Рпга титр 1 20 що означає. Аналіз на сифіліс рпга. Короткий опис тесту TPPA

Можливо, Вам дали направлення до лабораторії на аналіз РПГА, але Ви не дуже розумієте, що означає ця абревіатура. Що це таке і наскільки серйозно Ви докладно дізнаєтеся з цієї статті.

Крім пацієнтів з вираженими симптомами венеричних захворювань, направлення на РПГА аналіз можуть дати людям, які проходять медичне обстеження з метою влаштування на роботу, перед проведенням хірургічної операції, або при становленні жінки на облік вагітністю. Тут немає нічого страшного і соромного, просто, таким чином, фахівці аналізують населення на предмет серйозних статевих захворювань, що дозволяє своєчасно виявити носіїв інфекції та надати їм належну медичну допомогу ще до розвитку ускладнень.

Якщо Ви практикуєте незахищений секс (незалежно від того, як добре Ви знайомі з сексуальним партнером, адже багато людей самі не підозрюють про своє зараження), або підозрюєте свого постійного партнера, Ви можете спокійно здати кров і незабаром дізнатися про результат і розвіяти страх від невідомість. Щоб отримати направлення на лабораторний аналіз, не обов'язково йти до венеролога. Достатньо звернутися з цим проханням до свого терапевта, або розповісти про підозри гінеколога або уролога.

Розшифровка аналізу

РПГА розшифровується як реакція пасивної гемаглютинації. Знати її значення необхідно щодо наявності збудника важкого венеричного захворювання - сифілісу. Якщо людський організм піддався зараженню, за результатами аналізу крові це можна виявити.

У ході дослідження фахівець може виявити аглютинацію еритроцитів, що означає, що червоні кров'яні клітини почали склеюватися між собою та випадати в осад під якимось негативним впливом. В даному випадку це бліда трепонема, яка мешкає на верхніх шарах, і провокує ураження організму сифілісом.

Механізм зараження досить простий:

1. Є здоровий організм;
2. До нього потрапляє патогенний мікроорганізм – бліда трепонема;
3. Розвивається імунна відповідь;
4. Це своє чергу провокує вироблення антитіл, які є ознакою наявної венеричної хвороби.

Для аналізу крові на РПГА характерні два види антитіл, що вказують на наявність або відсутність збудника сифілісу:

• Неспецифічний та нетрепонемний;
• Специфічний та трепонемний.

Дана методика дослідження була вперше застосована у 1965-му році. З того часу вона активно використовується для діагностики сифілісу. Її висока чутливість дозволяє як виявити патоген, а й визначити стадію, де протікає захворювання.

Відомо чотири форми ураження сифілісом:

1. Первинна;
2. Вторинна;
3. Третинна;
4. Латентна.

При аутоімунних патологіях, що розвиваються, на тлі деяких вірусних захворювань, в організмі хворого може зрости кількість неспецифічних антитіл, які сприймуться аналізом РПГА, як помилкова реакція.

РПГА аналіз крові показаний усім пацієнтам, у яких були скарги, схожі на ознаки сифілісу, або коли лікар підозрює щось подібне завдяки своєму великому досвіду, що практикує.

Також дуже важливо проходити подібне обстеження деяким представницям жіночої статі, які планують незабаром завагітніти. Тому що в їх випадку потрібно пролікуватися, а після лише думати про народження дитини, якщо, звичайно, їм важливе її здоров'я.

Цей аналіз нерідко входить у групу обов'язкових тестів перед оперативним втручанням. Завдяки повній діагностиці організму можна спланувати перебіг операції та її сприятливий результат.

Як здавати цей аналіз

Ви, напевно, розумієте, наскільки серйозний діагноз може бути поставлений за результатами аналізу РПГА.

Іноді висновок буває помилковим через неякісну підготовку пацієнта до дослідження, чому помилково позитивна відповідь стає приводом для призначення марного або навпаки, шкідливого лікування.

Щоб не допустити спотворення результатів тесту, достатньо дотримуватися наведених нижче рекомендацій:

• Жодної їжі напередодні здачі крові на РПГА вживати не можна. Цей аналіз, як і більшість інших, проводиться строго натще;
• Будь-які напої, крім простої чистої води, також не повинні потрапити в організм у день, відведений під аналіз. Якщо питимете дозволену рідину, то її обсяг повинен бути мінімальним, щоб він ніяк не вплинув на склад крові;
• Зазвичай, щоб людина не морилася голодом і спрагою, забір крові відбувається вранці;
• Того ж ранку краще зовсім не курити. Речовини, що містяться в димі та парах, можуть дати негативну реакцію, через що результати будуть неправильно розшифровані лаборантом;
• Заборона покладається також на алкоголь. Причому пити спиртне краще припинити ще кілька днів до дослідження.

Прийшовши до спеціального кабінету, пацієнт має оголити свою руку від одягу, щоб медсестра змогла взяти кров із вени. Процедура ця відома практично всім. Вона відносно безболісна та швидка. Після її закінчення Вам скажуть, коли результати аналізу РПГА будуть готові, щоб їх можна було забрати.

Наразі для проведення РПДА користуються стандартизованими тест-наборами.

