Лабораторна діагностика

УДК -078

Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

Н.М. Носік, В.М. Стаханова

Інститут вірусології ім. Д.І. Іванівського РАМН, Москва

Laboratory Diagnosis of Viral Infections

N.N. Nosik, V.M. Stachanova

Вступ

Розширення можливостей у лікуванні та профілактиці вірусних хвороб з використанням противірусних препаратів, імуномодуляторів та вакцин з різним механізмом дії потребує швидкої та точної лабораторної діагностики. Вузька специфічність деяких противірусних препаратів також потребує швидкої та високоспецифічної діагностики інфікуючого агента. З'явилася потреба у кількісних методах визначення вірусів для моніторингу противірусної терапії. Крім встановлення етіології захворювання, лабораторна діагностика має важливе значення в організації протиепідемічних заходів.

Рання діагностика перших випадків епідемічних інфекцій дозволяє своєчасно провести протиепідемічні заходи – карантин, госпіталізацію, вакцинацію та ін. Реалізація програм ліквідації інфекційних захворювань, наприклад натуральної віспи, показала, що з їх виконання зростає роль лабораторної діагностики. Істотну роль відіграє лабораторна діагностика у службі крові та акушерській практиці, наприклад, виявлення донорів, інфікованих вірусом імунодефіциту людини(ВІЛ), вірусом гепатиту В (HBV), діагностика краснухи та цитомегаловірусної інфекції у вагітних.

Діагностичні методи

У лабораторній діагностиці вірусних інфекцій є три основні підходи (табл. 1, табл. 2):

1) безпосереднє дослідження матеріалу на наявність вірусного антигену чи нуклеїнових кислот;

2) ізоляція та ідентифікація вірусу з клінічного матеріалу;

3) серологічна діагностика, що ґрунтується на встановленні значного приросту вірусних антитіл протягом хвороби.

За будь-якого обраного підходу до вірусної діагностики одним з найважливіших факторів є якість досліджуваного матеріалу. Так, наприклад, для прямого аналізу зразка або для ізоляції вірусу досліджуваний матеріал повинен бути отриманий на початку захворювання, коли збудник ще екскретується в відносно великих кількостях і не пов'язаний поки антитілами, а обсяг зразка повинен бути достатній для проведення прямого дослідження. Також важливим є вибір матеріалу відповідно до передбачуваного захворювання, тобто того матеріалу, в якому виходячи з патогенезу інфекції ймовірність присутності вірусу найбільша.

Не останню роль успішної діагностиці грає середовище, у яку береться матеріал, як і транспортується як і зберігається. Так, носоглоткові або ректальні мазки, вміст везикул поміщають у середовище, що містить білок, що запобігає швидкій втраті інфекційності вірусу (якщо планується його ізоляція), або у відповідний буфер (якщо планується робота з нуклеїновими кислотами).

Прямі методи діагностики клінічного матеріалу

Прямі методи – це методи, які дозволяють виявити вірус, вірусний антиген чи вірусну нуклеїнову кислоту(НК) безпосередньо у клінічному матеріалі, тобто є найшвидшими (2–24 год). Однак через ряд особливостей збудників прямі методи мають свої обмеження (можливість отримання хибнопозитивних і хибнонегативних результатів). Тому часто вимагають підтвердження непрямими методами.

Електронна мікроскопія (ЕМ). За допомогою цього можна виявити власне вірус. Для успішного визначення вірусу його концентрація в пробі повинна бути приблизно 110 6 частинок в 1 мл. Але оскільки концентрація збудника, як правило, у матеріалі від хворих незначна, пошук вірусу утруднений і вимагає попереднього його осадження за допомогою високошвидкісного центрифугування з подальшим негативним контрастуванням. Крім того, ЕМ не дозволяє типувати віруси, так як у багатьох немає морфологічних відмінностей всередині сімейства. Наприклад, віруси простого герпесу, цитомегалії або оперізувального герпесу морфологічно практично не відрізняються.

Одним з варіантів ЕМ, що використовується в діагностичних цілях, є імунна електронна мікроскопія(ІЕМ), при якій застосовуються специфічні антитіла до вірусів. Внаслідок взаємодії антитіл з вірусами утворюються комплекси, які після негативного контрастування легше виявляються.

ІЕМ дещо чутливіша, ніж ЕМ, і використовується в тих випадках, коли вірус не вдається культивувати in vitroнаприклад при пошуку збудників вірусних гепатитів.

Реакція імунофлюоресценції (РІФ). Метод заснований на використанні антитіл, пов'язаних з барвником, наприклад флюоресцеїнізотіоціанатом. РІФ широко застосовується для виявлення вірусних антигенів у матеріалі хворих та для швидкої діагностики.

У практиці застосовуються два варіанти РІФ: прямийі непрямий. У першому випадку застосовуються мічені барвником антитіла до вірусів, які наносяться на інфіковані клітини (мазок, культура клітин). Отже, реакція протікає одноетапно. Незручністю методу є необхідність мати великий набір кон'югованих специфічних сироваток до багатьох вірусів.

При непрямому варіанті РІФ на досліджуваний матеріал наноситься специфічна сироватка, антитіла якої зв'язуються з вірусним антигеном, що знаходиться в матеріалі, а потім нашаровується антивидова сироватка до гамма-глобулінів тварини, в якому готувалася специфічна імунна сироватка, наприклад антикролича. непрямого варіанта РІФ полягає у потребі лише одного виду мічених антитіл.

Метод РІФ широко застосовується для швидкого розшифрування етіології гострих респіраторних вірусних інфекцій під час аналізу мазків-відбитків зі слизової оболонки верхніх дихальних шляхів. Успішне застосування РІФ для прямої детекції вірусу в клінічному матеріалі можливе лише у разі вмісту в ньому досить великої кількості інфікованих клітин та незначної контамінації мікроорганізмами, які можуть давати неспецифічне свічення.

Імуноферментний аналіз (ІФА). Імуноферментні методи визначення вірусних антигенів у принципі подібні до РІФ, але ґрунтуються на міченні антитіл ферментами, а не барвниками. Найбільш широко використовується пероксидаза хрону та лужна фосфатаза, застосовують також -галактозидазу та -лактамази. Мічені антитіла зв'язуються з антигеном і такий комплекс виявляється при додаванні субстрату для ферменту, з яким кон'юговані антитіла. Кінцевий продукт реакції може бути у вигляді нерозчинного осаду, і тоді облік проводиться за допомогою звичайного світлового мікроскопа, або у вигляді розчинного продукту, який зазвичай пофарбований (або флюоресціювати або люмінесцувати) і реєструється інструментально.

Оскільки за допомогою ІФА можна вимірювати розчинні антигени, то не потрібно інтактних клітин у зразку і таким чином можуть використовуватися різні види клінічного матеріалу.

Інша важлива перевага методу ІФА – можливість кількісного визначення антигенів, що дозволяє застосовувати його для оцінки клінічного перебігу хвороби та ефективності хіміотерапії. ІФА, як і РІФ, може застосовуватися як у прямому, так і непрямому варіанті.

Твердофазний ІФА, що дає розчинний забарвлений продукт реакції, знайшов найбільше поширення. ІФА може бути використаний як визначення антигену (тоді на тверду фазу - дно лунки полістиролового планшета - наносяться антитіла), так і для визначення антитіл (тоді на тверду фазу наносяться антигени) .

Радіоімунний аналіз (РІА) . Метод ґрунтується на мітці антитіл радіоізотопами, що забезпечувало високу чутливість у визначенні вірусного антигену. Широке поширення метод отримав у 80-ті роки, особливо визначення маркерів HBV та інших некультивируемых вірусів. До недоліків методу належить необхідність працювати з радіоактивними речовинами та використання дорогого обладнання (гамма-лічильників).

Молекулярні методи. Спочатку класичним методом виявлення вірусного геному вважався високоспецифічний метод гібридизації ПК, але в даний час все ширше використовується виділення геномів вірусу за допомогою полімеразної ланцюгової реакції(ПЛР).

Молекулярна гібридизація нуклеїнових кислот.Метод заснований на гібридизації комплементарних ниток ДНК або РНК з утворенням двониткових структур та виявлення їх за допомогою мітки. З цією метою використовуються спеціальні ДНК- або РНК-зонди, мічені ізотопом (32 Р) або біотином, що виявляють комплементарні нитки ДНК або РНК. Існують кілька варіантів методу: – точкова гібридизація – виділену та денатуровану ПК наносять на фільтри і потім додають мічений зонд; індикація результатів - авторадіографія при використанні 32 Р або забарвлення - при авідін-біотині; – блот-гібридизація – метод виділення фрагментів ПК, нарізаних рестрикційними ендонуклеазами із сумарної ДНК та перенесених на нітроцелюлозні фільтри та тестовані міченими зондами; використовується як підтверджуючий тест при ВІЛ-інфекції; - Гібридизація in situ- дозволяє визначати ПК в інфікованих клітинах.

