Формування, зростання, міграція планктонних форм клітин для колонізації в біоплівках регулюються лише на рівні популяції у вигляді механізмів міжклітинної комунікації. "Quorum sensing" (QS) - це процес колективної координації експресії генів у популяції бактерій, що опосередковує специфічну поведінку клітин. Механізм роботи QS заснований на складній ієрархічній регуляції цільових локусів геному бактеріальної клітини. При цьому регулювання здійснюється на різних рівнях впливу: транскрипційному, трансляційному, посттрансляційному.

На конкретний клітинний сигнал клітини популяції відповідають специфічним відповіддю. На сьогоднішній день встановлено, що клітинно-клітинні взаємозв'язки впливають на внутрішньопопуляційне диференціювання клітин, на експресію генів вірулентності, регулюють ростові процеси, характер та напрямок рухливості (таксис), а також бактеріальний апоптоз та токсиноутворення.

Роботу QS можна порівняти з гормональним регулюванням функціональної активності різних органів і тканин у багатоклітинному організмі.

Грампозитивні та грамнегативні мікроорганізми використовують різні сигнальні системи та різні хімічні передавачі сигналів. Перші синтезують 7-8-члені пептиди (Enterococcus spp.), Циклопептиди (Staphylococcus spp.); другі: різноманітні ацил-гомосерин лактони (AHL).

Розглянемо роботу QS з прикладу синегнойной палички. У даного мікроорганізму функціонують щонайменше три регуляторні системи. Найбільш вивчена їх LasI - LasR система (як хімічного сигналу виступають AHL з довгим ацильным ланцюгом); RhlI - RhlR система (месенджер - AHL з коротким ацильним ланцюгом, C4-HSL); та хінолонова PQS система. Взаємодія цих трьох систем дозволяє регулювати експресію близько 6-10% геному. У LasI - LasR системі за біосинтез сигнальних молекул відповідає AHL-синтаза, продукт гена lasI. Його експресія перебуває на базальному рівні, тому накопичення сигнальних молекул відбувається досить тривалий час, і біологічний ефект починає проявлятися тільки в стаціонарній фазі зростання популяції. У клітинах AHL взаємодіє з LasR-білком (продукт lasR-гену, експресія якого також знаходиться на базальному рівні), утворюючи при цьому гомодимер - регулятор транскрипції. Цей регулятор активує безліч генів, що беруть участь у формуванні вірулентності, і в процесах утворення біоплівок, він також активує хромосомний регулон las Box, який відповідає за експресію різних факторів патогенності (протеази, еластазу та інше). Комплекс LasR+AHL активує другу сигнальну систему. Це відбувається після взаємодії із промотором Rhl-генів. Експресія RhlI обумовлює утворення протеїну для синтезу AHL з короткими залишками ацильними (C4-HSL). Ген rhlR кодує білок (RhlR), який взаємодіє із сигнальними молекулами C4-HSL. Протеїновий тандем RhlR + C4-HSL, що утворюється, регулює транскрипцію генів, що кодують різні структурні сполуки матриксу біоплівок (альгінату, рамноліпіду та ін.), а також ліпази, піоціаніну. Також цей транскрипційний регулятор активує експресію іншого регулятора – RpoS (сигма-фактор стаціонарної фази росту P.aeruginosa), який ініціює утворення стресових білків клітини та бере участь у адаптаційних реакціях. Серед клінічних ізолятів P.aeruginosa виявлено, що крім функціонування AHL-сигнальних систем, паралельно вступає хінолонова система (генний локус - pqsABCDE), месенджерами є гідроксиалкілхінолони та гідроксигептилхінолони. Ця система функціонує так само, як і вищеописані механізми регуляції, та опосередковує збільшення експресії факторів вірулентності, зокрема синтез еластази, лектинів. Взаємодія трьох сигнальних систем зачіпає велику кількість генів, у зв'язку з чим відбувається глобальне регулювання транскрипції, що призводить до дуже гнучкої лабільності фізіологічних процесів клітини, і є наслідком величезного адаптаційного потенціалу бактерій у популяції.

Сигнальні системи працюють за принципом аутоіндукції, синтезовані сигнальні молекули діють на свою клітину, і в міру їх накопичення в позаклітинному середовищі відбувається все більша активація залежних промоторів, регулонів геному клітин. QS на основі AHL виявлений у багатьох грамнегативних бактерій: Acinetobacter, Aeromonas, Brucella, Burkholderia, Erwinia, Enterobacter, Chromobacterium, Hafnia, Serratia, Vibrio, Yersinia та ін. AHL-комунікація здійснюється всередині виду, специфічність та сила біологічної відповіді структури самої сигнальної молекули

Але серед клінічних ізолятів грамнегативних бактерій часто спостерігається і перехресна комунікація (cross – talk communication), що забезпечує взаємодію популяцій різних видів в інфекційному осередку. Перехресний QS здатний активувати, так і інгібувати роботу залежних цільових генів в бактеріальних асоціаціях. Наприклад, P. aeruginosa, Serratia liquefaciens, Aeromonas hydrophila синтезують один тип сигнальних молекул. QS C.violaceum та A.hydrophila інгібується AHL-молекулами з довгими ацильними залишками, які синтезуються різними грамнегативними мікроорганізмами. Синьогнійна паличка утворює сигнальні молекули з довгими і короткими ацильными залишками, і вони взаємно не пригнічуються, однак, месенджери E.coli такої ж молекулярної структури з довгими ацильными залишками здатні інгібувати rhl-сигнальну систему P.aeruginosa. У змішаних біоплівках P.aeruginosa та Burkholderia cepacia, буркхолдерії реагують на сигнали синьогнійної палички (яка у свою чергу не чутлива до сигналів B.cepacia), отже, популяція P.aeruginosa регулює багато фізіологічних процесів свого асоціанта. Є дані, що деякі штами P.aeruginosa, виділені від хворих на ісцидоз, не здатні самі синтезувати аутоіндуктори rhl-сигнальної системи, наслідком чого є зниження вірулентності, і неповноцінне формування біоплівок у дослідах in vitro. Але, однак, in vivo, ці ж штами синьогнійної палички формують повноцінні біоплівки. З'ясовано, що мікрофлора, виділена зі слизу від тих самих хворих, синтезує rhl-аутоіндуктори, регулюючи таким чином вірулентність та формування біоплівок P.aeruginosa та ініціюючи інфекційний процес. Самі AHL-молекули неоднаково впливають інші групи бактерій, встановлено наприклад, що аутоиндукторы синегнойной палички блокують роботу QS у S.aureus. Сигнальні молекули прокаріотів здатні впливати і на поведінку клітин грибів, рослин, і навіть тваринних клітин. Так, AHL P.aeruginosa пригнічує процес філаментації Candida albicans.

В організмі людини AHL-молекули пригнічують проліферацію лейкоцитів і процес утворення фактора некрозу пухлин б. У високих концентраціях AHL ініціюють апоптоз різних типів імунокомпетентних клітин. В цілому, бактеріальні аутоіндуктори мають імуносупресуючу дію. Саме за рахунок реакцій QS здійснюються «соціальні» відносини всередині популяції, утворюється «хімічна комунікаційна мережа» біоплівки, яка може охоплювати мультиводове співтовариство.

Не менш цікавою є робота сигнальних систем серед грампозитивних мікроорганізмів. Наприклад, Enterococcus spp. QS регулює процес перенесення плазмід (від донорної до реципієнтної клітини) через механізм кон'югації. Клітина-реципієнт синтезує специфічний пептидний сигнал («статевий» бактеріальний феромон), який накопичується в середовищі і специфічно зв'язується з рецепторами клітин-донорів, що несуть плазміду, яка відповідає цьому феромону. При цьому регуляторна система забезпечує експресію факторів, що опосередковують клітинну взаємодію та перенесення плазміди (компоненти кон'югації). Як зазначалося вище, певній плазміді відповідає конкретний феромон. За рахунок такого суворого механізму взаємодії здійснюється бактеріальна селекція клітин усередині біоплівки. Через таку комунікацію траслокуються плазміди, що несуть гени стійкості до антибіотиків, гени гемолізинів, бактеріоцинів. Зазвичай біологічно активні сигнальні пептиди закодовані в хромосомі, а рецепторні білки, що забезпечують афінітет до феромонів, закодовані в самих плазмідах. Після транслокації плазміди в клітину реципієнта вона починає синтез інгібіторів феромонів, для кожного типу феромона відповідає свій інгібітор. Ця властивість дозволяє вимикати сигнал для вже наявної плазміди і посилювати накопичення молекул феромонів для іншого типу плазмід. біоплівка мікроорганізм клітина

За рахунок роботи подібної системи в популяції біоплівки постійно відбувається позитивна селекція штамів із вигідними властивостями та негативна селекція – елімінація штамів, із «непотрібними» фенотипами. При інфекційних ураженнях такі комунікативні механізми передачі мобільних генетичних елементів дають змогу з максимальною швидкістю поширювати гени антибіотикорезистентності, вірулентності, додаткові фізіологічні можливості.