У них є все необхідне для аналізів:

• Флакон з еритроцитами, які містять на поверхні антигени блідої трепонеми штаму Nichols.
• Така ж ємність, але вже з чистими червоними кров'яними тільцями (потрібні для контролю).
• Буферний розчин для розведення сироватки пацієнта (нижче розкажемо, навіщо це роблять).
• Сироватка від людини, свідомо хворої на сифіліс, теж використовується для контролю (К+).
• Сироватка від свідомо здорової людини (К-).
• Пластикова планшетка з пронумерованими луночками для змішування зразків та оцінки результатів.

Кожен тест набір містить запас реактивів для встановлення певної кількості проб. Зазвичай – 100. Тому сироватку іноді зберігають, доки набереться необхідну кількість зразків на дослідження.

Методика проведення аналізу РПДА

Реакція пасивної гемаглютинації може надати два типи результатів:

• Якісний.Відповідає питання, чи є у досліджуваному зразку антитіла до збудника.
• Кількісний.Дозволяє оцінити інтенсивність синтезу імуноглобулінів і в такий спосіб відстежити активність інфекції.

Як правило, спочатку проводиться якісна оцінка, а позитивні зразки відбираються кількісних досліджень.

Алгоритм простого виявлення інфікованості такий:

• У лунки планшета вносяться однакові дози досліджуваних зразків. На одного пацієнта виділяється ряд із шести лунок.
• У перші дві капають його плазму, розведену буфером 1:20.
• Наступна пара служить контролю, у ній поміщають сироватку До+. І ще дві лунки для матеріалу К-.
• Потім вносять мічені антигеном еритроцити першу лунку з кожної пари. По-друге – еритроцити чисті.
• Планшет деякий час похитують для ретельного перемішування реактивів і дають спокій. Мінімум – 45 хвилин. Можна і всю ніч.

Результати оцінюються візуально. Якщо реакція негативна, еритроцити осідають на дно сферичного заглиблення лунки.

Це має статися в обох лунках із зразками пацієнта і там, куди було додано чисті контрольні еритроцити тест-системи.

При позитивному результаті еритроцити не збираються в одному місці, а рівномірно розподілені по всьому дну лунки. Подібна картина має бути там, де мічені стандартним антигеном еритроцити змішуються із зразком хворого та сироваткою К+. Таким чином, проводиться контроль реакції, що дозволяє уникнути помилкових результатів.

Кількісна оцінка РПДА

Зразки з позитивним результатом відбирають і кілька разів буферним розчином розводять (титрують). Перед кожним розведенням сироватку капають у відповідну лунку планшета і відзначають над нею ступінь сумарного розведення. Потім до зразків додають еритроцити з трепонеми антигеном і визначають, при якому титрі ще відзначається позитивний результат. Це кількісний аналіз крові на сифіліс РПГА, він показує концентрацію антитіл до збудника.

Результати оцінюють так:

• 4+ означає, що еритроцити вистилають дно лунки рівномірним шаром. Поява складчастості краю говорить про високі концентрації антитіл у досліджуваному зразку. Реакція є позитивною.
• 3+ ставлять, якщо коло чітке, але частина еритроцитів «стікає» до центру. Картина нагадує розправлену парасольку, що розцінюється як позитивна реакція.

• 2+ виглядає як широке кільце з тенденцією до просвітлення у центрі. Слабкопозитивна.
• 1+ означає сумнівний результат. У лунці – вузьке колечко. Потребує повтору через 1-2 тижні.
• При негативному аналізі, еритроцити формують ґудзик у центрі лунки.

Є, щоправда, серорезистентні випадки сифілісу, у яких хвороби вже начебто немає, а антитіла зберігаються тривалий час. Тому РПГА іноді потребує підтвердження іншими методами.

При необхідності здати РПГА та пройти будь-яке обстеження на сифіліс, звертайтеся до грамотних венерологів.

Аналіз крові РПГА – одне з найважливіших досліджень, що допомагає визначити наявність патогенних збудників в організмі.

Метод РПГА дуже часто використовується при підозрі на сифіліс, інфікування кишечника, кашлюк та інші небезпечні патології. Коли виписується направлення на дослідження, пацієнти цікавляться, як здають біоматеріал і наскільки достовірні результати дає методика. Про це й йтиметься далі.

Що таке РПГА та які має особливості

Не кожна людина знає, що це таке і як розшифровується абревіатура РПГА. Під цим скороченням мається на увазі реакція пасивної гемаглютинації, методика необхідна визначення патогенного процесу у організмі.

Цей тест виявляє антигени блідої трепонеми (люїс) – патогенного мікроорганізму, що провокує виникнення сифілісу. Якщо обстежуваний здоровий і не страждає від будь-яких хронічних захворювань, при потраплянні в організм блідої трепонеми імунітет починає активно виробляти антитіла.

Наявність у досліджуваному біоматеріалі антитіл блідої трепонеми – основа для діагностування сифілісу.

Умовно тестування на сифіліс можна поділити на 2 види:

• специфічне;
• неспецифічне.

Класифікація аналізу категорії залежить від виду антитіл, виявлених в отриманому зразку крові. Незважаючи на те, що вперше такий метод діагностики був проведений у 1965 році, тестування виявилося настільки ефективним і результативним, що сьогодні воно досі не втрачає актуальності.

Безперечною перевагою діагностики є те, що вона дозволяє виявити інфекцію на будь-якому етапі розвитку, у тому числі в латентній стадії.

