Комбінативні зміни. Трансдукція, трансформація та кон'югація. Генетичні рекомбінації (трансдукція, кон'югація, трансформація), їх механізм та значення у мінливості Особливості побудови генетичних карт у прокаріотів

Тема: Генетика мікроорганізмів 1. Кон'югація, трансдукція, трансформація. 2. Мінливість мікроорганізмів. 3. Використання досягнень генетики бактерій.

Спадковий апарат бактерій має ряд особливостей: бактерії – гаплоїдні організми, тобто вони мають 1 хромосому. У зв'язку з цим при наслідуванні ознак відсутнє явище домінантності; Бактерії мають високу швидкість розмноження, у зв'язку з чим за короткий проміжок часу (добу) змінюється кілька десятків поколінь бактерій. Це дає можливість вивчати великі за чисельністю популяції і легко виявляти навіть рідкісні за частотою мутації. Спадковий апарат бактерій представлений хромосомою. У бактерій вона одна. Хромосома бактерій – це молекула ДНК. Довжина цієї молекули досягає 1,0 мм і, щоб "вміститися" в бактеріальній клітині, вона не лінійна, як у еукаріотів, а суперспіралізована в петлі і згорнута в кільце. Це кільце в одній точці прикріплено до цитоплазматичної мембрани. На бактеріальній хромосомі розташовуються окремі гени. У кишкової палички, наприклад, їх понад 2 тис.

2. Функціональними одиницями геному бактерій, крім хромосомних генів, є: IS-послідовність; транспозони; плазміди. IS-послідовності (англ. insertion – вставка, sequence – послідовність) – короткі фрагменти ДНК. Вони не несуть структурних (кодують той чи інший білок) генів, а містять тільки гени, відповідальні за транспозицію (здатність IS-послідовностей переміщатися хромосомою і вбудовуватися в різні її ділянки). ISпослідовності однакові у різних видів бактерій. Транспозони - це молекули ДНК, більші, ніж IS послідовності. Крім генів, відповідальних за транспозицію, вони містять і структурний ген, що кодує ту чи іншу ознаку. Транспозони (Tn-елементи) складаються з 2000 -25 000 пар нуклеотидів, містять фрагмент ДНК, що несе специфічні гени, і два кінцеві ISелементи. Кожен транспозон зазвичай містить гени, що привносять важливі для бактерії характеристики типу множинної стійкості до антибактеріальних агентів. Загалом, для транспозонів характерні самі гени, як і плазмид (гени стійкості до антибіотиків, токсинообразования, додаткових ферментів метаболізму). Транспозони легко переміщаються хромосомою. Їхнє положення позначається на експресії як їх власних структурних генів, так і сусідніх хромосомних. Транспозони можуть існувати і поза хромосомою,

Плазміди – кільцеві суперспіралеподібні молекули ДНК. Їхня молекулярна маса коливається в широких межах і може бути в сотні разів більше, ніж у транспозонів. Плазміди містять структурні гени, що наділяють бактеріальну клітину різними, дуже важливими для неї властивостями: R-плазміди – лікарською стійкістю; Col-плазміди – здатністю синтезувати коліцини; F-плазміди – передавати генетичну інформацію; Тох-плазміди – синтезувати токсин; Плазміди біодеградації - руйнувати той чи інший субстрат і т. д. Плазміди можуть бути інтегровані в хромосому (на відміну від ISпослідовностей та транспозонів, вбудовуються в строго певні ділянки), а можуть існувати автономно. У цьому випадку вони мають здатність до автономної реплікації, і саме тому в клітині може бути 2, 4, 8 копій такої плазміди. Багато плазміди мають у своєму складі гени трансмісивності та здатні передаватися від однієї клітини до іншої при кон'югації (обміні генетичною інформацією). Такі плазміди називаються трансмісивними.

У бактерій розрізняють 2 види мінливості - фенотипічну та генотипічну. Фенотипова мінливість - модифікація - не торкається генотипу, але торкається більшості особин популяції. Модифікації не передаються у спадок і з часом загасають, тобто повертаються до вихідного фенотипу через більшу (тривалі модифікації) або меншу (короткочасні модифікації) ісло поколінь. год Генотипова мінливість торкається генотипу. В її основі лежать мутації та рекомбінації. Мутації бактерій принципово не відрізняються від мутацій еукаріотів. Особливістю мутацій у бактерій є відносна легкість їх виявлення, оскільки є можливість працювати з більшими за чисельністю популяціями бактерій. За походженням мутації може бути: спонтанними; індукованими. За довжиною: точковими; генними; хромосомними. За спрямованістю: прямими; - Зворотними.

Рекомбінації (обмін генетичним матеріалом) у бактерій відрізняються від рекомбінацій у еукаріотів: у бактерій є кілька механізмів рекомбінацій; при рекомбінаціях у бактерій утворюється не зигота, як у еукаріотів, а мерозигота (несе повністю генетичну інформацію реципієнта та частину генетичної інформації донора у вигляді доповнення); у бактеріальної клітини-рекомбінату змінюється як якість, а й кількість генетичної інформації.

Кон'югація У бактерій – спосіб перенесення генетичного матеріалу від однієї бактеріальної клітини до іншої. При цьому дві бактерії з'єднуються тонким містком, через який з однієї клітини (донора) до іншої (реципієнт) переходить відрізок нитки дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК). Спадкові властивості реципієнта змінюються відповідно до кількості генетичної інформації, що міститься в переданому шматочку ДНК.