Найбільший інтерес представляє QS, що бере участь у регуляції експресії факторів вірулентності у стафілококів. Генетичною основою роботи цієї системи є agrABCD – хромосомний локус. Як передавачі сигналів виступають циклопептиди - аутоіндуктори (AIP, auto-inducing peptide), які класифіковані за будовою та біологічним ефектом на групи та субгрупи, наприклад, 1 і 4 субгрупи у S.aureus збільшують експресію факторів вірулентності. Ці молекули вкрай специфічні, заміна хоча б однієї амінокислоти у структурі сполуки, веде до втрати біологічної функції. Як і з прикладами сигнальної - інгібіторної системи у ентерококів, стафілококова система реагує тільки на один тип аутоіндукторів, як тільки клітина отримала специфічний сигнал, активуються гени-інгібітори, клітина вже не здатна сприймати інші сигнали. Такий механізм забезпечує тверду популяційну селекцію. Синтезовані сигнальні молекули взаємодіють із гістидинкіназною мембранною системою (agrC), яка через каскад реакцій активує регулятор транскрипції (agrA). Цей білок здійснює біфункціональне регулювання двох промоторів P2 і P3. Відповідно, транскриптами цих залежних генів є РНК II та РНК III, перша містить основні agr-гени, таким чином проявляється аутоіндуктивна відповідь системи. У свою чергу РНК III забезпечує регуляцію синтезу факторів вірулентності (ДНКази, фібринолізину, ентеротоксину, б-, в-, д-токсинів та ін.). Цікавою особливістю на даному етапі регуляції є те, що транскрипт РНК III розміром 500 пар нуклеотидів не несе інформації, що кодується, за винятком однієї відкритої рамки зчитування для д-токсину. Переважна частина молекули транскрипта сама постає як рибосомальний інгібітор. РНК III блокує процес трансляції фактора репресії вірулентності Rot (repressor of toxins), що регулює синтез стафілококових токсинів, наслідком чого є неконтрольоване утворення екзотоксинів. Таким чином, agr-система забезпечує популяційну регуляцію експресії факторів вірулентності стафілококів. Використовуючи різні варіанти ПЛР-досліджень, встановлено, що експресія agr-локусу в клітинах спостерігається при багатьох стафілококових ураженнях: інфекції шкіри, ендокардити, артрити, сепсис. У популяції біоплівок накопичуються сигнальні молекули, синтезовані переважною більшістю клітин, що є метаболічним і генетичним «ядром, кворумом» популяції, вони задають метаболічну поведінку, фенотипічні зміни всім клітин. Це здійснюється за рахунок акумуляції сигналів через властивість аутоіндукції та інгібування інших сигналів, синтезованими меншістю, або взагалі іншими штамами в біоплівці за рахунок паралельного механізму інгібування. 1.5.Клінічне значення біоплівок.

Уявлення про біоплівки, підтверджені сучасними методами візуалізації, змінили погляди на інфекційні захворювання. Усі нові дані свідчать, що хронічні інфекції принципово відрізняються від гострих утворенням біоплівок, а фагоцити макроорганізму нездатні поглинати біоплівки на відміну окремих бактеріальних клітин.

Існування біоплівок при хронічних інфекціях вимагає абсолютно нових підходів до їх діагностики та лікування. З іншого боку, традиційні бактеріологічні методи не виявляють більшість бактерій, що у інфекційному процесі. Нові молекулярні, геномні, транскрипційні та протеомні методи дозволили визначити, що при виділенні чистої культури визначається лише близько 1% клітин патогенного мікробіоценозу. В результаті лікування націлене лише на 1-2 види бактерій з множини штамів, присутніх у складі біоплівки (у тому числі, можливо, і грибів).

На сьогодні достовірно доведено роль мікробних біоплівок у виникненні та розвитку таких поширених захворювань, як інфекції, пов'язані з катетеризацією судин, спричинені Staphylococcus aureus та іншими грампозитивними мікроорганізмами; інфекції серцевих клапанів і суглобових протезів, що викликаються стафілококами; пародонтит, зумовлений рядом мікроорганізмів ротової порожнини; інфекції сечових шляхів, що визначаються Е. coli та ін. патогенами; інфекції середнього вуха - причина, наприклад, Haemophilus influenzae, муковісцидоз, що викликається P. Aeruginosa та ін.

Всі ці захворювання важкі для лікування, мають високу частоту рецидивів і деякі з них можуть спричинити летальні наслідки. Далеко не до кінця зрозумілі механізми, якими мікроорганізми, що утворюють біоплівки, викликають патологічні процеси в макроорганізмі.

Крім тканин організму господаря, мікробні біоплівки колонізують різні медичні пристрої небіологічної природи, що впроваджуються в організм людини (катетери, водії ритму, серцеві клапани, ортопедичні пристрої). Дослідження імплантованих медичних пристроїв із застосуванням електронної мікроскопії показали присутність бактеріальних біоплівок.

Зростаюча антибіотикорезистентність та розвиток бактеріальних біоплівок є основними проблемами у лікуванні інфекцій сечових шляхів.

Встановлено, що в основі підвищеної стійкості лежать властивості клітин та позаклітинного матриксу. Матрікс біоплівки може пов'язувати або не пропускати та/або інактивувати антибіотики. Стійкість, обумовлену властивостями клітин біоплівки, пояснюють зменшенням їхньої вільної поверхні за рахунок контактів один з одним та формуванням особливих бактерій, що отримали назву персистерів.

Персистери - це альтруїстичні клітини, які утворюються в стаціонарній фазі росту, вони метаболічно не активні і забезпечують виживання материнської популяції в присутності летальних, для всіх клітин факторів. У біоплівках ця субпопуляція становить 1-5% від усієї клітинної маси. Формування таких клітин залежить від ступеня зростання популяції, у лог-фазі культура не утворює або утворює дуже невелику частку персистерів, їхня кількість збільшується до стаціонарної фази. Утворення субпопуляції обернено залежно від рівня метаболічної активності всіх клітин біоплівки, а також від дії екзогенних несприятливих факторів. Фенотип персистерів характеризується цікавою біологією, вони уповільнюють всі фізіологічні процеси та стають толерантними до дії різних факторів, у тому числі й до дії антимікробних препаратів.

Властивість антибіотикотолерантності відрізняється від механізмів резистентності. Дія всіх механізмів стійкості бактерій, по суті, можна звести до одного явища - це запобігання взаємодії антибіотика з його мішенню (за рахунок змін самих мішеней, або за допомогою синтезу ферментів, що нейтралізують антибіотики). Толерантність опосередковується здатністю мікробної клітини виживати в присутності антибіотика за рахунок уповільнення метаболізму і «виключення» основних біологічних процесів клітини.

Основними механізмами підвищення стійкості бактерій до антибіотиків у біоплівках є:

1. обмеження проникнення антибіотиків через біоплівки;

2. обмеження живлення та змінене мікросередовище в біоплівці призводять до зменшення швидкості поділу бактерій, внаслідок чого залишається менше мішеней для дії антибіотиків;

3. адаптивні реакції;

4. генна мінливість у персистуючих у біоплівці бактерій.

Виходячи з даних, що накопичилися, слід, що антибіотики по дії на бактерії біоплівок поділяються на два типи. До першого відносять антибіотики, що проникають в біоплівки і пригнічують або вбивають мікроорганізми, що їх утворюють. Другий тип - антибіотики, що практично не проникають у біоплівки, але ефективно перешкоджають їх розселенню за рахунок мігруючих бактерій. Таким чином, деякі антибіотики не проникають у біоплівки і не знищують існуючі спільноти, а лише перешкоджають збільшенню їхньої кількості та поширенню в організмі людини. У зв'язку з цим останніми роками почалося вивчення здатності антибіотиків проникати в біоплівки різних бактерій.

Встановлено, що в біоплівки Klebsiella pneumoniae погано проникає ампіцилін, а у спільноти Enterococcus faecalis - ампіцилін, котримаксозол і ванкоміцин. У біоплівки ряду мікробів погано проникає амоксицилін, що широко використовується.

