Кількісне чи якісне визначення вітаміну q. Якісне визначення вітамінів у лікарських препаратах. Підготовка до виконання вимірювань

Вступ……………………………………………………………2

1. Загальний огляд методів визначення вітамінів…………………3

2. Хроматографічні методи визначення вітамінів…………5

3. Електрохімічні методи визначення вітамінів…………10

4. Інверсійно-вольтамперометричний метод визначення

водорозривних вітамінів B 1 B 2 у харчових продуктах………..13

Заключение………………………………………………………...18

Вступ

В даний час на ринку з'явилася величезна кількість вітамінізованих продуктів харчування для людини і кормів для тварин, що є сухими багатокомпонентними сумішами. Асортимент таких продуктів представлений досить широко. Це насамперед біологічно активні добавки до їжі, премікси, комбікорми для тварин та птахів, полівітамінні препарати. Критерієм якості таких продуктів може бути їх аналіз на вміст вітамінів і, особливо, таких життєво необхідних, як водорозчинні та жиророзчинні вітаміни, кількість яких регламентується нормативними документами та санітарними нормами якості.

Для визначення вітамінів застосовують різноманітні методи. Широко використовуються оптичні методи аналізу трудомісткості, вимагають великих витрат часу та дорогих реактивів, застосування хроматографічних методів ускладнене використанням дорогого обладнання. З кожним роком розширюється асортимент та збільшується виробництво продуктів харчування, удосконалюється рецептура дитячого харчування. Це у свою чергу пред'являє підвищені вимоги до контролю за якістю продукції та вдосконалення методів визначення вітамінів. Медико-біологічні вимоги та санітарні норми якості продовольчої сировини та харчових продуктів характеризують харчову цінність більшості видів та груп продуктів дитячого харчування різного призначення.

1. Загальний огляд методів визначення вітамінів

Майже всі вітаміни легко піддаються окисленню, ізомеризації та руйнуються під впливом високої температури, світла, кисню повітря, вологи та інших факторів.

З існуючих методів визначення вітаміну С (аскорбінової кислоти) найбільш широко застосовують метод візуального і потенціометричного титрування розчином 2,6-ди-хлорфеноліндофенолу за ГОСТ 24556-81, заснований на властивостях, що редукують аскорбінової кислоти і її здатності відновлювати 2,6-ДХФІ. Темно-синє забарвлення цього індикатора при додаванні аскорбінової кислоти переходить у безбарвне. Важливе значення має приготування екстракту продукту, що досліджується. Найкращим екстрагентом є 6% розчин метафосфорної кислоти, який інактивує аскорбінотоксидазу і осаджує білки.

Каротин у рослинній сировині, концентратах та безалкогольних напоях контролюють фізико-хімічним методом за ГОСТ 8756.22-80. Метод ґрунтується на фотометричному визначенні масової частки каротину в розчині, отриманому в процесі екстрагування продуктів органічним розчинником. Попередньо розчин очищають від супутніх барвників за допомогою колонкової хроматографії. Каротин легко розчиняється в органічних розчинниках (ефір, бензин та ін) і надає їм жовтого забарвлення. Для кількісного визначення каротину використовують адсорбційну хроматографію на колонках з оксидом алюмінію та магнію. Таке визначення пігментів на колонці залежить від активності адсорбенту, кількості пігментів, а також присутності інших компонентів у суміші, що розділяється. Суха суміш окису алюмінію затримує каротин, а волога пропускає в розчин інші барвники.

Тіамін в основному знаходиться у зв'язаному стані у вигляді дифосфорного ефіру – кокарбоксилази, яка є активною групою ряду ферментів. За допомогою кислотного гідролізу та під впливом ферментів тіамін звільняється із зв'язаного стану. Цим способом визначають кількість тіаміну. Для розрахунку вмісту вітаміну B1 використовують флюрометричний метод, який застосовують визначення тіаміну в харчових продуктах. Він заснований на здатності тіаміну утворювати в лужному середовищі з феррнціаннд калня тіохром, який дає інтенсивну флюоресценцію в бутиловому спирті. Інтенсивність процесу контролюють на флюорометрі ЕФ-ЗМ.

У продуктах харчування та напоях рибофлавін присутній у зв'язаному стані, тобто у формі фосфорних ефірів, пов'язаних з білком. Щоб визначити кількість рибофлавіну в продуктах, необхідно звільнити його із зв'язаного стану шляхом кислотного гідролізу та обробки ферментними препаратами. Вітамін B1 у безалкогольних напоях розраховують за допомогою хімічного методу для визначення кількості легкогідролізованих та міцно пов'язаних форм рибофлавіну в тканинах. Метод ґрунтується на здатності рибофлавіну до флюоресценції до та після відновлення його гіпосульфітом натрію. Визначення загального змісту фенольних сполук. Для цього використовують колориметричний метод Фоліна - Дениса, який ґрунтується на утворенні блакитних комплексів при відновленні вольфрамової кислоти під дією поліфенолів з реагентом у лужному середовищі. Фенольні сполуки визначають за хлорогеновою кислотою методом полум'яної фотометрії на приладі ЕКФ-2.

2. Хроматографічні методи визначення вітамінів

Останнім часом там бурхливий розвиток переживає метод високоефективної рідинної хроматографії. Це пов'язано насамперед з появою прецизійних рідинних хроматографів, удосконаленням техніки виконання аналізу. Широке використання методу ВЕРХ щодо вітамінів знайшло свій відбиток й у числі публікацій. На сьогоднішній день більше половини всіх опублікованих робіт з аналізу як водо-, так і жиророзчинних вітамінів присвячено застосуванню цього методу. Широке поширення при визначенні вітамінів набули різні варіанти хроматографії.

Для очищення токоферолу від сторонніх домішок використовують метод тонкошарової хроматографії У поєднанні зі спектрофотометричними та флуориметричними методами цим способом проводять і кількісне визначення вітаміну Е.

Аналіз ізомерів токоферолу в оливковій олії проводиться методом газо-рідинної хроматографії. Методики аналізу ГХ та ГРХ вимагають отримання летких похідних, що дуже важко при аналізі жиророзчинних вітамінів. З цієї причини дані способи визначення не набули великого поширення. Визначення вітаміну Е у харчових продуктах, фармпрепаратах та біологічних об'єктах проводять у градієнтному та ізократичному режимах як у нормально-фазових, так і у обернено-фазових умовах. Як адсорбенти використовують силікагель (СГ), кізельгур, силасорб, ODS-Гіперсил та інші носії. Для безперервного контролю складу елюату в рідинній хроматографії при аналізі вітамінів та збільшення чутливості визначення використовують УФ (А,=292 нм), спектрофотометричний (Х=295нм), флуоресцентний (Х,=280/325нм), електрохімічний, ПМР- та мас-спектроскоп детектори.

Більшість дослідників для поділу сумішей всіх восьми ізомерів токоферолів та їх ацетатів вважають за краще використовувати адсорбційну хроматографію. У цих випадках рухомий фазою зазвичай служать вуглеводні, що містять незначні кількості будь-якого простого ефіру. Перелічені методики визначення вітаміну Е, як правило, не передбачають попереднього омилення зразків, що суттєво скорочує час виконання аналізу.

Поділ з одночасним кількісним визначенням вмісту жиророзчинних вітамінів (А, Д, Е, К) при їх спільній присутності в полівітамінних препаратах проводять як на прямій, так і зверненій фазах. При цьому більшість дослідників вважають за краще використовувати обернено-фазовий варіант ВЕРХ. Метод ВЕРХ дозволяє аналізувати водорозчинні вітаміни В1 та В2 як одночасно, так і окремо. Для поділу вітамінів використовують обернено-фазний, іоно-парний та іонообмінний варіанти ВЕРХ. Застосовують як ізократичний, і градієнтний режими хроматографування. Попереднє відділення визначених речовин від матриці здійснюють шляхом ферментативного та кислотного гідролізу проби.

Переваги методу рідинної хроматографії:

Одночасне визначення кількох компонентів

Усунення впливу компонентів, що заважають

Комплекс можна швидко перебудувати виконання інших аналізів.

Склад та характеристика обладнання та програмного забезпечення для рідинного хроматографа "Хромос ЖХ-301":

Таблиця 1

Позитивні якості хроматографа "Хромос ЖХ-301":

Висока стабільність та точність підтримки витрати елюентів забезпечується конструкцією насосів високого тиску.

Легкий доступ до колонок забезпечується конструкцією приладу.

Ефективність поділу забезпечується використанням високоефективних хроматографічних колонок.

Широкий лінійний діапазон вимірювального сигналу детекторів без перемикання межі вимірювання, що дозволяє з високою точністю вимірювати піки як великої, так і малої концентрації.

Хроматограма аналізу водорозчинних вітамінів:

Вступ

морепродукт вітамін антиоксидантний

З найдавніших часів людину цікавило все, що пов'язано з їжею та харчуванням. Спочатку головним було добування будь-якої їжі, потім були століття, коли люди розширювали джерела їжі, розвиваючи сільське господарство, а заразом і вдосконалювали способи приготування різних страв, доводячи їх до справжнього мистецтва (згадаймо французьку або китайську кулінарію). Лише в середині минулого століття з початком промислової та наукової революції виникла наука про харчування, яку тепер називають дієтологія чи нутріціологія.

Як правило, вітаміни надходять до нашого організму разом з їжею, яка теоретично повинна містити ті чи інші вітаміни, закладені в її елементи самою природою. Фрукти та овочі, м'ясо, молоко, злакові рослини - все це, вирощене відповідним чином, повинно містити мінімальний перелік необхідних вітамінів, але в наш час це досить рідко. Погана екологія, активне використання хімічних елементів у харчуванні тварин та виробництві рослинної продукції, генна інженерія - це дуже часто зводить нанівець, корисність продуктів, які не містять вітаміни, і є прямою причиною нестачі їхнього вмісту в організмі людини.

Вітаміни являють собою особливі органічні сполуки, які життєво необхідні організму людини для його нормального функціонування, вони відіграють важливу роль в обміні речовин.

Нестача вітамінів може призвести до серйозних змін у стані здоров'я. На жаль, наш організм не здатний самостійно синтезувати вітаміни (виняток становить вітамін К, який за рахунок діяльності особливих бактерій у достатній кількості утворюється в кишечнику), тому їхній дефіцит необхідно обов'язково заповнювати.

Вітаміни А і Е які у продуктах харчування відіграють велику роль життєдіяльності т.к. є природними антиоксидантами.

Останнім часом дуже часто використовується слово антиоксиданти. Його можна почути по телевізору, прочитати в газеті чи модному журналі, побачити на упаковці продуктів харчування. У зв'язку з цим ми починаємо ставити запитання: «Що таке антиоксиданти, і для чого вони потрібні в продуктах харчування?»

Метою роботи є визначення кількісного вмісту вітамінів А та Е у м'ясі морепродуктів та морській рибі.

Завдання дослідження. Для досягнення поставленої мети необхідно вирішити такі завдання:

1. Визначити кількісний вміст вітамінів А та Е та дієнових кон'югатів у м'ясі морепродуктів.

2. Порівняти кількісний вміст вітамінів А та Е та дієнових кон'югатів у м'ясі морепродуктів.

