набули спектрофотометричні та фотоколориметричні методи, засновані на загальному принципі - існуванні у відомих межах концентрацій прямої пропорційної залежності між світлопоглинанням розчину та концентрацією розчиненої речовини. Спектрофотометричний аналіз з безпосереднього вимірювання оптичної щільності може бути проведений для речовин, що володіють певними особливостями будови - у структурі повинні бути хромофорні та ауксохромні групи (наприклад, гетероатоми, системи сполучених зв'язків).

До переваг колориметричних (фотометричних) методів можна віднести доступність обладнання та засобів вимірювання, експресність. Основним недоліком є ​​низька селективність, що перешкоджає застосуванню цих методів до складних об'єктів за складом. Дається взнаки вплив супутніх компонентів: провітамінів, антиоксидантів, похідних вітамінів, продуктів деструкції вітамінів, здатних подібно до вітамінів, давати пофарбовані продукти. Трапляються труднощі при доборі специфічного реактиву для взаємодії з певним вітаміном.

Незважаючи на недоліки цього методу, для багатьох вітамінів розроблено методики фотометричного визначення.

Незважаючи на різноманітність методик фотометричного визначення вітамінів, вчені досі цікавляться цим методом, уніфікують старі методики та створюють нові.

Хроматографічні методи аналізу дуже поширені у фармацевтичній практиці. Ці методи є перспективними при аналізі речовин, що містять вітаміни і мають складну структуру.

Аж до відносно недавнього часу найчастіше з хроматографічних методів використовували газорідинну хроматографію (ГРХ).

В даний час альтернативним способом швидкого визначення вітамінів у різноманітних об'єктах є високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ).

Визначення вітамінів методом високоефективної рідинної хроматографії не потребує тривалої пробопідготовки, досить висока чутливість методу, проте висока вартість обладнання суттєво обмежує застосування цього методу.

Електрохімічні методи аналізу засновані на використанні іонообмінних або електрообмінних процесів, що протікають на поверхні електрода або при електродному просторі. Аналітичним сигналом служить будь-який електричний параметр (потенціал, сила струму, опір, електропровідність тощо), функціонально пов'язаний із складом та концентрацією розчину.

p align="justify"> Електрохімічні методи аналізу відіграють важливу роль у сучасній фармацеї, оскільки характеризуються високою чутливістю, низькими межами виявлення, широким інтервалом визначених змістів. Найпоширенішими методами є полярографія та вольтамперометрія. Літературні дані з полярографічного дослідження вітамінів найчисленніші. Полярографічно можна визначати кількісний вміст кожного вітаміну в індивідуальних та складних фармацевтичних препаратах.

Метод досить чутливий, але використання полярографії обмежене застосуванням ртутного токсичного електрода.

Водночас метод потенціометричного титрування є експресним, простим у виконанні, не вимагає дорогого обладнання та реактивів.

3. Експериментальна частина

1 Потенціометричне визначення вітаміну В1

В структуру вітаміну В 1входить рухомий хлор (С 12Н 18ОN4 Cl 2S):

вітамін тіамін титрування потенціометричний

Це дало можливість використовувати осадове потенціометричне титрування для визначення тіаміну. Як індикаторний електрод використовувався срібний електрод. Тітрантом служив розчин нітрату срібла з концентрацією 0,05 моль/л.

Для проведення аналізу готували розчини з концентрацією вітаміну В 10,02968 моль/л. Для цього вміст 10 ампул кількісно переносили в колбу на 50 мл і доводили до мітки дистильованою водою. Об'єм ампул дорівнює 1 мл, вміст вітаміну В 1 - 50 мг (Виробник: ВАТ «Мосхімфармпрепарати» ім. Н.А.Семашко). Відбирали аліквоти об'ємом по 5 мл і проводили потенціометричне титрування. Еквівалентний об'єм розчину нітрату срібла при титруванні 5 мл розчину вітаміну 6 мл. Було виконано 8 потенціометричних вимірів.

Приклади кривих титрування представлені на малюнках 1, 2, 3, 4, 5. Криві титрування побудовані в координатах-інтегральні криві V, мл-Е, Вт, а диференціальні криві в координатах -? V -

Рис.1 Крива потенціометричного титрування вітаміну В 1(V al =5 мл)

Рис.2 Крива потенціометричного титрування вітаміну В 1(V al =5 мл)

Рис.3 Крива потенціометричного титрування вітаміну В 1(V al =5 мл)

Рис.4 Крива потенціометричного титрування вітаміну В 1(V al =5 мл)

Рис.5 Крива потенціометричного титрування вітаміну В 1(V al =5 мл)

де ТAgNO3/віт.В1. = (0,05 * 337) / 1000 = 0,01685г / мл; Vе-об'єм нітрату срібла, що пішов на титрування.