До антибіотиків, добре проникають через ліпіди клітин, відносяться фторхінолони. Ця група антимікробних препаратів здатна діяти на основні збудники урологічних захворювань, у достатній концентрації проникає у осередок інфекції. Наявний досвід використання антибіотиків свідчить, що з інфекційним процесом, перш за все з його клінічними проявами, можна впоратися за допомогою антибіотиків, що проникають, так і не проникають у біоплівки. Однак різниця між ними існує, і вона досить суттєва. Показано, що відмінності антибіотиків, що проникають та непроникають у біоплівки, можуть виявлятися у віддалених результатах лікування. Використання антибіотиків, що погано проникають у біоплівку, дуже швидко призводить до формування та відбору стійких штамів. Крім того, при цьому частіше виникають рецидиви та формуються осередки хронічних процесів.

Терапевтична дія на біоплівки може бути спрямована на механізми початкової адгезії бактерій до поверхні, блокування синтезу або руйнування полімерного матриксу, порушення міжклітинного обміну інформацією, а також може поєднуватися з власне бактерицидними агентами. Подібне лікування, що діє на структуру або функції біоплівок, може виявитися ефективнішим, ніж стандартна антибактеріальна терапія.

«Антибіотики та хіміотерапія», 2003, 48 (10): 32-39.

Стаття розміщена з дозволу Єфременкової Ольги
Володимирівни, зав. сектором пошуку природних сполук
НДІ з пошуку нових антибіотиків ім. Г.Ф. Гаузе РАМН

Комунікативні сигнали бактерій

В.Д. Грузина

Науково-дослідний інститут з пошуку нових антибіотиків ім. Г. Ф. Гаузе РАМН, Москва

V.D. Грузіна. Bacteria Communicative Signals

GF. Gause Institute of New Antibiotics, Російська академія медичних наук, Москва

В даний час спостерігається перехід від традиційного уявлення про бактерії як суворо одноклітинні організми до уявлення про мікробні спільноти як цілісних структурах, що регулюють свої поведінкові реакції в залежності від зміни умов проживання.

Колонії практично всіх видів бактерій демонструють здатність до клітинної диференціювання та багатоклітинної організації. Ця здатність найбільш очевидно проявляється при зростанні бактерій у їх природних місцях проживання, де вони формують різні багатоклітинні структури: біоплівки, бактеріальні мати, плодові тіла та ін.

Поняття «відчуття кворуму» (Quorum Sensing) було запропоновано 1994 року. Воно означає сприйняття клітинами змін середовища, що настають при досягненні бактеріальною культурою деякої граничної чисельності, та реакцію на ці зміни.

До описаних процесів, що протікають лише за досить високої щільності популяції, належать такі явища:

• біолюмінесценція у морських бактерій Vibrio fisheriі V.harveyi;
• агрегація клітин міксобактерій та подальше формування плодових тіл зі спорами;
• споруляція у бацил та актиноміцетів;
• стимуляція зростання у стрептококів та інших мікроорганізмів;
• кон'югація з перенесенням плазмід у Enterococcus faecalisта споріднених видів, а також у бактерій роду Agrobacterium;
• синтез екзоферментів та інших факторів вірулентності у патогенів рослин ( Erwinia carotovora, E.hyacinthiiта ін) та тварин ( Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus);
• освіта антибіотиків у представників роду Streptomycesі у E.carotovora;
• формування біоплівок у Р.aeruginosaта інших мікроорганізмів.

Розкрито механізми багатьох із зазначених процесів, визначено фактори міжклітинної комунікації, які відповідають за процеси, що залежать від щільності популяції.

Серйозною проблемою клінічної практики є поширення стійких форм мікроорганізмів, що знижує ефективність застосування антибактеріальних препаратів. Особливу складність становить підвищена лікарська стійкість бактерій у біоплівках. Для синтезу факторів вірулентності, антибіотиків та формування біоплівок бактерії часто використовують реакції кворум-сенсингу. Тому вивчення механізмів таких реакцій відкриває нові можливості для попередження та лікування хвороб, викликаних мікробними агентами, а також дозволяє по-іншому поглянути на складний комплекс міжвидових бактеріальних взаємодій у природних місцях проживання мікроорганізмів.

Механізми реакцій кворум-сенсингу розрізняються у грампозитивних та грамнегативних бактерій, тому доцільно їх розгляд окремо.

Реакції кворум-сенсингу у грампозитивних мікроорганізмів

Грампозитивні бактерії зазвичай здійснюють комунікації, використовуючи сигнали олігопептиду молекули. Передача сигналів здебільшого включає двокомпонентний механізм фосфорилювання. Як правило, стан кворуму досягається при переході популяції бактеріальних клітин у стаціонарну фазу зростання. Саме в цей час виявляються сигнальні молекули, за допомогою яких клітини контактують одна з одною. Загальну схему комунікацій грампозитивних бактерій можна уявити так: спочатку у клітині синтезується попередник, який, модифікуючись, перетворюється на зрілий олигопептид. Останній екскретується назовні клітини експортером. Молекули олігопептиду накопичуються у міжклітинному просторі у міру того, як зростає щільність бактеріальних клітин. Двокомпонентна сенсорна кіназ, що пронизує мембрану, розпізнає сигнал і здійснює його передачу в клітину в процесі каскадного фосфорилювання. У клітині олигопептидная молекула взаємодіє із цільовим геном (генами).

Класичною пептидною кворум-залежною системою можна вважати систему, що відповідає за кон'югативне перенесення плазмід у Enterococcus faecalisта споріднених бактеріальних видів. Ця система стимулює поширення мікробної популяції ознак, важливих для взаємодії мікроорганізму і тварини-господаря, а також для усунення конкуренції. Переносима пептидною кворум-залежною системою плазміда pPDl відповідає за синтез гемолізинів, плазміда pCDl – за утворення бактеріоцину, плазміда pCFlO – за стійкість E.faecalisдо тетрацикліну. Кожен гекса або октапептид індукує злипання бактеріальних клітин та їх кон'югацію з перенесенням від донора до реципієнта певної плазміди. Наприклад, октапептид cPDl стимулює кон'югативне перенесення плазміди pPDl. Плазміда кодує рецептор, що знаходиться на білку-репресорі відповідного оперону. Взаємодія олігопептиду з рецептором викликає дисоціацію репресора ДНК, тим самим запускаючи синтез відповідного продукту. Плазміда pPDl включає ген traC, продуктом якого є білок, що полегшує проникнення пептиду через клітинну стінку. Олігопептидні сигнали інтенсивно синтезуються клітинами, що не несуть відповідні плазміди (реципієнтами), у той час як у клітин-донорів синтез таких сигналів пригнічений, більше того, плазміда кодує пептид, що інгібує.

Продуктом плазміди pPDl є пептид iPDl, HHaKTHBHpyiounmcPDl.

Іншим кворум-залежним процесом, виявленим у E.faecalis, є вироблення двох вірулентних факторів: желатинази (GelE) та серинової протеази (SprE).

Прикладом використання пептидного сигналу для здійснення міжклітинних взаємодій може служити система кворум-сенсингу, що здійснює контроль над синтезом екзотоксинів у пізній логарифмічній фазі зростання у Staphylococcus aureus. У цій системі білок AgrD синтезується у вигляді попередника, що складається з 46 амінокислот, який у процесі експорту білком AgrB перетворюється на зрілий пептид AIP (autoinducing peptide), що складається з 8 амінокислот. AIP розпізнається двокомпонентною сенсорною кіназою AgrC, яка передає сигнал всередину клітини в процесі фосфорилювання регулятора відповіді - AgrA. AgrA~P активує транскрипцію цільових генів, стимулює транскрипцію оперону agrB, D, С, А (позитивна ауторегуляторна петля), а також забороняє транскрипцію генів, що кодують інші екзотоксини. На підставі відмінностей у AIP та його рецепторі штами S.aureusможуть бути віднесені до чотирьох або більше груп. Олігопептиди, що синтезуються однією з груп, індукують патогенність у цій групі та специфічно пригнічують системи Agr-вірулентності в інших групах.

Від щільності популяції залежить поява компетентності у пізній логарифмічній фазі зростання у Streptococcus pneumoniae. Ген соmС кодує попередник, що складається з 41 амінокислотного залишку. Останній перетворюється на зрілий пептид, що складається з 17 амінокислотних залишків у процесі взаємодії з системою експорту пептидів (АВС-система), яку утворюють продукти генів соmАВ. Пептид контактує зі своїм рецептором на поверхні клітини – гістидинкіназою, продуктом гена comD. Активована гістидинкіназа фосфорилює продукт гена соmЕ. У міру накопичення клітин кількість пептидних сигналів зростає та досягає в середовищі критичного рівня. Відповідно збільшується і кількість фосфорильованого білка cоmЕ, який, починаючи з певної концентрації, пов'язується з промотором оперону comCDE, стимулюючи його роботу (позитивна ауторегуляторна петля), активує промотор оперону соmАВ (система експорту білка з клітини), активує оперон сотХ, який включає пізніх генів компетентності; відповідальних за зв'язування та поглинання трансформуючої ДНК та всі інші, пізні стадії трансформації.

