Якісне визначення вітаміну а. Якісні реакції на вітаміни. Кількісне визначення вітаміну С. Метод визначення вітаміну С у сульфітованих сушених продуктах

Вступ……………………………………………………………2

1. Загальний огляд методів визначення вітамінів…………………3

2. Хроматографічні методи визначення вітамінів…………5

3. Електрохімічні методи визначення вітамінів…………10

4. Інверсійно-вольтамперометричний метод визначення

водорозривних вітамінів B 1 B 2 у харчових продуктах………..13

Заключение………………………………………………………...18

Вступ

В даний час на ринку з'явилася величезна кількість вітамінізованих продуктів харчування для людини і кормів для тварин, що є сухими багатокомпонентними сумішами. Асортимент таких продуктів представлений досить широко. Це насамперед біологічно активні добавки до їжі, премікси, комбікорми для тварин та птахів, полівітамінні препарати. Критерієм якості таких продуктів може бути їх аналіз на вміст вітамінів і, особливо, таких життєво необхідних, як водорозчинні та жиророзчинні вітаміни, кількість яких регламентується нормативними документами та санітарними нормами якості.

Для визначення вітамінів застосовують різноманітні методи. Широко використовуються оптичні методи аналізу трудомісткості, вимагають великих витрат часу та дорогих реактивів, застосування хроматографічних методів ускладнене використанням дорогого обладнання. З кожним роком розширюється асортимент та збільшується виробництво продуктів харчування, удосконалюється рецептура дитячого харчування. Це у свою чергу пред'являє підвищені вимоги до контролю за якістю продукції та вдосконалення методів визначення вітамінів. Медико-біологічні вимоги та санітарні норми якості продовольчої сировини та харчових продуктів характеризують харчову цінність більшості видів та груп продуктів дитячого харчування різного призначення.

1. Загальний огляд методів визначення вітамінів

Майже всі вітаміни легко піддаються окисленню, ізомеризації та руйнуються під впливом високої температури, світла, кисню повітря, вологи та інших факторів.

З існуючих методів визначення вітаміну С (аскорбінової кислоти) найбільш широко застосовують метод візуального і потенціометричного титрування розчином 2,6-ди-хлорфеноліндофенолу за ГОСТ 24556-81, заснований на властивостях, що редукують аскорбінової кислоти і її здатності відновлювати 2,6-ДХФІ. Темно-синє забарвлення цього індикатора при додаванні аскорбінової кислоти переходить у безбарвне. Важливе значення має приготування екстракту продукту, що досліджується. Найкращим екстрагентом є 6% розчин метафосфорної кислоти, який інактивує аскорбінотоксидазу і осаджує білки.

Каротин у рослинній сировині, концентратах та безалкогольних напоях контролюють фізико-хімічним методом за ГОСТ 8756.22-80. Метод ґрунтується на фотометричному визначенні масової частки каротину в розчині, отриманому в процесі екстрагування продуктів органічним розчинником. Попередньо розчин очищають від супутніх барвників за допомогою колонкової хроматографії. Каротин легко розчиняється в органічних розчинниках (ефір, бензин та ін) і надає їм жовтого забарвлення. Для кількісного визначення каротину використовують адсорбційну хроматографію на колонках з оксидом алюмінію та магнію. Таке визначення пігментів на колонці залежить від активності адсорбенту, кількості пігментів, а також присутності інших компонентів у суміші, що розділяється. Суха суміш окису алюмінію затримує каротин, а волога пропускає в розчин інші барвники.

Тіамін в основному знаходиться у зв'язаному стані у вигляді дифосфорного ефіру – кокарбоксилази, яка є активною групою ряду ферментів. За допомогою кислотного гідролізу та під впливом ферментів тіамін звільняється із зв'язаного стану. Цим способом визначають кількість тіаміну. Для розрахунку вмісту вітаміну B1 використовують флюрометричний метод, який застосовують визначення тіаміну в харчових продуктах. Він заснований на здатності тіаміну утворювати в лужному середовищі з феррнціаннд калня тіохром, який дає інтенсивну флюоресценцію в бутиловому спирті. Інтенсивність процесу контролюють на флюорометрі ЕФ-ЗМ.

У продуктах харчування та напоях рибофлавін присутній у зв'язаному стані, тобто у формі фосфорних ефірів, пов'язаних з білком. Щоб визначити кількість рибофлавіну в продуктах, необхідно звільнити його із зв'язаного стану шляхом кислотного гідролізу та обробки ферментними препаратами. Вітамін B1 у безалкогольних напоях розраховують за допомогою хімічного методу для визначення кількості легкогідролізованих та міцно пов'язаних форм рибофлавіну в тканинах. Метод ґрунтується на здатності рибофлавіну до флюоресценції до та після відновлення його гіпосульфітом натрію. Визначення загального змісту фенольних сполук. Для цього використовують колориметричний метод Фоліна - Дениса, який ґрунтується на утворенні блакитних комплексів при відновленні вольфрамової кислоти під дією поліфенолів з реагентом у лужному середовищі. Фенольні сполуки визначають за хлорогеновою кислотою методом полум'яної фотометрії на приладі ЕКФ-2.