Показання до проведення

Лікарі радять здати аналіз РПГА у таких випадках:

• у пацієнта проявляються клінічні симптоми сифілісу (поява ерозій, виразок, збільшення лімфовузлів) та регіонарної лімфаденопатії; у цьому випадку РПГА на сифіліс є незамінним тестом, оскільки дозволяє виявити хворобу на первинній, вторинній та третинній стадії;
• виникнення ознак осередкової або дифузної алопеції;
• якщо людина мала статевий контакт із носієм сифілісу;
• людина хоче стати донором, здавати кров та плазму;
• РПГА входить до щорічного профілактичного обстеження, яке призначається працівникам різних держустанов;
• при оформленні медичної книжки;
• при госпіталізації.

Які захворювання можна виявити під час діагностики

Найчастіше позитивний результат тесту свідчить про наявність сифілісу (у 70% випадків) — як уродженого, так і набутого, а також може говорити про такі патології:

• ВІЛ інфекція;
• різні форми гепатиту;
• нещодавно перенесений інфаркт міокарда;
• зворотний тиф;
• туберкульоз;
• наявність венеричних захворювань;
• кліщовий бореліоз;
• дифтерія;
• дифузні захворювання сполучної тканини;
• зловживання наркотичними речовинами (що вводяться шляхом ін'єкцій);
• наявність запального процесу у ротовій порожнині або в районі геніталій;
• формування новоутворень злоякісної природи;
• інфекційний мононуклеоз.

Щоб отримати достовірні відомості, здавати кров потрібно з урахуванням усіх рекомендацій, в іншому випадку збудник сифілісу може бути не виявлений.

Чому для діагностики сифілісу призначається саме РПГА

Часто пацієнти запитують, чому при підозрі на сифіліс призначають саме РПГА. Фахівці запевняють, що тестування є таким популярним, оскільки у 99% випадків дає правильний результат.

Реакція аглютинації не відбудеться, тільки якщо в організмі відсутні антитіла трепонеми, інакше обстеження обов'язково покаже їхню присутність.

Медична практика показує, що чутливість тесту дуже висока, причому позитивну реакцію буде виявлено навіть при прихованих стадіях захворювання. Завдяки високій результативності тест не втрачає актуальності навіть нині.

Використання РПГА при інших патологіях

Здачу біоматеріалу на це дослідження часто призначають при підозрі на кашлюк, на черевний тиф, на ієрсиніоз (гостре інфекційне захворювання ШКТ). Така затребуваність обумовлена ​​тим, що у чутливості і результативності РПГА перевищує майже всі серологічні аналізи.

Тест допомагає визначити більшу частину недуг, спричинених патогенними клітинами та рикетсіями. При цьому в ролі антигенів можна використовувати інгредієнти бактеріальних вакцин, бактеріальні екстракти (з коровим або кашлюковим діагностикумом), очищені антигени різних мікроорганізмів.

Основні переваги методу

Ця методика активно використовується по всьому світу не тільки тому, що вона є дуже результативною, а й через певні переваги:

• проведення тесту не становить складності, від пацієнта потрібно лише здати кров;
• для проведення дослідження не потрібне спеціальне обладнання;
• дослідження не займає багато часу, зазвичай, пацієнту оголошують результат протягом 24 годин;
• тест має високу чутливість та специфічність до сифілісу.

Особливості проведення

Для здійснення тестування потрібна венозна кров. Щоб розшифрування було достовірним, пацієнту необхідно відповідально підійти до підготовки до аналізу та суворо дотримуватися лікарських порад.

• здавати біологічний матеріал можна тільки на порожній шлунок;
• перед заходом (якщо здавання крові здійснюється вдень чи ввечері) дозволено пити лише мінеральну воду без газів, вживати рідину потрібно у невеликих обсягах;
• за кілька годин до здачі біоматеріалу заборонено курити;
• категорично заборонено вживати спиртні напої протягом двох діб до процедури;
• якщо пацієнт приймає якісь лікувальні препарати, про це неодмінно потрібно попередити лікаря;
• якщо людина почувається погано, забір крові краще перенести на інший день, оскільки це може негативно позначитися на розшифровці результату.

Найважливішим етапом є підбір відповідної клініки. Кров краще здавати у сучасному діагностичному центрі з гарною репутацією.

Як довго проводиться аналіз?

Точно сказати, як довго розшифровуються результати, неможливо. Швидкість її залежить від типу дослідження, і навіть від використовуваного устаткування.

Найчастіше РПГА розшифровується протягом доби, але в деяких випадках процедура може тривати від 2 до 4 днів. Якщо лабораторія буде завантажена, пацієнту видадуть бланк з результатами не раніше ніж через 5 діб.

Розшифровка результатів

Щоб виявити наявність патології, до отриманої крові слід додати спеціальну сироватку. Якщо в організмі людини є трепонеми, відбудеться реакція аглютинації, внаслідок чого еритроцити випадуть в осад.

Число склеєних еритроцитів багато в чому залежить від того, яка кількість антитіл є в реагенті. Пасивна гемаглютинація показує як присутність антитіл, але й дає медику можливість визначити їх кількість.

Позитивний результат

Якщо тест показує позитивну реакцію, це свідчить про наявність збудника хвороби. Щоб поставити точніший діагноз, пацієнта потрібно направити на додаткову лабораторну та інструментальну діагностику.