Об'єктами дослідження є м'ясо морепродуктів (креветки, восьминога, кальмара, мідії) та м'ясо морської риби (мінтаю, путасу, камбали).

Предмет дослідження – кількісний вміст вітамінів А та Е у м'ясі морепродуктів та морської риби.

1. Аналітичний огляд литературы

1.1 Загальні уявлення про хімічний склад та властивості морепродуктів

Поняття морепродуктів використовується для позначення всіх їстівних жителів світового океану. Хоча риба відноситься до морськими жителями, цей продукт виділяють в окрему групу і не зараховують до морепродуктів. Дари моря застосовують і у кулінарії, а й у медицині, а як і в хімічної промисловості. Практично кожен вид морепродуктів має виняткові корисні властивості, які надають сприятливий вплив на здоров'я та самопочуття людини.

Риба - це продукт високої харчової цінності, оскільки містить білки (13-23%), жири (0,1-33%), мінеральні речовини (1-2%), вітаміни А, D, Е, В1, В12, РР, С, екстрактивні речовини та вуглеводи. Хімічний склад риби не є постійним, він змінюється в залежності від виду, віку, місця та часу вилову.

У рибі та морепродуктах містяться такі вкрай необхідні для людини сполуки, як незамінні амінокислоти, у тому числі лізин та лейцин, незамінні жирні кислоти, включаючи унікальні ейкозопентаєнову та докозогексаєнову, жиророзчинні вітаміни, мікро- та макроелементи у сприятливих для організму людини співвідношення.

Особливе значення має метіонін, що відноситься до ліпотропних протисклеротичним речовин. За вмістом метіоніну риба посідає одне з перших місць серед білкових продуктів тваринного походження. Завдяки присутності аргініну та гістидину, а також високому коефіцієнту ефективності білків (для м'яса риби він становить 1,88-1,90, а для яловичини - 1,64) рибопродукти дуже корисні для організму, що росте. Білок риби відрізняється гарною засвоюваністю. За швидкістю перетравності рибні та молочні продукти ідентичні і займають перше місце.

Білки риби в основному повноцінні: альбуміни та глобуліни (прості білки), нуклеопротеїди, фосфоропротеїди та глюкопротеїди (складні білки). Загалом у м'язовій тканині риб 85% повноцінних білків. Вони майже повністю (97%) засвоюються організмом людини. Тому риба є джерелом білкового харчування.

Неповноцінний білок сполучної тканини колаген (15%) під впливом теплової обробки легко перетворюється на глютин, тому м'ясо риби розм'якшується швидше, ніж м'ясо свійських тварин.

Жир риби містить велику кількість ненасичених жирних кислот (лінолеву, ліноленову, арахідонову та ін), тому він рідкий при кімнатній температурі, має низьку температуру плавлення (нижче 37 ° С) і легко засвоюється організмом людини. Жир в організмі риб розподілено нерівномірно.

Риба задовольняє добову потребу людини у тваринних білках на 7-24%, у жирах – на 0,1-12%, у тому числі у поліненасичених жирних кислотах – на 0,1-18%.

Особливо велика кількість вітамінів А і D міститься у жирі печінки риб. Вітаміном А багатий насамперед жир печінки морських тріскових риб (тріска, пікша, мінтай та ін), акул, морського окуня, скумбрії та багатьох інших. Вміст вітаміну D у печінці риб коливається від 60 до 360 мкг%, але в деяких видів горбилів сягає 700-1900 мкг%.

Водорозчинні вітаміни (групи В) при звичайних способах обробки риби значною мірою зберігаються. У процесі варіння риби деяка частина водорозчинних вітамінів, що містяться в ній, переходить у бульйон, у зв'язку з чим його доцільно використовувати для харчових цілей. Особливо багато вітамінів групи В темному м'ясі атлантичної скумбрії, сардини, тунців (20 мкг на 100 р.), вкрай необхідні у зв'язку зі збільшенням білка в раціоні людини.

Кількість жиру в м'ясі різних риб неоднакова. За вмістом жиру рибу умовно поділяються на такі групи:

· нежирна (до 2%) - тріска, пікша, сайда, навага, лин, судак, річковий окунь, вигляд, йорж, тихоокеанська камбала;

· Маложирна (2-5%) - оселедець тихоокеанський та атлантичний (під час нересту), корюшка, короп, вобла, карась, кефаль, морський окунь, сом, язь;

· жирна (5-15%) - білуга, осетр, стерлядь, сьомга, кета, горбуша, скумбрія, ставрида, тунець, оселедець атлантичний і тихоокеанський (влітку, восени, на початку зими);

· дуже жирна (15-33%) - лосось, мінога, стерлядь сибірська, осетр сибірський, оселедець тихоокеанський та атлантичний (наприкінці літа).

Мінеральні речовини входять до складу білків, жирів, ферментів та кісток риби. Найбільше їх у кістках. Це солі кальцію, фосфору, калію, натрію, магнію, сірки, хлору. Зміст фосфору в м'ясі риб становить середньому 0,20-0,25%. Особливо велике фізіологічне значення мають такі риби, що містяться в рибі в дуже малих кількостях, як залізо, мідь, йод, бром, фтор та ін. на 20%. Морепродукти містять більше мінеральних речовин, зокрема мікроелементів, ніж прісноводна риба. Вона багата на йод, який необхідний для нормальної діяльності щитовидної залози. У середньому у прісноводних рибах міститься 6,6 мкг йоду на 100 г сухої речовини, у прохідних – 69,1 мкг, у напівпрохідних – 26 мкг, у морських – 245 мкг.

Специфічний різкий запах морської риби зумовлений присутністю в ній азотистих речовин – амінів.

Вуглеводи риби представлені глікогеном (0,05-0,85%), який формує смак, запах та колір рибних продуктів. Солодкуватий смак риби після теплової обробки обумовлений розпадом глікогену до глюкози.

Харчова цінність риби залежить не тільки від хімічного складу, а й від співвідношення в її тілі їстівних та неїстівних частин та органів. До їстівних частин відносять м'ясо, шкіру, ікру, молочко, печінку; до неїстівних - кістки, плавники, луску, нутрощі. Чим більше в рибі м'яса та ікри, тим вища її харчова цінність.

Риба як продукт харчування цінується досить високо. Проте забрудненість прісноводних риб шкідливими речовинами стала справжньою проблемою. Щоправда, залишкові кількості важких металів або хлорованих вуглеводнів здебільшого нижчі від гранично допустимої концентрації (ГДК), але сума всіх шкідливих речовин може призвести до небажаних наслідків для здоров'я. Концентрація цих речовин у морській рибі в середньому значно нижча за ГДК.

Якщо виключити з раціону рибу, що зіпсувалася, і риби з надмірно забруднених водойм, то можна сказати, що вона є дуже важливим і високоякісним продуктом харчування.

Корисні властивості морепродуктів насамперед визначається середовищем їх проживання. Морська вода має величезну кількість мінеральних речовин, тому тварини, що живуть у ній, вбирають у собі всю «користу» морів і океанів.

У морепродуктах містяться швидкозасвоювані білки, жирні кислоти, мікро- та макроелементи. На відміну від м'ясних продуктів морепродукти набагато поживніші та корисніші для здоров'я. у м'язах морепродуктів сполучної тканини у кілька разів менше, ніж у м'язах наземних тварин - це пов'язано з особливостями їх будови та довкілля. На відміну від тварин суші, у м'ясі морських тварин немає щільного жиру, натомість у ньому багато білка та поліненасичених жирних кислот (ПНЖК), які необхідні дітям та дорослим. Нестача ПНЖК загрожує передчасною старістю та хронічними захворюваннями. ПНЖК захищають судини, запобігаючи розвитку атеросклерозу.

Свого фосфору в морепродуктах теж багато, і це актуально для тих, хто страждає на захворювання центральної нервової системи, інтенсивно навчається або займається розумовою роботою.

Морепродукти не калорійні, отже, їх вживання в їжу захищає від накопичення надмірної ваги. Наприклад, якщо порівнювати їх з телятиною, яка вважається дієтичним м'ясом, то вони виявляться калорійними, т.к. калорійність телятини – близько 290 ккал на 100 г., тоді як у кальмарах, креветках та мідіях – всього близько 70-85 ккал, а жирів вони містять від 0,3 до 3 г.

Користь креветок не обмежується їхньою низькою калорійністю. Це багате джерело тваринного білка та заліза, а також ряду вітамінів. Є в креветках та антиоксиданти. І найважливіший з них – астаксантин – захищає від раку та атеросклерозу. Ця речовина близька за будовою до каротину моркви. Його утворюють океанічні водорості, від них він переходить в організм креветок, крабів та червоної риби.

Відомо, що продукти моря багаті йодом (причому належить це не лише до морських тварин, а й до рослин), і найдоступнішим його натуральним джерелом вважатимуться морську капусту. Йод необхідний людям, які займаються розумовою діяльністю, тому що його недолік сприяє швидкій стомлюваності, підліткам, тому що їх організм швидко росте і йому необхідне харчування, вагітним необхідний йод як для власного організму, так і для плода.

Морепродукти багаті також міддю та цинком, які необхідні організму для нормалізації обміну речовин, вироблення гормонів, утворення клітин імунної системи, статевих клітин, переробки білка та інших важливих процесів життєдіяльності.

Важливою властивістю практично всіх морепродуктів є здатність знижувати вплив емоційних навантажень: не дарма в країнах, розташованих на морському узбережжі, населення відрізняється спокоєм та доброзичливістю, врівноваженістю та оптимізмом – не останню роль тут грає раціон харчування.

Шкідливими можуть бути морепродукти, які виловлені в екологічно несприятливих водах, а таких місць на Землі сьогодні дедалі більше. Крім забруднень, викликаних витоками нафти і скиданням промислових та побутових відходів, в океані багато місць, де є радіоактивне випромінювання, а жителі моря плавають і живуть скрізь.

Вживати в їжу слід свіжовиловлені або заморожені морепродукти, в консервованих зберігається мало корисного, і до того ж у них часто буває забагато харчових добавок. Продукти у вакуумних упаковках також можуть містити шкідливі хімічні речовини. Якщо морепродукти були заморожені досить свіжими, свої корисні властивості зберігають майже повністю, але багато залежить і від зберігання: якщо продукт зберігався неправильно, його якість може різко погіршитися.

Дієтологи не радять зловживати морепродуктами, і рекомендують включати їх до свого раціону не частіше двох разів на тиждень. До речі, деякі морські делікатеси багаті на холестерин, частина має здатність накопичувати надмірну кількість ртуті.

1.2 Перекисне окиснення ліпідів

Перекисне окислення ліпідів - складний процес, що протікає як у тваринах, так і в рослинних тканинах. Він включає активацію і деградацію ліпідних радикалів, вбудовування в ліпіди попереднього активованого молекулярного кисню, реорганізацію подвійних зв'язків в поліненасичених ацилах ліпідів і, як наслідок, деструкцію мембранних ліпідів і самих біомембран. Через війну розвитку свободнорадикальных реакцій перекисного окислення ліпідів утворюється низку продуктів, зокрема спирти, кетони, альдегіди, ефіри ін. Так, наприклад, лише за окисленні лінолевої кислоти утворюється близько 20 продуктів її розпаду. Біологічні мембрани, особливо мембрани холоднокровних тварин, містять велику кількість ненасичених жирних кислот, металопротеїни, що активують молекулярний кисень. Тому не дивно, що вони можуть розвиватися процеси перекисного окислення ліпідів.