2. Хроматографічні методи визначення вітамінів

Останнім часом там бурхливий розвиток переживає метод високоефективної рідинної хроматографії. Це пов'язано насамперед з появою прецизійних рідинних хроматографів, удосконаленням техніки виконання аналізу. Широке використання методу ВЕРХ щодо вітамінів знайшло свій відбиток й у числі публікацій. На сьогоднішній день більше половини всіх опублікованих робіт з аналізу як водо-, так і жиророзчинних вітамінів присвячено застосуванню цього методу. Широке поширення при визначенні вітамінів набули різні варіанти хроматографії.

Для очищення токоферолу від сторонніх домішок використовують метод тонкошарової хроматографії У поєднанні зі спектрофотометричними та флуориметричними методами цим способом проводять і кількісне визначення вітаміну Е.

Аналіз ізомерів токоферолу в оливковій олії проводиться методом газо-рідинної хроматографії. Методики аналізу ГХ та ГРХ вимагають отримання летких похідних, що дуже важко при аналізі жиророзчинних вітамінів. З цієї причини дані способи визначення не набули великого поширення. Визначення вітаміну Е у харчових продуктах, фармпрепаратах та біологічних об'єктах проводять у градієнтному та ізократичному режимах як у нормально-фазових, так і у обернено-фазових умовах. Як адсорбенти використовують силікагель (СГ), кізельгур, силасорб, ODS-Гіперсил та інші носії. Для безперервного контролю складу елюату в рідинній хроматографії при аналізі вітамінів та збільшення чутливості визначення використовують УФ (А,=292 нм), спектрофотометричний (Х=295нм), флуоресцентний (Х,=280/325нм), електрохімічний, ПМР- та мас-спектроскоп детектори.

Більшість дослідників для поділу сумішей всіх восьми ізомерів токоферолів та їх ацетатів вважають за краще використовувати адсорбційну хроматографію. У цих випадках рухомий фазою зазвичай служать вуглеводні, що містять незначні кількості будь-якого простого ефіру. Перелічені методики визначення вітаміну Е, як правило, не передбачають попереднього омилення зразків, що суттєво скорочує час виконання аналізу.

Поділ з одночасним кількісним визначенням вмісту жиророзчинних вітамінів (А, Д, Е, К) при їх спільній присутності в полівітамінних препаратах проводять як на прямій, так і зверненій фазах. При цьому більшість дослідників вважають за краще використовувати обернено-фазовий варіант ВЕРХ. Метод ВЕРХ дозволяє аналізувати водорозчинні вітаміни В1 та В2 як одночасно, так і окремо. Для поділу вітамінів використовують обернено-фазний, іоно-парний та іонообмінний варіанти ВЕРХ. Застосовують як ізократичний, і градієнтний режими хроматографування. Попереднє відділення визначених речовин від матриці здійснюють шляхом ферментативного та кислотного гідролізу проби.

Переваги методу рідинної хроматографії:

Одночасне визначення кількох компонентів

Усунення впливу компонентів, що заважають

Комплекс можна швидко перебудувати виконання інших аналізів.

Склад та характеристика обладнання та програмного забезпечення для рідинного хроматографа "Хромос ЖХ-301":

Таблиця 1

Позитивні якості хроматографа "Хромос ЖХ-301":

Висока стабільність та точність підтримки витрати елюентів забезпечується конструкцією насосів високого тиску.

Легкий доступ до колонок забезпечується конструкцією приладу.

Ефективність поділу забезпечується використанням високоефективних хроматографічних колонок.

Широкий лінійний діапазон вимірювального сигналу детекторів без перемикання межі вимірювання, що дозволяє з високою точністю вимірювати піки як великої, так і малої концентрації.

Хроматограма аналізу водорозчинних вітамінів:

1 аскорбінова кислота (C),
2 нікотинова кислота (Niacin),
3 піридоксин (B6),
4 тіамін (B1),
5 нікотинамід (B3),
6 фолієва кислота (M),
7 ціанокобаламін (B12),
8 рибофлавін (B2).

Хроматограма аналізу жиророзчинних вітамінів:

1. Вітамін А
2. токол
3. y-токоферол
4. a-токоферол (Вітамін E)
5. лютеїн
6. зеаксантин
7. криптоксантин

8. a-каротин

Незважаючи на високу чутливість методу ВЕРХ, висока вартість приладів та тривалість аналізу з урахуванням часу пробопідготовки суттєво обмежує його застосування в аналітичних лабораторіях нашої країни.

Вступ……………………………………………………………2

1. Загальний огляд методів визначення вітамінів…………………3

2. Хроматографічні методи визначення вітамінів…………5

3. Електрохімічні методи визначення вітамінів…………10

4. Інверсійно-вольтамперометричний метод визначення

водорозривних вітамінів B 1 B 2 у харчових продуктах………..13

Заключение………………………………………………………...18

Вступ

В даний час на ринку з'явилася величезна кількість вітамінізованих продуктів харчування для людини і кормів для тварин, що є сухими багатокомпонентними сумішами. Асортимент таких продуктів представлений досить широко. Це насамперед біологічно активні добавки до їжі, премікси, комбікорми для тварин та птахів, полівітамінні препарати. Критерієм якості таких продуктів може бути їх аналіз на вміст вітамінів і, особливо, таких життєво необхідних, як водорозчинні та жиророзчинні вітаміни, кількість яких регламентується нормативними документами та санітарними нормами якості.

