У цьому розділі представлені інструкції щодо застосування інтерферонів альфа 2b та альфа 2aпершого покоління, які ще називають лінійними, простими чи короткоживучими. Єдина перевага цих прераратів – це порівняно низька ціна.

У далекому 1943 В. і Дж. Хейле відкрили так званий феномен інтерферування. Початкове уявлення про інтерферон було таким: фактор, що перешкоджає розмноженню вірусів. У 1957 році англійський вчений Алік Айзакс та швейцарський дослідник Джин Лінденман виділили цей фактор, чітко описали його та назвали інтерфероном.

Інтерферон (ІФН) – це білкова молекула, яка виробляється в організмі людини. У генетичному апараті людини закодовано «рецепт» її синтезу (ген інтерферону). Інтерферон – це один із цитокінів, сигнальних молекул, які відіграють важливу роль у роботі імунної системи.

За минулі з часу відкриття ІФН півстоліття було вивчено десятки властивостей цього білка. З медичної точки зору головними є противірусна та протипухлинна функції.

В організмі людини виробляється близько 20 видів – ціле сімейство – інтерферонів. ІФН поділяють на два типи: I та II.

ІФН I типу - альфа, бета, омега, тета - продукуються та секретуються більшістю клітин організму у відповідь на дію вірусів та деяких інших агентів. До ІФН II типу відноситься інтерферон гама, який продукується клітинами імунної системи у відповідь на дію чужорідних агентів.

Спочатку препарати інтерферону отримували лише з клітин донорської крові; вони так і називалися: лейкоцитарні інтерферони. 1980 року почалася епоха рекомбінантних, або генно-інженерних, інтерферонів. Виробництво рекомбінантних препаратів стало значно дешевшим, ніж отримання аналогічних препаратів з донорської крові людини або іншої біологічної сировини; при їх виробництві не використовується донорська кров, яка може бути джерелом інфекції. Рекомбінантні препарати не містять сторонніх домішок і тому мають менше побічних ефектів. Їхній лікувальний потенціал вищий, ніж у аналогічних природних препаратів.

Для лікування вірусних захворювань, зокрема гепатиту C, використовується переважно інтерферон альфа (ІФН-α). Розрізняють «прості» («короткоживучі») інтерферони альфа 2b та альфа 2a та пегільовані (пегінтерферон альфа-2a та пегінтерферон альфа-2b). «Прості» інтерферони в ЄС та США практично не застосовуються, однак у нас, через їхню порівняльну дешевизну, використовуються досить часто. У терапії гепатиту С застосовуються обидві форми «коротких» ІФН-α: інтерферон альфа-2a та інтерферон альфа-2b (розрізняються однією амінокислотою). Ін'єкції простими інтерферонами роблять зазвичай через день (пегінтерферонами - раз на тиждень). Ефективність лікування короткоживучою ІФН при введенні їх через день нижче, ніж пегінтерферони. Деякі фахівці рекомендують щоденні ін'єкції «простих» ІФН, оскільки ефективність ПВТ при цьому дещо вища.

Асортимент "коротких" ІФН досить широкий. Вони випускаються різними виробниками під різними назвами: Роферон-А, Інтрон А, Лаферон, Реаферон-ЄС, Реальдірон, Еберон, Інтераль, Альтевір, Альфарона та іншими.
Найбільш дослідженими (відповідно, - дорогими) є Роферон-А та Інтрон-А. Ефективність лікування даними ІФН у комбінації з рибавірином, залежно від генотипу вірусу та інших факторів, становить від 30 до 60%. Список основних торгових марок виробників простих інтерферонів та їх опис наведено у таблиці.

Усі інтерферони повинні зберігатися у охолодженому стані (від +2 до +8 градусів Цельсія). Їх не можна нагрівати чи заморожувати. Не струшуйте та не піддавайте препарат дії прямих сонячних променів. Перевозити препарати необхідно у спеціальних контейнерах.

Форма випуску, склад та упаковка

Розчин для ін'єкцій прозорий, безбарвний.

Допоміжні речовини:

0.5 мл - ампули (5) - упаковки коміркові контурні (1) - пачки картонні.
0.5 мл - ампули (5) - упаковки коміркові контурні (2) - пачки картонні.
0.5 мл - флакони (1) - картонні пачки.
0.5 мл - флакони (5) - упаковки коміркові контурні (1) - пачки картонні.
0.5 мл - шприци скляні (1) - упаковки коміркові контурні (1) - пачки картонні.
0.5 мл - шприци скляні (1) - упаковки коміркові контурні (3) - пачки картонні.
0.5 мл - шприци скляні (3) - упаковки коміркові контурні (1) - пачки картонні.
0.5 мл - шприци скляні (3) - упаковки коміркові контурні (3) - пачки картонні.

Розчин для ін'єкцій прозорий, безбарвний.

Допоміжні речовини:натрію ацетат, хлорид натрію, етилендіамін тетраоцтової кислоти динатрієва сіль, твін-80, декстран 40, вода д/і.

1 мл - ампули (5) - упаковки коміркові контурні (1) - пачки картонні.
1 мл - ампули (5) - упаковки коміркові контурні (2) - пачки картонні.
1 мл - флакони (1) - картонні пачки.
1 мл - флакони (5) - упаковки коміркові контурні (1) - пачки картонні.
1 мл - шприци скляні (1) - упаковки коміркові контурні (1) - пачки картонні.
1 мл - шприци скляні (1) - упаковки коміркові контурні (3) - пачки картонні.
1 мл - шприци скляні (3) - упаковки коміркові контурні (1) - пачки картонні.
1 мл - шприци скляні (3) - упаковки коміркові контурні (3) - пачки картонні.

Клініко-фармакологічна група

Фармакологічна дія

Інтерферон. Альтевір ® має противірусну, імуномодулюючу антипроліферативну та протипухлинну дію.

Інтерферон альфа-2b, взаємодіючи зі специфічними рецепторами на поверхні клітини, ініціює складний ланцюг змін усередині клітини, що включає індукцію синтезу ряду специфічних цитокінів і ферментів, порушує синтез вірусної РНК і білків вірусу в клітині. Результатом цих змін є неспецифічна противірусна та антипроліферативна активність, пов'язана з запобіганням реплікації вірусу в клітині, гальмуванням проліферації клітин та імуномодулюючою дією інтерферону. Інтерферон альфа-2b стимулює процес презентації антигену імунокомпетентним клітинам, має здатність стимулювати фагоцитарну активність макрофагів, а також цитотоксичну активність Т-клітин та "натуральних кілерів", що беруть участь у противірусному імунітеті.

Запобігає проліферації клітин, особливо пухлинних. Чинить вплив на синтез деяких онкогенів, що призводить до інгібування пухлинного росту.

Фармакокінетика

Всмоктування

При підшкірному або внутрішньом'язовому введенні інтерферону альфа-2b його біодоступність становить від 80% до 100%. Після введення інтерферону альфа-2b Тmax у плазмі крові становить 4-12 год, T 1/2 - 2-6 год. Через 16-24 год після введення рекомбінантний інтерферон у сироватці крові не визначається.

Метаболізм

Метаболізм здійснюється у печінці.

Інтерферони альфа здатні порушувати окисні метаболічні процеси, знижуючи активність мікросомальних ферментів печінки системи цитохрому Р450.

Виведення

Виводиться переважно нирками шляхом клубочкової фільтрації.

Показання для застосування препарату

У складі комплексної терапії у дорослих:

- при хронічному вірусному гепатиті без ознак цирозу печінки;

- при хронічному вірусному гепатиті С без симптомів печінкової недостатності (монотерапія або комбінована терапія з рибавірином);

- При папіломатозі гортані;

- При гострих кондиломах;

— при волосатоклітинному лейкозі, хронічному мієлолейкозі, неходжкінській лімфомі, меланомі, множинні мієломи, саркомі Капоші на фоні СНІД, що прогресує рак нирки.