Сучасні уявлення про механізм перекисного окислення ліпідів свідчать про можливість безпосереднього приєднання молекулярного кисню до органічних молекул з утворенням гідроперекисів. Субстратом окиснення в біологічних мембранах є поліненасичені жирні кислоти, що входять до складу фосфоліпідів.

Перекисне окислення (автоокислення) ліпідів при контакті з киснем не тільки призводить до непридатності харчові продукти (прогоркання), а й викликає також пошкодження тканин in vivo, сприяючи розвитку пухлинних захворювань. Пошкоджуюча дія ініціюється вільними радикалами, що виникають у період утворення перекисів жирних кислот, що містять подвійні зв'язки, що чергуються з метиленовими містками (таке чергування є в поліненасичених природних жирних кислотах). Перекисне окиснення ліпідів є ланцюговою реакцією, що забезпечує розширене відтворення вільних радикалів, які ініціюють подальше поширення перекисного окиснення. Весь процес можна уявити так.

1) Ініціація: освіта R із попередника

2) Розвиток реакції:

3) Термінація (припинення реакції):

Оскільки гідроперекис ROOH виступає як попередник у процесі ініціації, перекисне окислення ліпідів є розгалуженою ланцюговою реакцією, що потенційно здатна викликати значне пошкодження. Для регулювання процесу перекисного окислення жирів і людина і природа використовують антиоксиданти. У харчові продукти з цією метою додають пропілгаллат, бутильований гідроксианізол та бутильований гідрокситолуол. До природних антиоксидантів відносяться жиророзчинний вітамін Е (токоферол), а також водорозчинні урати та вітамін С. Каротин є антиоксидантом тільки при низьких значеннях.

Антиоксиданти розпадаються на два класи:

1) превентивні антиоксиданти, що знижують швидкість ініціації ланцюгової реакції.

2) антиоксиданти, що гасять (переривають ланцюг), що перешкоджають розвитку ланцюгової реакції.

До перших відносяться каталаза та інші пероксидази, що руйнують ROOH, та агенти, що утворюють хелатні комплекси з металами - ДТПА (діетилентріамінпентаацетат) та ЕДТА (етилендіамінтетраацетат). В якості антиоксидантів, що переривають ланцюг, часто виступають феноли або ароматичні аміни. В умовах in vivo головними антиоксидантами, що переривають ланцюг, є супероксиддисмутаза, яка у водній фазі вловлює супероксидні вільні радикали а також вітамін Е, що уловлює вільні радикали ROO в ліпідній фазі, і, можливо, сечова кислота.

1.3 Біологічна роль вітамінів А та Е

Ретиномл (істинний вітамін A, транс - 9,13 - диметил-7 - (1,1,5 - триметил-циклогексен-5-іл-6) - нонатетраєн - 7,9,11,13 - ол) - жиророзчинний вітамін, антиоксидант (рис. 1.1)

Рис. 1.1 Формула ретинолу

Вітамін A отримав назву ретинол через його виняткову важливість для функціонування сітківки ока (ретини). Але, як і у випадку з іншими вітамінами, його роль в організмі набагато ширша і пов'язана з багатьма критично важливими процесами.

Біологічна роль вітаміну А.

· Антиоксидантна функція: нейтралізація вільних кисневих радикалів, що перешкоджає повторній появі (рецидиву) пухлин після операцій.

· Регуляція генетичних функцій: підвищення чутливості клітин до ростових стимулів, що забезпечує нормальне зростання клітин ембріона і молодого організму, регуляцію поділу та диференціювання клітин, що швидко діляться, таких як клітини плаценти, кісткової тканини, хряща, епітелію шкіри, сперматогенного епітелію, слизових, імунної системи.

Всі ці функції забезпечують нормальне функціонування імунної системи, підвищують бар'єрну функцію слизових оболонок, відновлення ушкоджених епітеліальних тканин, стимулює синтез колагену, знижує небезпеку інфекцій.

· Участь у зорових фотохімічних процесах.

Ретиналь у комплексі з білком опсином формує зоровий пігмент родопсин, який знаходиться в клітинах сітківки ока, що відповідають за чорно-білий сутінковий зір – паличках.

· Участь у синтезі стероїдних гормонів, сперматогенезі, є антагоністом тироксину – гормону щитовидної залози.

· Специфічними функціями мають окремі каротиноїди:

а) b - каротин особливо необхідний для нейтралізації вільних радикалів поліненасичених жирних кислот і радикалів кисню, має захисну дію у хворих на атеросклероз, стенокардію, підвищуючи вміст у крові ліпопротеїдів високої щільності, що мають антиатерогенну дію (перешкоджає формуванню атеросклеротичних).

б) лютеїн та зеаксетин – сприяють попередженню катаракти, знижують ризик дегенерації жовтої плями.

в) лікопін має антиатеросклеротичну дію, захищає організм від розвитку раку молочної залози, ендометрію, простати. Найбільший вміст лікопіну у помідорах.

Гіповітаміноз

Причинами є харчова недостатність, гіповітаміноз, гіповітаміноз Е, дефіцит цинку, зниження функції щитовидної залози (гіпотиреоз), дефіцит заліза в організмі. Залізо необхідне для нормального функціонування залізовмісних ферментів, що каталізують у печінці та кишечнику перетворення каротиноїдів на ретинол.

Нестача вітаміну А призводить до виникнення у нашому організмі великої кількості захворювань та інших проблем зі здоров'ям. Найвідомішою ознакою нестачі цього вітаміну вважається куряча сліпота – захворювання, яке характеризується поганим зором у місцях із слабким освітленням. В даному випадку не тільки погано бачать очі, а й людина починає відчувати дискомфорт: пересихає слизова оболонка, на холоді сльозяться очі, відбувається помутніння рогівки. Крім того, виникає відчуття піску в очах, з'являються скоринки та слиз у куточках.

Крім органів зору, недолік вітаміну А впливає і на інші органи. Зокрема, страждає шкіра, яка стає занадто сухою, тому рано починає покриватися зморшками. На голові утворюється лупа, волосся втрачає природний блиск і тьмяніє. Сечостатева система та ШКТ через брак ретинолу також страждають від численних патологій, а на жіночих репродуктивних органах можуть утворюватися ерозії, поліпи, мастопатія і навіть рак.

Нестача вітаміну А пояснюється в основному мізерним харчуванням, при цьому часто спостерігається відмова від жирів та білкової їжі. Крім того, це може бути пов'язано і з наявністю хвороб кишківника, печінки та шлунка, а також дефіцитом вітаміну Е, який допомагає ретинолу швидше окислюватися.

Гіпервітаміноз.

В основному пов'язаний з надлишковим прийомом різних харчових добавок, що містять вітамін А. Гіпервітаміноз, пов'язаний із вживанням в їжу продуктів багатих на вітамін А, практично не зустрічається.

Гостро отруєння проявляється головним болем, слабкістю, нудотою, порушенням свідомості, зору.

Хронічне отруєння характеризується порушенням травлення, втратою апетиту, що веде до схуднення, знижується активність сальних залоз шкіри, розвивається сухий дерматит, можлива ламкість кісток.

Особливо небезпечний гіпервітаміноз при вагітності. Доведено ембріотоксичність препарату у високих дозах. Описано також нефротоксичність та канцерогенність гіпервітамінозу.

Добова норма вітаміну для дітей дошкільного віку від 0,5 до 1,5 мг. Норма для дорослої людини дещо вища, але нижчою межею є значення 1,5 мг, при зниженні цієї позначки розвиваються симптоми дефіциту. Вагітним і грудним жінкам потрібно збільшувати норму вітаміну А до позначки в 2-2,5 мг.

Вітамін Е відноситься до групи природних сполук - похідних токола. Світло-жовті в'язкі рідини не розчиняються у воді, добре розчиняються у хлороформі, ефірі, гексані, петролейному ефірі, гірше – в ацетоні та етанолі.

· Вітамін вбудовується у фосфоліпідний бислой мембрани клітин та виконує антиоксидантну функцію, перешкоджаючи перекисному окисленню ліпідів.

Особливо дана функція важлива в клітинах, що швидко діляться, таких як епітелій, слизові оболонки, клітини ембріона, в сперматогенезі.

· Знижує дегенерацію клітин нервової тканини.

· Відомо позитивний вплив вітаміну Е на стан судинної стінки, зниження тромбоутворення.

· Вітамін Е захищає вітамін А від окиснення.

· Місцеве застосування кремів з вітаміном Е покращує стан шкіри, запобігає старінню клітин, сприяє загоєнню пошкоджених ділянок.

Гіповітаміноз.

Причинами гіповітамінозу є харчова недостатність.

Клінічна картина. Патологія мембран клітин веде до гемолізу еритроцитів, розвивається анемія, збільшується проникність мембран, м'язова дистрофія.

З боку нервової системи може відзначатися ураження задніх канатиків спинного мозку та мієлінової оболонки нервів, що призводить до порушення чутливості, парезу погляду.

Гіповітаміноз може призвести до безпліддя.

За нестачі вітаміну Е людина починає відчувати слабкість, настрій різко погіршується і настає апатія до всього. Так само симптоми нестачі вітаміну Е виражаються у появі пігментних плям та погіршенні стану шкіри обличчя. З моменту початку підготовки до вагітності аж до закінчення грудного вигодовування гінекологи призначають своїм пацієнткам збільшені дози вітаміну Е. Токоферол незамінний для тих, хто займається професійним спортом або зазнає щоденних фізичних навантажень.

Добова норма вітаміну Е залежить від віку та статі. Дітям віком від 0 до 7 років достатньо від 5 до 10 мг. цього вітаміну. Дітям від 7 до 14 років потрібна вже трохи більша доза, від 10 до 14 мг. Дорослим людям потрібно на добу отримувати щонайменше 10 мг вітаміну Е. Саме за такого значення не розвинеться дефіцит. Так само збільшується потреба у вітаміні Е у вагітних і жінок, що годують груддю. Для них нормою є від 15 до 30 мг. Норма вітаміну Е може підвищуватись при нервових потрясіннях, стресах або після перенесення тяжких захворювань.

Антиоксидантна активність вітаміну А.

Біологічно активні речовини виконують в організмі певну функцію, беручи участь у складних біохімічних процесах. Як відомо, ультрафіолетове опромінення, куріння, стреси, деякі препарати (у тому числі і лікарські) здатні стимулювати утворення вільних радикалів та активних форм кисню.

Кисень необхідний життя. Зниження вмісту кисню згубно впливає стан живих організмів. Але, з іншого боку, окислювальна здатність кисню пошкоджує діє клітинні структури.

Вільні радикали кисню з'являються не тільки під впливом агресивного впливу зовнішніх факторів, але можуть виникати як побічні продукти біологічного окислення в тканинах і клітинах. Вільні радикали здатні стимулювати розвиток різних реакцій. Найнебажанішою є реакція взаємодії з ліпідами – перекисне окиснення. В результаті утворюються перекиси. За цим механізмом частіше окислюються ненасичені жирні кислоти – складові клітинних мембран. Перекисне окислення може мати місце в оліях, що містять ненасичені жирні кислоти. Олія набуває гіркого смаку - «прогоркає».