ПЛРґрунтується на принципі природної реплікації ДНК. Суть методу полягає у багаторазовому повторенні циклів синтезу (ампліфікації) вірусспецифічної послідовності ДНК за допомогою термостабільної Taq ДНК-полімерази та двох специфічних затравок – так званих праймерів.

Кожен цикл складається з трьох стадій із різним температурним режимом. У кожному циклі подвоюється кількість копій ділянки, що синтезується. Знову синтезовані фрагменти ДНК служать як матриця для синтезу нових ниток у наступному циклі ампліфікації, що дозволяє за 25-35 циклів напрацювати достатню кількість копій обраної ділянки ДНК для її визначення, як правило, за допомогою електрофорезу в агарозному гелі.

Метод високоспецифічний і дуже чутливий. Він дозволяє виявити кілька копій вірусної ДНК у досліджуваному матеріалі. В останні роки ПЛР знаходить все ширше застосування для діагностики та моніторингу вірусних інфекцій (віруси гепатитів, герпесу, цитомегалії, папіломи та ін.).

Розроблено варіант кількісної ПЛР, що дозволяє визначати кількість копій ампліфікованого сайту ДНК. Методика проведення складна, дорога і поки що недостатньо уніфікована для рутинного застосування.

Цитологічні методи в даний час мають обмежене діагностичне значення, але при ряді інфекцій, як і раніше, повинні застосовуватися. Досліджуються матеріали аутопсії, біопсії, мазки, які після відповідної обробки фарбуються та аналізуються під мікроскопом. При цитомегаловірусній інфекції, наприклад, у зрізах тканини або в сечі виявляються характерні гігантські клітини - "совине око", при сказі - включення в цитоплазмі клітин (тільця Бабеша - Негрі). У деяких випадках, наприклад, при диференціальній діагностиці хронічних гепатитів, має значення оцінка стану тканини печінки.

2. Серологічні реакції, що використовуються для діагностики вірусних інфекцій.

Серологічні методи, тобто методи вивчення антитіл та антигенів за допомогою реакцій антиген-антитіло, що визначаються у сироватці крові та інших рідинах, а також тканинах організму. Виявлення в сироватці крові хворого на антитіл проти антигенів збудника дозволяє поставити діагноз хвороби. Серологічні дослідження застосовують також для ідентифікації антигенів мікробів, різних біологічно активних речовин, груп крові, тканинних та пухлинних антигенів, імунних комплексів, рецепторів клітин та ін. е. сироваток крові гіперімунізованих тварин, що містять специфічні антитіла. Це звана серологічна ідентифікація мікроорганізмів. Особливості взаємодії антитіла з антигеном є основою діагностичних реакцій у лабораторіях. Реакція in vitro між антигеном та антитілом складається зі специфічної та неспецифічної фази. У специфічну фазу відбувається швидке специфічне зв'язування активного центру антитіла з антигеном детермінантою. Потім настає неспецифічна фаза - повільніша, яка проявляється видимими фізичними явищами, наприклад утворенням пластівців (феномен аглютинації) або преципітату у вигляді помутніння. Ця фаза потребує певних умов (електролітів, оптимального рН середовища). Зв'язування детермінанти антигену (епітопу) з активним центром Fab-фрагменту антитіл обумовлено ван-дер-ваальсовими силами, водневими зв'язками та гідрофобною взаємодією. Міцність і кількість антигену, що зв'язався, антитілами залежать від афінності, авидності антитіл та їх валентності.

3. Збудники малярії. Малярія –антропонозна інфекційна хвороба, що викликається декількома видами найпростіших роду Plasmodium, що передається комарами (Anopheles), що супроводжується лихоманкою, анемією, збільшенням печінки та селезінки. Збудники малярії відносяться до Protozoa, типу Apicomplexa, класу Sporozoa та видів Pl. vivax, Pl.malariae, Pl.falciparum, Pl.ovale.

Епідеміологія.Джерело інфекції – інвазована людина; переносник - самка комара роду Anopheles. Основний механізм передачі – трансмісивний через укус інвазованої самки комара.

Лікування та профілактика.Протималярійні препарати мають різну дію на безстатеві, статеві стадії плазмодіїв. До основних протималярійних препаратів відносять хінін, хлорохін, акрихін, примахін, хіноцид, бігумаль, хлоридин та ін. Профілактичні заходи спрямовані на джерело збудника (лікування хворих на малярію та носіїв) та знищення переносників збудника – комарів. Розробляються методи вакцинації з урахуванням антигенів, отриманих методом генетичної інженерії.

1.Класифікація антибіотиків за хімічною структурою, механізмом, спектром і типом дії.За хім. структ. 1клас-В-лактам - пеніцилін, цефалоспорин. 2 клас-макроліди-еритроміцин, азитроміцин. 3 клас-аміноглікозиди-стрептоміцин, канаміцин. 4 клас-тетрацикліни-окситетрациклін, доксициклін. 5 кл-поліпептиди-поліміксин. 6 кл-полієн-ністатин 7кл-анзаміцин-рифампіцин .

2. Залежно від механізму дії розрізняють п'ять груп антибіотиків: 1.гр антибіотики, що порушують синтез клітинної стінки-β-лактами. 2. гр антибіотики, що порушують молекулярну організацію і синтез клітинних мембран - поліміксини, полієни; 3. гр антибіотики, що порушують синтез білка -аміноглікозиди, тетрацикліни, макролі-ди, левоміцетин. , рифампіцин - синтез РНК; 5.гр антибіотики, що пригнічують синтез пуринів і амінокислот-сульфаніламіди. Кожна з цих груп включає дві підгрупи: антибіотики широкого та вузького спектра дії.1гр. Антибактеріальні антибіотики становлять найчисленнішу групу препаратів.

а) антибіотики широкого спектра дії впливають на представників усіх трьох відділів бактерій-аміноглікозиди, тетрацикліни та ін.

б) Антибіотики вузького спектра дії ефективні щодо невеликого кола бактерій-політ-міксини діють на грацилікутні, ванкоміцин впливає на грампозитивні бактерії.

2гр - протитуберкульозні, протилепрозні, протисифілітичні препарати.

3.Протигрибкові антибіотики.

а) Широкий спектр дії має амфотерицин В, ефективний при кандидозах, бластомікозах, аспергільозах; в той же час

б) антибіотиком вузького спектра дії. - ністатин, що діє на гриби роду Candida, є

4. Антипротозойні та антивірусні антибіотики налічують невелику кількість препаратів.

5.Протипухлинні антибіотики - препарати, що мають цитотоксичну дію. Більшість із них застосовують при багатьох видах пухлин-мітоміцин С. Дія антибіотиків на мікроорганізми пов'язана з їхньою здатністю пригнічувати ті чи інші біохімічні реакції, що відбуваються в мікробній клітині.

2. Теорії імунітету.1.Теорія імунітету Мечникова – фагоцитоз грає вирішальну роль антибактеріальному імунітеті. І.І.Мечников першим розглядав запалення як захисне, а чи не руйнівне явище. Вчений назвав захисні клітини, що діють таким чином, "пожираючими клітинами". Його молоді французькі колеги запропонували використати грецьке коріння того ж значення. І.І.Мечніков прийняв цей варіант, і з'явився термін "фагоцит". 2.Теорія імунітетуЕрліха - одна з перших теорій антитілоутворення, згідно з якою у клітин є антигенспецифічні рецептори, що вивільняються як антитіла під дією антигену. Протимікробні речовини крові Ерліх назвав "антитіло". П.Ерліх усвідомив, що і до контакту з конкретним мікробом в організмі вже є антитіла у вигляді, який він назвав "бічними ланцюгами" - це рецептори лімфоцитів антигенів. Потім Ерліх "застосував" до фармакології: у своїй теорії хіміотерапії він передбачав передіснування в організмі рецепторів для лікарських речовин. 1908 р. П.Ерліху вручили Нобелівську премію за гуморальну теорію імунітету. 3.Теорія імунітету Безрідкі- теорія, що пояснює захист організму від низки інфекційних хвороб виникненням специфічної місцевої несприйнятливості клітин до збудників. 4. Інструктивні теоріїімунітету - загальна назва теорій антитілоутворення, згідно з якими провідна роль в імунній відповіді відводиться антигену, що прямо бере участь в якості матриці при формуванні специфічної конфігурації антидетермінанти або виступає як фактор, спрямовано змінює біосинтез імуноглобулінів плазматичними клітинами.