де V колби = 50мл, Т AgNO3/віт.В1 =0,008425г/мл, V е - обсяг нітрату срібла, що пішов на титрування, V al = 5 мл, N – число ампул (10 шт).

Результати аналізу представлені у таблиці 1.

Таблиця 1. Результати аналізу потенціометричного титрування.

№V, мла, мгm, г160.10110,05055260.10110,0505536,50,10950,05476460.10110,05055560.10110,05055660.10105150150<среднее>6,06250,102150,051076

де x - "підозріле" значення (імовірний промах) - це максимальне чи мінімальне значення вибірки, x найближче - Найближче до підозрілого значення, x min і x max - максимальне та мінімальне значення вибірки. Значення Q порівнюють із табличним значенням (Таблиця 2). Довірчу ймовірність беруть 0.90 або 0.95. Якщо Q> Q табл - підозрілий результат є промахом та виключається з подальшого розгляду; Q< Qтабл - підозрілий результат не є промахом.

Таблиця 2. Критичні значення Q-критерію для різної довірчої ймовірності p та числа вимірювань n.

np0.900.950.9930.9410.9700.99440.7650.8290.92650.6420.7100.82160.5600.6250.74070.5070.5680.68034.6.4.

Обчислення: n = 8; р = 0.90; = =1,0>0,468 критерій свідчить, що є промахом, і його не враховуємо.

Виключаючи промах отримуємо m= 0,05055 г, за нормативними документами вміст вітаміну В 1 має дорівнювати 0,05 р.

Похибка становить:

Х = 0,05055-0,05 = 0,00055 г

1,1%

.Середнє квадратичне відхилення, що характеризує розкид результатів КХА:

Таблиця 3. Допоміжна таблиця до розрахунку СКО.

m i m i - (m i - )2S0,050550,050550000,050550,050550000,050550,050550000,050550,050550000,050550,050550000,050550005

.Довірчий інтервал:

0,05055

3.2 Аргентометричне визначення вітаміну В1

Аргентометричне визначення за методом Фаянса. Метод Фаянса - це метод прямого титрування галогенідів розчином AgNO30,1М у слабко кислому середовищі із застосуванням адсорбційних індикаторів, які показують зміну кольору не в розчинах, а на поверхні осаду, що випав. Використовували розчин, приготований першого методу кількісного визначення тіаміну з концентрацією вітаміну 0,02968моль/л. Val = 5 мл. Додавали 2-3 краплі розчину бромфенолового синього і краплями розведену оцтову кислоту до отримання зеленувато-жовтого фарбування. Отриманий розчин титрували 0,1 М розчином нітрату срібла до фіолетового забарвлення.

Титрування йде за рівнянням:

(З 12Н 17N 4ОS)Cl - .HCl +2AgNO 3= 2AgCl + (С 12Н 17N 4OS)NO3 - .HNO 3

Таблиця 4. Результати аргентометиричного визначення вітаміну В1

№V , млm, г11,50,0505521,50,0505531,50,0505541,50,0505551,40,0471861,50,0505571,50,0505581,50,05055955<среднее>1,480,04988

Наведені результати свідчать про наявність результатів, що випадають. Визначення промахів ведемо за Q-критерієм: Тестова статистика Q-критерію обчислюється за формулою:

Обчислення: n = 10; р = 0.90;

> 0,412 критерій свідчить, що результат є промахом, і його не враховуємо у подальших розрахунках.

1.Встановлення титру AgNO 3 0,1 N розчином NaCl 0,1 N

= ;

V-обсяг AgNO 3, що пішов на титрування, мол.

2.Похибка становить:

Х = 0,05055 -0,05 = 0,00055 г

1,1%

Математична обробка результатів КХА (кількісного хімічного аналізу)

.Середнє квадратичне відхилення, що характеризує розкид результатів КХА

Таблиця 5. Допоміжна таблиця до розрахунку СКО.

m i m i - (m i - )2S0,050550,050550000,050550,050550000,050550,050550000,050550,050550000,050550,0505000000,050500000

.Довірчий інтервал:

Верхню та нижню межі інтервалу, в якому похибка результатів КХА знаходиться з довірчою ймовірністю 0,95, визначали таким чином:

0,05055

Висновок

У цій роботі стояло завдання кількісно визначити вітамін В 1. Для визначення вітамінів застосовують різноманітні методи. Також необхідно враховувати хімічну будову кожного вітаміну. Широко використовуються оптичні методи аналізу трудомісткості, вимагають великих витрат часу та дорогих реактивів, застосування хроматографічних методів ускладнене використанням дорогого обладнання. Було вибрано два методи визначення тіаміну:

.Потенціометричне титрування, яке має ряд переваг у порівнянні з існуючими методами аналізу фармпрепаратів, на вміст вітамінів: метод простий, експресен, не вимагає дорогого обладнання, витрата реактивів мінімальна, виключено вплив суб'єктивних факторів.