Режим дозування

Застосовують підшкірно, внутрішньом'язово і внутрішньовенно. Лікування має бути розпочато лікарем. Далі з дозволу лікаря пацієнт може вводити собі підтримуючу дозу самостійно (у випадках, коли препарат призначений підшкірно або внутрішньом'язово).

Хронічний гепатит В:Альтевір ® вводять підшкірно або внутрішньом'язово в дозі 5-10 млн. ME 3 рази на тиждень протягом 16-24 тижнів. Лікування припиняють після 3-4 місяців застосування за відсутності позитивної динаміки (за даними дослідження ДНК вірусу гепатиту В).

Хронічний гепатит С:Альтевір ® вводять підшкірно або внутрішньом'язово в дозі 3 млн. ME 3 рази на тиждень протягом 24-48 тижнів. У пацієнтів з рецидивуючим перебігом захворювання та хворих, які раніше не отримували лікування інтерфероном альфа-2b, ефективність лікування збільшується при комбінованій терапії з рибавірином. Тривалість комбінованої терапії становить щонайменше 24 тижнів. Терапію Альтевіром слід проводити 48 тижнів хворим на хронічний гепатит С і 1-й генотип вірусу з високим вірусним навантаженням, у яких до кінця перших 24 тижнів лікування в сироватці крові не визначається РНК вірусу гепатиту С.

Папіломатоз гортані:Альтевір ® вводять підшкірно в дозі 3 млн. МО/м 2 3 рази на тиждень. Лікування починають після хірургічного (або лазерного) видалення пухлинної тканини. Дозу підбирають з урахуванням переносимості препарату. Досягнення позитивної відповіді може вимагати лікування протягом 6 місяців.

Волосатоклітинний лейкоз:рекомендована доза Альтевіру для підшкірного введення пацієнтам після спленектомії або без неї становить 2 млн. МО/м 2 3 рази на тиждень. Найчастіше нормалізація одного і більше гематологічних показників настає через 1-2 місяці лікування, можливе збільшення термінів лікування до 6 місяців. Цього режиму дозування слід дотримуватись постійно, якщо при цьому не відбувається швидкого прогресування захворювання або виникнення симптомів тяжкої непереносимості препарату.

Хронічний мієлолейкоз:рекомендована доза Альтевіра як монотерапія - 4-5 млн. МО/м 2 щодня п/к щодня. Для підтримки кількості лейкоцитів може бути потрібне застосування в дозі 0.5-10 млн. МО/м 2 . Якщо лікування дозволяє досягти контролю кількості лейкоцитів, то для підтримки гематологічної ремісії препарат слід застосовувати в максимальній дозі, що переноситься (4-10 млн. МО/м 2 щодня). Препарат необхідно відмінити через 8-12 тижнів, якщо терапія не призвела до часткової гематологічної ремісії або клінічно значимого зниження кількості лейкоцитів.

Неходжкінська лімфома:Альтевір ® застосовують як ад'ювантну терапію в комбінації зі стандартними схемами хіміотерапії. Препарат вводять підшкірно в дозі 5 млн. МО/м 2 3 рази на тиждень протягом 2-3 місяців. Дозу слід коригувати залежно від переносимості препарату.

Меланома:Альтевір ® застосовують як ад'ювантну терапію при наявному високому ризику рецидиву у дорослих після видалення пухлини. Альтевір ® вводять внутрішньовенно в дозі 15 млн. МО/м 2 5 разів на тиждень протягом 4 тижнів, потім п/к у дозі 10 млн. МО/м 2 3 рази на тиждень протягом 48 тижнів. Дозу слід коригувати залежно від переносимості препарату.

Множинна мієлома: Альтевір ® призначають у період досягнення стійкої ремісії у дозі 3 млн. МО/м 2 3 рази на тиждень п/к.

Саркома Капоші на фоні СНІД:оптимальна доза не встановлена. Препарат можна застосовувати в дозах 10-12 млн. МО/м2/добу п/к або внутрішньом'язово. У разі стабілізації захворювання або відповіді на лікування, терапію продовжують доти, доки не відбудеться регрес пухлини або не буде потрібно відміна препарату.

Рак нирки:оптимальна доза та схема застосування не встановлені. Рекомендується застосовувати препарат підшкірно у дозах від 3 до 10 млн. МО/м 2 3 рази на тиждень.

Приготування розчину для внутрішньовенного введення

Набирають об'єм розчину Альтевіру, необхідний приготування необхідної дози, додають до 100 мл стерильного 0.9% розчину натрію хлориду і вводять протягом 20 хв.

Побічна дія

Загальні реакції:дуже часто - лихоманка, слабкість (є дозозалежними та оборотними реакціями, зникають протягом 72 годин після перерви в лікуванні або його припинення), озноб; менш часто – нездужання.

З боку центральної нервової системи:дуже часто – головний біль; менш часто - астенія, сонливість, запаморочення, дратівливість, безсоння, депресія, суїцидальні думки та спроби; рідко – нервозність, тривожність.

З боку кістково-м'язової системи:дуже часто – міалгія; менш часто – артралгія.

З боку травної системи:дуже часто – зниження апетиту, нудота; менш часто – блювання, діарея, сухість у роті, зміна смаку; рідко – біль у животі, диспепсія; можливе оборотне підвищення активності печінкових ферментів.

З боку серцево-судинної системи:часто – зниження АТ; рідко – тахікардія.

Дерматологічні реакції:менш часто – алопеція, підвищене потовиділення; рідко - шкірний висип, свербіж шкіри.

З боку системи кровотворення: можливі оборотні лейкопенія, гранулоцитопенія, зниження рівня гемоглобіну, тромбоцитопенія.

Інші:рідко – зниження маси тіла, аутоімунний тиреоїдит.

Протипоказання до застосування препарату

- тяжкі серцево-судинні захворювання в анамнезі (неконтрольована хронічна серцева недостатність, нещодавно перенесений інфаркт міокарда, виражені порушення серцевого ритму);

- тяжка ниркова та/або печінкова недостатність (в т.ч. викликана наявністю метастазів);

- епілепсія, а також тяжкі порушення функцій ЦНС, що особливо виражаються депресією, суїцидальними думками та спробами (в т.ч. в анамнезі);

- хронічний гепатит з декомпенсованим цирозом печінки та у хворих, які одержують або одержували нещодавно лікування імунодепресантами (за винятком завершеного короткочасного курсу лікування кортикостероїдами);

- аутоімунний гепатит або інше аутоімунне захворювання;

- Лікування імунодепресантами після трансплантації;

- Захворювання щитовидної залози, що не піддається контролю загальноприйнятими терапевтичними методами;

- Декомпенсовані захворювання легень (в т.ч. ХОЗЛ);

- Декомпенсований цукровий діабет;

- гіперкоагуляція (в т.ч. тромбофлебіт, тромбоемболія легеневої артерії);

- Виражена мієлодепресія;

- Вагітність;

- Період лактації (грудного вигодовування);

- Підвищена чутливість до компонентів препарату.

Застосування препарату при вагітності та годуванні груддю

Препарат протипоказаний при вагітності та в період лактації (грудного вигодовування).

Застосування при порушеннях функції печінки

Застосування при порушеннях функції нирок

Препарат протипоказаний при тяжкій нирковій та/або печінковій недостатності (у т.ч. спричиненими наявністю метастазів).

особливі вказівки

До лікування Альтевіром хронічного вірусного гепатиту В та С рекомендується провести біопсію печінки, щоб оцінити ступінь пошкодження печінки (ознаки активного запального процесу та/або фіброзу). Ефективність лікування хронічного гепатиту С збільшується при комбінованій терапії Альтевіром та рибавірином. Застосування Альтевіру не є ефективним при розвитку декомпенсованого цирозу печінки або печінкової коми.

У разі виникнення побічних ефектів під час лікування Альтевіром дозу препарату слід зменшити на 50% або тимчасово відмінити препарат до їх зникнення. Якщо побічні ефекти зберігаються або виникають знову після зниження дози, або спостерігається прогрес захворювання, то лікування Альтевіром слід припинити.