3. Збудник ботулізму.рід Clostridium вид Clostridium botulinum викликає ботулізм - харчову інтоксикацію, що характеризується ураженням цнс. Хвороба виникає в результаті вживання харчових продуктів, що містять токсини С. Botulinum – грамлоложітельние палички із закругленими кінцями. має форму тенісної ракетки. Чи не утворюють капсулу. Рухливі. Облігатні анаероби. За антигенними властивостями яких поділяються на 7 сероварів. Ботулінічний екзотоксин - найсильніший з усіх біологічних отрут-надаючи нейротоксичну дію (смертельна доза для людини становить близько 0,3 мкг). Мікробіологічна діагностика. Виявлення та ідентифікація ботулінічного токсину у досліджуваному матеріалі за допомогою реакції зворотної непрямої гемаглютинації (РОНГА), реакції нейтралізації токсину антитоксином (антитоксичною сироваткою) на лабораторних тваринах. Бактеріологічний метод для виявлення збудника в досліджуваному матеріалі. Специфічна профілактика.Ботулінічні анатоксин А, В, Е входять до складу секстанатоксину, що застосовується за показаннями. Для екстреної пасивної профілактики можливе застосування протиботулінічних антитоксичних сироваток. Лікування.Використовують антитоксичні протиботулінічні гетерологічні сироватки та гомологічні імуноглобуліни.

Культивування. На кров'яному агарі утворює невеликі прозорі колонії, оточені зоною гемолізу. резистентність.Спори С. botulinum мають дуже високу резистентність до високих температур.

Епідеміологія.З ґрунту ботулінічна паличка потрапляє у харчові продукти, де розмножується та виділяє екзотоксин. Шлях передачі інфекції – харчовий. Найчастіше чинником передачі інфекції є консерви (грибні, овочеві, м'ясні, рибні). Від людини людині захворювання не передається. Патогенез.Ботулінічний токсин потрапляє з їжею до травного тракту. Стійкий до дії травних ферментів, токсин всмоктується через стінку кишечника в кров та зумовлює тривалу токсинемію. Токсин зв'язується нервовими клітинами та блокує передачу імпульсів через нервово-м'язові синапси. В результаті розвивається параліч м'язів гортані, глотки, дихальних м'язів, що призводить до порушення ковтання та дихання, спостерігаються зміни з боку органів зору. Клінічна картина.Інкубаційний період продовжується від 6-24 год до 2-6 днів. Чим коротший період інкубації, тим важче протікає хвороба. Зазвичай захворювання починається гостро, але температура тіла залишається нормальною. Можливі різні варіанти ботулізму – з величезним переважанням симптомів ураження травного тракту, розладів зору чи дихальної функції. У першому випадку захворювання починається з появи сухості у роті, нудоти, блювання, проносу. У другому – перші прояви хвороби пов'язані з порушеннями зору (хворий скаржиться на «туман» перед очима та двоїння). В результаті паралічу м'язів гортані з'являється осиплість, а потім голос зникає. Хворі можуть загинути від паралічу дихання. Захворювання може ускладнитися гострою пневмонією, токсичним міокардитом, сепсисом. Летальність за ботулізму становить 15-30%. Імунітет. не формується. Антитіла, що виробляються протягом захворювання, спрямовані проти певного серовару.

1.Методи визначення чутливості бактерій до антибіотиків. 1) Метод дифузії в агар.На агаризоване живильне середовище засівають мікроб, що досліджується, а потім вносять антибіотики. препарати вносять або спеціальні лунки в агарі, або поверхні посіву розкладають диски з антибіотиками («метод дисків»). Облік результатів проводять через добу за наявністю чи відсутністю зростання бактерій навколо лунок (дисків). 2)Методи визначення. мінімального рівня антибіотика,який дозволяє in vitro запобігти видимому зростанню мікробів у поживному середовищі або повністю його стерилізує. А)Визначення чутливості бактерій до антибіотиків методом дисків. Досліджувану бактеріальну культуру засівають газоном на живильний агар або середовище АГВ у чашці Петрі. В)На засіяну поверхню пінцетом поміщають на однаковій відстані один від одного паперові диски, які містять певні дози різних антибіотиків. Посіви інкубують при 37 С до наступного дня. По діаметру зон затримки зростання досліджуваної культури бактерій судять про її чутливість до антибіотиків.

Г)Визначення чутливості бактерій до антибіотиків методом серійних розведень. визначають мінімальну концентрацію антибіотика, що інгібує зростання досліджуваної культури бактерій.

Д) Оцінку результатів визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків проводять за спеціальною готовою таблицею, яка містить прикордонні значення діаметрів зон затримки росту для стійких, помірно стійких та чутливих штамів, а також значення МІК антибіотиків для стійких та чутливих штамів. 3)Визначення антибіотика в крові, сечі та інших рідинах організму людини.У штатив встановлюють два ряди пробірок. В одному з них готують розведення еталонного антибіотика, в іншому – досліджуваної рідини. Потім у кожну пробірку вносять завись тест-бактерій, приготовлену серед Гісса з глюкозою. При визначенні в досліджуваній рідині пеніциліну, тетрациклінів, еритроміцину як тест-бактерії використовують стандартний штам S. aureus, а при визначенні стрептоміцину – Е. coli. Після інкубування посівів при 37 °С протягом 18-20 год відзначають результати досвіду з помутніння середовища та його фарбування індикатором внаслідок розщеплення глюкози тест-бактеріями. Концентрація антибіотика визначається множенням найбільшого розведення досліджуваної рідини, що затримує зростання тест-бактерій, на мінімальну концентрацію еталонного антибіотика, що затримує зростання тих же тест-бактерій. Наприклад, якщо максимальне розведення досліджуваної рідини, що затримує зростання тест-бактерій, дорівнює 1:1024, а мінімальна концентрація еталонного антибіотика, що затримує зростання тих же тест-бактерій, 0,313 мкг/мл, то добуток 1024-0,313=320 мкг/мл антибіотика на 1 мл.

4) Визначення здатності S. aureus продукувати бета-лактамазу.У колбу з 0,5 мл добової бульйонної культури стандартного штаму стафілококу, чутливого до пеніциліну, вносять 20 мл розплавленого та охолодженого до 45 °С поживного агару, перемішують і виливають у чашку Петрі. Після застигання агару в центр чашки поверхню середовища поміщають диск, що містить пеніцилін. По радіусах диска петлею засівають досліджувані культури. Посіви інкубують при 37 С до наступного дня, після чого відзначають результати досвіду. Про здатність досліджуваних бактерій продукувати бета-лакта-мазу судять за наявністю зростання стандартного штаму стафілокока навколо тієї чи іншої досліджуваної культури (навколо диска).

2.Розлади імунної системи: первинні та вторинні імунодефіцити.Імунодефіцити - це порушення нормального імунного статусу, обумовлені дефектом одного або декількох механізмів імунної відповіді. Первинні, або вроджені імунодефіцити. Можливі комбіновані та селективні варіанти імунних розладів. Залежно від рівня та характеру порушень розрізняють гуморальні, клітинні та комбіновані імунодефіцити.

Причини: подвоєння хромосом, точкові мутації, дефект ферментів обміну нуклеїнових кислот, генетично обумовлені порушення мембран, пошкодження геному в ембріональному періоді та ін. Прояви- Недостатність фагоцитозу, системи комплементу, гуморального імунітету (В-системи), клітинного імунітету (Т-системи). Вторинні, або набуті, імунодефіцити Вторинні імунодефіцити на відміну від первинних розвиваються в осіб з імунною системою, що нормально функціонувала від народження. Вони формуються під впливом навколишнього середовища на рівні фенотипу та обумовлені порушенням функції імунної системи внаслідок різних захворювань або несприятливих впливів на організм. Уражатися Т-і В-системи імунітету, фактори неспецифічної резистентності, можливі також їх поєднання. Побічні імунодефіцити зустрічаються значно частіше, ніж первинні. Вторинні імунодефіцити піддаються імунокорекції,

Вторинні імунодефіцити можуть бути:

після перенесених інфекцій (особливо вірусних) та інвазій (протозойні та гельмінтози);

при опіковій хворобі;

при уремії; при пухлинах;

при порушенні обміну речовин та виснаженні;

при дисбіоз;

при тяжких травмах, великих хірургічних операціях, що особливо виконуються під загальним наркозом; при опроміненні, дії хімічних речовин;

при старінні,

медикаментозні, пов'язані із прийомом ліків.

За клінічнимперебігу виділяють: 1) компенсовану, - підвищеною сприйнятливістю організму до інфекційних агентів. 2) субкомпенсовану-хронізація інфекційних процесів.

3) декомпенсовану – генералізованих інфекцій, викликаних умовно-патогенними мікробами (УПМ) та злоякісними новоутвореннями.

3. Збудник амебіазу. Таксономія. Характеристики. Мікробіологічна діагностика Специфічне лікування. Амебіаз – інфекційна хвороба, що викликається Entamoeba histolytica, що супроводжується виразковим ураженням товстої кишки; можливе утворення абсцесів у різних органах; протікає хронічно. Protozoa, типу Sarcomastidophora, підтипу Sarcodina.