Окислення в тканинах та клітинах носить ланцюговий характер і наростає лавиноподібно. В результаті додатково до вільних радикалів утворюються ліпідні перекиси, що легко перетворюються на нові вільні радикали, що реагують з усіма біологічними молекулами (ліпідними, білковими, ДНК).

Антиоксидантна система здатна блокувати реакції вільнорадикального окиснення. Антиоксиданти взаємодіють комплексно. Частина антиоксидантів розташовані в органелах клітин, інші – позаклітинно (у міжклітинному просторі). Наприклад, СОД, каталаза, глутатіонпероксидаза знаходяться як у цитоплазмі, так і в мітохондріях тих клітинних органел, де найбільше вільних радикалів. На додаток до внутрішньоклітинних антиоксидантний захист здійснюють позаклітинні антиоксиданти - глутаніон, вітаміни Е, С, А, СОД, каталаза, глутаніонпероксидаза. Кофермент Q10 (убіхінон) захищає мітохондрії від окисного ушкодження.

Крім того, антиоксидантні властивості мають й інші біологічні сполуки: токофероли, каротиноїди, жіночі статеві гормони, тіолові сполуки (що містять сірку), деякі білкові комплекси, амінокислоти вітамін К та ін.

Однак під дією агресивних зовнішніх факторів (наприклад, ультрафіолету) антиоксидантна система шкіри не завжди здатна її захистити. Тоді необхідно застосовувати засоби, що посилюють антиоксидантний захист.

Вітамін А (ретинол, Retinolum). Роль вітаміну А у життєдіяльності організму різноманітна. Ретинол та його метаболіти ретиналь (цис- і трансальдегід) та ретинолова кислота, ефіри ретинолу (ретинілпальмітат, ретинілацетат та ін.) зазнають під впливом специфічних ферментів певних перетворень.

Вивчення ретинолу розпочато 1909 р., синтезований він 1933 р. Паулем Каррером. Вітамін А у харчових продуктах присутній у вигляді ефірів, а також у вигляді провітамінів: альфа, бета та гамма-каротинів та ін. (у продуктах рослинного походження). Каротин був виявлений у 1931 р. у моркві. Найактивнішим є в-каротин.

Вітамін А поширений. Він міститься в продуктах тваринного походження, печінки великої рогатої худоби та свиней, яєчному жовтку, цілісному молоці, сметані, печінці морського окуня, тріски, палтуса та ін.

Каротини також є джерелом вітаміну А (червоно-м'якотні овочі: морква, томати, перець та ін.). Розщеплення каротинів відбувається переважно в ентероцитах під дією специфічного ферменту (в-каротиндиоксигенази (не виключена можливість аналогічного перетворення в печінці) до ретиналю. Під дією специфічної кишкової рефуктази ретиналь відновлюється в ретинол. Засвоєння покращується в присутності жирів та жирів. має імуностимулюючу властивість.

При авітамінозі А поряд із загальними явищами відзначається специфічне ураження шкіри, слизових оболонок та очей. Відзначається ураження епітелію шкіри, що супроводжується проліферацією та патологічним його зроговінням. Спостерігається гіперкератоз, шкіра посилено лущиться, утворюються тріщини, з'являються вугри, кісти сальних залоз, загострення бактеріальної та мікотичної інфекції. Має місце ураження слизових оболонок ШКТ, сечостатевої системи, дихального апарату, що порушує їх функцію та сприяє розвитку захворювань (гастритів, циститів, пієлітів, ларинготрахеобронхітів, пневмоній). Характерно ураження очного яблука - ксерофтальмія, порушення гостроти зору, здатності розрізняти предмети в сутінках (порушення темнової адаптації), при вираженому авітамінозі може порушуватися сприйняття кольору.

При дефіциті вітаміну А порушується зростання кісток, оскільки вітамін А необхідний синтезу хондроитинсульфатов кісткової та інших тканин. Вітамін А і каротиноїди мають виражену антиоксидантну властивість завдяки здатності гальмувати перекисне окислення ліпідів.

Каротиноїди - в-каротин (накопичується в яєчниках, захищаючи яйцеклітини від перекисів), резерватол (знаходиться в червоному вині та арахісі - потужний антиоксидант), лікопін (має виражену антиоксидантну властивість щодо ліпо-протеїдів, міститься в помідорах) та ін. , Зеаксантин, Кантаксантин накопичуються в сітківці).

У сучасних косметичних засобах особливе місце приділяється ретиноїдам (синтетичні та натуральні сполуки, що за дії аналогічні ретинолу). Вітамін А, як зазначалося, регулює біохімічні процеси в шкірі, здатний впливати на клітини шкіри (регулює процеси проліферації, диференціювання та міжклітинних взаємодій).

Ретиноїди при місцевому застосуванні (у концентраціях 0,001-1% - ретин-А, айрол, радевіт, ретинова кислота, диферін та ін.) сприяють оновленню епідермісу, нормалізації функціонування сальних залоз, відновленню дермального матриксу, застосовуються в програмах лікування вугрової системи старіння.

Не слід використовувати ці препарати при прийомі деяких лікарських засобів, які мають фотосенсибілізуючу властивість (тетрациклінів, сульфаніламідів, тіазидів та ін.). Препарати мають тератогенну властивість, їх не рекомендуються застосовувати у вагітних. Використання препаратів для загального застосування викладено у розділі «Лікування акне».

Антиоксидантна активність вітаміну Е.

Вітамін Е (токоферолу ацетат, Tocopheroli acetas). Токоферолу ацетат є синтетичним препаратом вітаміну Е. Найбільшу біологічну активність має а-токоферол. Під назвою «вітамін Е» відомі й інші токофероли, вони близькі за хімічною природою та біологічною дією. Вітамін Е має виражену антиоксидантну властивість. Він захоплює неспарені електрони активних форм кисню, блокує перекисне окиснення ліпідів (зокрема гальмує перекисне окиснення ненасичених жирних кислот), стабілізуючи стан клітинних мембран. Ця властивість - запобігання окисленню ненасичених жирних кислот - використовується в косметичних засобах, що дає змогу уникнути прогоркання жирів.

Крім того, вітамін Е бере участь у біосинтезі гемоглобіну крові та білків, у розподілі клітин, у тканинному диханні та інших складних та важливих процесах. Вітамін Е відновлює вітамін А та кофермент Q10 (убіхінон). Крім того, дія вітаміну Е пов'язана з дією мікроелементів (зокрема, селену, який входить до складу фосфоліпідглутатіонпероксидази та глутатіонпероксидази, активність яких залежить від вітаміну С).

Токофероли в природі містяться в зелених частинах рослин, особливо в молодих паростках злаків, кілька їх міститься в жирі, м'ясі тварин, яйцях, молоці, креветках, кальмарах та ін.

У медицині та косметології використовують екстракти із злаків, пророщених зерен, рослинні олії, отримані холодним віджимом. Багаті токоферолом такі рослинні олії:

· Соєве (1140 мг/кг);

· бавовняне (990 мг/кг);

· кукурудзяне (930 мг/кг);

· оливкова (130 мг/кг)

та інші (арахісова, обліпихова, пальмова, мигдальна, олія лісового горіха).

1.4 Неферментативна антиоксидантна система

Як компоненти неферментативної АОС можуть виступати низькомолекулярні речовини, що мають високу константу швидкості взаємодії з АФК.

Неферментативна АОС включає різні за хімічною будовою та властивостями сполуки: водорозчинні - глутатіон, аскорбат, цистеїн, ерготіонеїн, та гідрофобні - - токоферол, вітамін А, каротиноїди, убіхінони, вітаміни групи К, які знижують швидкість утворення вільних радикалів та зменшують протікають за участю радикалів.

Основна спрямованість дії низькомолекулярних АТ пов'язана із захистом білків, нуклеїнових кислот, полісахаридів, а також біомембран від окисного руйнування при вільнорадикальних процесах. Важливого значення низькомолекулярні АТ набувають в умовах окисного стресу, коли ферментативна АОС виявляється менш ефективною в порівнянні з їх протекторною дією. Причини цього – швидка інактивація конститутивного пулу ферментів вільними радикалами та значний час, необхідний для індукції їх синтезу.

У ліпідах містяться природні антиоксиданти (АТ), які суттєво впливають на швидкість реакції обриву ланцюгів окислення. До гідрофобних АТ фенольного типу відносяться три групи речовин: токофероли, убіхінони та вітаміни групи К. Кожна з цих речовин утворює групу структурно-родинних сполук, що включає хінони, хіноли, хроманоли та хроменоли. У ліпідному бішарі мембран ці форми можуть переходити одна в одну. Кожна група природних АТ присутня в ліпідах переважно в одній, найбільш стабільній для цих сполук формі: вітаміни групи К знаходяться у вигляді хінонів, токофероли знаходяться в ліпідах, в основному, у циклічній формі 6-оксихроманов як у вигляді вільного токоферолу, так і у вигляді його ефірів, для убіхінонів найбільш стійкою є хінонна форма. Гідрохінонна форма убихинонов задоволена нестабільна і окислюється киснем повітря, проте у клітинах до 70% убихинона може у відновленої формі. Більш стабільними є циклічні форми - убіхроменоли, які не беруть участь у процесі перенесення електрона по дихальному ланцюзі. Припускають, що ця форма виконує у ліпідах роль АТ.

Характерною особливістю вищезгаданих сполук є наявність у їх структурі бічних аліфатичних заступників, що складаються з кількох ізопреноїдних ланок, що відрізняються ступенем ненасиченості.

До складу природних АТ, що містяться в ліпідах, входять відновлені фенольні форми, що активно реагують з пероксирадикалами ліпідів (ROO) та окислені хінонні форми, що взаємодіють з алкільними радикалами (R). Значною спорідненістю до пероксирадикалів мають вітаміни групи К і токоферол, константи швидкостей реакцій становлять 5,8106 та 4,7106 М-1с-1 відповідно. Убіхіноли та убіхроменоли в 10 разів менш активні, ніж токофероли. Висока спорідненість природних АТ до пероксирадикалів обумовлена ​​наявністю в їх молекулах лабільних гідроксильних груп, а довжина та ступінь ненасиченості бічних ланцюгів не має істотного впливу.

Хінони легко реагують з алкільними радикалами ліпідів (R), частка яких у загальній кількості вільних радикалів при ПОЛ велика за механізмом:

R+Q RQ; RQ + R RQR можуть ефективно гальмувати окислення.

Хінони та їх похідні здатні реагувати з АФК, зокрема, хінони здатні пов'язувати радикали супероксид-аніону, що беруть участь в ініціювання ланцюгів вільнорадикального окислення ліпідів, з утворенням семіхінонів. Разом з тим припускають, що убісеміхінони та убіхінони можуть, подібно до менасеміхінону та менадіолу, реагувати з молекулярним киснем з утворенням супероксидних аніон-радикалів.