Кон'югація Кон'югація (від лат. conjugatio - з'єднання), парасексуальний процес - односпрямоване перенесення частини генетичного матеріалу (плазмід, бактеріальної хромосоми) при безпосередньому контакті двох бактеріальних клітин. Відкритий у 1946 році Дж. Ледербергом та Е. Тайтемом. Має велике значення у природі, оскільки сприяє обміну корисними ознаками за відсутності справжнього статевого процесу. З усіх процесів горизонтального перенесення генів кон'югація дозволяє передавати найбільшу кількість генетичної інформації.

Кон'югація - обмін генетичною інформацією у бактерій шляхом передачі її від донора до реципієнта при їхньому прямому контакті. Після утворення між донором і реципієнтом кон'югаційного містка одна нитка ДНК-донора надходить у клітину-реципієнт. Чим довше контакт, тим більша частина донорської ДНК може бути передана реципієнту. Ґрунтуючись на перериванні кон'югації через певні проміжки часу, можна визначити порядок розташування генів на хромосомі бактерій - побудувати хромосомні карти бактерій (здійснити картування бактерій). Донорська функція має F+-клітини.

Трансдукція Естер Ледерберг вдалося виділити бактеріофаг лямбда, ДНК-вірус, з Escherichia coli K 12 в 1950 році. Відкриття трансдукції пов'язане з ім'ям Джошуа Ледерберга. У 1952 році вони спільно з Нортоном Циндер виявили загальну трансдукцію. У 1953 Ледербергом та ін. було показано існування абортивної трансдукції, у 1956 – специфічної.

Трансдукція-обмін генетичною інформацією у бактерій шляхом передачі її від донора до реципієнта за допомогою помірних (трансдукуючих) бактеріофагів. Трансдукуючі фаги можуть переносити 1 або більше генів (ознаки). Трансдукія буває: специфічною - переноситься завжди той самий ген; неспецифічної – передаються різні гени. Це пов'язано з локалізацією трансдуіюючих фагів у геномі донора: у разі специфічної трансдукції вони розташовуються завжди в одному місці хромосоми; при неспецифічній їхній локалізації непостійна.

Рис. 2. Трансдукція 1 – бактерія – донор (В+), 2 – фаг, 3 – розмноження, 4 – адсорбція, 5 – бактерія – реципієнт (В-), 6 – бактерія – реципієнт з новою властивістю.

Трансформація - це обмін генетичною інформацією у бактерій шляхом введення в бактеріальну клітину реципієнта готового препарату ДНК (спеціально приготовленого або безпосередньо виділеного з клітини-донора). Найчастіше передача генетичної інформації відбувається при культивуванні реципієнта на живильному середовищі, що містить ДНК донора. Для сприйняття донорської ДНК при трансформації клітинареципієнт має перебувати у певному фізіологічному стані (компетентності), що досягається спеціальними методами обробки бактеріальної популяції або виникає спонтанно. При трансформації передаються поодинокі (частіше 1) ознаки. Трансформація є найоб'єктивнішим свідченням зв'язку ДНК або її фрагментів з тією чи іншою фенотипічною ознакою, оскільки в реципієнтну клітину вводиться чистий препарат ДНК.

Рис. 3. Трансформація капсульного штаму бактерії (1) при посіві дає ріст (6). Після кип'ятіння цієї культури зростання відсутнє (7). Аналогічний результат такого досвіду з безкапсульним штамом (4-зростання +, 8-зростання -). Об'єднання в одну ємність екстракту касульного (1) та живої культури безкапсульного (3) штамів з наступним висівом дає зростання капсульного штаму (5).

Властивості клітин колоній S - і R-форм S-форма R-форма Колонії шорсткі, непрозорі з нерівними краями, часто зморшкуваті Джгутики часто відсутні Капсули або слизовий шар відсутній Біохімічно менш активні Слабовірулентні або авірулентні осад крихтоподібний, клітини поліморфні Колонії прозорі, з гладкою блискучою поверхнею, круглі, з рівними краями, опуклі Рухливі види мають джгутики У капсульних видів добре видно капсула або слизовий шар клітин у фізіологічному розчині гомогенна, стійка, клітини нормальних розмірів

ГЕНЕТИЧНІ РЕКОМБІНАЦІЇ у еукаріотів відбуваються в процесі статевого розмноження шляхом взаємного обміну фрагментами хромосом, при цьому з двох батьківських хромосом утворюються дві рекомбінантні, тобто. виникають дві рекомбінантні особини.

У прокаріотів немає статевого розмноження в результаті внутрішньогеномних перебудов: зміна локалізації генів в межах хромосоми, або при проникненні в реципієнта частини ДНК донора → формування мерозиготи, тобто. утворюється лише ОДИН РЕКОМБІНАТ.

ГенР відбуваються за участю ферментів у межах окремих генів чи груп зчеплень генів. Існують спеціальні REC-ГЕНИ, що визначають здатність бактерій до рекомбінацій. Передача генетичного матеріалу від Б! до Б! відбувається шляхом трансформації, трансдукції та кон'югації, а плазмідних генів - шляхом трансдукції та кон'югації.

ТРАНСФОРМАЦІЯ -безпосередня передача генетичного матеріалу (фрагменту ДНК) донора Рец #. (Вперше Гріффітс – досвід з живим авірулентним безкапсульним штамом пневмокока, к/й став вірулентним при обробці екстрактом убитих капсульних пневмококів.)