Морфологія та культивування.Збудник існує у двох стадіях розвитку: вегетативної та цистної. Вегетативна стадія має кілька форм (тканинна, велика вегетативна, просвітня та передцистна). Циста (стадія, що спочиває) має овальну форму, утворюється з вегетативних форм в кишечнику. Інфікування відбувається при попаданні цист збудника в кишечник, де їх утворюються кишкові вегетативні форми.

Резистентність. Поза організмом швидко (через 30 хв) гинуть тканинна та просвітна форми збудника. Цисти стійкі у навколишньому середовищі, зберігаючись у фекаліях та воді при температурі 20ºС протягом місяця. У продуктах харчування, на овочах та фруктах цисти зберігаються протягом кількох днів.

Механізм передачі –фекально-оральний. Зараження відбувається при занесенні цист із продуктами харчування, особливо овочами та фруктами, рідше – з водою, через предмети домашнього вжитку. Поширенню цист сприяють мухи та таргани.

Патогенез та клінічна картина.Цисти, що потрапили в кишечник, і форми амеб, що утворилися просвітню, можуть мешкати в ньому, не викликаючи захворювання. При зниженні резистентності організму амеби проникають у стінку кишечника і розмножуються. Розвивається кишковий амебіаз. Цьому процесу сприяють деякі представники мікрофлори кишківника. Уражаються з утворенням виразок верхній відділ товстої кишки, іноді пряма кишка. Відзначається частий рідкий стілець. У випорожненнях виявляють гнійні елементи та слиз. Може відбуватись перфорація кишкової стінки з розвитком гнійного перитоніту. Амеби зі струмом крові можуть потрапляти до печінки, легень, головного мозку – розвивається позакишковий амебіаз. Можлива поява шкірного амебіазу, що розвивається як результат вторинного процесу. На шкірі періанальної області, промежини та сідниць утворюються ерозії та малоболючі виразки. Імунітет. При амебіазі імунітет нестійкий. Лікування та профілактика. У лікуванні використовуються такі препарати: що діють на амеб, що у просвіті кишечника (похідні оксихинолина – хініофон, энтеросептол, мексаформ, інтестопан, і навіть сполуки миш'яку – амінарсон, осарсол та інших.); що діють на тканинні форми амеб (препарати еметину); діють на просвітні форми амеб і амеб, що у стінці кишки (тетрациклини); діють на амеб за будь-якої їх локалізації (похідні імідазолу – метронідазол). Профілактикаамебіаза пов'язана з виявленням та лікуванням цистовидільників та носіїв амеб.

Мікробіологічна діагностикаОсновний метод – мікроскопічне дослідження випорожнень хворого, а також вмісту абсцесів внутрішніх органів. Мазки забарвлюють розчином Люголв або гематоксиліном з метою ідентифікації цист та трофозоїтів. Серологічний метод: РІГА, ІФА, РЗК та ін. Найбільш високий титр антитіл виявляють при позакишковому амебіазі.

Серологічна діагностика, заснована на реакції антиген - антитіло, може бути використана для визначення як тих, так і інших, і відіграє роль у визначенні етіології вірусної інфекції навіть при негативних результатах виділення вірусу.

Успіх серологічної діагностики залежить від специфічності реакції та дотримання тимчасових умов взяття крові, необхідні синтезу організмом антитіл.

Найчастіше використовують парні сироватки крові, взяті з інтервалом у 2–3 тижні. Позитивною реакцією вважається принаймні при 4-кратному наростанні титру антитіл. Відомо, що більшість специфічних антитіл відносяться до класів IgG та IgM, які синтезуються у різний час інфекційного процесу. При цьому антитіла IgM відносяться до ранніх, і тести, що використовуються для їх визначення, застосовуються для ранньої діагностики (достатньо дослідити одну сироватку). Антитіла класу IgG синтезуються пізніше та тривало зберігаються.

Для типування вірусів застосовується РН, при групоспецифічній діагностиці, наприклад, аденовірусної інфекції, використовують реакцію зв'язування комплементу(РЗК). Найбільш уживаними є реакція гальмування гемаглютинації(РТГА), РСК, РІФ, пасивної реакціїі зворотної пасивної гемаглютинації(РПГА, РОПГА), різні варіанти ІФА, що практично повсюдно замінив рівний йому за чутливістю РІА.

РТГАвикористовується для діагностики захворювань, викликаних гемаглютинуючими вірусами. Вона заснована на зв'язуванні антитіл сироватки хворого доданого стандартного вірусу. Індикатором реакції є еритроцити, що аглютинуються вірусом (формування характерного "парасольки") за відсутності специфічних антитіл і осідають на дно неаглютинованими за їх наявності.

РСКє однією з традиційних серологічних реакцій та використовується для діагностики багатьох вірусних інфекцій. У реакції беруть участь дві системи: антитіла сироватки хворого + стандартний вірус та еритроцити барана + антитіла до них, а також відтитрований комплемент. За відповідністю антитіл і вірусу цей комплекс пов'язує комплемент і лізис баранячих еритроцитів не відбувається (позитивна реакція). При негативній РЗК комплемент сприяє лізису еритроцитів. Недоліком методу є недостатньо висока чутливість і труднощі стандартизації реагентів.

Для врахування значимості РСК також, як і РТГА, необхідно титрування парних сироваток, тобто взятих на початку захворювання та в період реконвалесценції.

РПДА– аглютинація сенсибілізованих вірусними антигенами еритроцитів (або полістиролових кульок) у присутності антитіл. На еритроцитах можуть бути сорбовані будь-які віруси, незалежно від наявності або відсутності у них гемагглютинуючої активності. У зв'язку з наявністю неспецифічних реакцій сироватки досліджуються у розведенні 1:10 і більше.

РНДА– аглютинація еритроцитів, сенсибілізованих специфічними антитілами у присутності вірусних антигенів. Найбільшого поширення РОПГА набула при виявленні HBs-антигена як у хворих, так і донорів крові.

ІФметод також, як ІФА, застосовується визначення антитіл в сироватці. Все більшого значення та поширення набуває ІФА для діагностичних цілей. На тверду фазу (дно лунок полістиролових планшетів або полістиролових кульок) сорбується вірусний антиген. При додаванні відповідних антитіл, що знаходяться в сироватці, відбувається їхнє зв'язування з сорбованими антигенами. Наявність шуканих антитіл виявляється за допомогою анти-антитіл (наприклад, людських), кон'югованих з ферментом (пероксидазою). Додавання субстрату та реакція субстрат – фермент дають забарвлення. ІФА може бути використана і для визначення антигенів. В цьому випадку на тверду фазу сорбуються антитіла.

Моноклональні антитіла. Великий прогрес у діагностиці вірусних інфекцій досягнуто в останнє десятиліття, коли з розвитком генно-інженерних досліджень було розроблено систему отримання моноклональних антитіл. Тим самим було різко підвищено специфічність та чутливість діагностичних методів визначення вірусних антигенів. Вузька специфічність моноклонів, що представляють невелику частку вірусних білків, які можуть бути присутніми в клінічному матеріалі, успішно долається використанням кількох моноклональних антитіл до різних вірусних детермінантів.

№ 1Серологічні реакції, що використовуються для діагностики вірусні інфекції.

Імунні реакції використовують при діагностичних та імунологічних дослідженнях у хворих та здорових людей. З цією метою застосовують серологічні методи, Т. е. методи вивчення антитіл і антигенів за допомогою реакцій антиген-антитіло, що визначаються в сироватці крові та інших рідинах, а також тканинах організму.

Виявлення в сироватці крові хворого на антитіл проти антигенів збудника дозволяє поставити діагноз хвороби. Серологічні дослідження застосовують також для ідентифікації антигенів мікробів, різних біологічно активних речовин, груп крові, тканинних та пухлинних антигенів, імунних комплексів, рецепторів клітин та ін.

При виділенні мікроба від хворого проводять ідентифікацію збудника шляхом вивчення його антигенних властивостей за допомогою імунних діагностичних сироваток, тобто сироваток крові гіперімунізованих тварин, що містять специфічні антитіла. Це звана серологічна ідентифікація мікроорганізмів.

У мікробіології та імунології широко застосовуються реакції аглютинації, преципітації, нейтралізації, реакції за участю комплементу, з використанням мічених антитіл та антигенів (радіоімунологічний, імуноферментний, імунофлюоресцентний методи). Перелічені реакції розрізняються за ефектом, що реєструється, і техніці постановки, проте, всі вони засновані на реакції взаємодії антигену з антитілом і застосовуються для виявлення як антитіл, так і антигенів. Реакції імунітету характеризуються високою чутливістю та специфічністю.

Особливості взаємодії антитіла з антигеном є основою діагностичних реакцій у лабораторіях. Реакція in vitro між антигеном та антитілом складається зі специфічної та неспецифічної фази. У специфічну фазу відбувається швидке специфічне зв'язування активного центру антитіла з антигеном детермінантою. Потім настає неспецифічна фаза - повільніша, яка проявляється видимими фізичними явищами, наприклад утворенням пластівців (феномен аглютинації) або преципітату у вигляді помутніння. Ця фаза потребує певних умов (електролітів, оптимального рН середовища).