Невід'ємним етапом обстеження є перевірка всіх членів сім'ї та людей, з якими інфікована людина вступала у статевий контакт.

Як показує медична практика, приблизно у 5% пацієнтів у ході тестування проявляється хибнопозитивна реакція, що може статися при ігноруванні підготовчого етапу, а також при:

• формуванні онкологічних новоутворень;
• патології сполучної тканини;
• наявність гепатиту різних форм;
• ВІЛ-інфекції.

Також слабопозитивний результат може виявитись при вагітності. Хибна "+" реакція практично завжди супроводжується низьким титром. Цікавим моментом є те, що якщо людина хоча б раз хворіла на сифіліс, реакція РПГА завжди буде позитивною.

Виняток становлять лише ті випадки, коли сифіліс було виявлено на ранній стадії і після цього одразу почалася інтенсивна терапія.

Негативний результат

Тестування дає негативну відповідь у таких випадках:

• у пацієнта в організмі відсутні патогенні мікроорганізми, які є збудником сифілісу;
• з моменту зараження пройшло менше 3 тижнів, і імунітет ще не почав виробляти антитіла;
• забір крові з вени проводився неправильно.

Навіть якщо тестування показало “-”, фахівці все ж таки рекомендують пройти додаткові аналізи для підстрахування, щоб переконатися, що патогенні мікроорганізми відсутні.

Точність результату

Численні клінічні дослідження підтвердили, що таке ця методика дає гарантовано правильний результат, якщо аналіз проводився за дотримання всіх правил і пацієнт суворо дотримувався лікарських рекомендацій перед забором крові.

Якщо тестування дало позитивну відповідь, ймовірність того, що людина інфікована сифілісом, становить понад 95%.

Неправильна реакція може виявитися тільки в тих випадках, якщо з моменту інфікування пройшло дуже мало часу або лаборант не дотримувався інструкції щодо.

Що ж до хибнопозитивного результату, він може бути, якщо діагностика проводилася за наявності інфекційних захворювань чи патологічних станів.

Помилковий результат відрізняється від справжнього позитивного тим, що він дуже швидко стає негативним, якщо тестування провести повторно через 2 тижні.

На даний момент аналіз РПГА досі залишається найефективнішим та достовірнішим тестом визначення сифілісу та інших небезпечних патологій. Тому за підозри на наявність багатьох захворювань насамперед медики спрямовують пацієнта на РПГА.

Що таке реакція пасивної гемаглютинації

Реакція пасивної гемагглютинації (Treponema pallidum hemagglutination assay) заснована на визначенні аглютинації еритроцитів, але поверхні яких фіксовані антигени блідої трепонеми, яка відбувається тільки в присутності антитрепонемних антитіл. специфічним ( трепонемним) тестам.

Коли призначається РПГА

РПГА призначається для лабораторного підтвердження всіх стадій сифілісу. Відповідно до наказу МОЗ Росії № 87 від 26.03.01 р, дослідження крові в тесті РПГА у поєднанні з тестом ОРС замінює постановку КСР(комплексу серологічних реакцій на сифіліс). Як одиночна реакція для лабораторного підтвердження діагнозу сифілісу РПГА не використовується, частіше застосовується в комплексі з ОРС (RPR) та РІФ (FTA) .
РПГА може застосовуватися та застосовується для скринінгу сифілісу в деяких країнах у вигляді модифікованої реакції мікроаглютинації (Microhemagglutination Assay for antibodies to Treponema pallidum - MHA-TP).

Як оцінюється РПДА

РПГА стає позитивною через 4 тижні після первинного інфікування, при первинному сифілісі відзначаються низькі титри реакції (менше 1:320), при вторинному сифілісі титри реакції зростають (більше 1:320), при прихованому сифілісі титри реакції знову зменшуються до низьких. РПГА залишається позитивною все життя практично у всіх пацієнтів.

Де можна отримати ще інформацію

Вибране

• Hemagglutination treponemal test for syphilis (J Clin Microbiol. 1983) Full text
• Визначення hemagglutination трепонемальний test для syphilis J Clin Microbiol. 1984 р. June

Сифіліс – захворювання інфекційної природи, зумовлене спірохетою Treponema pallidum, схильна до прогредієнтної хронічної течії, із чіткою періодизацією клінічної симптоматики.

Переважна більшість статевого шляху передачі над контактним і трансплацентарним ставить це захворювання до ряду венеричних (ЗПСШ, ІПСШ). Крім зазначених способів передачі інфекції особливу роль відіграє артифікаційний шлях (від лат. Artificio - штучно створений).

Він уражає медичних установ, переважно, реалізується за умов стаціонару. Інфікування відбувається при гемотрансфузіях, різних хірургічних операціях, інвазивних діагностичних методах.

Незважаючи на карантинізацію донорської крові, проблема виявлення сифілісу у донорів на різних стадіях захворювання все ще є актуальною.

Тому діагностичні заходи при сифілісі вимагають стандартизації, впровадження нових чутливих та інформативних методів ідентифікації, а також зведення до мінімуму помилок та неправильного трактування результатів аналізів.

Показати все

1. Класифікація методів лабораторної діагностики

Діагностика сифілісу має деякі особливості та відрізняється від діагностики інших бактеріальних інфекцій. Складна будова та антигенні властивості блідої трепонеми зумовлюють помилки в інтерпретації результатів серологічних реакцій.