З донорної ДНК реципієнтну клітину зазвичай передається лише один ген, т.к. фрагмент ДНК, який може проникнути в Рец дуже маленький. Трансформації піддається лише частина клітин Б!! популяції - компетентними. Стан компетентності (коли стінка Б! проникна високополімерних (Мг=0,5–1 млн) фрагментів ДНК) виникає зазвичай наприкінці LOG–ФАЗЫ.

Фази процесу трансформації:

1) адсорбція ДНК-донора на Рец #;

2) проникнення ДНК всередину Рец і деспіралізація ДНК.

3) з'єднання будь-якої з двох ниток ДНК донора з гомологічною ділянкою хромосоми реципієнта і подальша рекомбінацією.

Ефективність залежить від ступеня гомологічної ДНК донора і реципієнта, що визначає кінцевий результат, тобто кількість формуються рекомбінантів (трансформантів) міжвидова трансформація відбувається набагато рідше, ніж внутрішньовидова.

ТРАНСДУКЦІЯ- Передача генетичного матеріалу за допомогою фагів. Розрізняють три типи трансдукції:

Неспецифічна (загальна).У момент складання фагових частинок в їх головку може проникнути БУДЬ-ЯКИЙ фрагмент ДНК Б!-донора. Разом з фагової ДНК переносяться будь-які гени донора і включаються в гомологічну область ДНК Рец# шляхом рекомбінації. Фаги лише переносять генетичного матеріалу

Специфічна- Фаг переносить ВИЗНАЧЕНІ гени при вищепленні профагу з Б! хромосоми разом із рядом розташованими генами, при цьому фаг стає дефектним. При взаємодії фага з Рец# відбувається включення гена донора та дефектного фага в хромосому РецБ!, а Б!! стають несприйнятливими до подальшого зараження вірулентним фагом.

Абортивна- фрагмент ДНК бактерії-донора не включається в хромосому РецБ!, а міститься в цитоплазмі і в такому вигляді функціонує. Під час поділу цей фрагмент ДНК передається лише одній дочірній #, і зрештою втрачається у потомстві.

КОН'ЮГАЦІЯ- Перенесення генетичного матеріалу з клітини-донора в клітину реципієнта при їх схрещуванні. Донори – ## з F-плазмідою (статевий фактор). При схрещуванні F+ з F–#статевий фактор передається незалежно від хромосоми донора, при цьому майже всі Рец# стають F+.

F-плазміда може інтегрувати Б! хромосому. У деяких випадках вона звільняється, захоплюючи при цьому зчеплені з нею Б! гени (позначаються із зазначенням включеного гена: F-lac).

1) прикріплення клітини-донора до Рец# за допомогою SEX-ПИЛЕЙ

2) утворення кон'югаційного МОСТИКА, через який передається F-фактор та інші плазміди, що знаходяться в цитоплазмі донора.

3) розрив одного з ланцюгів ДНК (у місці включення F-плазміди) за участю ендонуклеази. Один кінець ДНК проникає в Рец# і відразу ж добудовується до 2-ниткової структури. При переносі захоплюється частина ДНК Б!-донора - Hfr-штами (HIGH FREQUENCY OF RECOMBINATION). При схрещуванні Hfr-штаму з F-# F-фактор, не передається (бо кон'югаційний місток розривається, а F-фактор розташований у дистальній частині хромосоми). Передаються лише гени Б! хромосоми, розташовані поблизу початку перенесення (О-точка (origin)).

4) На решті # нитки ДНК синтезується 2 ланцюжка.

22. Спори та спороутворення у мікроорганізмів, властивості спор, методи виявлення спор.

Спороутворення спостерігається за умов, несприятливих для вегетативних форм. У бактерій виділяють 3 види спор:

– ЕНДОСПОРИ (справжні суперечки) – розташовуються всередині, мають високий коефіцієнт світлозаломлення.

- АРТОСПОР - обр-ся в рез фрагментації вегетуючих Б!!

- ХЛАМІДІОСПОРИ (мікроцисти) - формуються в різ потовщення стінок вегетуючої # і накопичення запасних піт в-в.

До спороутворення здатна лише невелика група еубактерій, та якщо з патогенних для чка лише – Clostridium і Bacillus. Кожна вегетативна утворює 1 ендоспору. Спори СТІЙКІ до t°С, висихання, радіації та хімічних в-вам (включаючи 70° етанол). Можуть зберігатися дуже довго. Імовірно, суперечки можуть зберігатися в сухому грунті до 1000 років, але фактично вже за 50 років 90% суперечки втрачають життєздатність.

Морфологічно суперечки м.б. круглими, овальними, еліптичними, деякі мають «ребра жорсткості».

ПРОЦЕС СПОРУЛЯЦІЇ починається відразу при виникненні дефіциту поживних речовин і триває близько 8год, при цьому ніяких зовнішніх джерел живлення або енергії не потрібно. Стимулюють – глюкоза, Р та NH 4 , пригнічують – пептон, лактоза, NaCl, CaCl 2 . Виділяють слід ЕТАПИ:

1) Підготовча стадія – припиняється розподіл, починається накопичення ліпідних включень.

2) Стадія передспори – з'являється еліптична оболонка, що оточує ділянку цитоплазми із зміненою щільністю та тинкторіальними властивостями.

3) Формування оболонки

4) Стадія дозрівання суперечки – відбувається її ущільнення та припинення будь-яких переміщень в #-спорангії.

5) Руйнування батьківської #.

6) У оптимальних умовах відбувається проростання суперечки. Спочатку вона активно поглинає воду і набухає, посилюється дихання, зростає активність ферментів, відбувається виділення АК – активація метаболізму (у цей період суперечки втрачає терморезистентність). Потім суперечка лопається і з неї виходить вегетативна форма.