Зв'язування детермінанти антигену (епітопу) з активним центром Fab-фрагменту антитіл обумовлено ван-дер-ваальсовими силами, водневими зв'язками та гідрофобною взаємодією. Міцність і кількість антигену, що зв'язався, антитілами залежать від афінності, авидності антитіл та їх валентності.

№2 Збудники лейшманіозів. Таксономія. Характеристики. Мікробіологічна діагностика Лікування.

Таксономія:Тип Sarcomastigophorae, підтип Mastigophora - джгутикові, клас Zoomastigophora, загін Kinetoplastida, рід Leishmania.

Культивування: живильне середовище NNN, що містить агар з дефібринованою кров'ю кролика. Лейшманії також ростуть на хоріон-алантоїсній оболонці курячого ембріона та в культурах клітин.

Епідеміологія: у країнах теплого клімату. Механізм передачі збудників – трансмісивний, через укус переносників – москітів. Основні джерела збудників: при шкірному антропонозному лейшманіозі – люди; при шкірному зоонозному лейшманіозі – гризуни; при вісцеральних лейшманіозах – люди; при шкірно-слизовому лейшманіозі - гризуни, дикі та домашні тварини.

Патогенез та клініка.Розрізняють два збудники шкірного лейшманіозу: L. tropica – збудник антропонозного лейшманіозу та L. major – збудник зоонозного шкірного лейшманіозу.

Антропонозний шкірний лейшманіоз характеризується тривалим інкубаційним періодом – кілька місяців. На місці укусу москітом з'являється горбок, який збільшується і через 3 місяці виразкується. Виразки частіше розташовуються на обличчі та верхніх кінцівках, рубці до кінця року. Зоонозний шкірний лейшманіоз (рано виразковий лейшманіоз, пендинська виразка, сільська форма) протікає більш гостро. Інкубаційний період становить 2-4 тижні. Виразки, що мокнуть, частіше локалізуються на нижніх кінцівках. Шкірно-слизовий лейшманіоз викликають лейшманії комплексу L. braziliensis; розвивається гранулематозне та виразкове ураження шкіри носа, слизових оболонок рота та гортані. Антрапонозний вісцеральний лейшманіоз викликається лейшманіями комплексу L. donovani; у хворих уражаються печінка, селезінка, лімфовузли, кістковий мозок та травний тракт.

Імунітет:стійкий довічний

У мазках (з горбків, вмісту виразок, пунктатів з органів), пофарбованих по Романівському-Гімзі, виявляють внутрішньоклітинно розташовані дрібні, овальної форми лейшманії (амастиготи). Для виділення чистої культури збудника роблять сівбу на середу NNN: інкубація 3 тижні. Серологічні методи недостатньо специфічні. Можливе застосування РІФ, ІФА.

Шкірно-алергічний тест на ГЗТ до лейшманіну застосовують при епідеміологічних дослідженнях лейшманіозу.

Лікування:При вісцеральному лейшманіозі застосовують препарати сурми та діамідини (пентамідин). При шкірному лейшманіозі – акрихін, амфотерицин.

Профілактика:знищують хворих тварин, проводять боротьбу з гризунами та москітами. Імунопрофілактику шкірного лейшманіозу здійснюють щепленням живої культури L. major.

КВИТОК №28

№ 1Імуноглобуліни, структура та функції.

Природа імуноглобулінів. У відповідь на введення антигену імунна система виробляє антитіла - білки, здатні специфічно з'єднуватися з антигеном, що викликав їхнє утворення, і таким чином брати участь в імунологічних реакціях. Належать антитіла до?-глобулінів, тобто найменш рухомий в електричному полі фракції білків сироватки крові. В організмі?-глобуліни виробляються особливими клітинами – плазмоцитами. ?-глобуліни, що несуть функції антитіл, отримали назву імуноглобулінів і позначаються символом Ig. Отже, антитіла - це імуноглобуліни, що виробляються у відповідь на введення антигену і здатні специфічно взаємодіяти з цим же антигеном.

Опції. Первинна функція полягає у взаємодії їх активних центрів з комплементарними ним детермінантами антигенів. Вторинна функція полягає у їх здібності:

Зв'язувати антиген з метою його нейтралізації та елімінації з організму, тобто брати участь у формуванні захисту від антигену;

брати участь у розпізнаванні «чужого» антигену;

Забезпечувати кооперацію імунокомпетентних клітин (макрофагів, Т- та В-лімфоцитів);

Участь у різних формах імунної відповіді (фагоцитоз, кілерна функція, ГНТ, ГЗТ, імунологічна толерантність, імунологічна пам'ять).

Структура антитіл. Білки імуноглобулінів за хімічним складом відносяться до глікопротеїдів, оскільки складаються з протеїну та Сахарів; побудовано з 18 амінокислот. Мають видові відмінності, пов'язані головним чином набором амінокислот. Їхні молекули мають циліндричну форму, вони видно в електронному мікроскопі. До 80% імуноглобулінів мають константу седиментації 7S; стійкі до слабких кислот, лугів, нагрівання до 60 °С. Виділити імуноглобуліни із сироватки крові можна фізичними та хімічними методами (електрофорез, ізоелектричне осадження спиртом та кислотами, висолювання, афінна хроматографія та ін.). Ці методи використовують у виробництві для приготування імунобіологічних препаратів.

Імуноглобуліни за структурою, антигенними та імунобіологічними властивостями поділяються на п'ять класів: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD. Імуноглобуліни М, G, А мають підкласи. Наприклад, IgG має чотири підкласи (IgG, IgG 2 , IgG 3 , IgG 4). Всі класи та підкласи розрізняються за амінокислотною послідовністю.

Молекули імуноглобулінів усіх п'яти класів складаються з поліпептидних ланцюгів: двох однакових важких ланцюгів Н та двох однакових легких ланцюгів - L, з'єднаних між собою дисульфідними містками. Відповідно до кожного класу імуноглобулінів, тобто. М, G, A, E, D, розрізняють п'ять типів важких кіл: ? (Мю), ? (Гама), ? (Альфа), ? (епсілон) та? (дельта), що різняться за антигенністю. Легкі ланцюги всіх п'яти класів є загальними та бувають двох типів: ? (Каппа) і? (ламбда); L-ланцюги імуноглобулінів різних класів можуть вступати в з'єднання (рекомбінуватись) як з гомологічними, так і з гетерологічними Н-ланцюгами. Однак в одній і тій же молекулі можуть бути лише ідентичні L-ланцюги (? або?). Як в Н-, так і в L-ланцюгах є варіабельна - V область, в якій послідовність амінокислот непостійна, і константна - З область з постійним набором амінокислот. У легких і важких ланцюгах розрізняють NH 2 - та СООН-кінцеві групи.

Під час обробки? -глобуліну меркаптоетанолом руйнуються дисульфідні зв'язки та молекула імуноглобуліну розпадається на окремі ланцюги поліпептидів. При дії протеолітичним ферментом папаїном імуноглобулін розщеплюється на три фрагменти: два не кристалізуються, що містять детермінантні групи до антигену та названі Fab-фрагментами I та II та один кристалізуючий Fc-фрагмент. FabI- і FabII-фрагменти подібні за властивостями та амінокислотним складом і відрізняються від Fc-фрагменту; Fab- та Fc-фрагменти є компактними утвореннями, з'єднаними між собою гнучкими ділянками Н-ланцюга, завдяки чому молекули імуноглобуліну мають гнучку структуру.

Як Н-ланцюга, так і L-ланцюга мають окремі, лінійно пов'язані компактні ділянки, названі доменами; в Н-ланцюга їх по 4, а в L-ланцюга - по 2.

Активні центри, або детермінанти, що формуються у V-областях, займають приблизно 2 % поверхні молекули імуноглобуліну. У кожній молекулі є дві детермінанти, що відносяться до гіперваріабельних ділянок Н-і L-ланцюгів, тобто кожна молекула імуноглобуліну може зв'язати дві молекули антигену. Тому антитіла є двовалентними.

Типовою структурою молекули імуноглобуліну є IgG. Інші класи імуноглобулінів відрізняються від IgG додатковими елементами організації їхньої молекули.

У відповідь на запровадження будь-якого антигену можуть вироблятися антитіла всіх п'яти класів. Зазвичай спочатку виробляється IgM, потім IgG, інші - трохи пізніше.

№2 Збудник хламідіозів. Таксономія. Характеристики. Мікробіологічна діагностика Лікування.

Таксономія:порядок Chlamydiales, сімейство Chlamydaceae, рід Chlamydia. Рід представлений видами С.trachomatis, C.psittaci, C.pneumoniae.

Хвороби, що викликаються хламідіями, називають хламідіозами. Захворювання, що спричиняються C. trachomatis u C. pneumoniae, - антропонози. Орнітоз, збудником якого є С. psittaci, – зооантропонозна інфекція.