На додаток до наведених прикладів реакцій кворум-сенсингу у грампозитивних бактерій слід зазначити, що як сигнальні молекули крім олігопептидів грампозитивними бактеріями також використовуються речовини іншої хімічної природи. Так, у представників порядку Actinomycetalesпоряд з пептидними сигнальними молекулами були виявлені речовини низькомолекулярної природи, більшість з яких містить лактонне угруповання.

У стрептоміцетів у системи кворум-сенсингу залучені бутиролактони та відповідні їм білкові рецептори, які спільно регулюють морфологічний розвиток та утворення антибіотиків у їх продуцентів. Найбільш добре вивченим актиноміцетним регулятором є А-фактор, що являє собою 2-ізо-каприлоїл-3-оксиметил-у-бутиролактон.

Вплив А-фактора на морфологічне диференціювання та антибіотикоутворення підпорядковується загальній схемі роботи стрептоміцетних регуляторів, що містять лактонне угруповання. На ранніх стадіях росту, коли концентрація А-фактору низька, рецептор А-фактора (АгрА) зв'язується та репресує експресію загального гіпотетичного активатора біосинтезу стрептоміцину та спороутворення. При виділенні АгрА із клітинного лізату S.griseus IFO 13350 було показано, що цей білок складається з 276 амінокислот і має молекулярну масу 29,1 кДа.

Коли щільність культури зростає, концентрація А-фактора досягає критичного рівня, при якому він зв'язує АгрА, викликаючи дисоціацію останнього від ДНК і, таким чином, включаючи транскрипцію ключового гена adpA, що кодує AdpA (білок, що складається з 405 амінокислот, що містить сайт зв'язування в центральній ділянці з ДНК, схожий з регуляторами транскрипції сімейства білків AraC/XylS). AdpA, у свою чергу, є позитивним регулятором виявленого цитоплазматичного активатора кластеру генів біосинтезу стрептоміцину та активаторів процесу спороутворення. Цитоплазматичний активатор, зв'язуючись з ДНК в районі промотора гена специфічної регуляції кластеру біосинтезу стрептоміцину strR, індукує транскрипцію даного гена, розташованого слідом за ним гена стійкості до власного антибіотику - aphD, гена adsA, що кодує екстрацитоплазма міцелію, а також гена sgmA, що кодує білок-пептидазу, що бере участь поряд з іншими гідролітичними ферментами в деградації білків субстратного міцелію в результаті формування повітряного міцелію. Регуляторний продукт гена strR обумовлює початок транскрипції структурних генів біосинтезу у складі кластера із StrR-залежних промоторів. Початок експресії з промотору strR гена під впливом цитоплазматичного активатора забезпечує напрацювання продукту гена aphD - аміноглікозидфосфотрансферази, і тим самим створення базового рівня стійкості штаму до власного антибіотика.

Показано, що з різних видів стрептоміцетів спостерігається гомологія між структурними елементами регуляторів. Нуклеотидні послідовності, гомологічні гену агро S.griseus, Виявлені також у інших стрептоміцетів. Наприклад, у S.coelicolor A3 (2) було виявлено два гени сргА та сргВ, що кодують АгрА-подібні білки СргА та СргВ, які на 90,7% подібні між собою і на 35% - з АгрА.

Реакції кворум-сенсингу у грамнегативних мікроорганізмів

Більш ніж у 450 видів грамнегативних бактерій виявлено кворум-залежні системи, в яких сигнальними молекулами є різні ацилгомосеринлактони. Загальну схему комунікацій грамнегативних бактерій можна представити так: у системі кворум-сенсингу грамнегативних бактерій білки сімейства Luxl є аутоіндукторними синтазами і каталізують формування специфічних ацилгомосеринлактонних аутоіндукторних молекул. Аутоіндуктори вільно дифундують через мембрану і акумулюються зі збільшенням щільності клітин. Білки сімейства LuxR пов'язують споріднені з ним аутоіндуктори при досягненні досить високої концентрації сигнальних молекул. Комплекс LuxR – аутоіндуктор зв'язується з промотором цільових генів, запускаючи їх транскрипцію.

Бактерії роду Erwinia (E.carotovora, E.chrysanthemii) - патогени для рослин. Вони розщеплюють рослинні клітинні стінки за допомогою пектиназ та целюлаз. Утворення цих ферментів є важливим фактором вірулентності та залежить від щільності популяції. У Erwiniaфункціонує генна система expI-expR, аналогічна системі luxI-luxR у V.fisheri. У реакціях кворум-сенсингу також задіяна регуляторна система, що забезпечується транскрипцією генів rsmA-rsmB. Від щільності популяції у E.carotovoraзалежить також синтез антибіотика карбапенему. Продукція цього антибіотика перебуває під контролем кластера генів сагА-сагН, і, можливо, необхідна усунення конкуруючих мікроорганізмів в локусі зараження рослини.

Інший приклад використання як сигнальних молекул гомосеринлактонів показаний для Pseudomonas aeruginosa- Патогену для тварин. Патогенність у Р.aeruginosaобумовлена ​​широким арсеналом факторів вірулентності. Одні з них асоційовані з клітиною (пили, адгезини, ліпополісахариди), інші секретуються (протеази, рамноліпіди, екзофермент S, екзотоксин А, антибіотик піоціанін тощо). Утворення багатьох із позаклітинних факторів вірулентності контролюється системами міжклітинної взаємодії. Центральними компонентами таких взаємодій є las- і rhl-системи кворум-сенсингу, що активують експресію генів залежно від величини щільності клітин мікроорганізму. Кожна система представлена ​​двома генами: один кодує фермент, з якого синтезується специфічний аутоіндуктор - ацильований гомосеринлактон (lasl/rhll); інший кодує активатор транскрипції, з яким зв'язується відповідний аутоіндуктор (lasR/rhIR). Аутоіндуктором систем las і rhi є N-(3-оксододеканоїл)-L-гомосеринлактон (З-оксо-С12-HSL), для експорту якого з клітини служить спеціальна система, що отримала назву MexEF-OprN-насос і N-бутирил-L- гомосеринлактон (C4-HSL) відповідно.

Система las контролює експресію генів, що кодують такі фактори вірулентності як еластази А, В, а також лужну протеазу; система rhi – ферменти біосинтезу рамноліпідів, піоціаніну. Нещодавно було виявлено третю сигнальну молекулу, яка бере участь у реакціях кворум-сенсингу у P.aeruginosa- 2-гептил-З-гідрокси-4-хінолон (PQS). Ця сигнальна молекула може контролювати рівень експресії las, кодує еластазу Las, а також рівень експресії rhil, що кодує синтазу C4-HSL.

Бактерія Agrobacterium tumefaciensвикликає утворення корончастих галлів у багатьох видів рослин. Галли є рослинний аналог злоякісної пухлини і утворюються в результаті перенесення онкогенних фрагментів ДНК від бактерії в ядро ​​рослинної клітини за допомогою Ti-плазмід. Деякі з генів Ti-плазмід обумовлюють синтез рослинними клітинами опінів, які служать поживним субстратом для A.tumefaciens. Гомологічна luxI-luxR генна система traI-traR стимулює поширення Ti-плазміду в бактеріальній популяції. Плазмідна ДНК прагне поширитися в популяції бактерій і, як тільки створюється достатній «кворум», спонукає клітини, що несуть плазміду, кон'югувати з іншими бактеріальними клітинами. У той же час кон'югативне перенесення Ti-плазміду залежить від опінів. Зокрема, транскрипція traR стимулюється фактором OccR, що активується октопіном.

Кворум-сенсинг у багатоклітинних утвореннях

Здатність бактерій утворювати біоплівки цікава через те, що представники патогенних для людини і тварин збудників виявляють стійкість до дії антимікробних речовин при їх зростанні в біоплівках. Біоплівки - високовпорядковані бактеріальні угруповання, які дозволяють бактеріям жити в прикріпленому стані. Біоплівки можуть складатися з одного або кількох видів бактерій. Їх пронизує мережу водних каналів, які забезпечують доставку поживних речовин членам спільноти та видаляють продукти метаболізму. В одній біоплівці можна спостерігати різні зразки генної експресії, що говорить про те, що індивідуальні члени спільноти мають «специфічні обов'язки», які, комбінуючись з іншими, посилюють життєздатність консорціуму.