Для визначення вітамінів застосовують різноманітні методи. Широко використовуються оптичні методи аналізу трудомісткості, вимагають великих витрат часу та дорогих реактивів, застосування хроматографічних методів ускладнене використанням дорогого обладнання. З кожним роком розширюється асортимент та збільшується виробництво продуктів харчування, удосконалюється рецептура дитячого харчування. Це у свою чергу пред'являє підвищені вимоги до контролю за якістю продукції та вдосконалення методів визначення вітамінів. Медико-біологічні вимоги та санітарні норми якості продовольчої сировини та харчових продуктів характеризують харчову цінність більшості видів та груп продуктів дитячого харчування різного призначення.

1. Загальний огляд методів визначення вітамінів

Майже всі вітаміни легко піддаються окисленню, ізомеризації та руйнуються під впливом високої температури, світла, кисню повітря, вологи та інших факторів.

З існуючих методів визначення вітаміну С (аскорбінової кислоти) найбільш широко застосовують метод візуального і потенціометричного титрування розчином 2,6-ди-хлорфеноліндофенолу за ГОСТ 24556-81, заснований на властивостях, що редукують аскорбінової кислоти і її здатності відновлювати 2,6-ДХФІ. Темно-синє забарвлення цього індикатора при додаванні аскорбінової кислоти переходить у безбарвне. Важливе значення має приготування екстракту продукту, що досліджується. Найкращим екстрагентом є 6% розчин метафосфорної кислоти, який інактивує аскорбінотоксидазу і осаджує білки.

Каротин у рослинній сировині, концентратах та безалкогольних напоях контролюють фізико-хімічним методом за ГОСТ 8756.22-80. Метод ґрунтується на фотометричному визначенні масової частки каротину в розчині, отриманому в процесі екстрагування продуктів органічним розчинником. Попередньо розчин очищають від супутніх барвників за допомогою колонкової хроматографії. Каротин легко розчиняється в органічних розчинниках (ефір, бензин та ін) і надає їм жовтого забарвлення. Для кількісного визначення каротину використовують адсорбційну хроматографію на колонках з оксидом алюмінію та магнію. Таке визначення пігментів на колонці залежить від активності адсорбенту, кількості пігментів, а також присутності інших компонентів у суміші, що розділяється. Суха суміш окису алюмінію затримує каротин, а волога пропускає в розчин інші барвники.

Тіамін в основному знаходиться у зв'язаному стані у вигляді дифосфорного ефіру – кокарбоксилази, яка є активною групою ряду ферментів. За допомогою кислотного гідролізу та під впливом ферментів тіамін звільняється із зв'язаного стану. Цим способом визначають кількість тіаміну. Для розрахунку вмісту вітаміну B1 використовують флюрометричний метод, який застосовують визначення тіаміну в харчових продуктах. Він заснований на здатності тіаміну утворювати в лужному середовищі з феррнціаннд калня тіохром, який дає інтенсивну флюоресценцію в бутиловому спирті. Інтенсивність процесу контролюють на флюорометрі ЕФ-ЗМ.

У продуктах харчування та напоях рибофлавін присутній у зв'язаному стані, тобто у формі фосфорних ефірів, пов'язаних з білком. Щоб визначити кількість рибофлавіну в продуктах, необхідно звільнити його із зв'язаного стану шляхом кислотного гідролізу та обробки ферментними препаратами. Вітамін B1 у безалкогольних напоях розраховують за допомогою хімічного методу для визначення кількості легкогідролізованих та міцно пов'язаних форм рибофлавіну в тканинах. Метод ґрунтується на здатності рибофлавіну до флюоресценції до та після відновлення його гіпосульфітом натрію. Визначення загального змісту фенольних сполук. Для цього використовують колориметричний метод Фоліна - Дениса, який ґрунтується на утворенні блакитних комплексів при відновленні вольфрамової кислоти під дією поліфенолів з реагентом у лужному середовищі. Фенольні сполуки визначають за хлорогеновою кислотою методом полум'яної фотометрії на приладі ЕКФ-2.

2. Хроматографічні методи визначення вітамінів

Останнім часом там бурхливий розвиток переживає метод високоефективної рідинної хроматографії. Це пов'язано насамперед з появою прецизійних рідинних хроматографів, удосконаленням техніки виконання аналізу. Широке використання методу ВЕРХ щодо вітамінів знайшло свій відбиток й у числі публікацій. На сьогоднішній день більше половини всіх опублікованих робіт з аналізу як водо-, так і жиророзчинних вітамінів присвячено застосуванню цього методу. Широке поширення при визначенні вітамінів набули різні варіанти хроматографії.

Для очищення токоферолу від сторонніх домішок використовують метод тонкошарової хроматографії У поєднанні зі спектрофотометричними та флуориметричними методами цим способом проводять і кількісне визначення вітаміну Е.