За цим методом помилка складає 1,1%.

.Титрування полягає в тому, що всі речовини реагують між собою в еквівалентних кількостях С*V = З *V

У цьому методі визначення тіаміну помилка становить 1,1%.

Довірчий інтервал: 0,05055.

Список використаної літератури

1. Біохімія: учеб.для вузів 3-тє вид., стереотип. / В.П. Комів; В.М. Шведова М: Дрофа, 2008. -638 с.

Хімія вітамінів/В.М. Березовський М.: "Харчова промисловість", 1973. -632 с.

Основи аналітичної хімії Книга 2 Методи хімічного аналізу / Ю.А. Золотов "Вища школа" рік; 2002. -494 с.

4. Аналітична хімія, навчальний посібник/Н.Я. Логінів; А.Г.Воскресенський; І.С. Солодкін-. М.: «Освіта» 1975. - 478 с.

5. Міхєєва Є.В. Вольтамперометричне визначення водорозчинних вітамінів В 1і В 2у вітамінізованих підгодівлях та кормах. / Є. В. Міхєєва, Л. С. Анісімова // Матеріали 6 конференції «Аналітика Сибіру та Далекого Сходу» м. Новосибірс.-2000.-с.367.

Хімічні методи у кількісному аналізі лікарських засобів: Методична вказівка ​​для студентів V курсу «Контроль якості лікарських засобів»/ Державний Університет Медицини та Фармації ім. Н. Тестеміцану.- Кишинеу.- 2008

ГОСТ 29138-91

8. Л.М. Корсун, Г.М. Баторова, Е.Т. Павлова/- Математична обробка результатів хімічного експерименту: навчальний посібник для студентів хімічних, медичних та біологічних спеціальностей та напрямків-Улан-Уде.- 2011.-70 с.

Репетиторство

Потрібна допомога з вивчення якоїсь теми?

Наші фахівці проконсультують або нададуть репетиторські послуги з цікавої для вас тематики.
Надішліть заявкуіз зазначенням теми прямо зараз, щоб дізнатися про можливість отримання консультації.

Незамінні речовини їжі, що об'єднуються під загальною назвою «вітаміни», відносяться до різних класів хімічних сполук, що саме виключає можливість використання єдиного методу їх кількісного визначення. Усі відомі для вітамінів аналітичні методи засновані або на визначенні специфічних біологічних властивостей цих речовин (біологічні, мікробіологічні, ферментативні), або на використанні їх фізико-хімічних характеристик (флуоресцентні, хроматографічні та спектрофотометричні методи), або на здатності деяких вітамінів вступати в реакції з деякими реагентами із заснуванням пофарбованих сполук (колориметричні методи).

Незважаючи на досягнуті успіхи в галузі аналітичної та прикладної хімії методи визначення вітамінів у харчових продуктах ще трудомісткі та тривалі. Це зумовлено низкою об'єктивних причин, основні у тому числі наступні.

1.Визначення низки вітамінів часто ускладнюється тим, що багато з них знаходяться в природі у зв'язаному стані у вигляді комплексів з білками або пептидами, а також у вигляді фосфорних ефірів. Для кількісного визначення необхідно зруйнувати ці комплекси та виділити вітаміни у вільному вигляді, доступному для фізико-хімічного чи мікробіологічного аналізу. Це досягається зазвичай шляхом використання особливих умов обробки (кислотним, лужним чи ферментативним гідролізом, автоклавуванням).

2.Майже всі вітаміни - сполуки дуже нестійкі, легко піддаються окисленню, ізомеризації і повному руйнуванню під впливом високої температури, кисню повітря, світла та інших факторів. Слід дотримуватися запобіжних заходів: максимально скорочувати час на попередню підготовку продукту, уникати сильного нагріву та впливу світла, використовувати антиоксиданти та ін.

3.У харчових продуктах, як правило, доводиться мати справу з групою сполук, що мають велику хімічну подібність і одночасно різняться за біологічною активністю. Наприклад, вітамін Е включає 8 токоферолів, подібних за хімічними властивостями, але відрізняються за біологічною дією; група каротинів і каротиноїдних пігментів налічує до 80 сполук, з яких тільки 10 тією чи іншою мірою мають вітамінні властивості.