Здати аналіз крові на сифіліс пропонують 3 основним групам пацієнтів:

1. 1 Скринінг та диспансеризація груп населення (у тому числі і вагітність, постановка на облік у жіночій консультації, надходження на роботу та оформлення медкнижки тощо).
2. 2 Скринінг у групах ризику (незахищені статеві контакти з людиною, інфікованою сифілісом, особи після примусових сексуальних контактів, ВІЛ-інфіковані тощо).
3. 3 Особи, які мають симптоми захворювання, або особи з підозрою на сифілітичну інфекцію.

Усі лабораторні методи умовно поділяють на прямі та непрямі.

1.1.

1. Прямі методи
2. 1 Ідентифікація Treponema pallidum у темному полі (темнопольна мікроскопія).
3. 2 Зараження піддослідних тварин (культивування в лабораторних тваринах).
4. 3 ПЛР (полімеразно-ланцюгова реакція).

4 ДНК-зонд або гібридизація нуклеїнових кислот.

1.2.

1. Непрямі методи
   • Серологічні реакції - це методи лабораторної діагностики, що базуються на виявленні антитіл (скорочено АТ) до антигенів блідої трепонеми (скорочено АГ). Вони мають основне значення для підтвердження діагнозу.
   • 1 Нетрепонемні тести:
   • Реакція Вассермана (РЗК);
   • Реакція мікропреципітації (МР, РМП) та її аналоги, які наведені нижче;
   • Тест швидких плазмових реагінів (RPR, РПР);
2. Тест з червоним толуїдином та сироваткою (TRUST);
   • Нетрепонемний тест Лабораторії дослідження венеричних хвороб – VDRL.
   • 2 Трепонемні тести:
   • Р-ція іммобілізації Treponema pallidum - РІБТ / РІТ;
   • Р-ція імунофлюоресценції - РІФ, FTA (розведення сироваток РІФ-10, РІФ-200, РІФ-абс);
   • Р-ція пасивної гемаглютинації (РПГА, ТРПГА, TPHA);



Імуноферментний аналіз (ІФА, EIA);

Імуноблот.

Малюнок 1 - Алгоритм серодіагностики сифілісу

1.3.

Цей метод ґрунтується на безпосередньому виявленні блідої трепонеми в досліджуваному матеріалі за допомогою мікроскопа та спеціальних пристосувань (найчастіше відокремлюваних ерозій та виразок, рідше спинномозкова рідина та інші субстрати).

За допомогою скарифікації, зішкрібання, здавлювання з ерозій та виразкових дефектів отримують ексудат, потім досліджують у мікроскоп підготовлений препарат.

Зазвичай бліді трепонеми виявляють у препараті, отриманому з шанкеру, з вогнищ вторинного свіжого, вторинного рецидивного сифілісу, пунктату лімфовузлів, плаценти.

Заснований на феномені світіння дрібних частинок у темному полі при попаданні променя світла (феномен Тіндаля), метод чудово дозволяє диференціювати збудника сифілісу від інших трепонем на підставі морфологічних відмінностей та відмінностей у способах пересування бактерії.

Для мікроскопії використовують спеціальний темнопольний конденсор відповідної оптичної роздільної здатності. Препарат одержують способом розчавленої краплі (краплю матеріалу наносять на чисте знежирене предметне скло та закривають дуже тонким покривним).

На покривне скло капають імерсійну олію. За допомогою повороту тубуса і повороту лінзи, що збільшує, регулюють потрібне освітлення.

У темному полі мікроскопа виявляються клітини крові, епітеліальні клітини та сам збудник сифілісу. Бліда трепонема виглядає як спіраль, дуже тонка, що випромінює сріблястий колір, з плавними рухами.



Малюнок 2 – Темнопольна мікроскопія як спосіб візуалізації блідої трепонеми у досліджуваному матеріалі. Джерело ілюстрації - CDC

Treponema pallidum необхідно відрізняти від інших трепонем, у тому числі Tr. refringens, яка може міститися в ротоглотці та на слизовій оболонці статевих органів. Ця бактерія здійснює хаотичні рухи, має широкі та несиметричні, досить грубі завитки. Крім того, Treponema pallidum відрізняють від Tr. Microdentium, Tr. Buccalis та Tr. vincenti.

Візуалізація бактерій у темному полі іноді доповнюється реакцією флюоресценції. Для цього мічені флюоресцентним барвником протитрепонемні АТ додають у нативний матеріал. При цьому утворюється комплекс, званий антиген-антитіло (скорочено АГ-АТ), який і є об'єктом для дослідження за допомогою люмінесцентного мікроскопа.

3. Метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)

ПЛР, розроблена в 1991 для виявлення молекули дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) блідої трепонеми, є високочутливим і специфічним, дозволяє виявити фрагменти ДНК збудника.

Базується даний аналіз на копіюванні коротких ділянок ДНК блідої спірохети, який задовольняє заданим параметрам і є присутнім у зразку. Все це виконується у штучних умовах (in vitro). Реакція проводиться у приладі – ампліфікаторі, який забезпечує періодизацію температурних циклів. Відбувається охолодження з наступним нагріванням пробірок з похибкою 0,1?