При зниженні рівня тромбоцитів нижче 50x109/л або рівня гранулоцитів нижче 0.75x109/л рекомендується зменшення дози Альтевіру в 2 рази з контролем аналізу крові через 1 тиждень. Якщо ці зміни зберігаються, то препарат слід відмінити.

При зниженні рівня тромбоцитів нижче 25x109/л або рівня гранулоцитів нижче 0.5х109/л рекомендується відміна препарату Альтевір з контролем аналізу крові через 1 тиждень.

У пацієнтів, які отримують препарати інтерферону альфа-2b, у сироватці крові можуть визначатися антитіла, що нейтралізують його противірусну активність. Практично у всіх випадках титри антитіл невисокі, їхня поява не призводить до зниження ефективності лікування або виникнення інших аутоімунних порушень.

Передозування

Дані щодо передозування препарату Альтевір ® не надано.

Лікарська взаємодія

Лікарська взаємодія між Альтевіром та іншими лікарськими засобами не вивчена повністю. З обережністю слід застосовувати Альтевір ® одночасно зі снодійними та седативними засобами, наркотичними анальгетиками та препаратами, що потенційно мають мієлодепресивний ефект.

При одночасному призначенні Альтевіру та теофіліну слід контролювати концентрацію останнього у сироватці крові та за необхідності змінювати режим його дозування.

При застосуванні Альтевіру у комбінації з хіміотерапевтичними препаратами (цитарабін, циклофосфамід, доксорубіцин, теніпозид) збільшується ризик розвитку токсичних ефектів.

Умови відпустки з аптек

Препарат відпускається за рецептом.

Умови та термін зберігання

Препарат слід зберігати в недоступному для дітей місці відповідно до СП 3.3.2-1248-03 при температурі від 2° до 8°С; не заморожувати. Термін придатності – 18 місяців.

Транспортувати за температури від 2° до 8°С; не заморожувати.

2018-02-02T17:43:00+03:00

Доведена ефективність інтерферону альфа 2b

Вперше про інтерферон - природний білок організму людини світ дізнався в 1957 році, коли вчені Алік Айзекс і Жан Лінденманн відкрили таке явище, як інтерференція - складний механізм біологічних процесів, завдяки якому організм здатний боротися з різними захворюваннями. Але в минулому столітті, напевно, не підозрювали, що цей білок стане головною складовою багатьох лікарських препаратів.

Інтерферони – це білки, які виробляються клітинами організму під час впровадження у яких вірусів. Завдяки їм відбувається активація генів, які відповідають за синтез захисних внутрішньоклітинних молекул, які забезпечують противірусну дію шляхом пригнічення синтезу білків вірусу та перешкоди його розмноженню. Іншими словами, ці білки (їх ще називають цитокінами) у нашому організмі виступають у ролі потужних захисників, які стоять на варті здоров'я і суворо пильнують, щоб у разі необхідності відразу ж відбити атаку вірусів і перемогти захворювання.

Для захисту зараженого вірусами організму інтерферон виробляється майже всіма клітинами нашого організму. Крім того, його утворення можуть стимулювати не тільки віруси, а й бактеріальні токсини, тому цей білок ефективний і за деяких бактеріальних інфекцій. Таким чином, можна зробити висновок, що цей цитокін є дуже важливим компонентом імунної системи людини. Без нього людство давно б перемогли численні віруси та бактерії.

Види інтерферонів

Інтерферони поділяють на три типи: альфа, бета та гамма, які продукують різні клітини.

• Інтерферон alpha активізує звані природні кілери – лейкоцити, які знищують віруси, бактерії та інші «ворожі» агенти.
• Інтерферон бета утворюється у фібробластах, клітинах епітелію та макрофагах, які поглинають збудників інфекції.
• Інтерферон гама продукується Т-лімфоцитами, головна його функція, як і інших видів – регуляція імунітету.

Чим доведено ефективність інтерферону при ГРВІ?

Як відомо, у своїй діяльності при призначенні терапії лікарі покладаються на свій досвід і систему знань, що вже склалася. Але медицина стрімко розвивається: щороку у світі розробляються нові ефективні методики лікування та патентуються нові ліки. Тому виникла потреба у систематизації нових досягнень та відкриттів у медицині, результатом чого з'явилися клінічні рекомендації та стандарти лікування. Ці задокументовані алгоритми, що базуються на доведеному клінічному досвіді, описують необхідні для виконання інструкції з діагностики, лікування, реабілітації, профілактики захворювань і допомагають лікарю приймати рішення щодо вибору тактики терапії в тій чи іншій ситуації.

Наприклад, з питань надання медичної допомоги дітям з проблеми ГРВІ та грипу група розробників налічує приблизно 40 осіб і включає провідних фахівців Росії в галузі інфекційних хвороб із різних установ та різних відомств. Логічно, що особливу увагу фахівці приділяють медичним препаратам, які здатні максимально швидко справлятися із захворюваннями і при цьому мають мінімум побічних ефектів. Наразі йдеться про препарати із вмістом інтерферону, які допомагають боротися з ГРВІ у дорослих та дітей.

Як згадувалося вище, їхня здатність боротися з вірусами була відкрита щодо інтерференції вченими Айзексом і Лінденманном. Вони описували інтерферон як «білок значно менший, ніж імуноглобуліни, який виробляється клітинами організму після зараження живими або інактивованими вірусами; здатний пригнічувати зростання різноманітних вірусів у дозах, нетоксичних для клітин». На сьогоднішній день відомо, що ці білки можуть вироблятися практично всіма клітинами організму у відповідь на впровадження чужорідної інформації незалежно від її етіології (віруси, гриби, бактерії, внутрішньоклітинні патогенні, онкогени). А основний їхній біологічний ефект полягає в процесах розпізнавання та видалення цієї чужорідної інформації. Іншими словами, ці захисні молекули «вміють» м'яко та акуратно знищувати віруси, які окупували клітини, без пошкодження самих клітин. Це було підтверджено численними науковими дослідженнями.

Що ж до методів застосування препаратів із вмістом інтерферонів, то тут необхідно згадати про деякі нюанси. Одна з основних проблем інтерферонотерапії полягає в тому, щоб доставити діючу дозу препарату, при цьому не викликавши негативних наслідків. У деяких випадках внутрішньом'язове або внутрішньовенне введення ліків із вмістом інтерферону призводить до побічних ефектів у вигляді лихоманки, ознобу, головного болю та інших небажаних явищ. Ці симптоми не є критичними для організму і незабаром проходять, але в процесі лікування викликають дискомфорт.

Звести до мінімуму побічні явища інтерферонотерапії або обійтися без них дозволило застосування супозиторіїв із вмістом інтерферону альфа-2б. Згідно з науковими дослідженнями, ректальне застосування рекомбінантного людського інтерферону в перші дні захворювання на ГРВІ знижує тривалість лихоманки, бореться з нежиттю і дозволяє швидше перемогти хворобу 2 . Інтраназальне застосування препаратів (коли ліки наносять на слизову оболонку носа) із вмістом інтерферону alfa-2b доповнює лікування та забезпечує оптимальний ефект терапії. Один із препаратів, який підходить для боротьби з грипом та іншими ГРВІ на будь-якій стадії захворювання – це ВІФЕРОН. Він випускається у вигляді супозиторіїв (свічок), гелю та мазі.

Коротка інструкція щодо застосування та переносимості препаратів із вмістом інтерферону альфа-2б

Хто може приймати препарати ВІФЕРОН:

• дорослі;
• діти із перших днів життя;
• вагітна жінка з 4-го тижня гестації.

Визнання науковою спільнотою

Інтерферон альфа-2b (ВІФЕРОН) включений до трьох федеральних стандартів надання медичної допомоги як рекомендований препарат для лікування грипу та ГРВІ, а також до трьох Федеральних протоколів лікування цих захворювань. 1 Якщо брати до уваги не тільки грип та ГРВІ, але й інші захворювання, то кількість стандартів і рекомендацій щодо цього препарату ще більше – інтерферон (ВІФЕРОН) включений до 30 федеральних стандартів надання медичної допомоги дорослим та дітям, затверджених МОЗ РФ, а також у 21 Протокол (Клінічні рекомендації) надання медичної допомоги дорослим, у тому числі вагітним жінкам та дітям.