4. Вітаміни належать до різних класів органічних сполук. Тому їм можуть існувати загальні групові реакції та загальні методи дослідження.

5. Крім того, аналіз ускладнює присутність у досліджуваному зразку супутніх речовин, кількість яких може у багато разів перевищувати вміст вітаміну (наприклад, стерини і вітамін D). Для усунення можливих похибок щодо вітамінів у харчових продуктах зазвичай проводять ретельне очищення екстрактів від супутніх сполук і концентрування вітаміну. Для цього використовують різні прийоми: осадження речовин, що заважають аналізу, методи адсорбційної, іонобмінної або розподільної хроматографії, виборчу екстракцію визначається компонента та ін.

В останні роки для визначення вітамінів у харчових продуктах з успіхом стали використовувати метод ВЕРХ. Цей метод є найбільш перспективним, оскільки дозволяє одночасно розділяти, ідентифікувати та кількісно визначати різні вітаміни та їх біологічно активні форми, що дозволяє скоротити час аналізу.

Фізико-хімічні методи дослідження вітамінів Методи засновані на використанні фізико-хімічних характеристик вітамінів (їх здібності до флуоресценції, світлопоглинання, окисно-відновних реакцій та ін). Завдяки розвитку аналітичної хімії, приладобудування фізико-хімічні методи майже повністю витіснили тривалі та дорогі біологічні методи.

Визначення вітаміну С.Вітамінб С (аскорбінова кислота) може бути присутнім у харчових продуктах як у відновленій, так і в окисленій формі. Дегідроаскорбінова кислота (ДАК) може утворюватися при обробці та зберіганні харчових продуктів в результаті окислення, що викликає необхідність її визначення. При визначенні вітаміну С у харчових продуктах використовують різні методи: колориметричні, флуоресцентні, методи об'ємного аналізу, засновані на окисно-відновних властивостях АК та ВЕРХ.

Відповідальний момент кількісного визначення АК – приготування екстракту зразка. Вилучення має бути повним. Найкращим екстрагентом є 6% розчин метафосфорної кислоти, що має здатність осаджувати білки. Використовуються також оцтова, щавлева та соляна кислоти, а також їх суміші.

1. Для сумарного та роздільного визначення окисленої та відновленої форм АК часто використовують метод Рое із застосуванням 2,4-динітрофенілгідразинового реактиву. АК (гулонова кислота) під дією окислювачів переходить у ДАК, а потім у 2,3-дикетогулонову кислоту, яка утворює з 2,4-динітрофенілгідразином сполуки, що мають помаранчеве забарвлення. Сам 2,4-динітрофенілгідразин є підставою, нездатною існувати в аци-формі. Однак відповідні гідразони під впливом лугів перетворюються на інтенсивно забарвлені аци-солі. При визначенні вітаміну С цим методом заважає присутність відновників (глюкоза, фруктоза та ін.). Тому при великому вмісті цукрів у досліджуваному продукті використовують хроматографію, що ускладнює визначення.

Нітроформ Ацидоформ

2. Останнім часом визначення загального вмісту вітаміну З (сума АК і ДАК) отримав визнання дуже чутливий і точний флуоресцентний метод. ДАК конденсуючись з о-фенілендіаміном, утворює флуоресцентну сполуку хіноксалін, що володіє максимальною флуоресценцією при довжині хвилі збуджуючого світла 350 нм.

о-Фенілендіамін ДАК Хіноксалін

Інтенсивність флуоресценції хіноксаліну в нейтральному середовищі при кімнатній температурі прямо пропорційна концентрації ДАК. Для кількісного визначення АК її попередньо окислюють ДАК. Недоліком методу є досить дороге устаткування.

Методи, засновані на окисно-відновних властивостях АК.

3. З методів, заснованих на окисно-відновних властивостях АК, найбільше застосування знайшов метод титрування розчином 2,6-дихлорфеноліндофенолу, що має синє забарвлення. Продукт взаємодії АК із реактивом – безбарвний. Метод може бути використаний для аналізу всіх видів продуктів. При аналізі продуктів, що не містять природних пігментів, у картоплі молоці використовують візуальне титрування. У разі присутності природних барвників використовують потенціометричне титрування або метод індофенол-ксилолової екстракції. Останній метод заснований на кількісному знебарвленні 2,6-дихлорфеноліндофенолу аскорбіновою кислотою. Надлишок фарби екстрагується ксилолом та вимірюється оптична щільність екстракту при 500 нм.