2. Матеріали та методи дослідження

2.1 Загальний огляд методів визначення вмісту вітамінів А та Е

В галузі вивчення вітамінів накопичений величезний і різноманітний матеріал і він свідчить про те, що вітаміни є органічними сполуками різної хімічної природи, необхідні забезпечення обміну речовин, що лежить в основі всіх життєвих процесів. У зв'язку з цим інтерес до вітамінів згодом не слабшає, а зростає ще більше. Особливо важливою є розробка методів визначення вітамінів у різних об'єктах з метою контролю за їх вмістом у продуктах харчування, косметичних засобах, лікарських препаратах.

Методи визначення вмісту вітаміну А у продуктах.

При кількісному визначенні вітаміну А в харчових продуктах використовують різні методи: колориметричний, флуоресцентний спосіб прямої спектроскопії і ВЕРХ. Вибір методу визначається наявністю тієї чи іншої апаратури, метою дослідження, властивостями аналізованого матеріалу, передбачуваним вмістом вітаміну А та характером супутніх домішок.

Виділення вітаміну здійснюють кип'ятінням зі спиртовим розчином КОН серед азоту; та подальшою екстракцією петролейним ефіром.

1. Для кількісного визначення речовин, що мають А-вітамінну активність, може бути використаний метод прямої спектрофотометрії, заснований на здатності цих сполук до вибіркового світлопоглинання на різних довжинах хвиль в УФ області спектру. Поглинання пропорційно концентрації речовини при вимірюванні на тих довжинах хвиль, де спостерігається властивий даної сполуки максимум абсорбції у розчиннику. Метод - найпростіший, швидкий, досить специфічний. Дає надійні результати щодо вітаміну А об'єктах, які містять домішок, які мають поглинанням у тій області спектра. За наявності таких домішок метод може бути використаний у поєднанні із стадією хроматографічного поділу.

2. Перспективним є флуоресцентний метод, заснований на здатності флуоресціювати ретинолу під дією УФ променів (довжина хвилі збуджуючого світла 330-360 нм). Максимум флуоресценції спостерігається в області 480 нм. Визначення вітаміну А цим методом заважають каротиноїди і вітамін D. Для усунення впливу, що заважає, використовують хроматографію на оксиді алюмінію. Недолік флуоресцентного методу – дорога апаратура.

3. Раніше найбільш поширеним був колориметричний метод визначення вітаміну А щодо реакції з хлоридом сурми. Використовують розчин хлориду сурми у хлороформі (реактив Карр-Прайса). Механізм реакції точно не встановлений і припускають, що в реакцію вступає домішка SbCL5 SbCl3. З'єднання, що утворюється в реакції, пофарбоване в синій колір. Вимір оптичної щільності проводять при довжині хвилі 620 нм протягом 3-5 секунд. Істотним недоліком методу є нестійкість забарвлення, що розвивається, а також висока гидролизуемость SbCl3. Передбачається, що реакція протікає так:

Ця реакція для вітаміну А не специфічна, аналогічне фарбування дають каратиноїди, але хроматографічне поділ цих сполук дозволяє усунути їх вплив, що заважає.

Визначення вітаміну А перерахованими методами, як правило, передує підготовча стадія, що включає лужний гідроліз жироподібних речовин і екстракцію залишку залишку органічним розчинником. Часто доводиться проводити хроматографічне поділ екстракту.

4. Останнім часом замість колонкової хроматографії знаходить все більш широке застосування ВЕРХ, яка дозволяє розділити жиророзчинні вітаміни (A, D, E, K), які зазвичай присутні одночасно в харчових продуктах, і кількісно їх визначити з великою точністю. ВЕРХ полегшує визначення різних форм вітамінів (вітамін А-спирт, його ізомери, ефіри ретинолу), що особливо необхідно при контролі за внесенням вітамінів у харчові продукти.

Методи визначення вмісту вітаміну Е у продуктах.

До групи речовин, що поєднуються загальною назвою «вітамін Е» відносяться похідні токола і трієнолу, що мають біологічну активність a-токоферолу. Крім a-токоферолу, відомо ще сім споріднених йому сполук, що мають біологічну активність. Усі вони можуть зустрічатися у продуктах. Отже, головна складність при аналізі вітаміну Е полягає в тому, що в багатьох випадках доводиться розглядати групу сполук, що мають велику хімічну подібність, але одночасно різняться за біологічною активністю, оцінити яку можна лише біологічним методом. Це важко та дорого, тому фізико-хімічні методи майже повністю витіснили біологічні.

Основні стадії визначення вітаміну Е: підготовка зразка, лужний гідроліз (омилення), екстракція неомилюваного залишку органічним розчинником, відділення вітаміну Е від речовин, що заважають аналізу, і поділ токоферолів за допомогою різних видів хроматографії, кількісне визначення. Токофероли дуже чутливі до окислення в лужному середовищі, тому омилення та екстракцію проводять в атмосфері азоту та в присутності антиоксиданту (аскорбінової кислоти). При омиленні можуть руйнуватися ненасичені форми (токотрієноли). Тому при необхідності визначення всіх форм вітаміну Е, що містяться в продукті, омилення замінюють іншими видами обробки, наприклад кристалізацією при низьких температурах.

1. Більшість фізико-хімічних методів визначення вітаміну Е ґрунтується на використанні окисно-відновних властивостей токоферолів. Для визначення суми токоферолів у харчових продуктах найчастіше використовують реакцію відновлення тривалентного заліза двовалентним токоферолами з утворенням забарвленого комплексу Fe (2+) з органічними реагентами. Найчастіше використовують 2,2" - дипіриділ, з яким Fe (2+) дає комплекс, забарвлений у червоний колір (лmax = 500 нм). Реакція не специфічна. У неї також вступають каротини, стироли, вітамін А та ін. , інтенсивність забарвлення істотно залежить від часу, температури, освітлення, тому для підвищення точності аналізу токофероли попередньо відокремлюють від сполук, що заважають визначенню, методом колонкової, газорідинної хроматографії, ВЕРХ. % загального вмісту токоферолів (м'ясо, молочні продукти, риба та ін.) часто обмежуються визначенням суми токоферолів, коли в значних кількостях присутні інші токофероли (рослинні олії, зерно, хлібобулочні вироби, горіхи), для їх поділу використовують колонкову хроматографію.

2. Для визначення суми токоферолів може бути використаний флуоресцентний метод. Гексанова екстракти мають максимум флуоресценції в області 325 нм при довжині хвилі збуджуючого світла 292 нм.

3. Для визначення індивідуальних токоферолів безперечний інтерес представляє метод ВЕРХ, що забезпечує в одному процесі як поділ, так і кількісний аналіз. Метод також характеризується високою чутливістю та точністю. Детектування проводять з поглинання або флуоресценції.

2.2 Визначення кількісного вмісту вітамінів А та Е у морепродуктах

Визначення кількісного вмісту вітамінів А та Е проводилося на зразках чотирьох видів заморожених морепродуктів (креветка, восьминіг, кальмар, мідія) та трьох видів замороженої морської риби (мінтай, путасу, камбала). Досліджували по п'ять паралельних зразків кожного об'єкта, у яких визначали вміст вітамінів А та Е.

Методика визначення кількісного вмісту вітамінів А та Е .

У центрифужні пробірки міститься розтерте м'ясо морепродукту (навішення 1 г), 1 мл спирту та 1 мл дистильованої води. Пробірки закривають кришками та перемішують вміст обережними струшуваннями. Потім додають по 5 мл гексану і ще раз виробляють струшування. Потім центрифугують протягом 10 хвилин при 1500 об/хв.

Гексановий шар, що чітко відокремився, використовують для проведення вимірювань.

Визначення вмісту вітамінів А та Е проводили на аналізаторі «Флюорат».

Градуювання приладу «Флюорат» здійснювали шляхом вимірювання сигналів флуоресценції, приготованих розчинів. Контроль стабільності градуювальної характеристики полягає у проведенні вимірювань концентрації вітамінів у кількох сумішах. Градуювання визнається стабільним, якщо отримане значення концентрації вітамінів у суміші відрізняється від відомого не більше ніж на 10% в діапазоні 0,5 -2,0 мг/дм 3 і 20% при нижчих концентраціях. За невідповідності отриманих результатів зазначеним нормативам процес градуювання необхідно повторити.

В основу роботи приладу покладено флуориметричний метод вимірювання вмісту органічних та неорганічних речовин в області спектру 250-900 нм (наприклад, вітамін Е діапазон 300-320 нм). Для аналізу використовували кювети 10х20 мм. Під час роботи на «Флюораті» необхідно вибрати з меню необхідну методику, потім виміряти фоновий сигнал, встановити кювету з пробою і запустити процес вимірювання.

Як світлофільтри при вимірі вітаміну Е застосовують світлофільтр збудження Е-1 (292 нм) і світлофільтр реєстрації Е-2 (320 нм). Як світлофільтри при аналізі вітаміну А використовують світлофільтр збудження А-1 (335) нм) і світлофільтр реєстрації А-2 (460 нм).

Цей метод визначення вмісту вітамінів був обраний у зв'язку з наявністю необхідного обладнання та простотою використання.

2.3 Визначення вмісту дієнових кон'югатів у морепродуктах

Крім того, що про антиоксидантну активність морепродуктів можна судити за вмістом вітамінів А і Е так і за змістом дієнових кон'югатів.

До первинних продуктів перекисного окислення ліпідів відносяться циклічні ендоперекиси та аліфатичні моно-і гідроперекиси, так звані ліпопероксиди та дієнові кон'югати.

Вільнорадикальне, або перекисне, окислення ліпідів (ПОЛ) являє собою ланцюгову реакцію, що самопідтримується, продукти якої в помірних кількостях необхідні для здійснення таких функцій організму, як оновлення біологічних мембран, фагоцитоз, регуляція артеріального тиску і т.д., але у великих - шкідливі, оскільки порушують структуру клітинних мембран.

При вільнорадикальному окисленні арахідонової кислоти відбувається відрив водню в б-положенні по відношенню до подвійного зв'язку, що призводить до переміщення цього подвійного зв'язку з утворенням ДК.

Дієнові кон'югати відносяться до токсичних метаболітів, які надають шкідливу дію на ліпопротеїди, білки, ферменти та нуклеїнові кислоти.

Визначення дієнових кон'югатів має значну перевагу для оцінки ПОЛ, оскільки відображає ранню стадію окислення. Звичайним субстратом для визначення дієнових кон'югатів є будь-яка речовина, що містить поліненасичені жирні кислоти.

Дієнові кон'югати мають поглинання в УФ-області (л = 232 нм), коефіцієнт молярної екстинкції 2,2 10 5 см -1 М -1 . Пробопідготовка для аналізу дієнових кон'югатів обов'язково включає екстрагування ліпідів органічними розчинниками.

а) Екстракція дієнових кон'югатів із сироватки крові або тканини гептан-ізопропанольною сумішшю, з подальшим вимірюванням оптичної щільності в гептанавій або ізопропанольній фазі (л=232-234 нм).

б) При аналізі з використанням ВЕРХ, встановлено, що дієнові кон'югати, що утворюються в організмі людини, в основному представлені ізомерами лінолевої кислоти, октодека-9 цис-, транс-дієнової кислоти.

У цьому роботі ступінь дієнової кон'югації ненасичених вищих жирних кислот визначали за методикою І.Д. Сталевий (1977).