Принцип дії препарату

Інтерферон альфа-2b людський рекомбінантний, що входить до складу препарату ВІФЕРОН, має противірусні, імуномодулюючі властивості і пригнічує реплікацію РНК- і ДНК-вірусів. Противірусну терапію проти грипу можна приступити на будь-якій фазі захворювання. Це допоможе покращити стан та запобігти розвитку ускладнень 2 . До препарату ВІФЕРОН входять загальновизнані високоактивні антиоксиданти: у свічках це вітаміни Е та С, у мазі – вітамін Е, у гелі – вітамін Е, лимонна та бензойна кислоти. На тлі такої антиоксидантної підтримки спостерігається підвищення противірусної активності інтерферонів.

Результати випробувань препарату

ВІФЕРОН пройшов повний цикл клінічних випробувань при широкому спектрі різноманітних захворювань у провідних клініках Росії. Результатом проведених досліджень був доказ лікувально-профілактичної ефективності препарату ВІФЕРОН при різних інфекційно-запальних захворюваннях у дорослих та дітей, включаючи новонароджених та вагітних жінок. Науково доведено, що комплексний склад та форма випуску забезпечує препарату ВІФЕРОН унікальні фармакокінетичні характеристики з пролонгуванням дії інтерферону за відсутності побічних ефектів, властивих парентеральним препаратам рекомбінантних інтерферонів 3 .

При яких захворюваннях застосовують препарати на основі інтерферонуalpha-2 b

Препарат ВІФЕРОН у вигляді супозиторіїв, гелю та мазі застосовується для лікування наступних захворювань:

• ГРВІ, у тому числі грип;
• герпес;
• папіломавірусна інфекція;
• ентеровірусна інфекція;
• ларинготрахеобронхіт;
• хронічні гепатити, С, D, включаючи ускладнені цирозом печінки;
• бактеріальний вагіноз;
• кандидоз;
• мікоплазмоз;
• уреаплазмоз;
• гарднереллез.

Застосування препарату ВІФЕРОН у складі комплексної противірусної терапії дозволяє знизити терапевтичні дози антибактеріальних та гормональних лікарських засобів, а також зменшити токсичні ефекти цієї терапії.

Лікар загальної практики

1. http://www.rosminzdrav.ru, Наказ Міністерства охорони здоров'я Російської Федерації, http://www.raspm.ru; http://www.niidi.ru; http://www.pediatr-russia.ru; http://www.nnoi.ru
2. Нестерова І.В. «Препарати інтерферону в клінічній практиці: коли і як», «Лікар, що лікує», вересень 2017.
3. «ВІФЕРОН – комплексний противірусний та імуномодулюючий препарат для лікування інфекційно-запальних захворювань у перинатології». (Посібник для лікарів), Москва, 2014.

Використовувані джерела: http://www.lsgeotar.ru

Побічні ефекти: Interferon beta.

Винахід відноситься до генної інженерії, біотехнології, медицини, фармакології. Нова рекомбінантна мультикопійна плазмідна ДНК pSX50, що кодує синтез лейкоцитарного альфа-2b інтерферону людини, експресія якого знаходиться під контролем лактозного та триптофанового промоторів та термінатора транскрипції. В результаті трансформації клітин реципієнтного штаму Е. coli BL21 рекомбінантної плазмідної ДНК pSX50 отримано штам Е. coli SX50 - продуцент рекомбінантного лейкоцитарного альфа-2b інтерферону людини з продуктивністю до 0.9-1.0 г альфа-2b. Спосіб отримання рекомбінантного альфа-2b інтерферону заснований на використанні створеного рекомбінантного штаму Е. coli SX50 і що передбачає його глибинне культивування на живильному середовищі з пониженим вмістом триптофану при безперервному додаванні живильних субстратів в процесі біосинтезу, механічне концентрованому розчині гуанідин гідрохлориду з подальшою ренатурацією інтерферону у фізіологічних буферних розчинах у присутності хаотропних агентів та його очищенням з використанням тристадійного хроматографічного очищення інтерферону на смолах типу Chelating Sepharose Fast Flow іммобілізованої йон фільтраційної хроматографії на смолах типу Superdex 75. Спосіб дозволяє отримувати субстанцію інтерферону більше 99% чистоти за даними електрофорезу в редукуючих та нередукуючих умов ях при фарбуванні гелів сріблом і більше 98% за даними RF HPLC і не містить пірогенів (LAL-тест) у кількостях не менше 400-800 мг з 1 л культурального середовища. 3 зв. та 3 з.п ф-ли, 6 іл.

Малюнки до патенту РФ 2242516

Винахід відноситься до генно-інженерних лікарських препаратів, одержуваних біотехнологічним шляхом, а саме до способів промислового отримання рекомбінантного лейкоцитарного інтерферону альфа-2b людини медичного призначення (далі інтерферон), а також до рекомбінантних штамів продуцентів Escherichia coli (Echerichia coli). що кодує синтез інтерферону.

Інтерферони являють собою білкові молекули з молекулярною масою від 15000 до 21000 дальтон, що продукуються та секретуються клітинами у відповідь на вірусну інфекцію або інші збудники. Виділяють три основні групи інтерферонів: альфа, бета та гама. Самі собою ці групи є однорідними і можуть містити кілька різних молекулярних різновидів інтерферону. Так, виділено понад 14 генетичних різновидів інтерферону альфа, які становлять інтерес і знаходять широке застосування в медицині як противірусні, антипроліферативні та імуномодулюючі засоби.

Відомі способи отримання лейкоцитарного інтерферону людини з лейкоцитів донорської крові людини, індукованих вірусами та іншими індукторами (SU1713591, UA 2066188, UA 2080873).

Основним недоліком цих способів отримання інтерферонів є ймовірність контамінації кінцевого продукту вірусами людини, такими як вірус гепатитів і С, вірусу імунодефіциту та ін.

В даний час більш перспективним визнаний спосіб отримання інтерферону мікробіологічним синтезом, який забезпечує можливість отримання цільового продукту з більш високим виходом з порівняно недорогої вихідної сировини. Підходи, що використовуються при цьому, дозволяють створити оптимальні для бактеріальної експресії варіанти структурного гена, а також регуляторних елементів, що контролюють його експресію.

Як вихідні мікроорганізми використовують різні конструкції штамів Pichia pastoris, Pseudomonas putida і Escherichia coli.

Недоліком використання P. pastoris як продуцента інтерферону (J.N. Garcia, J.A. Aguiar et al. //High level expression of human IFN-2b in Pichia pastoris.//Biotecnologia Aplicada, 12(3),152-155, 1995), є вкрай складні умови ферментації цього дріжджів, необхідність суворо підтримувати концентрацію індуктора, зокрема метанолу, у процесі біосинтезу. Недоліком використання штамів Ps. putida (SU1364343, SU1640996, SU1591484, RU1616143, RU2142508) є складність процесу ферментації при низькому рівні експресії (10 мг інтерферону на 1 л культурального середовища). Більш продуктивним є використання штамів Escherichia coli (Semin. Oncol., 1997, Iun; 24 (3 Suppl. 9): S9-41-S9-51).

Відома велика кількість плазмід і створених на їх основі штамів Е. coli, що експресують інтерферон: штами Е. coli ATCC 31633 та 31644 з плазмідами Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 або Z-pBR 322(Pstl) -AHL6 (SU 1764515), штам Е. coli pINF-AP2 (SU 1312961), штам Е. coli pINF-F-Pa (AU 1312962), штам E.Coli SG 20050 з плазмід p280/2 та ін. Біоорганічна хімія, 1987, т.13, №9, с.1186-1193), штам E.Coli SG 20050 з плазмідою pINF14 (SU 1703691), штам E.coli SG 20050 з1 плазмою ін. Недоліком технологій, заснованих на використанні цих штамів, є їхня нестабільність, а також недостатній рівень експресії інтерферону.