У реакцію вступає лише АК. ДАК попередньо відновлюють цистеїном. Для відокремлення АК від відновників, присутніх у харчових продуктах, які зазнали теплової обробки, або екстракти, що тривало зберігалися, обробляють формальдегідом. Формальдегід залежно від рН середовища вибірково взаємодіє з АК та сторонніми домішками відновників (рН = 0). Зазначеним методом визначають суму АК та ДАК.

2,6-дихлорфеноліндофенол може бути використаний і для фотометричного визначення АК. Розчин реактиву має синє забарвлення, а продукт взаємодії з АК безбарвний, тобто. в результаті реакції зменшується інтенсивність синього забарвлення. Оптичну густину вимірюють при 605 нм (рН = 3,6).

4. Ще одним методом, заснованим на відновлювальні властивості АК, є колориметричний метод, в якому використовується здатність АК відновлювати Fe(3+) до Fe(2+) і здатність останнього утворювати з 2,2'-дипіридилом солі, інтенсивно забарвлені в червоний колір. Реакцію проводять при рН 3,6 та температурі 70ºС. Оптичну густину розчину вимірюють при 510 нм.

5. Фотометричний метод, заснований на взаємодії АК із реактивом Фоліна. Реактив Фоліна є сумішшю фосфорномолібденової і фосфорновольфрамової кислот, тобто. це відомий метод, заснований на утворенні молібденових синів, що поглинають при 640-700 нм.

6. Для визначення вітаміну С у всіх харчових продуктах з успіхом може бути використаний високочутливий та специфічний метод ВЕРХ. Аналіз досить простий, лише за аналізі продуктів, багатих білками, необхідно попередньо видалити їх. Детектування здійснюється за флуоресценцією.

Крім названих методів визначення вітаміну С існує ще цілий ряд способів, наприклад, окислення хлоридом золота та утворення гідроксамових кислот, але ці методи не мають практичного значення.

Визначення тіаміну (1 ). У більшості природних продуктів тіамін зустрічається у вигляді дифосфорного ефіру кокарбоксилази. Остання, будучи активною групою низки ферментів вуглеводного обміну, перебуває у певних зв'язках із білком. Для кількісного визначення тіаміну необхідно зруйнувати комплекси та виділити досліджуваний вітамін у вільному вигляді, доступному для фізико-хімічного аналізу. З цією метою проводять кислотний гідроліз чи гідроліз під впливом ферментів. Об'єкти, багаті білком, обробляють протеолитическими ферментами (пепсином) серед соляної кислоти. Об'єкти з високим вмістом жиру (свинина, сири) для його видалення обробляють ефіром (тіамін практично нерозчинний в ефірі).

1. Для визначення тіаміну в харчових продуктах використовують, як правило, флуоресцентний метод, заснований на окисленні тіаміну в лужному середовищі гексаціаноферратом калію (3+) з утворенням тіохрому, що сильно флуорескує в ультрафіолетовому світлі. Інтенсивність його флуоресценції прямо пропорційна змісту тіаміну (довжина хвилі збуджуючого світла 365 нм, що випускається - 460-470 нм (синя флуоресценція)). При використанні цього методу виникають труднощі, пов'язані з тим, що в ряді об'єктів присутні флуоресцентні сполуки. Їх видаляють очищенням на колонках з іонообмінними смолами. При аналізі м'яса, молока, картоплі, пшеничного хліба та деяких овочів очищення не потрібне.

Тіамін Тіохром

2. Тіамін характеризується власним поглинанням в УФ області (240 нм – у водному розчині, 235 нм – в етанолі), а значить, він може бути визначений методом прямої спектрофотометрії.

3. Для одночасного визначення тіаміну та рибофлавіну використовують ВЕРХ.

Визначення рибофлавіну (2 ). У харчових продуктах рибофлавін присутній переважно у вигляді фосфорних ефірів, пов'язаних з білками, і, отже, не може бути визначений без попереднього протеолітичного розщеплення. Вільний рибофлавін у значній кількості міститься у молоці.

При визначенні рибофлавіну найбільшого поширення набули мікробіологічні та фізико-хімічні (флуоресцентні) методи аналізу. Мікробіологічний метод специфічний, високо чутливий та точний; застосовний до всіх продуктів, але тривалий і вимагає спеціальних умов.

Фізико-хімічний метод розроблений у двох варіантах, які відрізняються способом оцінки флуоресціюючих речовин:

· варіант прямої флуоресценції (визначення інтенсивності флуоресценції рибофлавіну) та

· Люміфлавіновий варіант.