Біоплівки формуються в легенях патогенним мікроорганізмом P.aeruginosa. Товщина такої біоплівки становить кілька сотень мікрометрів. Мікроколонії в зрілій біоплівці розташовані у позаклітинному полісахаридному матриксі. Усередині біоплівки виявляється неоднорідність: у ній існує кисневий градієнт – зменшення концентрації кисню від периферії углиб. Передбачається, що подібні градієнти будуть виявлені для рН та поживних речовин. Ці градієнти забезпечують фізіологічну варіабельність серед індивідуальних клітин біоплівки: так, у глибині клітини ростуть набагато повільніше, ніж на периферії. Бактерія в такій зрілій біоплівці фенотипно стійка до бактерицидних агентів. Таким чином, біоплівки викликають різні типи хронічних бактеріальних інфекцій. Формування біоплівки у P.aeruginosaзнаходиться під контролем реакцій кворум-сенсингу. Мутації гена lasI порушує дозрівання біоплівки, оскільки білок LasI не синтезує 3-oкco-C12-HSL, і після стадії мікроколонії формування мікроплівки не продовжується. Роль C4-HSL у процесах формування залишається невідомою. Біоплівки, утворені мутантами LasI-білку, сприйнятливі до детергентів, тоді як нормальні біоплівки стійкі. Це дає привід думати, що терапія, націлена на порушення регуляції механізму кворум-сенсингу у P.aeruginosaможе призвести до зупинення формування біоплівки, що підвищить чутливість цієї бактерії до антимікробних агентів.

Формування біоплівки у патогенної бактерії Burkholderia cepaciaтакож визначається «почуттям кворуму». При зростанні в біоплівках даний мікроорганізм подібний P.aeruginosaвиявляє значну стійкість до антимікробних агентів.

Міжвидові взаємодії мікроорганізмів

Міжвидові комунікації у бактерій можуть бути синхронізації спеціалізованих функцій видів групи. Різноманітність, присутня у кожній даній популяції, може підвищувати виживання для всієї спільноти. Більше того, продуктивні взаємодії на основі кворум-сенсингу можуть сприяти розвитку багатовидових бактеріальних організацій, таких як біоплівки, а також встановленню специфічних симбіотичних асоціацій з господарями – еукаріотами.

Міжвидові взаємодії мікроорганізмів найбільш повно вивчені на прикладі мікробної спільноти ротової порожнини та поверхні зубів людини. У біоплівках на поверхні зубів виявлено близько 500 видів бактерій, які функціонують як координоване співтовариство, що має внутрішньо- та міжвидові комунікації. Стрептококи складають від 60 до 90% бактерій, що колонізують поверхню зубів протягом перших чотирьох годин після її очищення стоматологом. Серед інших видів «ранніх колонізаторів» є представники Actinomyces, Capnocytophaga, Eikenella, Haemophilus, Prevotella, Propionibacteriumі Veillonella.

Способи комунікацій серед генетично ідентичних клітин, ймовірно, відрізняються від сигналів при міжвидових комунікаціях. Немає доказів наявності серед сигнальних молекул бактерій ротової порожнини типових представників сімейства ацилгомосеринлактонів, які регулюють внутрішньовидову генну експресію у грамнегативних бактерій.

Головною сигнальною молекулою при міжвидових комунікаціях є AI-2. Підтвердженням цього є факт виявлення гена luxS, що кодує фермент, необхідний синтезу молекули AI-2, у кількох родів бактерій ротової порожнини.

AI-2 вперше був виявлений у морської бактерії, що світиться Vibrio harveyi, Для якої він є сигнальною молекулою, що регулює процес біолюмінесценції. Пізніше наявність AI-2 було показано більш ніж у 30 видів бактерій, що включають грампозитивні та грамнегативні мікроорганізми.

Іноді однієї групи бактерій може бути корисним негативно впливати на цикл реакцій кворум-сенсингу конкуруючої групи бактерій. Дослідження у цій галузі виявляють кілька прикладів стратегій антикворум-сенсингу, які використовують співіснуючі популяції бактерій. Так, Staphylococcus epidermidisвикористовує пептид для контролю рівня своєї agr вірулентності, а також для придушення вірулентності у Staphylococcus aureus.

Штам Bacillus sp. 240B1 демонструє здатність до ензиматичної інактивації ацилгомосерінлактонів – сигнальних молекул грамнегативних бактерій. Було показано, що в присутності АІА, гомосеринлактоназ, що складається з 250 амінокислот, руйнуються молекули гомосеринлактонів, що продукуються патогеном у рослин Erwinia саготовора. Гени, гомологічні гену аiiА, виявлено і в 16 підвидів Bacillus thuringiensisОтже, дані мікроорганізми також здатні здійснювати деградацію гомосеринлактонів.

Ґрунтова бактерія Variovorax paradoxusможе використовувати ацилгомосеринлактони як єдине джерело вуглецю та азоту. Цей факт вказує на те, що у своїх природних місцях проживання V.paradoxusможе зростати на ацилгомосеринлактонах, одержуючи вигоду з конкурентного загострення у навколишньому середовищі. В даному випадку фермент, що руйнує ацилгомосеринлактони, відрізняється від AiiA-лактонази: це - аміноацилаза, що відщеплює лактонне кільце від ацильної групи.

Через те, що у багатьох патогенів тварин і рослин системи кворум-сенсингу контролюють вірулентність, ці системи можна розглядати як потенційні цілі для дії антимікробних агентів. По-перше, одна із стратегій полягає в інгібуванні синтезу молекул - попередників ацилгомосеринлактонів або самих ацилгомосерінлактонів. По-друге, мішенню лікарських препаратів можуть бути системи, що контролюють викид та дифузію ацилгомосеринлактонів. По-третє, ацилгомосеринлактон-подібні антагоністи можуть конкурувати з ацилгомосеринлактонами за зв'язування з гомологами LuxR. По-четверте, можливе застосування ферментів, що розщеплюють ацилгомосеринлактони, а також антитіл до цих молекул. І, нарешті, як було показано нещодавно, гени аiiА, що кодують лактонази, що здійснюють деградацію ацилгомосеринлактонів, можуть бути впроваджені в геном рослин, експресуючись в якому вони могли б забезпечувати захист рослині-господарю від патогенних мікроорганізмів. Так, трансгенні рослини тютюну з увімкненим аiiА-геном успішно протистояли зараженню. E.carotovora.

Бактеріальні цитокіни

Виявлено, що прокаріотичні мікроорганізми синтезують речовини, схожі на хребетні гормони (включаючи стероїди та поліпептидні гормони, такі, як інсулін). Збільшується кількість даних, що наголошують на важливості хімічно опосередкованих міжклітинних взаємодій у бактеріальних культурах для таких подій, як споруляція, кон'югація, вірулентність та біолюмінесценція. Таким чином, в даний час багато досліджень у галузі мікробіології присвячені взаємодіям між мікроорганізмами, заснованими на використанні бактеріальних цитокінів.

Відомо, що мікроорганізми здатні гнучко адаптуватися до умов навколишнього середовища, що змінюються (зокрема, до нестачі поживних компонентів). При цьому деякі з них мають генетично закріплену специфічну організацію метаболізму, що дозволяє існувати при дуже низьких концентраціях поживних речовин (оліготрофи). Клітини іншої категорії (копіотрофи) при виснаженні довкілля здатні включати спеціальні програми переживання несприятливих умов. Частина з них утворюють спеціалізовані структури (спори та цисти), які надзвичайно стійкі до різних стресів, неспорулюючі ж бактерії здатні переживати несприятливі умови, залишаючись вегетативними клітинами зі зниженою метаболічною активністю, тобто. переходячи в особливий VBNC (viable but nonculturable - життєздатний, але некультивований) стан. Природно, що бактерії, що некультивуються, залишаються за рамками загальноприйнятих методів досліджень (висіви на щільні або рідкі середовища не дозволяють їх виявляти). Наприклад, збудники таких небезпечних захворювань, як холера і кампілобактеріоз, схильні утворювати форми, що не культивуються. При мікроскопічному дослідженні зразків, виділених з навколишнього середовища (ґрунт, річкові та морські води і т.д.) виявлено безліч клітин, які, володіючи метаболічною активністю, не можуть утворювати повноцінну культуру (тобто не культивуються). В даний час відомо всього кілька прикладів перетворення таких бактерій в нормальні клітини, що культивуються. Концепція цитокін-залежного зростання мікроорганізмів дозволяє по-новому розглядати проблему підбору середовищ для відновлення некультивованих форм.