Рекомбінація – сукупність процесів, пов'язаних із заміщенням ділянки вихідної нуклеїнової кислоти на гомологічну (подібну) ділянку.

При цьому ступінь гомології може бути різним: від повної ідентичності вихідної та нової нуклеотидних послідовностей до помітних розбіжностей, що призводять до зміни фенотипу. В результаті рекомбінації утворюються нові поєднання алелів, наприклад: AB + ab → Ab + aB.

У прокаріотів існує три способи включення в геном чужорідної ДНК: трансформація, кон'югація та трансдукція.

Трансформація

Трансформацією називається перенесення чистої ДНК з одних клітин до інших. Трансформація була відкрита бактеріологом Ф. Гріффітсом в 1928 р. у дослідах з пневмококами. У пневмококів відомо два типи штамів: S-і R-форми.

S-форма характеризується наявністю полісахаридної капсули, завдяки чому при штучному культивуванні вона утворює гладкі блискучі колонії; ця форма патогенна для мишей. R-форма не має капсули, при штучному культивуванні вона утворює шорсткі колонії; ця форма непатогенна для мишей. Але якщо мишам одночасно ввести вбиті S-клітини та живі R-клітини, миші гинуть. Отже, генетичні властивості одного штаму впливають генетичні властивості іншого штаму.

У 1944 р. О. Евері, К. МакЛеод та М. МакКарті довели, що зміна спадкових властивостей клітин пов'язана з перенесенням ДНК.

Здатність клітини до трансформації можлива за особливого її стану, що називається компетентністю. У компетентних клітин змінюється склад клітинної стінки і плазмалеми: стінка стає пористою, плазмалема утворює численні вп'ячування, але в зовнішній поверхні виникають особливі антигени – чинники компетентності (зокрема, специфічні білки з низькою молекулярної масою).

У природних умовах чиста позаклітинна ДНК утворюється при загибелі (лізисі) прокаріотів.

Як правило, трансформація відбувається в межах одного виду прокаріотів, але за наявності гомологічних генів спостерігається і міжвидова трансформація.

Процес трансформації включає наступні стадії:

1. Приєднання трансформуючої двониткової ДНК до рецепторів на поверхні клітини-реципієнта.

2. Перетворення двониткової ДНК на однониткову.

3. Проникнення однониткової ДНК у клітину.

4. Інтеграція трансформуючої ДНК у хромосому реципієнта та рекомбінація генетичного матеріалу.

Довжина трансформуючої ДНК має бути від 500 до 200 тисяч понеділка. Енергія, що виділяється при деградації однієї з ниток ДНК, використовується для активного транспорту нитки, що залишилася, всередину клітини.

Перші три стадії трансформації залежить від нуклеотидного складу ДНК. Однак процес інтеграції трансформуючої ДНК у хромосому реципієнта більш вірогідний за високої гомологічності цієї ДНК по відношенню до ДНК реципієнта.

Процес трансформації зображено на схемі. Кожен відрізок прямої відповідає одному ланцюзі ДНК. Трансформуюча ДНК позначена чорним кольором, а ДНК клітини-реципієнта – сірим кольором.

На першій стадії трансформуюча ДНК приєднується до рецепторних сайтів на поверхні клітини-реципієнта.

На другому етапі двониткова ДНК на поверхні клітини перетворюється на однониткову за рахунок розщеплення однієї з ниток бактеріальними нуклеазами.

На третьому етапі нитка ДНК, що залишилася, транспортується через мембрану в цитоплазму. При цьому використовується енергія, що виділилася під час деградації комплементарного ланцюга.

При реплікації бактеріальної хромосоми трансформуюча нитка ДНК приєднується до гомологічної (частково комплементарної) ділянки ДНК клітини-реципієнта. При цьому через відсутність повної комплементарності утворюється гетеродуплекс («молекулярна гетерозигота») – ділянка двониткової ДНК, на якій не у всіх нуклеотидних парах азотисті основи пов'язані водневими зв'язками. Решта ДНК реплікується нормально.

Після закінчення реплікації ДНК клітина-реципієнт ділиться з утворенням двох клітин: частково трансформованої клітини з хромосомою, що включає гетеродуплексну ділянку ДНК, та нетрансформованої клітини. При реплікації ДНК у частково трансформованій клітині обох ланцюгах ДНК відбувається добудовування комплементарних ланцюгів. Один ланцюг зберігає вихідні послідовності нуклеотидів, а інший стає повністю трансформованим. Після поділу частково трансформованої клітини утворюється одна нетрансформована клітина і одна повністю трансформована, яка має вихідну послідовність нуклеотидів заміщена на послідовність нуклеотидів трансформуючої ДНК.

Таким чином, при трансформації відбувається заміщення генів реципієнта на гомологічні нуклеотидні послідовності. Що ступінь гомології, то успішніше протікає трансформація.

Частота трансформації у прокаріотів залежить від властивостей трансформуючої ДНК, від її концентрації, від стану клітини-реципієнта, від виду бактерій. Максимальна частота трансформованих клітин не перевищує 1 на 100 клітин.

Трансформація відома і для еукаріотів. Однак на поверхні еукаріотичних клітин відсутні рецепторні сайти, і ДНК, що трансформує, вводять у клітини штучно. Наприклад, в яйцеклітини тварин ДНК вводять шляхом прямої мікроін'єкції, а в яйцеклітини рослин - шляхом мікроін'єкції в пилкову трубку. Широко використовуються методи біобалістики (біолістики), що дозволяють вводити будь-які фрагменти ДНК у культурі тканин рослини.