Морфологія хламідій: дрібні, грам «-» бактерії, кулястої форми. Не утворюють суперечку, немає джгутиків та капсули. Клітинна стінка: 2-х шарова мембрана. Мають гліколіпіди. За Грамом – червоний колір. Основний метод забарвлення – за Романовським – Гімзе.

2 форми існування: елементарні тільця (неактивні інфекційні частки поза клітиною); ретикулярні тільця (всередині клітин, вегетативна форма).

Культивування:Можна розмножувати лише у живих клітинах. У жовтковому мішку курячих ембріонів, що розвиваються, організмі чутливих тварин і в культурі клітин

Ферментативна активність: невелика. Ферментують піровиноградну кислоту, синтезують ліпіди. Не здатні синтезувати високоенергетичні сполуки.

Антигенна структура: Антигени трьох типів: родоспецифічний термостабільний ліпополісахарид (у клітинній стінці). Виявляють за допомогою РЗК; видоспецифічний антиген білкової природи (у зовнішній мембрані). Виявляють за допомогою РІФ; варіантоспецифічний антиген білкової природи.

Чинники патогенності.З білками зовнішньої мембрани хламідій пов'язані їх адгезивні властивості. Ці адгезини виявляють лише в елементарних тілець. Хламідії утворюють ендотоксин. У деяких хламідій виявлено білок теплового шоку, здатний викликати аутоімунні реакції.

Резистентність. Висока до різних факторів довкілля. Стійкі до низьких температур, висушування. Чутливі до нагрівання.

С. trachomatis - збудник захворювань сечостатевої системи, очей та респіраторного тракту людини.

Трахома - хронічне інфекційне захворювання, що характеризується ураженням кон'юнктиви та рогівки очей. Антропоноз. Передається контактно-побутовим шляхом.

Патогенез:вражає слизову оболонку очей. Він проникає в епітелій кон'юнктиви та рогівки, де розмножується, руйнуючи клітини. Розвивається фолікулярний кератокон'юнктивіт.

Діагностика:дослідження зіскрібка з кон'юнктиви. У уражених клітинах при фарбуванні по Романівському-Гімзі виявляють цитоплазматичні включення фіолетового кольору, розташовані біля ядра - тільця Провачека. Для виявлення специфічного хламідійного антигену в уражених клітинах застосовують також РІФ та ІФА. Іноді вдаються до культивування хламідій трахоми на курячих ембріонах чи культурі клітин.

Лікування:антибіотики (тетрациклін) та імуностимулятори (інтерферон).

Профілактика:Неспецифічна.

Урогенітальний хламідіоз – захворювання, що передається статевим шляхом. Це гостре/хронічне інфекційне захворювання, яке характеризується переважним ураженням сечостатевого тракту.

Зараження людини відбувається через слизові оболонки статевих шляхів. Основний механізм зараження – контактний, шлях передачі – статевий.

Імунітет: клітинний, із сироваткою інфікованих – специфічні антитіла. Після перенесеного захворювання – не формується.

Діагностика: При захворюваннях очей застосовують бактеріоскопічний метод - у зіскрібках з епітелію кон'юнктиви виявляють внутрішньоклітинні включення. Для виявлення антигену хламідії у уражених клітинах застосовують РІФ. При ураженні сечостатевого тракту може бути застосований біологічний метод, що ґрунтується на зараженні досліджуваним матеріалом (зіскоби епітелію з уретри, піхви) культури клітин.

Постановка РІФ, ІФА дозволяють виявити антигени хламідії у досліджуваному матеріалі. Серологічний метод – для виявлення IgM проти С. trachomatis при діагностиці пневмонії новонароджених.

Лікування.антибіотики (азитроміцин із групи макролідів), імуномодулятори, еубіотики.

Профілактика. Тільки неспецифічна (лікування хворих), дотримання особистої гігієни.

Венерична лімфогранулема – захворювання, що передається статевим шляхом, характеризується ураженням статевих органів та регіонарних лімфовузлів. Механізм зараження – контактний, шлях передачі – статевий.

Імунітет:стійкий, клітинний та гуморальний імунітет.

Діагностика:Матеріал для дослідження – гній, біоптат із уражених лімфовузлів, сироватка крові. Бактеріоскопічний метод, біологічний (культивування в жовтковому мішку курячого ембріона), серологічний (РСК із парними сироватками позитивна) та алергологічний (внутрішньошкірна проба з алергеном хламідії) методи.

Лікування. Антибіотики - макроліди та тетрацикліни.

Профілактика: Неспецифічна.

С. pneumoniae - збудник респіраторного хламідіозу, що викликає гострі та хронічні бронхіти та пневмонії. Антропоноз. Зараження – повітряно-краплинним шляхом. Попадають у легені через верхні дихальні шляхи. Викликають запалення.

Діагностика:постановка РЗК для виявлення специфічних антитіл (серологічний метод). При первинному зараженні враховують виявлення IgM. Застосовують також РІФ для виявлення хламідійного антигену та ПЛР.

Лікування:Проводять за допомогою антибіотиків (тетрацикліни та макроліди).

Профілактика: Неспецифічна.

С. psittaci – збудник орнітозу – гострого інфекційного захворювання, яке характеризується ураженням легень, нервової системи та паренхіматозних органів (печінки, селезінки) та інтоксикацією.

Зооантропоноз. Джерела інфекції – птахи. Механізм зараження - аерогенний, шлях передачі - повітряно-краплинний. Збудник – через слиз. оболонки дихати. шляхів, епітелій бронхів, альвеол, розмножується, запалення.

Діагностика:Матеріал для дослідження – кров, мокрота хворого, сироватка крові для серологічного дослідження.

Застосовують біологічний метод - культивування хламідій у жовтковому мішку курячого ембріона, культурі клітин. Серологічний метод. Застосовують РЗК, РПГА, ІФА, використовуючи парні сироватки крові хворого. Внутрішньошкірна алергічна проба з орнітином.

Лікування: антибіотики (тетрацикліни, макроліди).

КВИТОК №29

№1 Збудник дифтерії. Таксономія та характеристика. Умовно – патогенні корінебактерії. Мікробіологічна діагностика Виявлення анатоксичного імунітету. Специфічна профілактика та лікування.

Дифтерія – гостра інфекційна хвороба, що характеризується фібринозним запаленням у зіві, гортані, рідше в інших органах та явищами інтоксикації. Збудником її є Corynebacterium diphtheriae.

Таксономія. Corynebacterium належить до відділу Firmicutes, роду Corynebacterium.

Морфологічні та тинкторіальні властивості.Збудник дифтерії характеризується поліморфізмом: тонкі, злегка вигнуті палички (найбільш поширені) зустрічаються кокоподібні і розгалужені форми. Бактерії нерідко розташовуються під кутом одна до одної. Вони не утворюють суперечки, не мають джгутиків, у багатьох штамів виявляють мікрокапсулу. Характерна риса – наявність на кінцях палички зерен волютину (обумовлює булавоподібну форму). Збудник дифтерії за Грамом забарвлюється позитивно.

Культуральні характеристики.Факультативний анаероб, оптим. Температура. Мікроб росте на спеціальних живильних середовищах, наприклад на середовищі Клауберга (кров'яно-телуритовий агар), на якій дифтерійна паличка дає колонії 3 типів: а) великі, сірі, з нерівними краями, радіальною смугастістю, що нагадують маргаритки; б) дрібні, чорні, опуклі, з рівними краями; в) схожі на перші та другі.

Залежно від культуральних та ферментативних властивостей розрізняють 3 біологічні варіанти C.diphtheriae: gravis, mitis та проміжний intermedius.

Ферментативна активність.Висока. Ферментують глк та мальтозу в утворенням кислоти, не розкладають сахарозу, лактозу та маніт. Чи не продукують уреазу і не утворюють індол. Продукує фермент цистиназу, що розщеплює цистеїн до H 2 S. Утворює каталазу, сукцинатдегідрогеназу.

Антигенні властивості.О-антигени – термостабільні полісахаридні, розташовані у глибині клітинної стінки. К-антигени – поверхневі, термолабільні, сіруватоспецифічні. З допомогою сироваток до К-антигена С.diph. поділяють на серовари(58).

Чинники патогенності.Екзотоксин, що порушує синтез білка і вражає у зв'язку з цим клітини міокарда, надниркових залоз, нирок, нервових гангліїв. Здатність виробляти екзотоксин обумовлена ​​наявністю у клітині профагу, що несе tох-ген, відповідальний за утворення токсину. Ферменти агресії – гіалуронідазу, нейрамінідазу. До факторів патогенності відноситься мікрокапсула.

резистентність.Стійкий до висушування, впливу низьких температур, тому протягом кількох днів може зберігатися на предметах у воді.