Аналіз ізомерів токоферолу в оливковій олії проводиться методом газо-рідинної хроматографії. Методики аналізу ГХ та ГРХ вимагають отримання летких похідних, що дуже важко при аналізі жиророзчинних вітамінів. З цієї причини дані способи визначення не набули великого поширення. Визначення вітаміну Е у харчових продуктах, фармпрепаратах та біологічних об'єктах проводять у градієнтному та ізократичному режимах як у нормально-фазових, так і у обернено-фазових умовах. Як адсорбенти використовують силікагель (СГ), кізельгур, силасорб, ODS-Гіперсил та інші носії. Для безперервного контролю складу елюату в рідинній хроматографії при аналізі вітамінів та збільшення чутливості визначення використовують УФ (А,=292 нм), спектрофотометричний (Х=295нм), флуоресцентний (Х,=280/325нм), електрохімічний, ПМР- та мас-спектроскоп детектори.

Більшість дослідників для поділу сумішей всіх восьми ізомерів токоферолів та їх ацетатів вважають за краще використовувати адсорбційну хроматографію. У цих випадках рухомий фазою зазвичай служать вуглеводні, що містять незначні кількості будь-якого простого ефіру. Перелічені методики визначення вітаміну Е, як правило, не передбачають попереднього омилення зразків, що суттєво скорочує час виконання аналізу.

Поділ з одночасним кількісним визначенням вмісту жиророзчинних вітамінів (А, Д, Е, К) при їх спільній присутності в полівітамінних препаратах проводять як на прямій, так і зверненій фазах. При цьому більшість дослідників вважають за краще використовувати обернено-фазовий варіант ВЕРХ. Метод ВЕРХ дозволяє аналізувати водорозчинні вітаміни В1 та В2 як одночасно, так і окремо. Для поділу вітамінів використовують обернено-фазний, іоно-парний та іонообмінний варіанти ВЕРХ. Застосовують як ізократичний, і градієнтний режими хроматографування. Попереднє відділення визначених речовин від матриці здійснюють шляхом ферментативного та кислотного гідролізу проби.

Переваги методу рідинної хроматографії:

Одночасне визначення кількох компонентів

Усунення впливу компонентів, що заважають

Комплекс можна швидко перебудувати виконання інших аналізів.

Склад та характеристика обладнання та програмного забезпечення для рідинного хроматографа "Хромос ЖХ-301":

Таблиця 1

Позитивні якості хроматографа "Хромос ЖХ-301":

Висока стабільність та точність підтримки витрати елюентів забезпечується конструкцією насосів високого тиску.

Легкий доступ до колонок забезпечується конструкцією приладу.

Ефективність поділу забезпечується використанням високоефективних хроматографічних колонок.

Широкий лінійний діапазон вимірювального сигналу детекторів без перемикання межі вимірювання, що дозволяє з високою точністю вимірювати піки як великої, так і малої концентрації.

Хроматограма аналізу водорозчинних вітамінів:

У статті представлені результати експериментальних досліджень щодо вибору методу та розробки методики кількісного визначення філлохінону (вітаміну К1) у рослинах. Обґрунтовано перевагу хроматографічного методу (навернено-фазової ВЕРХ) перед спектрофотометричним щодо філлохінону у складі комплексу БАВ рослин. Відповідно до рекомендацій Міжнародної конференції з гармонізації технічних вимог до реєстрації лікарських засобів для застосування у людини була проведена валідація розробленої методики за показниками специфічність, лінійність, відтворюваність та точність. Встановлено, що запропонована методика є специфічною, лінійною, відтворюваною та точною. На прикладі фармакопейних видів сировини, що містять вітамін К1, доведено універсальність застосування методики при аналізі рослинних об'єктів.

філлохінон

вітамін К1

кропиви листя

калини кора

кукурудзи стовпчики з приймочками

грицики трава

валідація

1. Абишев А. З. Синтез, властивості та контроль якості вітамінних препаратів та вітаміноподібних речовин: навчально-методичний посібник / А. З. Абишев, С.М. Трусов, Н.І. Котова, М. П. Блінова. - СПб. : Вид-во СПФХА, 2010. - 136 с.

2. ГОСТ Р ИСО 5725-2002 «Точність (правильність і прецизійність) методів та результатів вимірів» О 6 год. – Введ. 23.04.02. - М.: Держстандарт Росії; Вид-во стандартів, 2002.

3. Державна фармакопея СРСР. Вип. 2 Загальні методи аналізу. Лікарська рослинна сировина / МОЗ СРСР. - 11-е вид., Дод. - М., 1989. - 400 с.

4. Норми фізіологічних потреб у енергії та харчових речовин для різних груп населення Російської Федерації. Методичні рекомендації МР 2.3.1.2432-08

5. Носов А. М. Лікарські рослини. - М.: ЕКСМО-Прес, 1999. - 350 с.

6. Погодін І.С., Лукша Є.А. Розробка методики кількісного визначення сесквітерпенових лактонів у траві соссюреи гіркої // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2013. - № 1; URL: www.сайт/107-8426

Вступ

Вітамін К відноситься до класу жиророзчинних вітамінів, що впливають на систему гемостазу. До природних вітамінів групи К відносяться два типи метильованих хіноїдних сполук з бічними ланцюгами, представленими ізопреноїдними ланками: вітаміни К1 і К2. В основі структури вказаних вітамінів лежить система 1,4-нафтохінону. Вітамін К1 (філохінон) синтезується всіма фотосинтезуючими організмами. Вітамін К 2 (менахінон) синтезується мікрофлорою товстого кишківника. Біологічна роль вітамінів групи К полягає в активації факторів згортання та протизгортання систем ссавців.