Кон'югація

Кон'югацією у прокаріотів називається прямий контакт двох різноякісних клітин, що супроводжується хоча б частковим перенесенням генетичного матеріалу від клітини-донора до клітини-реципієнта. (Процес кон'югації було відкрито 1946 р. Дж. Ледербергом і Еге. Татумом).

У кишкової палички клітина-донор («чоловіча») має довгасту форму, клітина-реципієнт («жіноча») – ізодіаметричну. Клітина-донор утворює статеві ворсинки (пили), які притягують її до клітини-реципієнта та утворюють цитоплазматичні канали. Цими каналами ДНК із клітини-донора перетворюється на клітину-реципієнт. Існує три типи клітин-донорів: F + (еф-плюс), Hfr (ейч-еф-а) і F ' (еф-прим).

F + -донори містять у цитоплазмі статевий фактор - специфічну F-плазміду.

F-плазміда - це автономний реплікон довжиною близько 100 тпн. У складі F-плазміди вивчено понад 20 генів. Приблизно половина їх утворює гігантський оперон tra (довжиною близько 30 тпн); продукти цього оперону контролюють утворення контакту між донором та реципієнтом та власне перенесення ДНК. Інші гени регулюють роботу tra–оперона.

Клітина-реципієнт не містить F-плазміди і позначається як F-клітка.

При утворенні цитоплазматичного містка один з ланцюгів F-плазміди надрізається в певній точці (точка О), а на комплементарному ланцюгу починається реплікація ДНК за принципом кільця, що «котиться». Копія комплементарного ланцюга по цитоплазматичному містку переходить в цитоплазму клітини-реципієнта, і на ньому добудовується ланцюг, що бракує. Після закінчення реплікації двониткова плазмідна ДНК замикається в кільце, і F - клітина перетворюється на F + - клітину. Повний час перенесення копії F-плазміди в клітину-реципієнт становить приблизно 5 хвилин.

Однак при схрещуванні F + × F - в клітину-реципієнт потрапляють тільки гени, що містяться в F-плазміді; гени домашнього господарства, локалізовані в бактеріальній хромосомі, в клітину-реципієнт не переносяться.

У той же час F-плазміда може вбудовуватись у бактеріальну хромосому, тобто переходити в інтегрований стан. У бактеріальній хромосомі є близько 20 сайтів інтеграції F-плазміди. Тоді при перенесенні копії одного з ланцюгів F-плазміди в клітину-реципієнт за нею захоплюється і копія одного з ланцюгів бактеріальної хромосоми. Клітини з інтегрованою F-плазмідою називаються Hfr-донори (від англ. «висока частота рекомбінацій»). Залежно від умов можливе повне або часткове перенесення копії бактеріальної хромосоми Hfr-донора в цитоплазму реципієнта. В результаті утворюється клітина з однією вихідною двонитковою бактеріальною хромосомою та однією повною або неповною гомологічною однонитковою молекулою ДНК. Така клітина називається мерозигота («часткова зигота»). Далі при реплікації ДНК відбувається рекомбінація. Цей процес принципово не відрізняється від рекомбінації під час трансформації.

Перенесення копії ДНК починається приблизно з середини F-плазмідної ДНК (з точки О, в якій один з ланцюгів ДНК надрізається, і починається реплікація F-плазмідної ДНК). Таким чином, половина F-плазмідної ДНК проникає в клітину-реципієнт на початку кон'югації, а друга половина - тільки після повного перенесення копії хромосомної ДНК. Для завершення цього процесу при t = 37 0 С потрібно більше 100 хвилин. Однак у природних умовах кон'югація переривається значно раніше, у клітину-реципієнт переходить лише частина копії хромосоми донора і лише перша половина F-плазмідної ДНК. Таким чином, клітина-реципієнт не приймає властивості Hfr-донора.

Однак існують штами бактерій, у яких копія бактеріальної хромосоми разом з копією F-плазмідної ДНК переноситься повністю. Такі клітини називаються vHfr–донори (від англ. «дуже висока частота рекомбінацій»).

Імовірність перенесення певного гена в клітину-реципієнт залежить від його видалення від F-плазмідної ДНК, а точніше, від точки О, в якій починається реплікація F-плазмідної ДНК. Чим більший час кон'югації, тим вища ймовірність перенесення цього гена. Це дозволяє скласти генетичну карту бактерій у хвилинах кон'югації. Наприклад, у кишкової палички ген thr (оперон із трьох генів, що контролюють біосинтез треоніну) знаходиться в нульовій точці (тобто безпосередньо поруч із F–плазмідною ДНК), ген lac переноситься через 8 хв, ген recE – через 30 хв, ген argR – через 70 хв і т.д.

F-плазміда може переходити з інтегрованого стану в автономне шляхом самовирізування з бактеріальної хромосоми. У цьому випадку можливе захоплення частини хромосомної ДНК (до 50% хромосомних генів). F-плазміда, що включає хромосомні гени, називається F -фактором. Перенесення генетичного матеріалу при схрещуваннях F′×F – називається сексдукцією.

Крім F-плазміди у прокаріотів відомі й інші типи статевих факторів (R, Ent, Hly, Col), які забезпечують перенесення генетичного матеріалу від бактерії до бактерії. На основі природних плазмід (у тому числі ДНК хлоропластів та мітохондрій) отримані напівсинтетичні молекули ДНК, що забезпечують перенесення генетичного матеріалу з однієї клітини до іншої, називаються вектори. Вектори повинні забезпечувати як стійке перенесення генів, а й регуляцію їх транскрипції.