1. Вільний рибофлавін і його фосфорні ефіри мають характерну жовто-зелену флуоресценцію при довжині хвилі збуджуючого світла 440-500 нм. На цій властивості заснований найбільш широко використовуваний метод флуоресцентного визначення рибофлавіну. Рибофлавін та його ефіри дають дуже подібні спектри флуоресценції з максимумом при 530 нм. Положення максимуму залежить від рН. Інтенсивність флуоресценції значно залежить від рН і від розчинника (по-різному для рибофлавіну та його ефірів), тому попередньо руйнують ефіри та аналізують вільний рибофлавін. Для цього використовують гідроліз із соляною та трихлороцтовою кислотами, автоклавування, обробку ферментними препаратами.

Інтенсивність жовто-зеленої флуоресценції рибофлавіну в УФ-світлі залежить не лише від його концентрації, а й від значення рН розчину. Максимальна інтенсивність досягається при рН = 6-7. Однак вимір проводять при рН від 3 до 5, тому що в цьому інтервалі інтенсивність флуоресценції визначається лише концентрацією рибофлавіну і не залежить від інших факторів - значення рН, концентрації солей, заліза, органічних домішок та ін.

Рибофлафін легко руйнується на світлі, визначення проводять у захищеному від світла місці і при рН не вище 7. Слід зазначити, що метод прямої флуоресценції не застосовується до продуктів з низьким вмістом рибофлавіну.

2. Люміфлавіновий варіант заснований на використанні властивості рибофлавіну при опроміненні в лужному середовищі, переходити в люміфлавін, інтенсивність флуоресценції якого вимірюють після отримання його хлороформом (блакитна флуоресценція, 460-470 нм). Оскільки за певних умов в люміфлавін переходить 60-70% загального рибофлавіну, при проведенні аналізу необхідно дотримуватись постійних умов опромінення, однакових для випробуваного та стандартного розчину.

Рибофлавін Люміфлавін

Визначення вітаміну В 6 . Для визначення вітаміну можуть бути використані такі методи:

1. Пряма спектрофотометрія. Піридоксину гідрохлорид характеризується власним поглинанням при 292 нм (e=4,4·103) при рН=5.

2. Метод К'єльдаля. Визначення здійснюється за аміаком, що утворюється при окисленні вітаміну.

3. Фотометричний метод, заснований на реакції з 2,6-дихлорхінонхлоріміном (реактив Гіббса) при рН 8-10, в результаті якої утворюються індофеноли, що мають синє забарвлення. Індофеноли екстрагують метил-етилкетоном і вимірюють оптичну щільність екстракту при 660-690 нм (реакцію Гіббса дають феноли з вільним пара-положенням).

Індофенол

4. Флуоресцентний метод, заснований на тому, що при опроміненні піридоксину та піридоксаміну спостерігається синя, а піридоксаля – блакитна флуоресценція.

Визначення вітаміну В 9 .Визначення фолатів у харчових продуктах у тканинах та рідинах організму становить значні труднощі, т.к. у цих об'єктах вони зазвичай присутні у зв'язаній формі (у вигляді поліглютаматів); крім того, більшість форм чутлива до дії кисню повітря, світла та температури. Для захисту фолатів від гідролізу рекомендується вести гідроліз у присутності аскорбінової кислоти.

У харчових продуктах фолати можуть бути визначені фізичними, хімічними та мікробіологічними методами. Колориметричний метод заснований на розщепленні птероілглутамінової кислоти з утворенням п-амінобензойної кислоти та споріднених їй речовин і подальшому перетворенні їх на пофарбовані сполуки. Однак через недостатню специфічність цей метод застосовується в основному для аналізу фармацевтичних препаратів.

Для поділу, очищення та ідентифікації фолатів розроблені також методи хроматографії на колонках, папері та тонкому шарі адсорбенту.

Визначення вітаміну РР.У харчових продуктах нікотинова кислота та її амід знаходяться як у вільній, так і у зв'язаній формі, входячи до складу коферментів. Хімічні та мікробіологічні методи кількісного визначення ніацину припускають найбільш повне виділення та перетворення його пов'язаних форм, що входять до складу складної органічної речовини клітин, у вільну нікотинову кислоту. Пов'язані форми ніацину звільняють вплив розчинів кислот або гідрооксиду кальцію при нагріванні. Гідроліз з 1 М розчином сірчаної кислоти в автоклаві протягом 30 хвилин при тиску 0,1 МПа призводить до повного звільнення пов'язаних форм ніацину та перетворення нікотинаміду на нікотинову кислоту. Встановлено, що цей спосіб обробки дає менш забарвлені гідролізати та може бути використаний при аналізі м'ясних та рибних продуктів. Гідроліз з гідрооксидом кальцію переважний при визначенні ніацину в борошні, крупах, хлібобулочних виробах, сирах, харчових концентратах, овочах, ягодах та фруктах. Ca(OH) 2 утворює з цукрами та полісахаридами, пептидами та глікопептидами сполуки, майже повністю нерозчинні в охолоджених розчинах. В результаті гідролізат, отриманий при обробці Ca(OH) 2 містить менше речовин, що заважають хімічному визначенню, ніж кислотний гідролізат.