ДНК-матрицю прогрівають протягом 2 хвилин при температурі 92-98˚С (максимальна температура використовується, якщо полімераза термостабільна). При нагріванні ланцюга ДНК розходяться через розпад водневих зв'язків між ними. У стадії відпалу температуру реакції знижують для зв'язування праймера з матрицею одноланцюгової.

Відпал займає близько 30 секунд, протягом цього часу синтезуються сотні нуклеотидів. Знову синтезовані молекули копіюються полімеразою, в результаті багаторазово збільшуються специфічні фрагменти дезоксирибонуклеїнової кислоти. Подальша детекція фрагментів проводиться за допомогою електрофорезу в гелі агар.

ПЛР-діагностика сифілісу поки що носить експериментальний характер, але виправдана при виявленні вродженої інфекції, у складних діагностичних випадках або при мінімальному вмісті блідих трепонем у досліджуваному матеріалі.

4. ДНК-гібридизація

ДНК-гібридизація виконується in vitro і заснована на повному або частковому з'єднанні двох одноланцюгових молекул ДНК в одну молекулу. У разі повної відповідності комплементарних фрагментів об'єднання відбувається легко. Якщо комплементарна відповідність часткова, то поєднання ланцюжків ДНК відбувається повільно. З часу злиття ланцюгів можна оцінити ступінь комплементарності.

При нагріванні ДНК у буферному розчині розриваються водневі зв'язки азотистими основами, що є комплементарними, в результаті ланцюжка ДНК розходяться. Далі отримують препарат із двох денатурованих дезоксирибонуклеїнових кислот. При охолодженні одноланцюгові ділянки ренатурують. Утворюється так званий гібрид ДНК.

Метод дозволяє оцінити та аналізувати швидкість відпалу, враховуючи особливості (подібності та відмінності) ДНК між видами або всередині виду.

Застосування ДНК-зонда полягає у гібридизації міченого фрагмента ДНК зі специфічною ділянкою ДНК для ідентифікації комплементарних послідовностей нуклеотидів. Для мітки зонда використовується група ненасичених атомів (хромофори) чи радіоактивні ізотопи.

ДНК-зонд застосовують для гетерогенного та гомогенного детектування нуклеїнових кислот. Роль зонда полягає у визначенні ділянок, на яких відбулося злиття мішень-зонд. Детектування в гомогенній системі має перевагу – дозволяє відстежити гібридизацію молекул ДНК у реальному часі.

Суть методу зводиться у денатурації ДНК та ренатурації (возз'єднання ланцюжків ДНК). Процес ренатурації нуклеїнової кислоти та ДНК-зонда закінчується утворенням «гібриду».

Специфічні послідовності нуклеїнових кислот гібридизуються з ДНК-зондом і, таким чином, виявляються та дозволяють оцінити кількість ДНК у досліджуваному матеріалі.

5. Зараження лабораторних тварин

Висока чутливість кроликів до Treponema pallidum (близько 99,9%) дозволяє застосовувати їх у діагностиці сифілітичної інфекції.

Зараження кроликів проводиться у науково-дослідних центрах та є «золотим стандартом» оцінки чутливості інших методів.

Повернемося до трепонемних та нетрепонемних тестів, оскільки вони використовуються найчастіше. Розглянемо їх переваги та недоліки, а також помилки в інтерпретації результатів.

6. Нетрепонемні тести

Це тести визначення антитіл IgG та IgM до стандартизованого кардіоліпінового антигену. Їхнім суттєвим недоліком є ​​порівняно невелика специфічність.

Низька вартість та простота виконання дозволяють віднести ці тести до відбіркових діагностичних, необхідних для встановлення попереднього діагнозу та скринінгу серед населення.

Саме нетрепонемні тести здаються під час оформлення медичної книжки, влаштування на роботу, постановки на облік у жіночій консультації.

Недоліки:

1. 1 Мінімальна чутливість у стадії сифілісу первинного – 70%;
2. 2 Мінімальна чутливість у стадії сифілісу пізнього – 30%;
3. 3 Можливість появи хибнонегативних і хибнопозитивних результатів;
4. 4 Трудомісткість виконання РЗК.

Переваги:

1. 1 Відносно невелика вартість виробництва тестів;
2. 2 Отримання швидкої відповіді;
3. 3 Можливість їх застосування для скринінгу.

Отримання хибнопозитивних або слабопозитивних проб можливе в таких випадках:

1. 1 Порушення технології виконання при блокуванні комплексу АГ-АТ.
2. 2 Наявність у хворого на аутоімунні захворювання (ревматоїдний артирит, ревматизм, склеродермія, системний червоний вовчак, саркоїдоз та ін.).
3. 3 Злоякісні новоутворення.
4. 4 Вірусні та бактеріальні інфекції.
5. 5 Ендокринні захворювання (аутоімунний тиреоїдит, цукровий діабет).
6. 6 Вагітність.
7. 7 Вживання алкоголю.
8. 8 Прийом жирної їжі.
9. 9 Старецький вік.

Як видно зі списку, є достатньо причин для невірного результату. Тому до нього слід дуже насторожено ставитись. Розглянемо поруч із РСК ще дві проби. Це реакція мікропреципітації та VDLR (її модифікація).