Епідеміологія.Джерело дифтерії – хворі люди Зараження відбувається частіше через дихальні шляхи. Основний шлях передачі повітряно-краплинний, можливий контактний шлях - через білизну, посуд.

Патогенез.Вхідні ворота інфекції – слизові оболонки зіва, носа, дихальних шляхів, очей, статевих органів, ранова поверхня. На місці вхідних воріт спостерігається фібринозне запалення, утворюється характерна плівка, яка важко відокремлюється від тканин, що підлягають. Бактерії виділяють екзотоксин, що потрапляє в кров, – розвивається токсинемія. Токсин уражає міокард, нирки, надниркові залози, нервову систему.

клініка.Існують різні за локалізації форми дифтерії: дифтерія зіва, яка спостерігається у 85-90% випадків, дифтерія носа, гортані, очей, зовнішніх статевих органів, шкіри, ран. Інкубаційний період становить від 2 до 10 днів. Захворювання починається із підвищення температури тіла, болю при ковтанні, появи плівки на мигдаликах, збільшення лімфатичних вузлів. Набряк гортані, розвивається дифтерійний круп, який може призвести до асфіксії та смерті. Іншими важкими ускладненнями, які також можуть спричинити смерть, є токсичний міокардит, параліч дихальних м'язів.

Імунітет.Після захворювання – стійкий, напружений антитоксичний імунітет. Особливе значення - утворення АТ до фрагмента В. Вони нейтралізують дифтерійний гістотоксин, запобігаючи прикріпленню останнього до клітини. Антибактеріальний імунітет - ненатиснений, сіруватоспецифічний

Мікробіологічна діагностика. За допомогою тампона у хворого беруть плівку та слиз із зіва і носа. Для встановлення попереднього діагнозу можливе застосування бактеріоскопічного методу. Основний метод діагностики - бактеріологічний: посів на середовище Клаубера II (кров'яно-телуритовий агар), на щільне сироваткове середовище для виявлення продукції цистинази, на середовищі Гісса, на середовище для визначення токсигенності збудника. Внутрішньовидова ідентифікація полягає у визначенні біо-і серовару. Для прискореного виявлення дифтерійного токсину застосовують: РНГА(реакція непрямої геммаглютинації) з антитільним еритроцитарним діагностикумом, реакцію нейтралізації антитіл (про наявність токсину судять за ефектом запобігання гемаггютинації); РІА (радіоімунний) та ІФА (імунноферментний аналіз).

Лікування.Основний метод терапії – негайне введення специфічної антитоксичної протидифтерійної кінської рідкої сироватки. Імуноглобулін людини протидифтерійний для внутрішньовенного введення.

Асоційовані вакцини: АКДС (абсорбована коклюшно-правцева вакцина), АДС (абсорбований дифтерійно-правцевий анатоксин).

№ 2Класи імуноглобулінів, їх характеристика.

Імуноглобуліни за структурою, антигенними та імунобіологічними властивостями поділяються на п'ять класів: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.

Імуноглобулін класу G. Ізотип G складає основну масу Ig сироватки крові. На його частку припадає 70-80% всіх сироваткових Ig, причому 50% міститься в тканинній рідині. Середній вміст IgG у сироватці крові здорової дорослої людини 12 г/л. Період напіврозпаду IgG – 21 день.

IgG - мономер, має 2 антигензв'язувальні центри (може одночасно зв'язати 2 молекули антигену, отже, його валентність дорівнює 2), молекулярну масу близько 160 кДа та константу седиментації 7S. Розрізняють підтипи Gl, G2, G3 та G4. Синтезується зрілими В-лімфоцитами та плазматичними клітинами. Добре визначається у сироватці крові на піку первинного та при вторинній імунній відповіді.

Має високу афінність. IgGl та IgG3 пов'язують комплемент, причому G3 активніше, ніж Gl. IgG4, подібно до IgE, має цитофільність (тропність, або спорідненість, до гладких клітин і базофілів) і бере участь у розвитку алергічної реакції I типу. В імунодіагностичних реакціях IgG може проявляти себе як неповне антитіло.

Легко проходить через плацентарний бар'єр та забезпечує гуморальний імунітет новонародженого у перші 3-4 місяці життя. Здатний також виділятися в секрет слизових, у тому числі молоко шляхом дифузії.

IgG забезпечує нейтралізацію, опсонізацію та маркування антигену, здійснює запуск комплемент-опосередкованого цитолізу та антитілозалежної клітинно-опосередкованої цитотоксичності.

Імуноглобулін класу М. Найбільша молекула з усіх Ig. Це пентамер, який має 10 антигензв'язуючих центрів, тобто його валентність дорівнює 10. Молекулярна маса близько 900 кДа, константа седиментації 19S. Розрізняють підтипи Ml та М2. Важкі ланцюги молекули IgM на відміну інших ізотипів побудовані з 5 доменів. Період напіврозпаду IgM – 5 днів.

На його частку припадає близько 5-10% всіх сироваткових Ig. Середній вміст IgM у сироватці крові здорової дорослої людини становить близько 1 г/л. Цей рівень у людини досягається вже до 2-4-річного віку.

IgM філогенетично – найдавніший імуноглобулін. Синтезується попередниками та зрілими В-лімфоцитами. Утворюється на початку первинної імунної відповіді, також першою починає синтезуватися в організмі новонародженого – визначається вже на 20-му тижні внутрішньоутробного розвитку.

Має високу авидність, найефективніший активатор комплементу класичного шляху. Бере участь у формуванні сироваткового та секреторного гуморального імунітету. Будучи полімерною молекулою, що містить J-ланцюг, може утворювати секреторну форму і виділятися в секрет слизових оболонок, у тому числі в молоко. Більшість нормальних антитіл і изоагглютининов належить до IgM.

Чи не проходить через плаценту. Виявлення специфічних антитіл ізотипу М у сироватці крові новонародженого вказує на колишню внутрішньоутробну інфекцію чи дефект плаценти.

IgM забезпечує нейтралізацію, опсонізацію та маркування антигену, здійснює запуск комплемент-опосередкованого цитолізу та антитілозалежної клітинно-опосередкованої цитотоксичності.

Імуноглобулін класу А. Існує у сироватковій та секреторній формах. Близько 60% всіх IgA міститься у секретах слизових.

Сироватковий IgA:На його частку припадає близько 10-15% всіх сироваткових Ig. У сироватці крові здорової дорослої людини міститься близько 2,5 г/л IgA, максимум досягається до 10-річного віку. Період напіврозпаду IgA – 6 днів.

IgA - мономер, має 2 антигензв'язувальні центри (тобто 2-валентний), молекулярну масу близько 170 кДа і константу седиментації 7S. Розрізняють підтипи А1 та А2. Синтезується зрілими В-лімфоцитами та плазматичними клітинами. Добре визначається у сироватці крові на піку первинного та при вторинній імунній відповіді.

Має високу афінність. Можливо неповним антитілом. Чи не пов'язує комплемент. Чи не проходить через плацентарний бар'єр.

IgA забезпечує нейтралізацію, опсонізацію та маркування антигену, здійснює запуск антитілозалежної клітинно-опосредованной цитотоксичності.

Секреторний IgA:На відміну від сироваткового, секреторний sIgA існує у полімерній формі у вигляді ди- або тримера (4- або 6-валентний) і містить J- та S-пептиди. Молекулярна маса 350 кДа та вище, константа седиментації 13S і вище.

Синтезується зрілими В-лімфоцитами та їх нащадками - плазматичними клітинами відповідної спеціалізації тільки в межах слизових та виділяється у їх секрети. Об'єм продукції може досягати 5 г на добу. Пул slgA вважається найчисленнішим в організмі - його кількість перевищує сумарний вміст IgM та IgG. У сироватці крові не виявляється.

Секреторна форма IgA – основний фактор специфічного гуморального місцевого імунітету слизових оболонок шлунково-кишкового тракту, сечостатевої системи та респіраторного тракту. Завдяки S-ланцюгу він стійкий до дії протеаз. slgA не активує комплемент, але ефективно зв'язується з антигенами та нейтралізує їх. Він перешкоджає адгезії мікробів на епітеліальних клітинах та генералізації інфекції в межах слизових.

Імуноглобулін класу Е. Називають також реагін. Вміст у сироватці крові вкрай невисокий - приблизно 0,00025 г/л. Виявлення потребує застосування спеціальних високочутливих методів діагностики. Молекулярна маса – близько 190 кДа, константа седиментації – приблизно 8S, мономер. На його частку припадає близько 0,002% всіх Ig, що циркулюють. Цей рівень досягається до 10-15 років життя.

Синтезується зрілими В-лімфоцитами та плазматичними клітинами переважно у лімфоїдній тканині бронхолегеневого дерева та ШКТ.

Чи не пов'язує комплемент. Чи не проходить через плацентарний бар'єр. Має виражену цитофільність - тропність до гладких клітин і базофілів. Бере участь у розвитку гіперчутливості негайного типу – реакція І типу.