Поряд з особливостями використовуваних штамів ефективність процесу багато в чому залежить від технології виділення та очищення інтерферону.

Відомий спосіб отримання інтерферону, що включає культивування клітин Ps. putida, руйнування біомаси, обробку поліетиленіміном, фракціонування сірчанокислим амонієм, гідрофобну хроматографію на фенілсилохромі С-80, рН-фракціонування лізату, його концентрування та діафільтрацію, іонообмінну хроматографію на целюлозеНолю -52, концентрування пропусканням через касету фільтрів та гель-фільтрацію на Сефадекс G-100 (SU 1640996). Недоліком цього способу, крім складної багатостадійної ферментації, є багатостадійність при отриманні кінцевого продукту.

Відомий також спосіб отримання інтерферону, що включає культивування штаму E.coli SG 20050/pIF16, в LB-бульйоні в колбах в термостатированном шейкері, центрифугування біомаси, її промивання буферним розчином і обробку ультразвуком для руйнування клітин. Отриманий лізат центрифугують, промивають 3М розчином сечовини в буфері, розчиняють у розчині гуанідин хлориду в буфері, обробляють ультразвуком, центрифугують, проводять окислювальний сульфітоліз, діаліз проти 8 М сечовини, ренатурацію і остаточну двостадію 5 UA 2054041). Недоліками цього є його відносно невисока продуктивність основних етапів процесу виділення і очищення. Особливо це стосується ультразвукової обробки продукту, діалізу та окислювального сульфітолізу, що призводить до нестабільності виходу інтерферону, а також до неможливості використання цього методу для промислового виробництва інтерферону.

В якості найближчого аналога (прототипу) може бути вказаний спосіб отримання лейкоцитарного інтерферону людини, що полягає в культивуванні рекомбінантного штаму E.coli, заморожуванні отриманої біомаси при температурі не вище -70°С, розморожуванні, руйнуванні клітин мікроорганізму лізоцимом, видалення у лізат ДНК-ази та очищенням виділеної нерозчинної форми інтерферону відмиванням буферним розчином з детергентами, розчиненні осаду інтерферону в розчині гуанідин гідрохлориду, ренатурації та одностадійному очищенні іонообмінною хроматографією. Як продуцент використовують штам E.coli SS5, отриманий за допомогою рекомбінантної плазміди pSS5, що містить три промотори: P lac , P t7 і P trp , і ген альфа-інтерферону з введеними нуклеотидними замінами.

Експресія інтерферону штамом E.coli SS5, що містить цю плазміду, контролюється трьома промоторами: P lac , P t7 і P trp . Рівень експресії інтерферону становить близько 800 мг на 1 л клітинної суспензії (UA 2165455).

Недоліком способу є низька технологічність використання ферментативного руйнування клітин, ДНК та РНК мікроорганізму та одностадійне хроматографічне очищення інтерферону. Це зумовлює нестабільність процесу виділення інтерферону, призводить до зниження його якості та обмежує можливість використання наведеної схеми для промислового виробництва інтерферону. Недоліками даної плазміди та штаму на її основі є використання в плазміді сильного нерегульованого промотора фага Т7 у штамі Е. coli BL21 (DE3), в якому ген Т7 РНК полімерази знаходиться під промотором lac оперону і який завжди "тече". Отже, у клітині безперервно відбувається синтез інтерферону, що призводить до дисоціації плазміди та зниження життєздатності клітин штаму, і в результаті – зниження виходу інтерферону.

Завданням даного винаходу є конструювання рекомбінантного промислового штаму продуцента Е. coli за допомогою нової рекомбінантної плазмідної ДНК, що володіє високим рівнем біосинтезу інтерферону, і розробка ефективної промислової технології отримання субстанції інтерферону медичного призначення, відповідної за якістю "European-European"

Зазначене завдання вирішувалося створенням рекомбінантної плазмідної ДНК pSX50 та штаму Escherichia coli SX50, депонованого у Всеросійській колекції промислових штамів ФГУП ДержНДІ генетики, номер ВКПМ В-8550,

а також способом отримання рекомбінантного альфа-2b інтерферону, заснованим на використанні рекомбінантного штаму Е. coli SX50 і що передбачає його глибинне культивування на живильному середовищі зі зниженим вмістом триптофану при безперервному додаванні живильних субстратів у процесі біосинтезу, механічне білка в концентрованому розчині гуанідин гідрохлориду з подальшою ренатурацією інтерферону в фізіологічних буферних розчинах у присутності хаотропних агентів і тристадійного хроматографічного очищення інтерферону на смолах типу Chelating Sepharose Fast Flow, іммобілізованої іонами хроматографії на смолах типу Superdex 75

Згідно винаходу пропонується нова рекомбінантна мультикопійна плазмідна ДНК pSX50, що кодує синтез лейкоцитарного альфа-2b інтерферону людини, експресія якого знаходиться під контролем лактозного та триптофанового промоторів та термінатора транскрипції. Плазміда pSX50 має 3218 пар основ (п.о.) та характеризується наявністю наступних фрагментів:

Послідовність з 1 нуклеотиду по 176 нуклеотид (н.) включає фрагмент ДНК розміром 176 п.о., що містить триптофановий промотор (P trp);

Послідовність із 177 н. за 194 н. містить синтетичний фрагмент ДНК розміром 18 п.о., що містить послідовність Шайн Дельгарно, відповідальний за ініціацію трансляції;

Послідовність із 195 н. за 695 н. містить фрагмент ДНК розміром 501 в. , у положенні 67 заміна А на С, у положенні 69 заміна G на Т, у положенні 70 заміна А на С, у положенні 72 заміна А на Т, у положенні 96 заміна G на А, у положенні 100 заміна А на С, положенні 102 заміна А на Т, у положенні 114 заміна А на С, у положенні 120 заміна С на G, у положенні 126 заміна G на А, у положенні 129 заміна G на А, у положенні 330 заміна С на G, у положенні 339 заміна G на А, у положенні 342 заміна G на А, у положенні 487 заміна А на С, у положенні 489 заміна А на Т, у положенні 495 заміна G на А;

Послідовність із 696 н. за 713 н. включає синтетичний фрагмент ДНК розміром 18 п.о., що містить синтетичний полілінкер;

Послідовність із 714 н. до 1138 н. включає фрагмент ДНК плазміди рКК223-3 з 4129 н. за 4553 н. розміром 425 п.о., що містить послідовність суворого термінатора транскрипції rrnBT 1 T 2 ;

Послідовність із 1139 н. до 1229 н. включає фрагмент ДНК плазміди pUC19 з 2487 н. до 2577 н. розміром 91 п.о., що містить промотор гена -лактомази (ген стійкості до ампіциліну - Аmр R);

Послідовність із 1230 н. до 2045 н. містить фрагмент ДНК плазміди pUC4K з 720 н. до 1535 н. розміром 816 п.о., що містить структурну ділянку гена kan;

Послідовність із 2046 н. за 3218 зв. включає фрагмент ДНК плазміди pUC19 з 1625 по 453 н. розміром 1173 п.н., що містить послідовність, відповідальну за реплікацію плазміди (ori) і промотора lac (P lac).

На фіг.1-5 зображені схеми конструювання та фізична карта плазміди рSХ50.

На фіг.6 представлена ​​встановлена ​​для плазміди pSX50 повна послідовність нуклеотидів.

Штам Escherichia coli SX50 отримано трансформацією клітин Escherichia coli BL21 плазмідою pSX50 з використанням традиційної генно-інженерної технології. Штам E.Coli SX50 характеризується такими ознаками.

Культурально-морфологічні ознаки

Клітини дрібні, прямі, потовщеної паличкоподібної форми, грамнегативні, неспороносні. Клітини добре ростуть на простих живильних середовищах. При зростанні на агарі "Діфко" утворюються круглі, гладкі, опуклі, каламутні, блискучі, сірі колонії, з рівними краями. При зростанні рідких середовищах (у мінімальному середовищі з глюкозою або в LB-бульйоні) утворюють інтенсивну рівну каламут.