Прокаріотичні плазміди можуть реплікуватись лише у прокаріотичних клітинах. У той же час існує необхідність перенесення генів від еукаріотів до прокаріотів і навпаки. Для цього використовуються човникові плазміди, які містять два реплікатори (прокаріотичний та еукаріотичний) і здатні реплікуватися і в прокаріотичних, і в еукаріотичних клітинах, наприклад, Ti– та Ri–плазміди, здатні до реплікації в прокаріотичних та рослинних клітинах, та напівсин з їхньої основі. Для захисту векторів від руйнування нуклеазами їх укладають у фосфоліпідні бульбашки – ліпосоми.

Трансдукція

Трансдукцією називається перенесення генетичного матеріалу за допомогою вірусів із клітини-донора до клітини-реципієнта. (Явлення трансдукції відкрив у 1951 р. Н. Зіндер (учень Дж. Ледерберга)).

При трансдукції у віріони потрапляє ДНК клітини-хазяїна. Віріони заражають інші клітини і ДНК вихідної бактеріальної клітини проникає в іншу бактеріальну клітину. Вірусна ДНК інтегрується в бактеріальну хромосому, а привнесена бактеріальна ДНК рекомбінує ДНК бактеріальної хромосоми. В результаті 50% клітин виявляються трансформованими.

Розрізняють загальну (неспецифічну), обмежену (специфічну) та абортивну трансдукцію.

Загальна трансдукція

При загальній трансдукції фрагменти бактеріальної ДНК донора випадково включаються в дозріваючу фагову частинку разом з фаговою ДНК або замість фагової ДНК. Фрагменти бактеріальної ДНК утворюються під час її розрізання ферментом, контрольованим фагом. До складу фагової частки може включатись до 100 бактеріальних генів.

Обмежена трансдукція

При обмеженій трансдукції відбувається рекомбінація – бактеріальна ДНК замінює частину фагової ДНК. До складу рекомбінантної ДНК входить невелика кількість бактеріальних генів, що належать до фагової ДНК, інтегрованої в бактеріальну хромосому.

При загальній та обмеженій трансдукції донорська ДНК замінює гомологічні ділянки ДНК реципієнта. Цей процес подібний до трансформації.

Абортивна трансдукція може бути і неспецифічною, і специфічною. Її сутність полягає в тому, що трансдукований фагом фрагмент ДНК не включається в хромосому реципієнта, а існує як цитоплазматичний реплікон. Рано чи пізно цей реплікон втрачається.

Явище трансдукції вірусами широко використовується при перенесенні генів у еукаріотів. Якщо застосовується вірус, нездатний формувати капсид (тобто існуючий лише у формі ДНК), то трансдукція принципово відрізняється від трансформації чи то з кон'югативного перенесення генетичного матеріалу з допомогою плазмид-векторів. Створено системи векторів на основі модифікованих вірусів SV40 (вони утворюють у клітині до 100 тисяч копій), герпесу, осповакцини, вірусу мозаїки цвітної капусти.

Слід ще раз наголосити, що всі описані типи рекомбінації пов'язані не з додаванням нових ділянок ДНК, а із заміщенням вже наявних нуклеотидних послідовностей. Чим вищий ступінь гомології трансформуючої та вихідної ДНК, тим вища ймовірність успішної рекомбінації. Найлегше вдається рекомбінація ферментів, що є у всіх організмів. Найважче ввести в геном нові регулятори, що відрізняються високою специфічністю. Тому для впровадження в геном нових генів використовуються складніші методи, пов'язані з біохімічними модифікаціями ДНК.

Тема 7: Цитоплазматичне успадкування . Генетика соматичних клітин та тканин.

1. Цитоплазматичне успадкування. Генетичний матеріал напівавтономних органоїдів. Пластидне успадкування. Спадкування через мітохондрії. Цитоплазматична чоловіча стерильність

2. Особливі типи наслідування. Передетермінація цитоплазми. Спадкування через інфекцію та ендосімбіонтів

3. Генетика соматичних клітин. Соматичні мутації. Хімери. Генетика онкологічних захворювань.

Комбінативні зміни.

З'являються внаслідок трансформації та кон'югації. Трансформація - це процес перенесення ділянки генетичного матеріалу ДНК, що містить одну пару нуклеотидів, відклітини-донорак клітинерецептору.

У процесі трансформації розрізняють 5 стадій:

1)Адсорбція трансформуючої ДНК на поверхні мікробної клітини;

2)Проникнення ДНК у клітину-реципієнт;

3)Спарювання ДНК, що впровадилася, з хромосомними структурами клітини;

4) Включення ділянки ДНК клітини-донорів хромосомні структури клітини-реципієнта;

5) Подальша зміна нуклеотиду під час наступних поділів. Оптимальна температура трансформації 29-32С.

Трансдукція- це зміна, у якому генетичний матеріал отклетки-доноракклетке-реципиентупереносит трансдуцірующий (помірний) фаг, тобто. фаг, що не викликає її руйнування.

Розрізняють три типи трансдукції:

1) Загальна (неспецифічна), може відбуватися перенесення різних чи кількох ознак одночасно.

2) Специфічна, характеризується перенесенням лише певної ознаки.

3) Абортивна ділянка ДНК клітини-донора, перенесена фагом в клітину-реципієнта, не включається в її геном.