В даний час визначено фізіологічну потребу у вітаміні К для дорослих – 120 мкг/добу та для дітей – від 30 до 75 мкг/добу.

У медичній практиці препарати рослинного походження, що містять філлохінон, використовуються для корекції геморагічних ускладнень. До Державної фармакопеї 11 видання включені такі види лікарської рослинної сировини, що мають гемостатичний вітамін К-залежний ефект: кора калини (Соrtex Viburni), стовпчики з приймочками кукурудзи (Styli cum stigmatis Zeae maydis), листя кропиви (F Herba Bursae pastoris). Встановлено, що вітамін К 1 також міститься в траві деревію, горця перцевого, горця ниркового та споришу, що визначає можливість застосування зазначеної сировини при шлункових, маткових та гемороїдальних кровотечах. У Державній фармакопеї нині відсутні методики визначення філохінону в рослинній сировині. Для оцінки доцільності використання лікарської рослинної сировини як джерела вітаміну К1, актуальною проблемою є вирішення питань стандартизації та розробки методик, спрямованих на визначення вмісту філлохінону в рослинних об'єктах.

Мета роботи: розробка методики визначення вітаміну К1 у лікарській рослинній сировині.

Матеріали та методи дослідження

Об'єктами дослідження були офіцинальні види лікарської рослинної сировини: кора калини, стовпчики з приймочками кукурудзи, листя кропиви, трава грициків. Усі види сировини було придбано через аптечні мережі. Вибір раціонального способу визначення вітаміну К 1 проводили на підставі оцінки валідаційних характеристик, отриманих за допомогою хроматографічних та спектрофотометричних методів аналізу. Для розробки методики кількісного визначення філлохінону в рослинній сировині використовували метод обернено-фазової високоефективної хроматографії високого тиску (ВЕРХ) з діодно-матричним детектором на приладі Shimadzu LC-20 Prominence в ізократичному режимі в наступних умовах: аналітична колонка 0 4,6 х250 мм, з розміром частинок 5 мкм; склад рухомої фази: ацетонітрил-ізопропанол-вода у співвідношенні 75:20:5; детектування при довжині хвилі 254 нм; температура колонки – кімнатна; швидкість рухомої фази 1 мл/хв; обсяг проби, що вводиться 20 мкл. Оцінку результатів проводили за величиною часу утримування (t r) філлохінону, що збігається з показником t r РСО (20.00±1.00 хв.) та за величиною площі піку філлохінону. Обробку результатів робили з використанням програмного забезпечення LC Solutions.

Спектрофотометричне визначення вмісту вітаміну К 1 проводили на приладі UNICO 2802S у кварцовій кюветі з товщиною шару 1 см.

Обробку результатів виконували за допомогою програми STATISTICA 8.0. Для опису отриманих результатів після перевірки нормальності розподілу наводили значення середнього (X ср), стандартного відхилення (S), відносного стандартного відхилення (RSD), дисперсії (S 2), довірчого інтервалу середнього (Δx ср) при рівні значимості α=0 05.

Як стандартний зразок використовували робочий стандартний зразок (РСО) вітаміну К 1 виділеного методом препаративної колонкової хроматографії з гексанового вилучення листя кропиви дводомної. Робочий стандартний зразок являє собою жовту в'язку маслянисту рідину, що не висихає, практично не розчинну у воді, розчинну в органічних розчинниках і рослинних оліях, температура плавлення -20ºС. Спектральні характеристики спиртового розчину робочого стандартного зразка (після видалення гексану) представлені на рис. 1.

Мал. 1. Спектр в УФ-і видимій ділянці розчину РСО філлохінону (вітаміну К1)

Для максимального вилучення вітаміну К1 з досліджуваних зразків підбирали такі параметри пробопідготовки: ступінь подрібненості сировини, вид екстрагента, кількісні співвідношення сировини та екстрагента, час та кратність екстракції, температурний та світловий режим екстрагування.

Результати та обговорення. З метою розробки оптимального способу визначення вмісту вітаміну К 1 були підібрані умови для його вилучення з сировини. Як об'єкт для розробки методики служило листя кропиви. З урахуванням нестійкості філлохінону до впливу світлової енергії, всі етапи дослідження проводили в умовах, що передбачають захист витягів від світла. Повноту вилучення визначали методом ВЕРХ за величиною площі піку з t r 20.00±2.00 хв. В результаті оцінки впливу факторів пробопідготовки на повноту вилучення філлохінону були підібрані наступні параметри та умови: подрібненість сировини - частки, що проходять крізь сито з величиною діаметра отворів 0,5 мм; екстрагент – гексан; кількісне співвідношення «сировина: екстрагент» – 1:25; одноразова експозиція протягом 60 хв.; температурний режим – кімнатна температура (20-22ºС).