Фізико-біологічні ознаки

Аероб. Температурний діапазон зростання 4-42°З оптимумі рН 6,5-7,5.

Як джерело азоту використовують як мінеральні солі в амонійній та нітратній формах, так і органічні сполуки у вигляді амінокислот, пептону, триптону, дріжджового екстракту і т.д.

Як джерело вуглецю використовують амінокислоти, гліцерин, вуглеводи. Стійкість до антибіотиків. Клітини виявляють стійкість до канаміцину (до 100 мкг/мл).

Штам Escherichia coli 8Х50 – продуцент інтерферону.

Спосіб, умови та склад середовища для зберігання штаму

L-arape з додаванням канаміцину до концентрації 20 мкг/мл під маслом, L-бульйоні, що містить 15% гліцерину і відповідними антибіотиками в ампулах при температурі мінус 70°С, в ліофілізованому стані в ампулах при температурі плюс 4°.

Штам Escherichia coli SX50 ідентифікований за Визначником Берги (1974) як штам виду Escherichia coli.

Спосіб промислового отримання альфа-2b інтерферону

Особливістю заявляється способу є розробка технології, що дозволяє виділяти інтерферон з нерозчинної форми, що накопичується протягом ферментації, що дозволяє суттєво спростити технологічну схему процесу виділення та підвищити вихід цільового продукту.

Спосіб полягає в культивуванні штаму Escherichia coli SХ50 в живильному середовищі, з постійним додаванням поживних субстратів, переважно глюкози і дріжджового екстракту, в процесі біосинтезу, переважно зі зниженим вмістом триптофану, механічному руйнуванні клітин мікрофером0 високо0 розчині гуанідин гідрохлориду, ренатурації інтерферону у фізіологічних буферних розчинах у присутності хаотропних агентів, з подальшим тристадійним хроматографічним очищенням інтерферону на смолах типу Chelating Sepharose Fast Flow, іммобілізованих іонами Сu +2 , смолах типу Superdex 75

Оптимальними умовами проведення окремих стадій отримання інтерферону є:

Ферментацію проводять при безперервному додаванні субстратів протягом усього процесу, що зумовлює високий рівень експресії інтерферону;

Руйнування клітин здійснюють у дезінтеграторі типу Гаулін при тиску 900 bar;

Видалення розчинних клітинних компонентів (ДНК, РНК, білків, ліпополісахаридів і т.д.) проводять промиванням нерозчинної форми інтерферону буферними розчинами, що містять детергенти (Тритон XI00, сечовина і т.д.);

Осад, що містить інтерферон, розчиняють у буферному розчині 6 М гуанідину гідрохлориду;

Ренатурацію інтерферону проводять у фізіологічному буферному розчині, що містить хаотропні агенти;

Тристадійне хроматографічне очищення інтерферону проводять на Chelating Sepharose Fast Flow, іммобілізованої іонами Сu +2 , на катіонообмінної смолі СМ Sepharose Fast Flow і фільтраційну гель хроматографію на смолі типу Superdex 75;

Після кожного хроматографічного очищення проводять стерилізуючу фільтрацію через апірогенні фільтри з розмірами пор 0.22 мкм.

Вихід інтерферону внаслідок застосування описаного способу становить приблизно 400-800 мг інтерферону з 1 л культурального середовища. Якість продукту відповідає нормам та вимогам "European Pharmacopoeia" для субстанції альфа-2b інтерферону.

Істотними відмінностями заявляється способу від прототипу є:

Використання конструкції штаму з більш високою продуктивністю, що дозволяє отримувати при біосинтезі більшу кількість інтерферону з 1 л культурального середовища;

Використання ефективного механічного руйнування клітинної біомаси, що дозволяє отримувати чистіший екстракт нерозчинної форми інтерферону за більш короткий час, з меншими втратами;

Використання буферних фізіологічних розчинів при ренатурації в присутності хаотропних агентів дозволяє підвищити вихід коректно ренатурованої форми інтерферону;

Тристадійне хроматографічне очищення інтерферону дозволяє отримувати субстанцію інтерферону більше 99% чистоти за даними електрофорезу в редулюючих і нередукуючих умовах при фарбуванні гелів сріблом і більше 98% за даними RF HPLC і практично не містить пірогенів (LAL-тест).

Сутність та переваги заявляється групи винаходів ілюструється наступними прикладами.

Приклад 1. Конструювання рекомбінантної плазміди рSХ50

Спосіб конструювання плазміди pSX50 включає наступні етапи:

Конструювання векторної плазміди pSX10;

1. конструювання плазміди pSX3 (2641 п.о.)

2. конструювання векторної плазміди pSX10 (2553 п.о.)

Конструювання рекомбінантної плазміди pSX41 (3218 п.о.);

Конструювання рекомбінантної плазміди pSX43 (3218 п.о.);

Конструювання рекомбінантної плазміди pSX45 (3218 п.о.);

Конструювання рекомбінантної плазміди pSX50 (3218 п.о.).

Конструювання векторної плазміди pSX10

Векторна плазміда pSX10 являє собою вектор pUC19, в якому кодуюча послідовність гена бета-лактомази, що забезпечує стійкість до ампіциліну, замінюється послідовністю кодування гена kаn і містить термінатор транскрипції з плазміди рКК223-3.

Конструювання векторної плазміди pSS10 проводять у дві стадії:

Отримання плазміди pSX3 (2641 п.о.), що представляє собою плазміду pUC19, в якій кодує область гена аmp гена замінюється на кодуючу область гена kan;

Отримання вітерної плазміди pSX10 (2553 п.о.), що являє собою плазміду pSX3, в якій за сайтом BamHI вставлений фрагмент ДНК, що кодує термінатор транскрипції рГBT 1 T 2 .

Для отримання плазміди pSX3 проводять п'ять раундів ампліфікації ДНК методом ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція). В ході першого раунду, використовуючи ДНК плазміди pUC19 як матрицю, проводять ампліфікацію фрагмента ДНК розміром 1828 п.о. (фрагмент PU1-PU2) за допомогою праймерів:

Дану та наступні ПЛР реакції проводять у наступних умовах: 20 mМ Tis-HCl, рН 8.8, 10 mM (NH 4) 2 SO 4 ,10 mМ КСl, 2 тМ MgCl 2 , 0.1% Triton Х100,0.1 mg/ml BSA, 1 mM кожного dNTP, 1.25 од. Pfu ДНК полімерази, 100 нг ДНК. Процес ампліфікації складається з наступних стадій: прогрівання при 95°С 5 хв, 35 циклів ПЛР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 2 хв 72°С) та інкубація 10 хв при 72°С. Після ампліфікації (і після наступних ампліфікацій) фрагмент ДНК очищають електрофоретично 1% агарозному гелі. В ході другого та третього раундів, використовуючи ДНК плазміди pUC4K як матрицю, проводять ампліфікацію фрагмента ДНК розміром 555 п.о. (Фрагмент КМ1-КМ2) за допомогою праймерів:

та ампліфікацію фрагмента ДНК розміром 258 п.о. (КМЗ-КМ4) із праймерів

У п'ятому раунді ПЛР проводять об'єднання фрагментів (PU1-PU2) і (КМ1-КМ4) у таких умовах: прогрівання при 95°С 5 хв, 5 циклів ПЛР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 10 хв 72° С) та інкубація 10 хв при 72°С. ДНК, отриману після останньої ПЛР, прямо трансформують у клітини штаму E.coli DH5 і висівають на середовище LA, що містить 20 мкг/мл канаміцину. Після інкубування протягом 12 годин при 37°С клони відсівають, виділяють плазмідну ДНК та проводять рестрикційний аналіз. В результаті одержують плазміду рSХ3 розміром 2641 п.о.