Кон'югація - форма статевого процесу, при якому відбувається з'єднання чоловічої та жіночої мікробних клітин та обмін між ними ядерною речовиною.

При цьому генетичний матеріал клітини-донора переходить у клітину реципієнт. Після рекомбінації та поділу клітини утворюються форми з ознаками кон'югуючих клітин.

Таким чином, всі три форми комбінативної мінливості (трансформація, трансдукція, кон'югація) різні формою, але однакові по суті. При трансформації ділянка ДНК клітини-донора в клітину-реципієнт, при трансдукції цю роль виконує фаг, а при кон'югації перенесення генетичної інформації здійснюється через цитоплазматичний місток (пилки).

Ріккетсії

Грамнегативні мікроби. За формою короткі палички або коки. Ріккетсії мають клітинну стінку, яка подібна до клітинної стінки грамнегативних бактерій.

Відносять до справжніх бактерій. Прокаріоти.

Нітрифікація.

Продукти гниття білків і розкладання сечовини аміак та аміачні солі – можуть бути безпосередньо засвоєні рослинами, але вони зазвичай перетворюються на нітрати солі азотної кислоти.

У першій фазі нітрифікації аміак окислюється до азотної кислоти за схемою

DG = -662кДж/моль.

Процес нітрифікації відбувається у кілька стадій, у своїй утворюється ряд проміжних продуктів: гидроксиламин, нітроксил та інших.

У другій фазі азотиста кислота окислюється до азотної:

DG=-201кДж/моль.

Перша та друга фаза єдиного процесу нітрифікації викликаються різними збудниками. С.М. Виноградський об'єднав їх у три роди:

1)Нитросомонас. Мають форму паличок, грамнегативні, рухливі, забезпечені одним джгутиком, суперечка не утворюють. Широко поширені у ґрунті та відрізняються один від одного формою та розмірами.

2) Nitrosocystis. Здатний утворювати зооглеї (кокові форми мікробів, навколишньою капсулою)

3) Nitrosspira. Вони поділяються на два види. Бактерії обох видів мають правильну форму. Поряд із спірально закрученими нитками у старих культур зустрічаються короткі палички та коки.

Останнім часом виділено ще два роди мікробів, що викликають першу фазу нітрифікації.

Нітрифікуючі бактерії негативно ставляться до органічних речовин. Сильна чутливість нітрифікуючих мікробів до органічних речовин відзначається у розчинах; у грунті цього немає, т.к. у ній водорозчинних речовин у значних кількостях ніколи не буває.

На процеси окислення аміаку впливають як мікроби, а й їх ферменти. Крім органічної речовини на нітрифікацію впливає концентрація аміаку. Його вплив на культуру різко проявляється в умовах рідких середовищ. У ґрунті ж аміак знаходиться адсорбованому стані і не може чинити пригнічуючої дії. Тому нітробактер відразу ж окислює азотисту кислоту азотну.

На процес нітрифікації позитивно позначається присутність кисню. У оброблюваних ґрунтах процес нітрифікації протікає інтенсивніше.

Трансформація - зміна спадкових властивостей клітини внаслідок проникнення чи штучного привнесення до неї чужорідної ДНК. Природу трансформуючого фактора встановили Евері, Мак-Леод в 1944. Трансформувати вдається тільки ті бактерії, в клітини яких може проникнути високомолекулярна, дволанцюжкова (інтактна) ДНК. Здатність поглинати ДНК – компетенція і залежить від фізіологічного стану клітини. ДНК може поглинатися певну коротку фазу зміни клітинної поверхні. За допомогою ДНК можуть передаватися такі ознаки як: капсулоутворення, синтез в-в, ферментативна активність, стійкість до отрути, антибіотиків. Кон'югація - перенесення генетичного матеріалу шляхом прямого контакту між двома клітинами. Досліджували Ледерберг та Татум у 1946 на мутантах Кишкової палички. Один мутант чекав амінокислот А і В, але був здатний синтезувати Сі Д, другий був йому компетентний (А-В-С + Д +). Ці мутанти не росли і не утворювали колоній на мінімальному, поживному середовищі, але якщо внести на неї суспензію обох мутантів, колонії з'являлися. Клітини цих колоній мали спадкову здатність синтезувати всі амінокислоти (А+В+С+Д+). Тут передумовою рекомбінації є кон'югація. При дослідженні бактерій з'ясували, що здатність клітини бути донором пов'язана з наявністю фактора F (F+клітини, які не містять фактора – F- і може функціонувати як реципієнт) – плазміда, кільцева, дволанцюжкова молекула ДНК. Т.о. клітини реципієнти внаслідок кон'югації стають донорами, а хромосомні ознаки не передаються. F-плазміда зумовлює утворення на клітині статевих фімбрій/F-пили, які служать для впізнавання при контакті між клітиною донором і клітиною реципієнтом і роблять можливим утворення містка, яким ДНК переходить в клітину. Кон'югація поширена у ентеробактерій, прокаріотів. Трансдукція - пасивне перенесення бактеріальних генів з однієї клітини в іншу частинками бактеріофага, що призводить до зміни спадкових властивостей клітини. Розрізняють 2 види трансдукції: а) неспецифічний - при якому може бути перенесений будь-який фрагмент ДНК господаря (ДНК клітини господаря включається в частинку фага / до його власного гена / замість нього); б) Специфічний – може бути перенесений строго певний фрагмент ДНК, деякі гени фага замінюються генами господаря). У обох випадках фаги дефектні, тобто. втрачають здатність лізувати клітину.

38. Фактори резистентності (r-фактори). Властивості плазмідів. Транспозони.