7. Реакція зв'язування комплементу (РСК, Вассермана, RW)

Це проба, заснована на можливості комплементу зв'язуватися з комплексами АГ-АТ. Ідентифікують комплекс, що утворився, за допомогою гемолітичної системи. Кардіоліпіновий антиген помітно підвищує чутливість проби.

Чутливою є реакція Колмера, яка полягає у виконанні при різних температурних режимах. Так, перша фаза реакції Колмера протікає при температурі 20С протягом півгодини, друга фаза при тепературі 4-8С протягом 20-ти годин. За цей час відбувається зв'язування комплементу.

За виконання РСК можливе отримання різко позитивних результатів. Причиною, ймовірно, є великий титр антитіл у сироватці. У цьому випадку проби ставлять із зменшуючими дозами.

Для диференціювання стадій сифілісу та оцінки ефективності протисифілітичного лікування визначають кількість АТ у сироватці.

Позитивність проби оцінюють за допомогою хрестів, також у реакціях Вассермана, Колмера та Канна вказується розведення сироватки.

8. Реакція мікропреципітації

Оскільки трудомісткість виконання вищезазначених проб велика, то широти обхвату диспансеризацією різних груп населення розроблено прискорений метод серодиагностики сифілісу, про експрес-метод – реакція микропреципитации (скорочено МР, РМП).

Вона виконується з кардіоліпіновим антигеном та допоміжними речовинами. Його перевагою є забір периферичної крові для дослідження. Це значно прискорює і саму методику, і роботу лаборантів.



Малюнок 2 - Реакція мікропреципітації (схема)

Для проведення МР потрібна плазма або інактивована сироватка крові пацієнта (саме вони містять антитіла). Далі плазму поміщають у марковані лунки. Потім до досліджуваного матеріалу додають краплю кардіоліпінового антигену, змішують і струшують. У результаті сироватці інфікованого виникають характерні пластівці, різні за рівнем інтенсивності.

Це якісна проба. При кількісній оцінці використовуються 10 розведень сироватки, що міститься в 10 лунок з відповідним маркуванням. При якісній МР відповідь указується у вигляді хрестів (плюсів) або мінусу, при кількісній вказується титр антитіл (1:2, 1:4 тощо).

Наявність пластівців розцінюється як позитивна або слабопозитивна відповідь. Можлива поява флокуляту та за відсутності захворювання, тому остаточну оцінку отриманого результату проводять після контрольного дослідження або проведення інших реакцій (РІБТ, РІФ, ІФА, РПГА).

9. VDRL

Рекомендований Всесвітньою організацією охорони здоров'я метод постановки реакції з антигеном ліпоїдної природи (АГ) вважається найкращим серед інших стандартних нетрепонемних тестів. Розроблено в США, штат Джорджія в лабораторії венеричних хвороб (Veneral Diseases Research Laboratories).

Абревіатура закладу стала назвою для проби – VDRL. VDRL – це модифікація МР. Сироватку від хворого на сифіліс інактивують і поміщають на предметне скло. Використовуваний антиген складається з кардіоліпіну, холестерину та лецитину в різному відсотковому співвідношенні. Відповідь реєструється практично одразу.

Виразна флокуляція виникає у присутності в сироватці антитіл. Сироватка стає реактивною після 4-х тижнів після зараження. Для оцінки кількості антитіл сироватку попередньо розводять в геометричній прогресії.

Переваги VDRL:

1. 1 порівняно висока чутливість;
2. 2 порівняно висока специфічність;
3. 3 легкість виконання;
4. 4 мала вартість реактивів;
5. 5 отримання швидкої відповіді.

Недоліком VDRL є відносно висока частота хибнопозитивних результатів.

Їх причинами є ті самі перелічені вище захворювання.

Трепонемні випробування виконуються зі специфічними АГ Treponema pallidum. Вони необхідні та обов'язкові для встановлення остаточного діагнозу. Це реакція імунофлюоресценції (РІФ), реакції непрямої гемаглютинації (РПГА), імуноферментний аналіз (ІФА) та ін.

Після позитивного результату нетрепонемного тесту (RPR, MP, VDRL) завжди мають виконуватися трепонемні (частіше комбінація - РПГА, ІФА, РІФ).

Трепонемні тести складніші у виконанні, ніж експрес-тести, і вимагають великих витрат коштів.

10. РІФ

Дана реакція (скорочено РІФ) використовується для діагностики сифілісу, у тому числі і прихованих форм, і повторної перевірки позитивних і хибнопозитивних проб.

РІФ заснована на світінні мічених антитіл при з'єднанні з комплексом антиген-антитіло під кварцовою лампою. Метод почав застосовуватися в 60-х роках і відрізнявся простотою виконання та високою специфічністю (яка трохи поступається РІБТ).

Він має кілька модифікацій: РІФ-10, РІФ-200 та РІФ-abs.

Найбільш чутлива РІФ у розведенні 10 разів, а інші - більш специфічні. РІФ проводиться у двох фазах. До артеріальної гіпертензії додають сироватку крові пацієнта. Утворюється комплекс АГ-АТ, що досліджується у наступній фазі. Далі мічений за допомогою флюоохром комплекс ідентифікують при мікроскопії. Якщо не спостерігається свічення, це вказує на відсутність специфічних АТ у сироватці крові.