Некультивовані форми патогенних бактерій виявлені у навколишньому середовищі, а й у тканинах, органах людини і тварин. Найчастіше вони сильно відрізняються морфологічно та біохімічно. Наприклад, збудник туберкульозу в тканинах утворює нетипові кокоподібні форми. Можливо, такі клітини є особливими формами, що переживають, здатними до активації і розмноження. Існування таких форм, що покоїться, може пояснити періодично виникаючі рецидиви хвороби у, здавалося б, вилікованих хворих. Показано, що клітини Mycobacterium tuberculosisможуть переходити в нереплікований коккоподібний стан у мікроаерофільних умовах in vitro, які часто виникають in vivo(наприклад, у гранульомах). Коккоподібні форми також виявлені для Campylobacter jejuniі Helicobacter pylori. Передбачається, що вони утворюються в тканинах у відповідь на вплив ліків і, можливо, є клітинами, що лежать, стійкими до дії антибіотиків. Однак дані про культивування таких форм дуже суперечливі. Можливо, такі бактерії можуть бути активовані специфічними ростовими факторами, роль яких, ймовірно, виконують цитокіни господаря. Наприклад, зростання туберкульозних бацил усередині моноцитів суттєво стимулювався трансформуючим ростовим фактором (TGF-1), тоді як зростання клітин М.tuberculosisі M.aviumусередині макрофагів значно прискорювався у присутності епідермадного ростового фактора. Очевидно, цитокінні фактори господаря можуть відігравати важливу роль і в активації бактерій, що покояться, і в розмноженні активних збудників. Зниження рівня інсуліну в крові хворих на цукровий діабет призводить до значного розмноження клітин Pseudomonas pseudomallei, які є збудниками меліоїдозу, а трансферин має велике значення для зростання та переживання всередині мишачих макрофагів клітин. Francisella tularensis.

Можливо, що специфічні бактеріальні цитокіни також відіграють істотну роль в утворенні форм, що покояться, і їх відновленні в активні клітини, що діляться. Тоді, беручи до уваги проблеми виникнення стійкості до антибіотиків, складно переоцінити важливість відшукання автокринних ростових факторів, необхідних для зростання патогенних бактерій, і, отже, є мішенню для впливу нових антибіотиків, нетоксичних для хворого.

Застосування специфічних бактеріальних цитокінів також може істотно поліпшити ситуацію з вирощуванням бактерій, що не культивуються, в середовищах, не цілком придатних для їх розмноження. Наприклад, мікрококи, що зазвичай не ростуть на мінімальному сукцинатному середовищі, починають нормально в ньому розмножуватися в присутності автокринного фактора Rpf (resuscitation-promoting factor), а відмиті клітини Mycobacterium smegmatis, які ростуть на мінімальному середовищі тільки при додаванні Rpf, виділеного з Micrococcus luteus, можна розглядати як модель популяції «голодних» бактерій у грунті, ймовірно, що вимагає початку розподілу присутності специфічного цитокіна. Застосування специфічних бактеріальних цитокінів також може істотно поліпшити ситуацію з вирощуванням бактерій, що не культивуються, в середовищах, не цілком придатних для їх розмноження. Гени, що мають схожість з геном, що кодує білок Rpf у М.luteus, Широко поширені серед грампозитивних бактерій з високим вмістом G + C, до яких належать стрептоміцети, коринебактерії та мікобактерії. Цей факт відкриває нові можливості для попередження та лікування хвороб, викликаних мікробними агентами, а також дозволяє по-іншому поглянути на складний комплекс міжвидових бактеріальних взаємодій у природних місцях проживання мікроорганізмів.