Для отримання векторної плазміди pSX10 проводять три раунди ампліфікації ДНК методом ПЛР. В ході першого раунду, використовуючи ДНК плазміди pSX3 як матрицю, проводять ампліфікацію фрагмента ДНК розміром 2025 п.о. (фрагмент 10.1-10.2) за допомогою праймерів:

У ході другого раунду, використовуючи ДНК плазміди рКК223-3 як матрицю, проводять ампліфікацію фрагмента ДНК розміром 528 п.о. (фрагмент КК1-КК2) за допомогою праймерів:

У третьому раунді ПЛР проводять об'єднання фрагментів (10.1-10.2) і (КК1-КК2) у таких умовах: прогрівання при 95°С 5 хв, 5 циклів ПЛР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 10 хв 72° С) та інкубація 10 хв при 72°С. ДНК, отриману після останньої ПЛР, прямо трансформують у клітини штаму E.coli DH5 і висівають на середовище LA, що містить 20 мкг/мл канаміцину. Після інкубування протягом 12 годин при 37°С клони відсівають, виділяють плазмідну ДНК та проводять рестрикційний аналіз. В результаті одержують плазміду pSX10 розміром 2553 п.о.

Конструювання рекомбінантної плазміди pSX41

Рекомбінантна плазміда pSX41 являє собою Hind III - BamHI фрагмент ДНК векторної плазміди pSX3 (2529 п.о.), Hind III - EcoRI фрагмент ДНК розміром 168 п.о. синтетичний фрагмент ДНК розміром 20 п.о., що кодує SD послідовність (Шайн-Дельгарно) та XbaI-BamHI фрагмент ДНК розміром 501 п.о., що кодує ген альфа 2b інтеферону людини.

Для отримання Hind III - ВаmHI фрагмент ДНК векторної плазміди pSX3 (2529 п.о.) ДНК плазміди pSX3 обробляють ферментами рестрикції HindIII і BamHI з подальшим електрофоретичним очищенням в 1% агарозному гелі. Hind III EcoRI фрагмент ДНК розміром 168 в.

Для отримання EcoRI-Xbal синтетичний фрагмент ДНК розміром 20 п.о., що кодує послідовність SD (Шайн-Дельгарно), синтезуються наступні комплементарні олігонуклеотиди:

XbaI-ВаmIII фрагмент ДНК розміром 501 п.о., що кодує ген альфа 2b інтеферону людини, отримують методом ПЛР, використовуючи тотальну ДНК людини як матрицю і праймери IFN1 і IFN2 з подальшою обробкою ампліфікованого фрагмента рестриктазами Xbal і

Далі електрофоретично очищені фрагменти об'єднують, лігують ферментом лігаза фага Т4, ДНК трансформують у клітини штаму E.coli DH5 і висівають на середовище LA, що містить 20 мкг/мл канаміцину. Після інкубування протягом 12 годин при 37°С клони відсівають, виділяють плазмідну ДНК, проводять рестрикційний аналіз та визначають первинну структуру ДНК. В результаті одержують плазміду pSX41 розміром 3218 п.о. Далі проводять поетапний мутагенез гена інтерферону збільшення рівня експресії цільового продукту. Мутагенез гена інтерферону полягає в заміні рідко зустрічаються в Е. coli триплетів, що кодують відповідні амінокислоти на часто зустрічаються в Е. coli триплети, що кодують ці ж амінокислоти. Мутагенез ДНК гена інтерферону проводять методом ПЛР.

Конструювання рекомбінантної плазміди pSX43

Для отримання рекомбінантної плазміди pSX43 проводять один раунд ампліфікації ДНК методом ПЛР, використовуючи ДНК плазміди pSX41 як матриці та праймери IFN3 та IFN4:

ПЛР проводять у наступних умовах: прогрівання при 95°С 5 хв, 20 циклів ПЛР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 10 хв 72°С) та інкубація 20 хв при 72°С. ДНК, отриману після ПЛР, прямо трансформують у клітини штаму E.coli DH5 і висівають на середовище LA, що містить 20 мкг/мл канаміцину. Після інкубування протягом 12 годин при 37°С клони відсівають, виділяють плазмідну ДНК, проводять рестрикційний аналіз та визначають первинну структуру ДНК. В результаті одержують плазміду рSХ43 розміром 3218 п.о.

Конструювання рекомбінантної плазміди pSX45

Для отримання рекомбінантної плазміди pSX45 проводять один раунд ампліфікації ДНК методом ПЛР, використовуючи ДНК плазміди pSX43 як матриці та праймери IFN5 та IFN6:

ПЛР проводять у наступних умовах: прогрівання при 95°С 5 хв, 20 циклів ПЛР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 10 хв 72°С) та інкубація 20 хв при 72°С. ДНК, отриману після ПЛР, прямо трансформують у клітини штаму E.coli DH5 і висівають на середовище LA, що містить 20 мкг/мл канаміцину. Після інкубування протягом 12 годин при 37°С клони відсівають, виділяють плазмідну ДНК, проводять рестрикційний аналіз та визначають первинну структуру ДНК. В результаті одержують плазміду pSX45 розміром 3218 п.о.

Конструювання рекомбінантної плазміди pSX50

Для отримання рекомбінантної плазміди pSX50 проводять один раунд ампліфікації ДНК методом ПЛР, використовуючи ДНК плазміди pSX45 як матриці та праймери IFN7 та IFN8:

ПЛР проводять у наступних умовах: прогрівання при 95°С 5 хв, 20 циклів ПЛР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 10 хв 72°С) та інкубація 20 хв при 72°С. ДНК, отриману після ПЛР, прямо трансформують у клітини штаму E.coli DH5 і висівають на середовище LA, що містить 20 мкг/мл канаміцину. Після інкубування протягом 12 годин при 37°С клони відсівають, виділяють плазмідну ДНК, проводять рестрикційний аналіз та визначають первинну структуру ДНК. В результаті одержують плазміду pSX50 розміром 3218 п.о.

Приклад 2. Отримання штаму Е. coli SX50 – продуцента інтерферону

Штам продуцент інтерферону Е. coli SX50 одержують шляхом трансформації клітин штаму Е. coli BL21 рекомбінантною плазмідою рSХ50. Штам продуцент інтерферону вирощують в 30 л ферментер до оптичної щільності 25.0-30.0 о.е. серед М9, що містить 1% кислотного гідролізату казеїну (Difco), 1% глюкози, 40 мкг/мл канаміцину, при температурі 38-39°С. У процесі ферментації проводять безперервне додавання поживного субстрату, використовуючи гравітометричний контролер.

Приклад 3. Спосіб виділення інтерферону із штаму Е. coli SX50

Отримання інтерферону проводили у 4 етапи:

1 етап. Культивування штаму Е. coli SX50.

2 етап. Виділення та очищення нерозчинної форми інтерферону.

3 етап. Розчинення та ренатурація інтерферону.

4 етап. Хроматографічна очистка інтерферону.

1 етап. Культивування штаму Е. coli SX50

Вирощений посівний матеріал штаму Е. coli SX50 в об'ємі 3 л багатого середовища LB протягом 12 год при 26°С асептично вносять в ферментер, що містить 27 л стерильного середовища, що містить М9, 1% кислотного гідролізату казеїну, 1% глюкози 2 , 0.1 mM CaCl 2 , 40 мг/мл канаміцину. Культивування в ферментері проводять при температурі 38-39°С, підтримуючи рН 7±0,15 шляхом автоматичного підтитрування 40% розчином гідроксиду натрію. Концентрацію розчиненого кисню в діапазоні (50±10)% від насичення підтримують шляхом зміни швидкості обертання мішалки від 100 до 800 об/хв і подачі повітря від 1 до 15 л/хв. Концентрацію субстратів, зокрема глюкози та дріжджового екстракту, вимірюють протягом ферментації та підтримують їх концентрацію шляхом зміни швидкості подачі концентрованих розчинів через перистальтичні насоси, використовуючи гравіметричний контролер.