Для розробки методики визначення вітаміну К 1 в рослинах спектрофотометричним методом попередньо було проведено порівняльний аналіз спектрів поглинань витягів з фармакопейної сировини (рис. 2) та розчину РСО філлохінону (рис. 1). В результаті було встановлено, що довести присутність вітаміну К1 в сировині за референтним максимумом (249 нм) не представляється можливим через відсутність цього максимуму в спектрі всіх досліджуваних об'єктів. Отже, методика визначення вітаміну К1 у сумарному комплексі біологічно активних речовин рослинної сировини прямим спектрофотометричним методом спочатку не може бути позитивно провалідована за показником «специфічність». Підвищити показник специфічності методики під час використання спектрофотометрії можна за умови вилучення з сировини очищеного філлохінону, що потребує запровадження додаткових препаративних маніпуляцій на стадії пробопідготовки об'єкта дослідження. Додаткове очищення вилучення може негативно вплинути на експресність та точність методики в кінцевому результаті.

Малюнок 2 - Спектри поглинання витягів з лікарської рослинної сировини, що містить філлохінон (Кр - листя кропиви, К - кора калини, Ку - стовпчики з приймочками кукурудзи, П - трава грициків)

Найбільш прийнятним варіантом для визначення вітаміну К 1 в рослинній сировині є використання методу звернено-фазової високоефективної хроматографії високого тиску (ВЕРХ) з діодно-матричним детектором. За розробленими параметрами пробопідготовки сировини до аналізу було розроблено таку методику: аналітичну пробу сировини подрібнюють до розміру частинок, що проходять крізь сито з отворами діаметром 0,5 мм. Близько 1,0 г (точна навішування) подрібненої сировини поміщають у конічну колбу місткістю 50 мл, заливають 25 мл гексану, закривають пробкою і перемішують на механічному струшувачі протягом 60 хвилин. Вилучення фільтрують через паперовий фільтр у круглодонну колбу і відганяють гексан на ротаційному випарнику. Залишок кількісно переносять у мірну колбу на 5 мл (пікнометр) за допомогою 4 мл етанолу. Доводять об'єм розчину до мітки тим самим розчинником і перемішують. 0,02 мл розчину вводять у хроматограф.

Приготування стандартного зразка: До 0,0005 г (точне навішування) РСО філлохінону доливають 4 мл етанолу, переносять у мірну колбу місткістю 5 мл. Доводять об'єм розчину до мітки розчинником і перемішують. 0,02 мл розчину вводять у хроматограф.

Вміст філохінону (X) у абсолютно сухій сировині у відсотках обчислюють за формулою:

де S o - площа піку на хроматограмі розчину РСО філлохінону; S - площа піку філлохінону на хроматограмі випробуваного розчину; m o - навішування РСО філлохінону, в г; m - навішування сировини, г; W - втрата в масі при висушуванні сировини, %; Р - вміст філлохінону в РСО філлохінону, %.

За результатами кількісного визначення філлохінону методом обернено-фазової ВЕРХ було визначено вміст вітаміну К1 у листі кропиви (табл. 1).

Таблиця 1 - Метрологічна характеристика методу кількісного визначення філлохінону в листі кропиви (%) (n=6)

Зважаючи на малий вміст вітаміну К1 у сировині пропонуємо проводити розрахунки в мг%, для цього необхідно внести зміни до розрахункової формули для перекладу одиниць вимірювання (г в мг):

Валідаційну оцінку методики проводили за показниками - специфічність, лінійність, прецизійність (відтворюваність) та точність.

Специфіка. Ідентифікація філлохінону підтверджувалася збігом часу утримання аналізованого компонента в сировині та РСО філлохінону (рис. 3). Піки супутніх сполук, що входять до складу витягів рослинної сировини, добре поділяються з піком філлохінону, і не впливають на аналітичне визначення.

Мал. 3. Хроматограма вилучення листя кропиви (А - пік 17,tr =20.37 хв відповідає філлохінону) та робочого стандартного зразка філлохінону (Б - пік 22 ,tr =20.71 хв)

Лінійність та аналітична область методики була підтверджена аналізом 7 проб різних концентрацій у діапазоні від 13 до 417 % від концентрації (0,12 мг/мл), прийнятої за 100 %. Порівняння залежності між вмістом філлохінону (мг/мл) у випробуваних розчинах та величинами площ хроматографічних піків показало, що вона має лінійний характер і описується рівнянням y = 5104417,9 x + 10944,88. Коефіцієнт кореляції (rxy) дорівнює 0,999, що дозволяє використовувати цю методику для кількісного визначення філлохінону в рослинних об'єктах у діапазоні концентрацій від 0,016 до 0,5 мг/мл.

Відтворюваність (прецизійність) визначалася шляхом проведення аналізу різними (двома) аналітиками на одній серії сировини у різний час. Число повторностей для кожного аналітика – 3, загальна кількість повторностей – 6. Відносне стандартне відхилення, виражене у відсотках (RSD, %), не повинно перевищувати 5 %. За результатами проведених досліджень RSD становило 1,21%, що характеризує надійність аналізу у вибраних умовах (табл. 2).