Останнє оновлення: 20.02.2004

ЛІТЕРАТУРА

1. Олескін О.В., Ботвінко І.В., Цавкелова Є.А. Колоніальна організація та міжклітинна комунікація у мікроорганізмів. Мікробіологія 2000; 69: 3: 309-327.
2. Fuqua W.С., Winans S., Greenberg Е. Quorum sensing in bacteria: Lux R-Lux I знайомство з основою репресійно-відповідних transcriptional regulators. J Bacteriol 1994; 176: 2: 269-275.
3. Meighen E. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Microbiol Rev 1991; 55:1:123-142.
4. Winans S.С., Bassler В.L. Mob психології. J Bacteriol 2002; 184: 4: 873-883.
5. Writh R., Muscholl A., Wanner G. Роль пферомонів в bacterial interactions. Trends Microbiol 1996; 4: 3: 96-103.
6. Хохлов О.С. Низькомолекулярні мікробні ауторегулятори. М: 1988;270.
7. Waldburger С., Gonzalez D., Chambliss G.H. Characterization of a new sporulation factor у Bacillus subtilis. J Bacteriol 1993; 175: 6321-6327.
8. Pestova E., Havarstein L., Morrison D. Regulation of competence for genetic transformation in Streptococcus pneumoniaeЗа допомогою auto-induced peptide pheromones і двох-компонентних регуляторних систем. Mol Microbiol 1996; 21:4: 853-862.
9. Alloing G., Martin Ст, Granadel G., Claveris J. Розвиток компетенції в Streptococcus pneumoniae: pheromonone autoinduction and control of quorum-sensing за oligopeptide permease. Ibid 1998; 9:1: 75-83.
10. Прозоров А.А. Феромони компетентності бактерій. Мікробіологія 2001; 70: 1:5-14.
11. Salmond G., Bycroft В., Stewart С., Williams P. The bacterial «enigma»: Cracking the code of cell-cell communication. Mol Microbiol 1995; 16:4:615-624.
12. Greenberg E., Winans S., Fuqua C. Quorum-sensing by bacteria. Ann Rev Microbiol 1996; 50: 727-751.
13. Otto M., Sussmuth R., Vuong C. та ін. Inhibition of virulence factor expression in Staphylococcus aureus by the Staphylococcus epidermidis agr pheromone and derivatives. FEBS Lett. 1999; 450: 257-262.
14. Dong Y., Xu J., Li X., Zhang L. AiiA, Enzyme, що inactivates acyl-homoserine lactone quorum-sensing signal і attenuates the virulence of Erwinia carotovoru. Proc Natl Acad Sci 2000; 97:7: 3526-3531.
15. Byers J., Lucas C., Salmond G., Welch М. Nonenzymatic turnover of an Erwinia carotovora quorum-sensing signaling molecule. J Bacteriol 2002; 184:4: 1163-1171.
16. Calfee М., Coleman J., Pesci E. Interference with Pseudomonas quinolone signal synthesis inhibits virulence factor expression by Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci 2001; 98: 20:11633-11637.
17. Nakayama J., Takanami Y., Horii T. та ін. Molecular mechanism of pep-tide-specific pheromone signaling in Enterococcus faecalis: функції pheromone receptor TraA і pheromone-binding protein TraC вказані за допомогою plasmid pPDI. J Bacteriol 1998: 180: 3: 449-456.
18. Mylonakis E., Engelbert М., Qin X. та ін. The Enterococcus faecalis FsrB gene, key component of the fsr quorum-sensing system, є поєднаний з virulence в rabbit endophthalmitis model. Infect Immun 2002; 70: 8: 4678-4681.
19. Sifri C., Mylonakis E., Singh V. та ін. Virulence effect of Enterococcus faecalis protease genes and quorum-sensing locust в Caenorhabditis elegans and mice. Ibid 2002; 70:10: 5647-5650.
20. Matson М., Armitage J., Hoch J., Macnab R. Bacterial locomotion and signal transduction. J Bacteriol 1998; 180: 5: 1009-1022.
21. Onaka H., Horinouchi S. DNA-binding activity of A-factor receptor protein and its recognition DNA sequences. Mol Microbiol 1997; 24: 991-1000.
22. Onaka H., Ando N., Nihira Т., Yamada Y. та ін. Cloning and characterisation of the A-factor receptor gene from Streptomyces griseus. J Bacteriol 1995; 177: 21: 6083-6092.
23. Ohnishi Y., Kameyama S., Onaka H., Horinouchi S. Streptomyces griseus: identification of target gene the A-factor receptor. Mol Microbiol 1999; 34: 102-111.
24. Yamazaki H., Ohnishi Y., Horinouchi S. An A-фактор-dependent extracytoplasmatic функція sigma factor (OAdsA), що є важливим для morphological development в Streptomyces griseus. J Bacteriol 2000; 182:16:4596-4605.
25. Kato J., Suzuki A., Yamazaki H. та ін. Управління A-фактором металоендептатидас гена впроваджено в аеріальний мічеліум формування в Streptomyces griseus. Ibid 2002; 184: 21: 6016-6025.
26. Onaka H., Nikagawa Т., Horinouchi S. Involvement of two A-factor receptor homologues in Streptomyces coelicolor A3(2) в регулюванні секційного metabolism and morphogenesis. Mol. Microbiol. 1998; 28:4: 743-753.
27. Revenchon S., Bouillant М., Salmond G., Nasser W. Erwinia chrysanthemii. Mol Microbiol 1998; 29: 1407-1418.
28. Chatterjee A., Cui Y., Chatterjee A.K. RsmA and the quorum-sensing signal, N-L-homoserine lacton, control the levels of rsmB RNA in Erwinia carotovora subsp. carotovora за впливом його stability. J Bacteriol 2002; 184:15: 4089-4095.
29. Kohler Т., Van Delden C., Curty L. та ін. Надвиразом MexEF-OprN multidrug efflux system affects cell-to-cell signaling in Pseudomonas aeruginosa. Ibid 2001; 183: 18:5213-5222.
30. Gallagher L., McKnight S., Kuznetsova М. el al. Functions required for extracellular quinolone signaling Pseudomonas aeruginosa. Ibid 2002; 184:23:6472-6480.
31. Parsek М., Greenberg P. Acyl-homoserine lactone quorum sensing в gram-negative bacteria: signaling mechanism involved in associations with higher organisms. Proc Natl Acad Sci 2000; 97: 16: 8789-8793.
32. Conway В.А., Уепі V., Speert D. Biofilm формування та акил-хомосерін lactone production in the Burkholderia cepaciaкомплекс. J Bacteriol 2002; 184:20:5678-5685.
33. Kolenbrander P., Andersen R., Blehert D. та ін. Communication among oral bacteria. Microb. Molecular Biology Rev 2002; 66: 3: 486-505.
34. Miller M., Bassler B. Quorum sensing in bacteria. Annu Rev Microbiol 2001; 55: 165-199.
35. Frias J., Olle E., Alsina M. Periodontal pathogens produce quorum sensing signal molecules. Infect Immun 2001; 69: 3431-3434.
36. McNab R., Ford S., EI-Sabaeny A. та ін. LuxS-based signaling in Streptococcus gordonii: Autoinducer 2 controls carbohydrate metabolism and biofilm формування Porphyromonas gingivalis. J Bacteriol 2003; 185: 1:274-284.
37. Bassler Ст, Wright M., Silverman M. Multiple signalling systems controlling expression of luminescence in Vibrio harveyi: sequence and function of genes encoding a second sensory pathway. Mol Microbiol 1994; 13: 273-286.
38. Ji G., Beavis R., Novick R. Bacterial interference caused by autoinducing peptide variants. Science 1997; 276: 2027-2030.
39. Lee S., Park S., Lee J., et al. Genes encoding the N-acyi homoserine lactone-degrading enzyme є widespread in many subspecies of Bacillus thuringiensis. Appl Environ Microbiol 2002; 68: 8: 3919-3924.
40. Leadbetter J., Greenberg E. Metabolism of acylhomoserine lactone quorum-sensing signals Variovorax paradoxus. J Bacteriol 2000; 182:6921-6926.
41. Hoang Т., Schweizer H. Characterization of Pseudomonas aeruginosa enoyl-acyl carrier protein reductase (Fabl): a target for antimicrobial triclosan and its role in acylated homoserine lactone synthesis. Ibid 1999; 181:. 5489-5497.
42. Pearson J., Delden C., Iglewski B. Active efflux і diffusion є впроваджені в транспорті Pseudomonas aeruginosa cell-to-cell сигнали. J. Bacteriol. 1999; 181: 1203-1210.
43. Manefield M., Welch M., Givskov G. та ін. Halogenated furanoses від červenої alga, Delisea pulchra, inhibit carbapenem antibiotic synthesis and exoenzyme virulence factor production в phytopatoge Erwinia carotovora. FEMS Microbiol Lett 2001; 205: 131-138.
44. Dong Y., Wang L., Xu J. та ін. Quenching quorum-sensing-dependent bacterial infection за N-acyl homoserine lactonase. Nature. 2001; 411:813-817.
45. Романова Ю.М., Гінцбург А.Л. Цитокіни – можливі активатори зростання патогенних бактерій. Вести РАМН 2000; 1: 13-17.
46. Barcina I., Lebaron P., Vives-Rego J. Survival of allochthonous bacteria in aquatic systems: a biological approach. FEMS Microbiol Ecol 1997; 23:1-9.
47. Heim S., Lleo M., Bonato B. та ін. Viable, але некультурний стан і starvation є різні stress responses of Enterococcus faecalis, Як визначається за proteome analysis. J Bacteriol 2002; 184:23: 6739-6745.
48. Xu H., Roberts N. Singleton F. el al. Survival and viability of nonculturable Escherichia coli and Vibrio cholerae in estuarine and marine environment. Microb Ecol 1982; 8: 313-323.
49. Kell D., Kaprelyants A., Grafen A. Pheromones, соціально-behavior та функції 2-го metabolism in bacteria. Trends In Ecology & Evolution 1995; 10: 126-129.
50. Domingue G., Woody H. Bacterial persistence and expression of disease. Clin Microbiol Rev 1997; 10: 320-328.
51. Khomenko A. variability of Mycobacterium tuberculosisу пацієнтів з каветацією pulmonary tuberculosis в курсі хімічноїтерапії. Tubercle Lung Disease 1987; 68: 243-253.
52. Gangadharam P. Mycobacterial dormancy. Tub Lung Dis 1995; 76: 477-479.
53. Wayne L. Dormancy of Mycobacterium tuberculosis and latency of disease. European J Clin Microbiol Infect Dis 1994; 13: 908-914.
54. Wayne L., Hayes L. An in vitro model for sequential study shiftdown of Mycobacterium tuberculosisЧерез 2 сцени з невідповідної persistence. Infect Immun 1996; 64: 2062-2069.
55. Beumer R., Devries J., Rombouts F. Campylobacter jejuni nonculturable coccoid cells. Intern J Food Microbiol 1992; 15: 153-163.
56. Kusters J. Gerrits M. Van Strijp J. el at. Coccoid forms of Helicobacter pyloriє morphologicky manifestation of cell death. Infect Immun 1997; 65: 3672-3679.
57. Cellini L., Hui P., Leung K. el at. Coccoid Helicobacter pylori no culturable in vitro reverts in mice. Microbiol Immun 1994; 38: 843-850.
58. Hirsch С., Yoneda T., Averill L. та ін. Наростання intracellular growth of Mycobacterium tuberculosis in human monocytes by transforming growth-factor-b-l. J. Infect Dis 1994; 170: 1229-1237.
59. Bermudez. L., Pelrofsky M. Regulation of the expression of Mycobacterium aviumскладні proteínи різняться відповідно до навколишнього середовища з host hosts. Immunol Cell Biol 1997; 75: 35-40.
60. Woods D., Jones A., Hill P. Interaction of insulin with Pseudomonas pseudomallei. Infect Immun 1993; 61: 4045-4050.
61. FortierA., Leiby D., Narayanan R. та ін. Growth of Francisella tularensis LVS в macrophages - acidic intracellular compartment provides essential iron required for growth. Ibid 1995; 65:1478-1483.
62. Duncan S., Glover L., Killham K., Prosser J. Luminescence-базований виявлення діяльності, що постраждав і вільний, але некультурні bacteria. Appl Environ Microbiol 1994; 60: 1308-1316.
63. Young D., Duncan K. Prospects for new interventions in treatment and prevention of mycobacterial disease. Ann. Rev. Microbiol. 1995; 49: 641-673.
64. Mukamolova G., Kapreilyants A., Young D. та ін. A bacterial cytokine. Proc Nat! Acad Sci USA. 1998; 95: 8916-8921.
65. Шлєєва M.О., Мукамолова Г.В., Телков M.В. та ін. Освіта «некультивованих» клітин Mycobacterium tuberculosisта їхнє пожвавлення. Мікробіологія 2003; 72: 76-83.

Як зазначалося вище, процес формування біоплівки є складним процесом, до якого залучаються багато клітинні системи. Безсумнівно, такий процес вимагає досить тонких механізмів регуляції, які б оптимізувати процес формування біоплівки і забезпечувати правильне функціонування цієї структури. Особливо гостро це питання ставиться, коли ми маємо справу з природними полівідовими біоплівками, що складаються з десятків, а то й сотень видів мікроорганізмів. Для нормального функціонування та виживання такої спільноти мікроорганізми, що входять до її складу, повинні діяти спільно і координувати свою активність, приносячи тим самим користь усьому співтовариству. Дослідження останніх сорока років дозволили виявити та описати механізми такої регуляції та їх роль у існуванні мікроорганізмів та їх угруповань.

Сьогодні вивчення процесів міжклітинної комунікації у мікроорганізмів є однією з областей сучасної мікробіології, що найбільш динамічно розвиваються, із залученням найпередовіших на сьогоднішній день методів біохімії та молекулярної генетики. Поглиблення знань про процес комунікації у мікроорганізмів відкриває широкі перспективи для спрямованого регулювання цих процесів, що є важливим, зокрема для біотехнології та медицини. Нижче буде проведено аналіз основних принципів функціонування системи міжклітинної комунікації у мікроорганізмів.