1. У основі хімічного методу визначення ніацину лежить реакція Кеніга, яка у дві стадії. Перша стадія – реакція взаємодії піридинового кільця нікотинової кислоти з бромціаном, друга – утворення пофарбованого похідного глутаконового альдегіду в результаті взаємодії з ароматичними амінами. (Одразу після додавання до нікотинової кислоти бромистого ціана з'являється жовте забарвлення глутаконового альдегіду. В результаті взаємодії його з ароматичними амінами, що вводяться в реакційну суміш, утворюються діаніли, які інтенсивно забарвлені в жовтий, помаранчевий або червоний колір, , сульфанілова кислота – жовтий) Реакцію Кеніга застосовують для фотометричного визначення піридину та його похідних з вільним a-положенням.Недоліком методу є його тривалість, оскільки швидкість реакцій мала.

1. Вітамін В 1 (тіамін)

а) з діазореактивом

Принцип методу.Спочатку утворюється діазобензолсульфат (діазобензолсульфокислота):

Розчин тіаміну при додаванні діазобензолсульфату та лугу дає забарвлену сполуку.

Хід роботи.У пробірку послідовно додають:

б) окислення в тіохром

Принцип методу.При дії K 3 Fe(CN) 6 в лужному середовищі тіамін окислюється в жовтий тіохром, що має блакитну флуоресценцію в УФ-світлі.

Хід роботи. 10 мг порошку тіамінброміду або тіамінхлориду розчиняють у 5 мл води, додають 1 мл 5%-го розчину залізосинеродистого калію K 3 Fe(CN) 6 (ферицианид калію) і 1 мл 10%-го розчину їдкого натру, і перемішують. Половину об'єму, що вийшов, нагрівають і спостерігають забарвлення в жовтий колір в результаті перетворення тіаміну в тіохром. До другої половини додають 3 мл бутилового або ізоамілового спирту, добре струшують і залишають на кілька хвилин. Верхній, спиртовий шар дозатором відбирають у ємність з нефлуоресціюючого скла і розглядають в УФ-світлі (можна – у променях ртутно-кварцової лампи у темному відвідуванні). Добре помітна блакитна флуоресценція.

в) зняти спектр поглинання (модуль "спектральний", діапазон від 350 до 220нм) і спостерігати максимум при = 250-260 нм. Графік зберегти, перевести в Paint, потім вставити у файл "Графіки" (документ Word), підписати та вклеїти у звіт. УВАГА! Спектри всіх вітамінів одночасно, щоб включати та прогрівати спектрофотометр тільки один раз.

УФ-спектр тіаміну гідрохлориду (8 мкг/мл) у розчині HCl 0,9%. Максимум за 246 нм.

2. Вітамін В 2 (рибофлавін)

а) з металевим цинком

Принцип методу.Рибофлавін відновлюється воднем, що виділяється, в безбарвний лейкофлавін. Спостерігається зміна забарвлення з жовтого в зелену, потім в малинову, рожеву, а потім - колір зникає.

Хід роботи.У пробірку наливають 1мл суспензії рибофлавіну у воді (0,015 - 0,025% розчин), додають 10 крапель концентрованої HCl і опускають шматочок металевого цинку. Починається бурхливе виділення бульбашок водню, і рідина поступово забарвлюється в рожевий або червоний колір, потім забарвлення рідини починає бліднути і знебарвлюватися (зворотне окиснення лейкофлавіну в рибофлавін).

б) із азотнокислим сріблом

Принцип методу.Нейтральні або слабокислі розчини рибофлавіну (рН 6,5-7,2), реагуючи з AgNO 3 дають з'єднання рожево-червоних тонів. Інтенсивність фарбування залежить від концентрації вітаміну.

Хід роботи.До 1 мл розчину рибофлавіну (0,015 - 0,025%) додають 0,5 мл розчину AgNO 3 (0,1%). З'являється рожеве фарбування.

в) флуоресценція в УФ + її гасіння після додавання SnCl 2 +Na 2 S 2 O 4 які гасять флуоресценцію самого вітаміну, але не домішок. Флуоресценція рибофлавіну максимальна при рН 35-75. Зняти спектр у розчині ацетату натрію.