Таблиця 2 - Результати визначення прецизійності методики

Для визначення точності методики аналізували зразки листя кропиви з однієї партії сировини в 3 рівнях наважок (0,5, 1,0 і 1,5 г), тричі проводячи відбір проб для кожного рівня. Вміст вітаміну К1 визначали мг у навішуванні сировини. Попередньо розраховували очікувану (теоретичну) величину, виходячи із встановленого середнього показника за вмістом вітаміну К1 у листі кропиви, що дорівнює 4,1 мг%. Теоретичний показник значення порівнювали із фактичним. Для оцінки отриманих результатів використовували показник «відкривальність» (R), критерій прийнятності якого прийнятий у межах 98-102 % від розрахункової величини .

Таблиця 3 – Результати визначення точності методики

Результати визначення точності методики, представлені в таблиці 3, показали, що відкриття R становить 98,73%, величина відносного стандартного відхилення (RSD) не перевищує 5%, що характеризує точність методики як задовільну.

Таким чином, встановлено, що запропонована методика кількісного визначення вітаміну К1 методом ВЕРХ у листі кропиви є специфічною, відтворюваною та точною. Ця методика була відтворена для визначення вітаміну К1 в інших видах лікарської рослинної сировини (табл. 4).

Таблиця 4 - Вміст вітаміну К1 (мг%) у лікарській рослинній сировині

Проведені дослідження показали доцільність використання методу обернено-фазової ВЕРХ для визначення філохінону у рослинній сировині. Перевагою методу ВЕРХ є можливість проведення оцінки якісного та кількісного вмісту філохінону в одній навішуванні сировини, що суттєво економить тимчасові витрати на аналіз. Розроблена методика може бути використана для визначення вмісту вітаміну К1 у рослинних об'єктах.

Рецензенти:

Гришин А.В. д.фарм.н., професор, зав. кафедрою фармації ДБОУ ВПО ОмДМА МОЗ Росії, м. Омськ.

Пеньєвська Н.А. д.м.н., доцент, зав. кафедрою фармацевтичної технології з курсом біотехнології ГБОУ ВПО ОмДМА МОЗ Росії, м. Київ.

Бібліографічне посилання

Методи кількісного визначення вітамінів засновані на їх фізико-хімічних властивостях, таких як окиснювально-відновлювальні властивості, здатність флуоресціювати в УФ-світлі. Застосовують різні методи визначення: титрометричні, фотоколориметричні, спектрофотометричні, флуорометричні та ін.

Кількісне визначення вітаміну К

Вітамін К у листі кропиви визначають методом СФМ (таблиця 3).

Таблиця 3. Кількісне визначення вітаміну K у листі кропиви (авторський метод)

Кількісне визначення БАВ у плодах шипшини.

Аскорбінову кислотуможна визначати титрометричним методом, який ґрунтується на відновленні 2,6-дихлорфеноліндофенолу. Із цим же реактивом можна провести фотоколориметричне визначення аскорбінової кислоти. Для цього проводять екстракцію сировини 2% метафосфорною кислотою, додають розчин 2,6-дихлорфеноліндофенолу. Через 35 сік. проводять фотоколориметрування. Паралельно колориметрують контрольний розчин 2% метафосфорної кислоти з 2,6-дихлорфеноліндофенолом. Інтенсивність фарбування пропорційна кількості аскорбінової кислоти.

Кількісне визначення аскорбінової кислоти можна провести фотоколориметричним методом за допомогою гексаціанофериту калію. У кислому середовищі аскорбінова кислота відновлює гексаціаноферит калію до гексаціаноферату калію, який у присутності іонів заліза (Ш) утворює берлінську блакить, з подальшим її фотоколориметруванням.

Метод кількісного визначення аскорбінової кислоти (ГФ XI, вип. 2, стор. 294) заснований на її здатності окислюватися до дегідроформи розчином 2,6-дихлорфеноліндофеноляту і відновлювати останній до лейкоформи. Точка еквівалентності встановлюється появою рожевого фарбування, яке свідчить про відсутність відновника, тобто кислоти аскорбінової (2,6-дихлорфеноліндофенол має в лужному середовищі синє фарбування, в кислому - червоне, а при відновленні знебарвлюється):

1. Визначення вмісту аскорбінової кислоти. (Таблиця 4). З грубо подрібненої аналітичної проби плодів беруть навішення масою 20 г, поміщають у фарфорову ступку, де ретельно розтирають зі скляним порошком (близько 5 г), поступово додаючи 300 мл води, і настоюють 10 хв. Потім суміш розмішують та витяг фільтрують. У конічну колбу місткістю 100 мл вносять 1 мл отриманого фільтрату, 1 мл 2% розчину хлористоводневої кислоти, 13 мл води, перемішують і титрують з мікробюретки розчином 2,6-дихлорфеноліндофеноляту натрію (0,001 моль/л) до появлений протягом 30-60 с. Титрування продовжують трохи більше 2 хв. У разі інтенсивного фарбування фільтрату або високого вмісту в ньому аскорбінової кислоти [витрата розчину 2,6-дихлорфеноліндофенолятанатрію (0,001 моль/л) більше 2 мл], виявленого пробним титруванням, вихідне вилучення розбавляють водою в 2 рази або більше.