4.1. Система quorum sensing

Система міжклітинної комунікації у мікроорганізмів має назву системи quorum sensing (QS ). Сьогодні система QS визначається як система координованої експресії генів у популяції, яка залежить від показника її щільності, з використанням малих сигнальних молекул. Як уже зазначалося вище, цей механізм був вперше описаний в 1970 Нільсоном у морської бактерії Vibrio fisheriяк система регуляції біолюмінісценції. Спочатку передбачалося, що цей механізм регуляції властивий лише невеликій кількості близькоспоріднених видів роду VibrioПроте подальші дослідження показали широку поширеність цього механізму регуляції у світі мікроорганізмів. Було виявлено, що за допомогою системи QS мікроорганізми здатні регулювати багато процесів життєдіяльності, зокрема патогенність, вторинний метаболізм, формування біоплівки та багато іншого. Було показано, що система QS зустрічається не тільки у бактерій, але й у деяких нижчих еукаріотах, таких як дріжджоподібні гриби пологів Candidaі Cryptococcus. Понад те, виявилося, що з допомогою цієї системи мікроорганізми здатні взаємодіяти як з собі подібними, а й здійснювати міжцарську комунікацію, зокрема і з вищими еукаріотами .

У загальному випадку функціонування системи QS базується на низці ключових принципів (рис. 12):

Використання малих сигнальних молекул - у системі QS передача сигналу від однієї клітині до іншої здійснюється за допомогою сигнальних молекул різної хімічної природи.

Наявність специфічних рецепторів – сигнальні молекули впливають на експресію генів-мішеней на пряму. Активація генів-мішеней відбувається лише після зв'язування сигнальних молекул із відповідними рецепторами.

Вплив щільності популяції клітин – запуск системи QS здійснюється лише після досягнення певного значення щільності популяції клітин, що корелює з концентрацією сигнальних молекул у зовнішньому середовищі.

Самопідтримка функціонування – контроль синтезу нових сигнальних молекул і рецепторів здійснюється так само, як і генів-мішеней без активації систем репресії.

Наявність механізмів вибіркової негативної регуляції – у клітинах мікроорганізмів є як залежні, і не залежні від QS гени негативної регуляції, продукти яких здатні вибірково відключати цілі ланки системи QS чи всю систему загалом.

Мал. 12. Загальна схема функціонування системи quorum sensing.

Дані принципи є загальними практично всім типів систем QS незалежно від своїх конкретної структурної організації. Запуск системи QS зазвичай збігається за часом з ранньою стадією експоненціального зростання, для якої характерне швидке зростання щільності популяції клітин. Експресія генів-мішеней навпаки зазвичай починається з виходом популяції клітин в стаціонарну фазу, і зазвичай є комплексною, тобто, передбачає початок біосинтезу практично всіх регульованих за допомогою QS продуктів в короткий проміжок часу . Таким чином, ранні етапи роботи системи QS полягають у забезпеченні біосинтезу сигнальних молекул і рецепторів до них, до певного моменту, що збігається з накопиченням максимальної концентрації сигнальних молекул у міжклітинному просторі, по досягненню якої робота системи QS переходить у стан, що самопідтримується.

Механізми, що лежать в основі ранньої активації системи QS, сьогодні остаточно не з'ясовані. Незважаючи на те, що виявлено велику кількість різних регуляторів, яким приписується певна роль ранньої активації системи, багато питань залишаються не вирішеними. Насамперед, не зрозуміло, як регулюється первинне накопичення сигнальних молекул і рецепторів до них. Існує гіпотеза про те, що певна кількість сигнальних молекул і рецепторів до них присутня в клітинах постійно, і первинне їх накопичення відбувається за тим же механізмом, що самопідтримується, при цьому на синтез сигнальних молекул і рецепторів витрачається частина внутрішньоклітинного пулу цих сполук. Решта ж частина виводиться з клітин і після досягнення порогової концентрації реабсорбується і запускає експресію генів-мішеней. Проте, з особливостей функціонування деяких типів системи QS, подібне бачиться малоймовірним. James P. Pearson, навпаки, вважає, що первинний запуск QS здійснюється за допомогою неспецифічних регуляторів транскрипції таких як MvaT і Vfr (V irulence f actors r egulator) Pseudomonas aeruginosa, і система перетворюється на самопідтримується стан значно пізніше .

Система міжклітинної комунікації у мікроорганізмів має назву системи quorum sensing (QS ). Сьогодні система QS визначається як система координованої експресії генів у популяції, яка залежить від показника її щільності, з використанням малих сигнальних молекул. Як уже зазначалося вище, цей механізм був вперше описаний в 1970 Нільсоном у морської бактерії Vibrio fisheriяк система регуляції біолюмінесценції. Спочатку передбачалося, що цей механізм регуляції властивий лише невеликій кількості близькоспоріднених видів роду VibrioПроте подальші дослідження показали широку поширеність цього механізму регуляції у світі мікроорганізмів. Було виявлено, що за допомогою системи QS мікроорганізми здатні регулювати багато процесів життєдіяльності, зокрема патогенність, вторинний метаболізм, формування біоплівки та багато іншого. Було показано, що система QS зустрічається не тільки у бактерій, але й у деяких нижчих еукаріотах, таких як дріжджоподібні гриби пологів Candidaі Cryptococcus. Понад те виявилося, що з допомогою цієї системи мікроорганізми здатні взаємодіяти як з собі подібними, а й здійснювати міжцарську комунікацію, зокрема і з вищими еукаріотами .

У загальному випадку функціонування системи QS базується на низці ключових принципів (рис. 11):

1. Використання малих сигнальних молекул – у системі QS передача сигналу з однієї клітині до іншої здійснюється з допомогою сигнальних молекул різної хімічної природи.

2. Наявність специфічних рецепторів – сигнальні молекули впливають на експресію генів-мішеней на пряму. Активація генів-мішеней відбувається лише після зв'язування сигнальних молекул із відповідними рецепторами.

3. Вплив щільності популяції клітин - запуск системи QS здійснюється лише після досягнення певного значення щільності популяції клітин, що корелює з концентрацією сигнальних молекул у зовнішньому середовищі.

4. Самопідтримка функціонування – контроль синтезу нових сигнальних молекул і рецепторів здійснюється так само, як і генів-мішеней без активації систем репресії.

5. Наявність механізмів вибіркової негативної регуляції – у клітинах мікроорганізмів є як залежні, і не залежні від QS гени негативної регуляції, продукти яких здатні вибірково відключати цілі ланки системи QS чи всю систему загалом.

Мал. 11. Загальна схема функціонування системи quorum sensing.

Дані принципи є загальними практично всім типів систем QS незалежно від своїх конкретної структурної організації. Запуск системи QS зазвичай збігається за часом з ранньою стадією експоненціального зростання, для якої характерне швидке зростання щільності популяції клітин. Експресія генів-мішеней навпаки зазвичай починається з виходом популяції клітин в стаціонарну фазу, і зазвичай є комплексною, тобто, передбачає початок біосинтезу практично всіх регульованих за допомогою QS продуктів в короткий проміжок часу . Таким чином, ранні етапи роботи системи QS полягають у забезпеченні біосинтезу сигнальних молекул і рецепторів до них, до певного моменту, що збігається з накопиченням максимальної концентрації сигнальних молекул у міжклітинному просторі, по досягненню якої робота системи QS переходить у стан, що самопідтримується.

Механізми, що лежать в основі ранньої активації системи QS, сьогодні остаточно не з'ясовані. Незважаючи на те, що виявлено велику кількість різних регуляторів, яким приписується певна роль ранньої активації системи, багато питань залишаються не вирішеними. Насамперед, не зрозуміло, як регулюється первинне накопичення сигнальних молекул і рецепторів до них. Існує гіпотеза про те, що певна кількість сигнальних молекул і рецепторів до них присутня в клітинах постійно, і первинне їх накопичення відбувається за тим же механізмом, що самопідтримується, при цьому на синтез сигнальних молекул і рецепторів витрачається частина внутрішньоклітинного пулу цих сполук. Решта ж частина виводиться з клітин і після досягнення порогової концентрації реабсорбується і запускає експресію генів-мішеней. Проте, з особливостей функціонування деяких типів системи QS, подібне бачиться малоймовірним. James P. Pearson, навпаки, вважає, що первинний запуск QS здійснюється за допомогою неспецифічних регуляторів транскрипції, таких як MvaT і Vfr (V irulence f actors r egulator) Pseudomonas aeruginosa, і система перетворюється на самопідтримується стан значно пізніше .