УФ-спектр рибофлавіну (35 мкг/мл) у розчині ацетату натрію CH 3 COONa

0,01%. Максимум за 266,5 нм. Додаткові піки при 223,0 нм, 373,5 нм та 444,5 нм.

3. Вітамін В 5 (РР, нікотинова кислота)

а) з ацетатом міді

Принцип методу.При нагріванні нікотинової кислоти з оцтовокислою міддю утворюється осад мідної солі нікотинової кислоти.

Хід роботи. 5-10 мг нікотинової кислоти розчиняють при нагріванні в 10-20 краплях 10%-го розчину оцтової кислоти (або готують 0,75% розчин нікотинової кислоти в гарячій воді, а потім до 2 мл цього розчину додають 1 мл 15 %-ного розчину оцтової к-ти). До нагрітому до початку кипіннярозчину додати рівний об'єм 5%-го розчину оцтовокислої міді. Рідина стає блакитною каламутною, а при стоянні та охолодженні випадає осад нікотинату міді синього кольору.

б) на запах піридину

Принцип методу.При нагріванні нікотинової кислоти з безводним Na 2 CO 3 відчувається неприємний запах піридину.

Хід роботи. У невеликому сухому фарфоровому тиглі змішують 0,05 г нікотинової кислоти з 0,1-0,15 г безводного вуглекислого натрію і підігрівають. З'являється різкий запах піридину.

4. Вітамін В 6 (піридоксин)

а) із хлорним залізом

Принцип методу.Вітамін В6 утворює з хлорним залізом комплекс криваво-червоного кольору.

Хід роботи. 4 мл 0,5-1% розчину піридоксину + 0,5мл 1%-ного FeCl 3 → струсити та спостерігати червоний колір.

б) ДОДАТКОВО –

в) зняти спектр 0,1М NaOH (спостерігати максимуми при λ=245 і 308 нм) або воді (див.рис).

УФ-спектр піридоксину гідрохлориду (15мкг/мл) у воді (рН 6,0). Максимум за 291 нм.

5. Вітамін В 12 – оформити у звіті, практично не робимо у зв'язку з високою токсичністю діючого реактиву.

Вітамін В 12 реагує з ціанідом при рН=10 з утворенням пурпурового диціанкобаламіну, оскільки Окислюється до 3-валентного і 5'-дезоксіаденозин заміщається на аніон CN.

6. Вітамін Р (з прикладу рутина)

До речовин Р-вітамінної дії відноситься ряд сполук фенольної природи, основна фізіологічна дія яких – зменшення проникності та підвищення міцності капілярів. Вони сприяють засвоюваності віт.С в організмі людини і тварин, беруть активну участь в окислювально-відновних процесах, мають антиокислювальні властивості, залягаючи, серед іншого, і окислення адреналіну. Вони також інактивують фермент гіалуронідазу, тим самим гальмуючи розпад гіалуронової кислоти – гетерополісахариду в основному речовині сполучних тканин. Віт. Пригнічують активність холінестерази, сукцинатдегідрогенази та ряду інших ферментів.

Вітамінними властивостями має ряд флавонолів (рутин, кверцетин), флаванонів, катехінів, кумаринів, галова кислота та її похідні, антоціани (фарбувальні речовини з плодів, ягід, квіток).

Багато речовин Р-вітамінної дії – це глікозиди флавонолів та флаванонів або аглікони (невуглеводні компоненти глікозидів). Наприклад, рутин – це глікозид, у якому до дисахариду рутинозіприєднаний аглікон фенольної будови флавонол кверцетин.

а) із хлорним залізом

б) із сірчаною кислотою

Принцип:Конц сірчана к-та утворює з флавонами (рутином) оксонієві солі, що володіють у розчині жовтим забарвленням. Флаванони (наприклад, гесперидин) дають із сірчаною к-тою малинове фарбування.

7. Вітамін С

а) якісно - з K 3 Fe(CN) 6

Принцип методу:відновлення фериціаніду калію вітаміном С із зміною забарвлення до синього через утворення берлінської блакиті.

Хід роботи.У двох пробірках змішують 5 крапель 5%-го розчину До 3 Fe(CN) 6 c 5 краплями 1%-го розчину FeCl 3 . В одну з пробірок до зеленувато-бурої рідини додають 20 крапель 1% розчину аскорбінової кислоти або соку капусти, а в іншу - стільки ж дистильованої води. Рідина в першій пробірці набуває зеленувато-синього забарвлення, випадає синій осад берлінської блакиті; у другій пробірці (контроль) зеленувато-буре фарбування рідини залишається без зміни.