де 0,000088 - кількість аскорбінової кислоти, що відповідає 1 мл розчину 2,6-дихлорфеноліндофеноляту натрію (0,001 моль/л), в грамах; V - об'єм розчину 2,6-дихлорфеноліндофеноляту натрію (0,001 моль/л), що пішов на титрування, в мілілітрах; m – маса сировини в грамах; W - втрата в масі при висушуванні сировини у відсотках.

Примітки. Приготування розчину 2,6-дихлорфеноліндофеноляту натрію (0,001 моль/л): 0,22 г 2,6-дихлорфеноліндофеноляту натрію розчиняють у 500 мл свіжопрокип'яченої та охолодженої води при енергійному збовтуванні (для розчинення. Розчин фільтрують у мірну колбу місткістю 1 л і об'єм розчину доводять водою до мітки. Термін придатності розчину не більше 7 діб за умови зберігання у холодному, темному місці.

Встановлення титру. Декілька кристалів (3-5) аскорбінової кислоти розчиняють у 50 мл 2% розчину сірчаної кислоти; 5 мл отриманого розчину титрують з мікробюретки розчином 2,6-дихлорфеноліндофеноляту натрію до появи рожевого забарвлення, що зникає протягом 1-2 тижнів. Інші 5 мл цього ж розчину аскорбінової кислоти титрують розчином калію йодату (0,001 моль/л) у присутності декількох кристалів (близько 2 мг) калію йодиду та 2-3 краплі розчину крохмалю до появи блакитного фарбування. Поправочний коефіцієнт обчислюють за такою формулою:

де V - об'єм розчину калій йодату (0,001 моль/л), що пішов на титрування, у мілілітрах; V1-об'єм розчину 2,6-дихлорфеноліндофеноляту натрію, що пішов на титрування, в мілілітрах.

2. Визначення вмісту вільних органічних кислот. Аналітичну пробу сировини подрібнюють до розміру частинок, що проходять через сито з отворами діаметром 2 мм. 25 г подрібнених плодів шипшини поміщають у колбу місткістю 250 мл, заливають 200 мл води і витримують протягом 2 год на киплячій водяній бані, потім охолоджують, кількісно переносять у мірну колбу місткістю 250 мл, доводять об'єм вилучення водою до . Відбирають 10 мл вилучення, поміщають в колбу місткістю 500 мл, додають 200-300 мл свіжо-прокип'яченої води, 1 мл 1% спиртового розчину фенолфталеїну, 2 мл 0,1 % розчину метиленового синього і титрують розчином натрію їдкого л) до появи в піні лілово-червоного забарвлення.

де 0,0067-кількість яблучної кислоти, що відповідає 1 мл розчину їдкого натру (0,1 моль/л), в грамах; V - об'єм розчину їдкого натру (0,1 моль/л), що пішов на титрування, в мілілітрах; m – маса сировини в грамах; W - втрата в масі при висушуванні сировини у відсотках.

Таблиця 4. Кількісне визначення аскорбінової кислоти у плодах шипшини (фармакопейний метод)

Кількісне визначення хімічних речовин у квітках календули.

Каротиноїди визначають у лікарській сировині фотоколориметричним методом, заснованому на вимірюванні інтенсивності їхнього природного забарвлення. Розроблено спектрофотометричний метод визначення каротиноїдів. Каротиноїди з сировини екстрагують петролейним ефіром, потім хроматографують на платівці "Силуфол" у системі петролейний ефір-бензол-метанол (60:15:4), елююють хлороформом і спектрофотометрують при довжині хвилі 464 нм (-каротин) при 456 нм ).

• 1. Близько 1 г (точна навішування) подрібнених квіток нігтик, просіяних крізь сито з отворами розміром 1 мм, поміщають у конічну колбу місткістю 250 мл, додають 50 мл спирту 70 %, колбу закривають пробкою, зважують (з по0 ) і залишають на 1 год. Потім колбу з'єднують із зворотним холодильником, нагрівають, підтримуючи слабке кипіння протягом 2 год. Після охолодження колбу з вмістом знову закривають тією ж пробкою, зважують і втрату в масі заповнюють розчинником. Вміст колби ретельно збовтують і фільтрують через сухий паперовий фільтр, відкидаючи перші 20 мл, суху колбу місткістю 200 мл (розчин А).
• 1 мл розчину А поміщають у мірну колбу місткістю 25 мл, додають 5 мл розчину алюмінію хлориду, 0,1 мл оцтової кислоти і доводять об'єм розчину спиртом 96 % до мітки і залишають на 40 хвилин (розчин Б).

Через 40 хвилин вимірюють оптичну щільність випробуваного розчину Б і розчину стандартного зразка Б 1 на спектрофотометрі в максимумі поглинання при довжині хвилі (408 + 2) нм у кюветі з товщиною шару 10 мм, використовуючи розчини порівняння для випробуваного розчину та стандартного зразків.

де: А – оптична щільність випробуваного розчину;

А про - оптична щільність розчину стандартного зразка рутину;

а - навішування сировини, г;

а про - навішування стандартного зразка рутина, г;

W – вологість сировини, %;

Дозволяється проводити визначення вмісту суми флавоноїдів з використанням питомого показника поглинання рутину.