Імуноглобулін класу D. Відомостей про Ig даного ізотипу не так багато. Майже повністю міститься в сироватці крові в концентрації близько 0,03 г/л (близько 0,2 % від загальної кількості циркулюючих Ig). IgD має молекулярну масу 160 кДа та константу седиментації 7S, мономер.

Чи не пов'язує комплемент. Чи не проходить через плацентарний бар'єр. Є рецептором попередників В-лімфоцитів.

КВИТОК №30

№1 Збудник амебіазу. Таксономія. Характеристики. Мікробіологічна діагностика Специфічне лікування.

Таксономія:тип Sarcomastigophorae, підтип Sarcodina, клас Lobosia, загін Amoebida.

Морфологія:Розрізняють дві стадії розвитку збудника: вегетативну та цистну. Вегетативна стадія має кілька форм: велика вегетативна (тканинна), мала вегетативна; передцистна форма, подібна до просвітної, що утворює цисти.

Циста (стадія, що спочиває) має овальну форму. Зріла циста містить 4 ядра. Просвітна форма малорухлива, мешкає у просвіті верхнього відділу товстої кишки як нешкідливий комменсал, харчуючись бактеріями та детритом.

Велика вегетативна форма утворюється, за певних умов, із малої вегетативної форми. Вона найбільша, утворює псевдоподії і має рух. Може фагоцитувати еритроцити. Виявляється у свіжих випорожненнях при амебіазі.

Культивування: на живильних середовищах, багатих на поживні речовини.

Резистентність:Поза організмом швидко (за 30 хв) гинуть вегетативні форми збудника. Цисти стійкі у навколишньому середовищі, зберігаються у фекаліях та воді. У продуктах харчування, на овочах та фруктах цисти зберігаються протягом кількох днів. При кип'ятінні гинуть.

Епідеміологія: Амебіаз - антропонозна хвороба; джерело інвазії – людина. Механізм передачі – фекально-оральний. Зараження відбувається при занесенні цист із продуктами харчування, водою, через предмети домашнього вжитку.

Патогенез та клініка:Цисти, що потрапили в кишечник, і просвітні форми амеб, що потім утворилися з них, можуть мешкати в товстій кишці, не викликаючи захворювання. При зниженні резистентності організму амеби проникають у стінку кишки і розмножуються. Розвивається кишковий амебіаз.

Трофозоїти тканинної форми рухомі за рахунок формування псевдоподій. Вони проникають у стінку товстої кишки, викликаючи некроз; здатні фагоцитувати еритроцити; можуть виявлятися у фекаліях людини. При некрозі утворюються виразки. Клінічно кишковий амебіаз проявляється у вигляді частого рідкого випорожнення з кров'ю, що супроводжується лихоманкою та дегідратацією. У випорожненнях виявляють гній та слиз, іноді з кров'ю.

Амеби зі струмом крові можуть потрапляти в печінку, легені, головний мозок, у результаті розвивається позакишковий амебіаз.

Імунітет:Нестійкий, активується переважно клітинна ланка.

Мікробіологічна діагностикаОсновним методом є мікроскопічне дослідження випорожнень хворого, а також вмісту абсцесів внутрішніх органів. Мазки фарбують розчином Люголя або гематоксиліном. Серологічні дослідження (РНГА, ІФА, РСК): найвищий титр антитіл у сироватці крові виявляють при позакишковому амебіазі.

Лікування:Застосовують метронідазол, фурамід.

Профілактика:виявлення та лікування цистовидільників та носіїв амеб, проведення загальносанітарних заходів.

№2Інтерферони. Природа, способи одержання. Застосування.

Інтерферони - глікопротеїни, що виробляються клітинами у відповідь на вірусну інфекцію та інші стимули. Блокують репродукцію вірусу в інших клітинах та беруть участь у взаємодії клітин імунної системи. Розрізняють дві серологічні групи інтерферонів: I тип – ІФН-? та ІФН -?; II тип - ІФН-.? Інтерферони I типу мають противірусні та протипухлинні ефекти, тоді як інтерферон II типу регулює специфічну імунну відповідь та неспецифічну резистентність.

Інтерферон (лейкоцитарний) продукується лейкоцитами, обробленими вірусами та іншими агентами. ?-інтерферон (фібробластний) продукується фібробластами, обробленими вірусами.

ІФН І типу, зв'язуючись зі здоровими клітинами, захищає їхню відмінність від вірусів. Антивірусна дія ІФН I типу може обумовлюватися і тим, що він здатний пригнічувати проліферацію клітин, перешкоджаючи синтезу амінокислот.

ІФН-? продукується Т-лімфоцитами та NK. Стимулює активність Т- та В-лімфоцитів, моноцитів/макрофагів та нейтрофілів. Індукує апоптоз активованих макрофагів, кератиноцитів, гепатоцитів, клітин кісткового мозку, ендотеліоцитів та пригнічує апоптоз периферичних моноцитів та герпес-інфікованих нейронів.

Генно-інженерний лейкоцитарний інтерферон одержують у прокаріотичних системах (кишковій паличці). Біотехнологія отримання лейкоцитарного інтерферонувключає такі етапи: 1) обробка лейкоцитарної маси індукторами інтерферону; 2) виділення з оброблених клітин суміші іРНК; 3) одержання сумарних комплементарних ДНК за допомогою зворотної транскриптази; 4) вбудовування кДНК у плазміду кишкової палички та її клонування; 5) відбір клонів, що містять гени інтерферону; 6) включення до плазміди сильного промотора для успішної транскрипції гена; 7) експресія гена інтерферону, тобто. синтез відповідного білка; 8) руйнування прокаріотичних клітин та очищення інтерферону за допомогою афінної хроматографії.

Інтерферони застосовуютьсядля профілактики та лікування низки вірусних інфекцій. Їх ефект визначається дозою препарату, проте високі дози інтерферону мають токсичну дію. Інтерферони широко застосовуються при грипі та інших гострих респіраторних захворюваннях. Препарат ефективний на ранніх стадіях захворювання, застосовується місцево. Інтерферони мають терапевтичну дію при гепатиті В, герпесі, а також при злоякісних новоутвореннях.

Заснований на визначенні в крові хворого на противірусні антитіла в серологічних реакціях з використанням специфічних вірусних антигенів - діагностикумів або спеціальних тест-систем. Серологічні реакції при вірусних інфекціях ставлять у рідкому середовищі (РСК, РТГА, РНГА, РОНГА, РТОНГА, РІА), гелі (РПГ, РРГ, РВІЕФ) або на твердофазному носії (наприклад, на стінках лунки полістиролового планшета з фіксацією на них одного з компонентів імунної реакції - антигену або антитіла). Відомі такі твердофазні методи як ІФА, ІЕМ, РГадсТО, РІФ, РГадс, РТГадс.

Нерідко, внаслідок наявності у крові більшості здорових людей природних противірусних антитіл, серологічна діагностика вірусних інфекцій ґрунтується на дослідженні парних сироваток,взятих на початку та в розпалі хвороби або в період реконвалесценції з метою визначення наростання титру антитіл. Діагностично значущим вважається наростання титру антитіл вчетверо і більше.

Підвищення чутливості серологічних методів досягається адсорбцією антигенів або антитіл на еритроцитах (РНГА, РОНГА, РТОНГА, РГадсТО, РРГ), міткою ферментами (ІФА), радіоактивними ізотопами (РІА, РПГ) або флюорохромізи (РІФ), Використовується також принцип системи) при взаємодії антигенів та антитіл у присутності комплементу (РСК, РРГ).

Реакція зв'язування комплементу (РЗК)у вигляді варіанта зв'язування комплементу на холоді (протягом ночі при температурі +4 0 С) часто застосовується в вірусології для ретроспективної діагностики ряду вірусних інфекцій та для визначення вірус-специфічних антигенів у матеріалах від хворих.

Реакція радіального гемолізу (РРГ)в агарозному гелеоснована на явище гемолізу еритроцитів, сенсибілізованих антигеном, під впливом вірусспецифічних антитіл у присутності комплементу та застосовується для серологічної діагностики грипу, ГРВІ, краснухи, паротиту, тогавірусних інфекцій.

Для постановки реакції до баранячих еритроцитів (0,3 мл 10% суспензії) додають 0,1 мл нерозведеного вірусного антигену і суміш витримують 10 хв при кімнатній температурі. До 1,2% агарозі при температурі 42 0 С додають 0,3 мл сенсибілізованих еритроцитів і 0,1 мл комплементу, суміш розливають на предметні скла або в лунки полістиролових планшетів, в застиглому гелі агарози за допомогою пробійника вирізають отвори і заповнюють контрольною сироватками. Скло або панелі закривають кришкою та поміщають їх у вологій камері на 16-18 годин у термостат. Облік реакції здійснюють діаметром зони гемолізу навколо отворів, заповнених сироваткою. У контролі гемолізу відсутня.