РІФ-200 є найбільш цінним із усіх розведень. Метод призначений для діагностики різних форм сифілісу, особливо прихованого сифілісу та повторної перевірки позитивних проб.

11. РИБТ

Реакція іммобілізації блідих трепонем (скорочено РІБТ, РІТ) одна із складних серологічних проб, що потребують значних зусиль та фінансових витрат. РИБТ застосовують дедалі рідше, але актуальність її зберігається у діагностиці прихованого сифілісу.

Велике значення вона несе у розпізнаванні хибнопозитивних результатів у вагітних жінок і ґрунтується на іммобілізації бактерій у присутності іммобілізинів – пізніх антитіл.

Результат оцінюється на відсотковій кількості (%) іммобілізованих трепонем за допомогою спеціальної таблиці:

1. 1 Від 0 до 20 – негативна проба.
2. 2 Від 21 до 50 – слабопозитивна проба.
3. 3 Від 50 до 100 – позитивна реакція.

Неправдиві результати також можливі при застосуванні РІБТ. Так, невірна відповідь можлива при інфікуванні тропічними трепанематозами, а також при туберкульозі, цирозі печінки, саркоїдозі та пацієнтів похилого віку.

12. РПГА

Цей аналіз крові на сифіліс називається реакцією пасивної гемаглютинації (скорочено кров на РПГА, ТРПГА).

Антиген для РПГА готують з еритроцитів барана, покритих фрагментами блідих трепонем (отриманих від інфікованих кроликів (див. рисунок 4)). Для аналізу використовується венозна кров (плазма чи інактивована сироватка) пацієнта.

При додаванні антигену в сироватку пацієнта із сифілісом відбувається утворення комплексу АГ-АТ, що призводить до аглютинації еритроцитів. аглютинація визначається суб'єктивно лікарем-лаборантом.



Рисунок 3 – Схема РПГА (реакція пасивної гемаглютинації)

Проба оцінюється як позитивна з появою аглютинатів рівномірного рожевого забарвлення. Фарбування преципітату в червоний свідчить про осадження еритроцитів. РПГА є високочутливою та високоспецифічною.

12.1.

Вона є спрощеним варіантом РПГА. Відрізняється від проби, описаної вище, меншою кількістю антигену, розріджувача та сироватки крові для виконання реакції. Через 4 години після інкубації сироватки можна оцінити пробу. Використовується при скринінгових та масових обстеженнях на сифіліс.

13. Імуноферментний аналіз

Імуноферментний аналіз (скорочено ІФА) базується на специфічній реакції антиген-антитіло. Біологічний матеріал (сироватка крові пацієнта, ліквор) вносять у лунки, на твердій поверхні яких фіксовано антигени блідої трепонеми. Досліджуваний матеріал інкубують, потім відмивають антитіла, які не зв'язалися з антигенами (див. рис. 5).

Ідентифікація отриманого комплексу складає етапі ферментації з допомогою імунної сироватки, міченої ферментом. При хімічній реакції фермент забарвлює отримані комплекси. Інтенсивність фарбування залежить від кількості специфічних антитіл у крові пацієнта та фіксується спектрофотометром.



Малюнок 4 – Схема ІФА (імуноферментного аналізу)

Чутливість ІФА становить понад 95%. Метод використовується в автоматизованому режимі для дослідження декретованих груп населення: донорів, вагітних та інших, для уточнення діагнозу при позитивних та хибнопозитивних нетрепонемних тестах.

14. Імуноблот

Імуноблот - високочутливий метод, модифікація простого ІФА. Реакція заснована на електрофорез з розділенням антигенів блідих трепонем.

Розділені імунодетермінанти переносять на нітроцелюлозний папір і виявляють ІФА. Далі інкубують сироватку і змивають антитіла, що не зв'язалися. Отриманий матеріал обробляють імуноглобулінами (IgМ або IgG), міченими ферментом.

15. Клінічна оцінка результатів лабораторної діагностики сифілісу

У таблиці 1 нижче ми навели можливі результати аналізів та їх розшифрування. Як можна побачити в таблиці, основне значення при розшифровці має комплексна оцінка тестів.



Таблиця 1 – Розшифровка результатів серологічних реакцій (аналізів крові на сифіліс). Для перегляду клацніть по таблиці

Оцінка реактивності тестів виконується також «хрестами»:

1. 1 Максимальна відповідь (різко позитивна проба) позначається за допомогою 4-х хрестів.
2. 2 Позитивна проба позначається за допомогою трьох хрестів.
3. 3 Слабопозитивну реакцію позначають двома хрестами.
4. 4 Один хрест свідчить про сумнівний та негативний результат.
5. 5 Негативну відповідь маркують знаком «мінус».

Проблема оптимізації лабораторної діагностики сифілісу не втратила своєї актуальності до нашого часу. Сучасні методи діагностики, незважаючи на прагнення вчених привести діагностику до максимально високих показників чутливості та специфічності, потребують контрольної перевірки та індивідуального підходу.

Особливістю сифілітичної інфекції є феномен серорезистентності, який не отримав наукового пояснення. Діагноз виставляється після повноцінного обстеження хворого на епідеміологічні, клінічні, лабораторні методи.

На тлі економіко-технічного розвитку медицини спостерігається прогрес у розробці нових критеріїв діагностики сифілісу. Все це дозволить швидко, успішно та безпомилково лікувати пацієнтів.