Накопичення інтерферону у вигляді нерозчинної форми контролюють за допомогою фазово-контрастної мікроскопії, методом електрофорезу у 15% поліакриламідному гелі (SDS-PAAG) та методом зворотнофазної високоефективної хроматографії (RF HPLC). Ферментацію зупиняють після досягнення максимальної оптичної щільності (~ 25-30 о.е.) та зупинки синтезу інтерферону. Після закінчення ферментації культуральну рідину сепарують центрифугуванням у проточному роторі при швидкості обертання 5000-10000 об/хв. Біомасу фасують поліетиленові пакети і заморожують при температурі мінус 70°С.

2 етап. Виділення та очищення нерозчинної форми інтерферону

300-400 г замороженої біомаси штаму Е. coli SX50 суспедують у 3000 мл буфера 1 (20 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 10 мМ ЕДТА, 0,1% Triton X100). Суспензію пропускають через проточний гомогенізатор типу Гаулін, підтримують тиск 900 бар та центрифугують у проточному роторі при 15 000 об/хв. Отриманий осад промивають в аналогічних умовах послідовно буферами 2 (20 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 1 мМ ЕДТА, 3 М сечовини) і буфером 3 (20 мМ Tris-HCl pH 8.0, 1 мМ ЕДТА) і остаточно осад інтерферону суспедують мл буфера 3. При цьому час виділення та очищення нерозчинної форми інтерферону становить не більше 5 год.

3 етап. Розчинення та ренатурація інтерферону

До отриманої на попередньому етапі суспензії нерозчинної форми інтерферону додають сухий гуанідин гідрохлорид до концентрації 6 М, додають дитиотреитол до концентрації 50 мМ, Tris-HCl pH 8.0 до концентрації 50 мМ, NaCl до концентрації 150 м1 і концентрації 100 і Triton X. кімнатній температурі протягом 2 год. Нерозчинний матеріал відокремлюють при стерилізуючій фільтрації через мембрани з діаметрами пор 0.22 мікрона.

Ренатурацію інтерферону проводять шляхом повільного розведення отриманого розчину в 100-200 разів буфером 4 (20 мМ Tris-HCl pH 8.0, 100 мМ NaCl, 0.1 мМ ЕДТА). Після цього ренатураційну суміш інкубують при постійному перемішуванні протягом 12-15 годин при температурі 4-8°С. Далі сульфат магнію додають до концентрації 1 мМ і агрегований матеріал видаляють стерилізуючою фільтрацією через мембранний фільтр з діаметром пор 0.22 мікрона.

4 етап. Хроматографічна очистка інтерферону

Хроматографічне очищення інтерферону здійснюють у три стадії.

1. Отриманий ренатурований інтерферон на першому етапі очищають за допомогою афінної хроматографії на смолі типу Chelating Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences), іммобілізованої іонами Cu +2 . Для цього розчин інтерферону наносять на колону Cu +2 Chelating Sepharose Fast Flow і інтерферон елююють буфером 0.1 М лимонної кислоти pH 2.2.

2. На другій стадії хроматографічного очищення розчин інтерферону наносять на катіонообмінну смолу типу CM Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) та інтерферон елююють градієнтом розчинів (0.0-0.5 М NaCl) у буфері 50 мМ Nа(СН 3 .

3. Очищення мономерної форми інтерферону від залишків полімерних форм інтерферону проводять на третій стадії очищення інтерферону гель-фільтрацією на смолі типу Superdex 75 (Amersham Biosciences). Хроматографію проводять у буфері 50 мМ Na(CH 3 COO), рН 5.0, що містить 0.15М NaCl.

Описаний спосіб виділення та очищення інтерферону дозволяє отримати 4-8 г високоочищеного інтерферону за один цикл виділення протягом 7-10 днів із біомаси, отриманої з 10 л культурального середовища. Якість одержуваного інтерферону повністю відповідає вимогам "European Pharmacopoeia" для субстанції інтерферону альфа-2b, а саме:

Концентрація інтерферону не менше 2×10 8 МО/мл;

Питома активність інтерферону щонайменше 2.0×10 8 МО/мг;

Електофоретична чистота препарату не менше 99% у редукувальних та не редукувальних умовах при фарбуванні гелів сріблом;

Ізоелектрична точка виділеного інтерферону знаходиться в районі рН 5.8-6.3;

Пептидна карта виділеного інтерферону принципово не відрізняється від пептидної картки для Європейського стандарту інтерферону альфа 2b CRS;

Як випливає з наведених прикладів, група винаходу, що заявляється, дозволяє отримувати інтерферон альфа-2b з високим виходом при відносно простій і надійної технології.

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Рекомбінантна плазмідна ДНК pSX50, що кодує синтез рекомбінантного людського альфа-2b інтерферону, що характеризується тим, що вона має розмір 3218 пар основ (п.о.) і складається з наступних фрагментів: послідовність з 1 по 176 нуклеотиду (н.) включає фрагмент ДНК розміром 176 п.о., що містить триптофановий промотор (Р trp), послідовність з 177 до 194 н. включає синтетичний фрагмент ДНК розміром 18 п.о., що містить послідовність Шайн Дельгарно, відповідальний за ініціацію трансляції, послідовність з 195 до 695 н. включає фрагмент ДНК розміром 501 п.о., що містить ген інтерферону альфа-2b з нуклеотидними замінами: 37 (А>С), 39 (G>T), 40 (А>С), 42 (G>T), 67 ( А>С), 69 (G>T), 70 (А>С), 72 (А>Т), 96 (G>A), 100 (А>С), 102 (А>Т), 114 (А) >С), 120 (C>G), 126 (G>A), 129 (G>A), 330 (C>G), 339 (G>A), 342 (G>A), 487 (A>) C), 489 (А>Т), 495 (G>A), послідовність з 696 по 713 н. включає синтетичний фрагмент ДНК розміром 18 п.о., що містить синтетичний полілінкер, послідовність з 714 до 1138 н. включає фрагмент ДНК плазміди рКК223-3 з 4129 до 4553 н. розміром 425 п.о., що містить послідовність суворого термінатора транскрипції rrnBT 1 T 2 послідовність з 1139 по 1229 н. включає фрагмент ДНК плазміди pUC19 з 2487 до 2577 н. розміром 91 п.о., що містить промотор гена -лактомази (ген стійкості до ампіциліну -Amp R), послідовність з 1230 до 2045 н. містить фрагмент ДНК плазміди pUC4K з 720 н. до 1535 н. розміром 816 п.о., що містить структурну область гена kan, послідовність 2046 н. за 3218 зв. включає фрагмент ДНК плазміди pUC19 з 1625 по 453 н. розміром 1173 п.н., що містить послідовність, відповідальну за реплікацію плазміди (ori) і промотора lac (P lac).

2. Штам бактерій Eschcerichia coli SX50 трансформований рекомбінантною плазмідою за п.1 – продуцент рекомбінантного лейкоцитарного інтерферону альфа-2b людини.

3. Спосіб отримання інтерферону альфа-2b людини, що включає культивування штаму Escherichia coli SX5 по п.2 в поживному середовищі з постійним додаванням поживних субстратів в процесі біосинтезу, механічне руйнування клітин мікроорганізму при тиску 700-900 bar, розчинення і , ренатурацію інтерферону в фізіологічних буферних розчинах у присутності хаотропних агентів, тристадійну хроматографічну очистку інтерферону на смолах типу Chelating Sepharose Fast Flow, іммобілізованих іонами Сu +2 .

4. Спосіб за п.3, в якому культивування проводять на живильному середовищі зі зниженим вмістом триптофану при безперервному додаванні поживних субстратів, переважно глюкози та дріжджового екстракту.

5. Спосіб за п.3, в якому перед розчиненням інтерферону його очищають видаленням розчинних клітинних компонентів, що включають ДНК, РНК, білки, ліпополісахариди, промиванням буферними розчинами, що містять детергенти типу Тритон XI 00 сечовин.

6. Спосіб за п.3, в якому після кожного хроматографічного очищення проводять стерилізуючу фільтрацію через фільтри з розмірами пір 0.22 мкм.