принцип. Процес пероксидного окислення поліненасичених жирних кислот супроводжується перегрупуванням подвійних зв'язків і виникненням системи сполучених дієнових структур, що мають максимум поглинання при 232-234 нм з плечем в ділянці 260-280 нм, відповідним сполученим кетодієнам.

Реактиви:

1) гептан

2) ізопропанол

3) етиловий спирт

Хід дослідження:

Для визначення дієнових кон'югатів 300 мг м'яса морської риби гомогенізували з 3 мл суміші гептан: ізопропан у співвідношенні 1:1 та центрифугували 10 хв при 6000 об/хв. До супернатанта додали 0,25 мл води. До 0,5 мл гептанової фази додали 2,5 мл спирту етилового. Оптичну густину вимірюють при л=233 нм проти контролю (гептан: ізопропан 1:1).

У ході ПОЛ на стадії утворення вільних радикалів у молекулах НЖК виникає система сполучених подвійних зв'язків, що супроводжується появою нового максимуму у спектрі поглинання при 233 нм.

Розрахунок ДК проводили за такою формулою:

ДК=Д233/(Е*с)

де Д233 – оптична щільність;

Е - коефіцієнт молярної екстинкції, 2,2 * 10 5 см -1 * М -1;

С – концентрація ліпідів, мг/мл.

Дієнові кон'югати виражали в мкмоль ДК/мг ліпідів.

3. Результати та обговорення

За вибраними методами визначення вітамінів А та Е та дієнових кон'югатів були проведені експерименти, в результаті яких представлені у малюнках.

Примітка* - Р< 0,05 по сравнению с мясом осьминога

Рисунок 3.1 - Вміст вітаміну А в морепродуктах

Керуючись даними малюнка 3.1, досліджувані зразки морепродуктів можна розташувати в наступній послідовності збільшення вмісту вітаміну А: восьминіг, кальмар, мідія, креветка. Вміст вітаміну А в м'ясі кальмару в 2,3 рази більший ніж у м'ясі восьминога, в м'ясі мідії вітаміну А міститься більше в 4,6 разів, а в м'ясі креветки в 6,9 разів більше.

Рисунок 3.2 - Вміст вітаміну А в морській рибі

За результатами дослідів на кількісний вміст вітаміну А в м'ясі морської риби видно, що в досліджуваних зразках міститься практично однакова кількість вітаміну А (рис. 3.2).

Примітка* - Р< 0,05 по сравнению с мясом осьминога

Рисунок 3.3- Вміст вітамінів Е в морепродуктах

Подібні документи

Методи збагачення продуктів харчування та готових страв вітамінами. Стабільність вітамінів у основних харчових продуктах. Визначення вітамінів у продуктах харчування, їхня безпека. Рекомендовані норми споживання вітамінів (рекомендована добова потреба).

реферат, доданий 14.06.2010


Характеристика окремих груп водорозчинних вітамінів, накопичення та вміст їх у рослинних продуктах. Синтез вітамінів залежно від екологічних умов, втрати вітамінів при збиранні та зберіганні продукції. Речовини вторинного синтезу.

реферат, доданий 05.01.2012


Поняття раціонального, збалансованого харчування та його основні засади. Визначення необхідної кількості жирів у раціоні. Хвороби пов'язані з неправильним харчуванням. Таблиця вмісту вітамінів у продуктах. Роздільне харчування: плюси та мінуси.

реферат, доданий 16.09.2011


Загальні поняття про макроелементи та їх впливом геть організм людини. Концентрація в продуктах харчування кальцію, магнію, калію, натрію, хлору, сірки та фосфору. Методи визначення якісного та кількісного вмісту макроелементів у харчових продуктах.

реферат, доданий 11.05.2011


Біологічна роль вітамінів, історія відкриття, класифікація. Хліб, молоко, молочні, кисломолочні, м'ясні та рибні продукти. Як зберегти вітамінну цінність цих продуктів. Роль вітамінів обміні речовин. Раціональне використання вітамінів.

презентація , доданий 26.05.2015


Їжа – різноманітні продукти харчування, що забезпечують існування людини. Будова, фізичні, хімічні властивості, вміст білків у продуктах харчування. Значення та харчова цінність жирів. Глюкоза, цукроза, крохмаль, целюлоза. Визначення вітамінів.

презентація , додано 18.03.2012


Формування класичної теорії збалансованого харчування. Роль білків, жирів та вуглеводів у живій системі. Мінеральний обмін організму: основні джерела кальцію, фосфору, заліза. Ферментативна (каталітична) та гормональна дія вітамінів.

практична робота , доданий 12.07.2011


Розгляд рекомендованих норм споживання харчових речовин. Обчислення енергетичної цінності сирокопченої ковбаси "Зерниста" та хліба житнього. Порівняння вмісту вітамінів, мінеральних речовин, білків, жирів та вуглеводів у цих продуктах харчування.

курсова робота , доданий 27.11.2014


Обчислення харчової цінності страви. Оцінка харчування населення. Зміна меню раціону та приведення його у відповідність до формули збалансованого харчування. Оцінка продуктового набору. Рекомендоване добове споживання вітамінів, білків, жирів та вуглеводів.

Досвід 1.Кількісне визначення вітаміну С.

Принцип способу. Метод заснований на здатності вітаміну С відновлювати 2,6-дихлорфеноліндофенол, який у кислому середовищі має червоне забарвлення, а при відновленні знебарвлюється; у лужному середовищі забарвлення синє. Для запобігання вітаміну С від руйнування досліджуваний розчин титрують у кислому середовищі лужним розчином 2,6-дихлорфеноліндофенолом до появи рожевого забарвлення.

Для розрахунку вмісту аскорбінової кислоти в таких продуктах, як капуста, картопля, хвоя, шипшина та ін, використовують формулу:

де Х– вміст аскорбінової кислоти у міліграмах на 100 г продукту; 0,088 – вміст аскорбінової кислоти, мг; А– результат титрування 0,001 н розчином 2,6-дихлорфеноліндофенолу, мл; Б -об'єм екстракту, взятий для титрування, мл; В –кількість продукту, взяте для аналізу, г; Г- загальна кількість екстракту, мл; 100 - перерахунок на 100 г продукту.

Висновок: записати результати досвіду та розрахункових даних.

Досвід 1.1. Визначення вмісту вітаміну С у капусті.

Порядок виконання.

Відважують 1 г капусти, розтирають у ступці з 2 мл 10% розчину хлористоводневої кислоти (HCl – Соляна кислота, хлористоводнева кислота, хлороводнева кислота), доливають 8 мл води та фільтрують. Відмірюють для титрування 2 мл фільтрату, додають 10 крапель 10% розчину хлористоводневої кислоти і титрують 2,6-дихлорфеноліндофенолом до рожевого забарвлення, що зберігається протягом 30 с, на цьому заснований принцип методуреакції. Обчислюють вміст аскорбінової кислоти 100 г капусти за формулою, зазначеною вище. У 100 г капусти міститься аскорбінової кислоти 25-60 мг, в 100 г шипшини 500-1500 мг, а хвої 200-400 мг.

Досвід 1.2. Визначення вмісту вітаміну С у картоплі.

Порядок виконання.

Відважують 5 г картоплі, розтирають у ступці з 20 краплями 10 % розчину хлористоводневої кислоти (щоб картопля не темніла). Поступово доливають дистильовану воду – 15 мл. Отриману масу зливають у склянку, обполіскують ступку водою, зливають її скляною паличкою в склянку і титрують 0,001 н. розчином 2,6-дихлорфеноліндофенолу до рожевого забарвлення, на цьому заснований принцип методуреакції. У 100 г картоплі міститься вітамін С 1-5 мг.

Висновок: записати результати досвіду.

Досвід 1.3. Визначення вмісту вітаміну С у сечі.

Визначення вмісту вітаміну С у сечі дає уявлення про запаси цього вітаміну в організмі, оскільки спостерігається відповідність між концентрацією вітаміну С у крові та кількістю цього вітаміну, що виділяється із сечею. Однак при гіповітаміноз С вміст аскорбінової кислоти в сечі не завжди знижено. Часто воно буває нормальним, незважаючи на велику нестачу цього вітаміну в тканинах та органах.

У здорових людей введення per os 100 мг вітаміну С швидко призводить до підвищення його концентрації у крові та сечі. При гіповітамінозі С тканини, які відчувають нестачу вітаміну, затримують прийнятий вітамін С і його концентрація в сечі не підвищується. Сеча здорової людини містить 20-30 мг вітаміну С або 113,55-170,33 мкмоль/добу. У дітей рівень цього вітаміну знижується при цингу, а також гострих та хронічних інфекційних захворюваннях.

Незамінні речовини їжі, що об'єднуються під загальною назвою «вітаміни», відносяться до різних класів хімічних сполук, що саме виключає можливість використання єдиного методу їх кількісного визначення. Усі відомі для вітамінів аналітичні методи засновані або на визначенні специфічних біологічних властивостей цих речовин (біологічні, мікробіологічні, ферментативні), або на використанні їх фізико-хімічних характеристик (флуоресцентні, хроматографічні та спектрофотометричні методи), або на здатності деяких вітамінів вступати в реакції з деякими реагентами із заснуванням пофарбованих сполук (колориметричні методи).

Незважаючи на досягнуті успіхи в галузі аналітичної та прикладної хімії методи визначення вітамінів у харчових продуктах ще трудомісткі та тривалі. Це зумовлено низкою об'єктивних причин, основні у тому числі наступні.

1.Визначення низки вітамінів часто ускладнюється тим, що багато з них знаходяться в природі у зв'язаному стані у вигляді комплексів з білками або пептидами, а також у вигляді фосфорних ефірів. Для кількісного визначення необхідно зруйнувати ці комплекси та виділити вітаміни у вільному вигляді, доступному для фізико-хімічного чи мікробіологічного аналізу. Це досягається зазвичай шляхом використання особливих умов обробки (кислотним, лужним чи ферментативним гідролізом, автоклавуванням).

2.Майже всі вітаміни - сполуки дуже нестійкі, легко піддаються окисленню, ізомеризації і повному руйнуванню під впливом високої температури, кисню повітря, світла та інших факторів. Слід дотримуватися запобіжних заходів: максимально скорочувати час на попередню підготовку продукту, уникати сильного нагріву та впливу світла, використовувати антиоксиданти та ін.

3.У харчових продуктах, як правило, доводиться мати справу з групою сполук, що мають велику хімічну подібність і одночасно різняться за біологічною активністю. Наприклад, вітамін Е включає 8 токоферолів, подібних за хімічними властивостями, але відрізняються за біологічною дією; група каротинів і каротиноїдних пігментів налічує до 80 сполук, з яких тільки 10 тією чи іншою мірою мають вітамінні властивості.

4. Вітаміни належать до різних класів органічних сполук. Тому їм можуть існувати загальні групові реакції та загальні методи дослідження.

5. Крім того, аналіз ускладнює присутність у досліджуваному зразку супутніх речовин, кількість яких може у багато разів перевищувати вміст вітаміну (наприклад, стерини і вітамін D). Для усунення можливих похибок щодо вітамінів у харчових продуктах зазвичай проводять ретельне очищення екстрактів від супутніх сполук і концентрування вітаміну. Для цього використовують різні прийоми: осадження речовин, що заважають аналізу, методи адсорбційної, іонобмінної або розподільної хроматографії, виборчу екстракцію визначається компонента та ін.

В останні роки для визначення вітамінів у харчових продуктах з успіхом стали використовувати метод ВЕРХ. Цей метод є найбільш перспективним, оскільки дозволяє одночасно розділяти, ідентифікувати та кількісно визначати різні вітаміни та їх біологічно активні форми, що дозволяє скоротити час аналізу.

Фізико-хімічні методи дослідження вітамінів Методи засновані на використанні фізико-хімічних характеристик вітамінів (їх здібності до флуоресценції, світлопоглинання, окисно-відновних реакцій та ін). Завдяки розвитку аналітичної хімії, приладобудування фізико-хімічні методи майже повністю витіснили тривалі та дорогі біологічні методи.

Визначення вітаміну С.Вітамінб С (аскорбінова кислота) може бути присутнім у харчових продуктах як у відновленій, так і в окисленій формі. Дегідроаскорбінова кислота (ДАК) може утворюватися при обробці та зберіганні харчових продуктів в результаті окислення, що викликає необхідність її визначення. При визначенні вітаміну С у харчових продуктах використовують різні методи: колориметричні, флуоресцентні, методи об'ємного аналізу, засновані на окисно-відновних властивостях АК та ВЕРХ.

Відповідальний момент кількісного визначення АК – приготування екстракту зразка. Вилучення має бути повним. Найкращим екстрагентом є 6% розчин метафосфорної кислоти, що має здатність осаджувати білки. Використовуються також оцтова, щавлева та соляна кислоти, а також їх суміші.

1. Для сумарного та роздільного визначення окисленої та відновленої форм АК часто використовують метод Рое із застосуванням 2,4-динітрофенілгідразинового реактиву. АК (гулонова кислота) під дією окислювачів переходить у ДАК, а потім у 2,3-дикетогулонову кислоту, яка утворює з 2,4-динітрофенілгідразином сполуки, що мають помаранчеве забарвлення. Сам 2,4-динітрофенілгідразин є підставою, нездатною існувати в аци-формі. Однак відповідні гідразони під впливом лугів перетворюються на інтенсивно забарвлені аци-солі. При визначенні вітаміну С цим методом заважає присутність відновників (глюкоза, фруктоза та ін.). Тому при великому вмісті цукрів у досліджуваному продукті використовують хроматографію, що ускладнює визначення.

Нітроформ Ацидоформ

2. Останнім часом визначення загального вмісту вітаміну З (сума АК і ДАК) отримав визнання дуже чутливий і точний флуоресцентний метод. ДАК конденсуючись з о-фенілендіаміном, утворює флуоресцентну сполуку хіноксалін, що володіє максимальною флуоресценцією при довжині хвилі збуджуючого світла 350 нм.

о-Фенілендіамін ДАК Хіноксалін

Інтенсивність флуоресценції хіноксаліну в нейтральному середовищі при кімнатній температурі прямо пропорційна концентрації ДАК. Для кількісного визначення АК її попередньо окислюють ДАК. Недоліком методу є досить дороге устаткування.

Методи, засновані на окисно-відновних властивостях АК.

3. З методів, заснованих на окисно-відновних властивостях АК, найбільше застосування знайшов метод титрування розчином 2,6-дихлорфеноліндофенолу, що має синє забарвлення. Продукт взаємодії АК із реактивом – безбарвний. Метод може бути використаний для аналізу всіх видів продуктів. При аналізі продуктів, що не містять природних пігментів, у картоплі молоці використовують візуальне титрування. У разі присутності природних барвників використовують потенціометричне титрування або метод індофенол-ксилолової екстракції. Останній метод заснований на кількісному знебарвленні 2,6-дихлорфеноліндофенолу аскорбіновою кислотою. Надлишок фарби екстрагується ксилолом та вимірюється оптична щільність екстракту при 500 нм.

У реакцію вступає лише АК. ДАК попередньо відновлюють цистеїном. Для відокремлення АК від відновників, присутніх у харчових продуктах, що зазнали теплової обробки, або екстракти, що тривало зберігалися, обробляють формальдегідом. Формальдегід залежно від рН середовища вибірково взаємодіє з АК та сторонніми домішками відновників (рН = 0). Зазначеним методом визначають суму АК та ДАК.

2,6-дихлорфеноліндофенол може бути використаний і для фотометричного визначення АК. Розчин реактиву має синє забарвлення, а продукт взаємодії з АК безбарвний, тобто. в результаті реакції зменшується інтенсивність синього забарвлення. Оптичну густину вимірюють при 605 нм (рН = 3,6).

4. Ще одним методом, заснованим на відновлювальних властивостях АК, є колориметричний метод, в якому використовується здатність АК відновлювати Fe(3+) до Fe(2+) та здатність останнього утворювати з 2,2'-дипіридилом солі, інтенсивно забарвлені в червоний колір. Реакцію проводять при рН 3,6 та температурі 70ºС. Оптичну густину розчину вимірюють при 510 нм.

5. Фотометричний метод, заснований на взаємодії АК із реактивом Фоліна. Реактив Фоліна є сумішшю фосфорномолібденової і фосфорновольфрамової кислот, тобто. це відомий метод, заснований на утворенні молібденових синів, що поглинають при 640-700 нм.

6. Для визначення вітаміну С у всіх харчових продуктах з успіхом може бути використаний високочутливий та специфічний метод ВЕРХ. Аналіз досить простий, лише за аналізі продуктів, багатих білками, необхідно попередньо видалити їх. Детектування здійснюється за флуоресценцією.

Крім названих методів визначення вітаміну С існує ще цілий ряд способів, наприклад, окислення хлоридом золота та утворення гідроксамових кислот, але ці методи не мають практичного значення.

Визначення тіаміну (1 ). У більшості природних продуктів тіамін зустрічається у вигляді дифосфорного ефіру кокарбоксилази. Остання, будучи активною групою низки ферментів вуглеводного обміну, перебуває у певних зв'язках із білком. Для кількісного визначення тіаміну необхідно зруйнувати комплекси та виділити досліджуваний вітамін у вільному вигляді, доступному для фізико-хімічного аналізу. З цією метою проводять кислотний гідроліз чи гідроліз під впливом ферментів. Об'єкти, багаті білком, обробляють протеолитическими ферментами (пепсином) серед соляної кислоти. Об'єкти з високим вмістом жиру (свинина, сири) для його видалення обробляють ефіром (тіамін практично нерозчинний в ефірі).

1. Для визначення тіаміну в харчових продуктах використовують, як правило, флуоресцентний метод, заснований на окисленні тіаміну в лужному середовищі гексаціаноферратом калію (3+) з утворенням тіохрому, що сильно флуорескує в ультрафіолетовому світлі. Інтенсивність його флуоресценції прямо пропорційна змісту тіаміну (довжина хвилі збуджуючого світла 365 нм, що випускається - 460-470 нм (синя флуоресценція)). При використанні цього методу виникають труднощі, пов'язані з тим, що в ряді об'єктів присутні флуоресцентні сполуки. Їх видаляють очищенням на колонках з іонообмінними смолами. При аналізі м'яса, молока, картоплі, пшеничного хліба та деяких овочів очищення не потрібне.

Тіамін Тіохром

2. Тіамін характеризується власним поглинанням в УФ області (240 нм – у водному розчині, 235 нм – в етанолі), а значить, він може бути визначений методом прямої спектрофотометрії.

3. Для одночасного визначення тіаміну та рибофлавіну використовують ВЕРХ.

Визначення рибофлавіну (2 ). У харчових продуктах рибофлавін присутній переважно у вигляді фосфорних ефірів, пов'язаних з білками, і, отже, не може бути визначений без попереднього протеолітичного розщеплення. Вільний рибофлавін у значній кількості міститься у молоці.

При визначенні рибофлавіну найбільшого поширення набули мікробіологічні та фізико-хімічні (флуоресцентні) методи аналізу. Мікробіологічний метод специфічний, високо чутливий та точний; застосовний до всіх продуктів, але тривалий і вимагає спеціальних умов.

Фізико-хімічний метод розроблений у двох варіантах, які відрізняються способом оцінки флуоресціюючих речовин:

· варіант прямої флуоресценції (визначення інтенсивності флуоресценції рибофлавіну) та

· Люміфлавіновий варіант.

1. Вільний рибофлавін і його фосфорні ефіри мають характерну жовто-зелену флуоресценцію при довжині хвилі збуджуючого світла 440-500 нм. На цій властивості заснований найбільш широко використовуваний метод флуоресцентного визначення рибофлавіну. Рибофлавін та його ефіри дають дуже подібні спектри флуоресценції з максимумом при 530 нм. Положення максимуму залежить від рН. Інтенсивність флуоресценції значно залежить від рН і від розчинника (по-різному для рибофлавіну та його ефірів), тому попередньо руйнують ефіри та аналізують вільний рибофлавін. Для цього використовують гідроліз із соляною та трихлороцтовою кислотами, автоклавування, обробку ферментними препаратами.

Інтенсивність жовто-зеленої флуоресценції рибофлавіну в УФ-світлі залежить не лише від його концентрації, а й від значення рН розчину. Максимальна інтенсивність досягається при рН = 6-7. Однак вимір проводять при рН від 3 до 5, тому що в цьому інтервалі інтенсивність флуоресценції визначається лише концентрацією рибофлавіну і не залежить від інших факторів - значення рН, концентрації солей, заліза, органічних домішок та ін.

Рибофлафін легко руйнується на світлі, визначення проводять у захищеному від світла місці і при рН не вище 7. Слід зазначити, що метод прямої флуоресценції не застосовується до продуктів з низьким вмістом рибофлавіну.

2. Люміфлавіновий варіант заснований на використанні властивості рибофлавіну при опроміненні в лужному середовищі, переходити в люміфлавін, інтенсивність флуоресценції якого вимірюють після вилучення його хлороформом (блакитна флуоресценція, 460-470 нм). Оскільки за певних умов в люміфлавін переходить 60-70% загального рибофлавіну, при проведенні аналізу необхідно дотримуватись постійних умов опромінення, однакових для випробуваного та стандартного розчину.

Рибофлавін Люміфлавін

Визначення вітаміну В 6 . Для визначення вітаміну можуть бути використані такі методи:

1. Пряма спектрофотометрія. Піридоксину гідрохлорид характеризується власним поглинанням при 292 нм (e=4,4·103) при рН=5.

2. Метод К'єльдаля. Визначення здійснюється за аміаком, що утворюється при окисленні вітаміну.

3. Фотометричний метод, заснований на реакції з 2,6-дихлорхінонхлоріміном (реактив Гіббса) при рН 8-10, в результаті якої утворюються індофеноли, що мають синє забарвлення. Індофеноли екстрагують метил-етилкетоном і вимірюють оптичну щільність екстракту при 660-690 нм (реакцію Гіббса дають феноли з вільним пара-положенням).

Індофенол

4. Флуоресцентний метод, заснований на тому, що при опроміненні піридоксину та піридоксаміну спостерігається синя, а піридоксаля – блакитна флуоресценція.

Визначення вітаміну В 9 .Визначення фолатів у харчових продуктах у тканинах та рідинах організму становить значні труднощі, т.к. у цих об'єктах вони зазвичай присутні у зв'язаній формі (у вигляді поліглютаматів); крім того, більшість форм чутлива до дії кисню повітря, світла та температури. Для захисту фолатів від гідролізу рекомендується вести гідроліз у присутності аскорбінової кислоти.

У харчових продуктах фолати можуть бути визначені фізичними, хімічними та мікробіологічними методами. Колориметричний метод заснований на розщепленні птероілглутамінової кислоти з утворенням п-амінобензойної кислоти та споріднених їй речовин і подальшому перетворенні їх на пофарбовані сполуки. Однак через недостатню специфічність цей метод застосовується в основному для аналізу фармацевтичних препаратів.

Для поділу, очищення та ідентифікації фолатів розроблені також методи хроматографії на колонках, папері та тонкому шарі адсорбенту.

Визначення вітаміну РР.У харчових продуктах нікотинова кислота та її амід знаходяться як у вільній, так і у зв'язаній формі, входячи до складу коферментів. Хімічні та мікробіологічні методи кількісного визначення ніацину припускають найбільш повне виділення та перетворення його пов'язаних форм, що входять до складу складної органічної речовини клітин, у вільну нікотинову кислоту. Пов'язані форми ніацину звільняють вплив розчинів кислот або гідрооксиду кальцію при нагріванні. Гідроліз з 1 М розчином сірчаної кислоти в автоклаві протягом 30 хвилин при тиску 0,1 МПа призводить до повного звільнення пов'язаних форм ніацину та перетворення нікотинаміду на нікотинову кислоту. Встановлено, що цей спосіб обробки дає менш забарвлені гідролізати та може бути використаний при аналізі м'ясних та рибних продуктів. Гідроліз з гідрооксидом кальцію переважний при визначенні ніацину в борошні, крупах, хлібобулочних виробах, сирах, харчових концентратах, овочах, ягодах та фруктах. Ca(OH) 2 утворює з цукрами та полісахаридами, пептидами та глікопептидами сполуки, майже повністю нерозчинні в охолоджених розчинах. В результаті гідролізат, отриманий при обробці Ca(OH) 2 містить менше речовин, що заважають хімічному визначенню, ніж кислотний гідролізат.

1. У основі хімічного методу визначення ніацину лежить реакція Кеніга, яка у дві стадії. Перша стадія – реакція взаємодії піридинового кільця нікотинової кислоти з бромціаном, друга – утворення пофарбованого похідного глутаконового альдегіду в результаті взаємодії з ароматичними амінами. (Одразу після додавання до нікотинової кислоти бромистого ціана з'являється жовте забарвлення глутаконового альдегіду. В результаті взаємодії його з ароматичними амінами, що вводяться в реакційну суміш, утворюються діаніли, які інтенсивно забарвлені в жовтий, помаранчевий або червоний колір, , сульфанілова кислота – жовтий) Реакцію Кеніга застосовують для фотометричного визначення піридину та його похідних з вільним a-положенням.Недоліком методу є його тривалість, оскільки швидкість реакцій мала.

Методи кількісного визначення вітамінів засновані на їх фізико-хімічних властивостях, таких як окиснювально-відновлювальні властивості, здатність флуоресціювати в УФ-світлі. Застосовують різні методи визначення: титрометричні, фотоколориметричні, спектрофотометричні, флуорометричні та ін.

Кількісне визначення вітаміну К

Вітамін К у листі кропиви визначають методом СФМ (таблиця 3).

Таблиця 3. Кількісне визначення вітаміну K у листі кропиви (авторський метод)

Кількісне визначення БАВ у плодах шипшини.

Аскорбінову кислотуможна визначати титрометричним методом, який ґрунтується на відновленні 2,6-дихлорфеноліндофенолу. Із цим же реактивом можна провести фотоколориметричне визначення аскорбінової кислоти. Для цього проводять екстракцію сировини 2% метафосфорною кислотою, додають розчин 2,6-дихлорфеноліндофенолу. Через 35 сік. проводять фотоколориметрування. Паралельно колориметрують контрольний розчин 2% метафосфорної кислоти з 2,6-дихлорфеноліндофенолом. Інтенсивність фарбування пропорційна кількості аскорбінової кислоти.

Кількісне визначення аскорбінової кислоти можна провести фотоколориметричним методом за допомогою гексаціанофериту калію. У кислому середовищі аскорбінова кислота відновлює гексаціаноферит калію до гексаціаноферату калію, який у присутності іонів заліза (Ш) утворює берлінську блакить, з подальшим її фотоколориметруванням.

Метод кількісного визначення аскорбінової кислоти (ГФ XI, вип. 2, стор. 294) заснований на її здатності окислюватися до дегідроформи розчином 2,6-дихлорфеноліндофеноляту і відновлювати останній до лейкоформи. Точка еквівалентності встановлюється появою рожевого фарбування, яке свідчить про відсутність відновника, тобто кислоти аскорбінової (2,6-дихлорфеноліндофенол має в лужному середовищі синє фарбування, в кислому - червоне, а при відновленні знебарвлюється):

1. Визначення вмісту аскорбінової кислоти. (Таблиця 4). З грубо подрібненої аналітичної проби плодів беруть навішення масою 20 г, поміщають у фарфорову ступку, де ретельно розтирають зі скляним порошком (близько 5 г), поступово додаючи 300 мл води, і настоюють 10 хв. Потім суміш розмішують та витяг фільтрують. У конічну колбу місткістю 100 мл вносять 1 мл отриманого фільтрату, 1 мл 2% розчину хлористоводневої кислоти, 13 мл води, перемішують і титрують з мікробюретки розчином 2,6-дихлорфеноліндофеноляту натрію (0,001 моль/л) до появлений протягом 30-60 с. Титрування продовжують трохи більше 2 хв. У разі інтенсивного фарбування фільтрату або високого вмісту в ньому аскорбінової кислоти [витрата розчину 2,6-дихлорфеноліндофенолятанатрію (0,001 моль/л) більше 2 мл], виявленого пробним титруванням, вихідне вилучення розбавляють водою в 2 рази або більше.

де 0,000088 - кількість аскорбінової кислоти, що відповідає 1 мл розчину 2,6-дихлорфеноліндофеноляту натрію (0,001 моль/л), в грамах; V - об'єм розчину 2,6-дихлорфеноліндофеноляту натрію (0,001 моль/л), що пішов на титрування, в мілілітрах; m – маса сировини в грамах; W - втрата в масі при висушуванні сировини у відсотках.

Примітки. Приготування розчину 2,6-дихлорфеноліндофеноляту натрію (0,001 моль/л): 0,22 г 2,6-дихлорфеноліндофеноляту натрію розчиняють у 500 мл свіжопрокип'яченої та охолодженої води при енергійному збовтуванні (для розчинення. Розчин фільтрують у мірну колбу місткістю 1 л і об'єм розчину доводять водою до мітки. Термін придатності розчину не більше 7 діб за умови зберігання у холодному, темному місці.

Встановлення титру. Декілька кристалів (3-5) аскорбінової кислоти розчиняють у 50 мл 2% розчину сірчаної кислоти; 5 мл отриманого розчину титрують з мікробюретки розчином 2,6-дихлорфеноліндофеноляту натрію до появи рожевого забарвлення, що зникає протягом 1-2 тижнів. Інші 5 мл цього ж розчину аскорбінової кислоти титрують розчином калію йодату (0,001 моль/л) у присутності декількох кристалів (близько 2 мг) калію йодиду та 2-3 краплі розчину крохмалю до появи блакитного фарбування. Поправочний коефіцієнт обчислюють за такою формулою:

де V - об'єм розчину калій йодату (0,001 моль/л), що пішов на титрування, у мілілітрах; V1-об'єм розчину 2,6-дихлорфеноліндофеноляту натрію, що пішов на титрування, в мілілітрах.

2. Визначення вмісту вільних органічних кислот. Аналітичну пробу сировини подрібнюють до розміру частинок, що проходять через сито з отворами діаметром 2 мм. 25 г подрібнених плодів шипшини поміщають у колбу місткістю 250 мл, заливають 200 мл води і витримують протягом 2 год на киплячій водяній бані, потім охолоджують, кількісно переносять у мірну колбу місткістю 250 мл, доводять об'єм вилучення водою до . Відбирають 10 мл вилучення, поміщають в колбу місткістю 500 мл, додають 200-300 мл свіжо-прокип'яченої води, 1 мл 1% спиртового розчину фенолфталеїну, 2 мл 0,1 % розчину метиленового синього і титрують розчином натрію їдкого л) до появи в піні лілово-червоного забарвлення.

де 0,0067-кількість яблучної кислоти, що відповідає 1 мл розчину їдкого натру (0,1 моль/л), в грамах; V - об'єм розчину їдкого натру (0,1 моль/л), що пішов на титрування, в мілілітрах; m – маса сировини в грамах; W - втрата в масі при висушуванні сировини у відсотках.

Таблиця 4. Кількісне визначення аскорбінової кислоти у плодах шипшини (фармакопейний метод)

Кількісне визначення хімічних речовин у квітках календули.

Каротиноїди визначають у лікарській сировині фотоколориметричним методом, заснованому на вимірюванні інтенсивності їхнього природного забарвлення. Розроблено спектрофотометричний метод визначення каротиноїдів. Каротиноїди з сировини екстрагують петролейним ефіром, потім хроматографують на платівці "Силуфол" у системі петролейний ефір-бензол-метанол (60:15:4), елююють хлороформом і спектрофотометрують при довжині хвилі 464 нм (-каротин) при 456 нм ).

• 1. Близько 1 г (точна навішування) подрібнених квіток нігтик, просіяних крізь сито з отворами розміром 1 мм, поміщають у конічну колбу місткістю 250 мл, додають 50 мл спирту 70 %, колбу закривають пробкою, зважують (з по0 ) і залишають на 1 год. Потім колбу з'єднують із зворотним холодильником, нагрівають, підтримуючи слабке кипіння протягом 2 год. Після охолодження колбу з вмістом знову закривають тією ж пробкою, зважують і втрату в масі заповнюють розчинником. Вміст колби ретельно збовтують і фільтрують через сухий паперовий фільтр, відкидаючи перші 20 мл, суху колбу місткістю 200 мл (розчин А).
• 1 мл розчину А поміщають у мірну колбу місткістю 25 мл, додають 5 мл розчину алюмінію хлориду, 0,1 мл оцтової кислоти і доводять об'єм розчину спиртом 96 % до мітки і залишають на 40 хвилин (розчин Б).

Через 40 хвилин вимірюють оптичну щільність випробуваного розчину Б і розчину стандартного зразка Б 1 на спектрофотометрі в максимумі поглинання при довжині хвилі (408 + 2) нм у кюветі з товщиною шару 10 мм, використовуючи розчини порівняння для випробуваного розчину та стандартного зразків.

де: А – оптична щільність випробуваного розчину;

А про - оптична щільність розчину стандартного зразка рутину;

а - навішування сировини, г;

а про - навішування стандартного зразка рутина, г;

W – вологість сировини, %;

Дозволяється проводити визначення вмісту суми флавоноїдів з використанням питомого показника поглинання рутину.