1. Резистентність- Устойч.орг-мов до будь-яких антигенів. Бактерії стійкі до деяких антибіотиків були відкр. У 50-ті роки в Японії (збудники дезінтерії. отм.множ.уст-ть бакт.дезінтерії і це може перед.ін. відразу до 8 антибіотиків, а ін R-ф.надають уст-ть до тяж.мет.(ртуть, нікель, кадмій) R-плазміда несе 2 гр.генів:1)ген відп. ) і вони обр.так назив. Склад. лише невелика частина плазміди.

RTF включ.всі гени,відповід.за перенесення фактора R з клітини в клітину, котор.осущ.шляхом кон'югації. Т. е фактор R також як і фактор F-інфекційний. Можливе перенесення R-фактору між декількома різними пологами бактерій, що способств.их подальшому распр. Фермітативн.хім.модиф.антибіотиків явл.осн.причиною уст.до них,обусл.плазмідами. Наприклад канаміцин і неоміцин подверг.фосфореліров-ю, а пінпіц.інактивіро.пеніциліназою. поск. При наявності. R-факторів можлива генетт.рекомбінація, то може.возн.нов.сочет-е генів,котор.додадуть.доповн.св-ва уст-ти. R-фактори мають більш.знач-е для хіміо-терапії.

2. Бактеріоцини. Багато бакт.синтез.білки,Юкотор. Убив.родств.види чи штами чи гальмують їх зростання. Ці білки називаються бактеріоцинами. Вони кодир. Особ.плазмідами, котор.назів.бактеріоциногенними факторами. Бактеріоцини були виділені з ешріхіа колі (коліцини) та ін. Назв-е бактеріоцинам дається по продуцир.формі бакт., напр.стафілококі произв.стафілоцини. неорг.в-ва, убив.бакт.зв.антисептиками.

3. ін.призн., опр.плазмідами.Плазміди можуть содерж.гени,котор.обусл.ряд специф.біол.св-в,котор.в опр.усл-ях созд. Гени ферментів, необхідні для розщепл-я комифори, саліц. до-ти та ін. Перелік св-в, наслед.с плазмидами, значить-й включає: азотфиксацию,обр-е бульбочок, погл-е цукрів, синтез гідрогенази та інших. Некотор.з цих св-в можуть опр.генами бактер. Хромасоми (обмін генами м-ду хромосомою та плазмідою). Плазміди зіграли важливу роль в евол.прокаріотів.

4. Несумісність.Багато бакт.міст.плазміди розл.велич. Сосущ.разн.плазмідів в одній клітині говорить про те, що такі плазміди сумісні між собою. Але 2 спорідненості.плазміди не можуть сосущ.в одній клітині, вони несумісні. Усі плазміди подр.на гр.несов-ти: плазміди,отн.до однієї й тієї ж групі несовм.

Транспозони –це послід-ти ДНК,которые.способны встр.во мног.уч-ки геному і можуть «перепр.»з плазміди на бакт.хромосому,на ін.плазміду. Транспазони містять гени, котор.опр.зовнішньорозп.ознаки,а саме уст-ть до таких антибіотиків як пиниц.,тетрациклін та ін. У зв'язку з цим їх легше виявити. .собою инсерцион.посл-ти зустрічей в бакт.хромосомах і плазмидах.). По обидва боки від генів уст-ти, котор.нах.внутрі транспозона розпол 2 однаковий посл-ти,котор.можуть у одному й тому ж чи протипол.напр-ях. Ці повт.посл-ти підстав ДНК частково ідентичні з IS - Ел-тамі.

41. Еволюція м/оів.

Кл-ки всього живого від примітивних форм до високо організованих складаються з одних і тих же структурних елементів і ви одні й ті ж механізми для отримання енергії і зростання. У цьому полягає біохімічна єдність живих організмів. У процесі еволюції відбувалося становлення та формування різних форм живого. Для процесу еволюції життя необхідно представити якісь умови були на Землі, в кіт виявилося можливим самозародження життя. У після формування Землі період на ній відбувалися активні біологічні процеси, кіт змінювали її вигляд і призводили до формування земної кори, гідросфери і атмосфери. Коли органіч-ва на Землі накопичилися у великій кількості =>виникли умови, при якому міг відбутися перехід від хіміч еволюції до виникнення перших живих істот, що самовідтворюються. Для кліт життя характерно, що вона завжди має вигляд опред структур, кіт просторово відокремлені від зовнішнього середовища, але постійно взаємодіє з нею на кшталт отк систем. Передбачав, що слідом етапом еволюції на шляху виникнення життя було формування певної структурної організації – абіогенносинтезованих органічних сполук. Вони мали сферичну форму, діаметр 0,5-7мкм, нагадували коккоподібні форми бактерій, містили протеїноїди, кіт мали певну стабільність. При фарбуванні за грамом було виявлено, що мікросфери, утворені з кислих протеїноїдів – гр-, а основними протеїноїдами – гр+. Цей етап перехідний етап від хімічної до біологічної еволюції і закономірність, що виникла, може бути визначена як передбіологічний природний відбір. Надалі припустив, що першими прокаріотами, кіт могли з'явитися у водоймах, де було багато органіч-ва були організми, кіт сущий за рахунок бродіння і володіли основними функціями анаеробного обміну. Якщо припустити, що у водоймах були тоді і сульфати, то слід етапом еволюції явл ефективний транспорт електронів зі створенням протонного потенціалу як джерела енергії для регенерації АТФ. Крім того, було експериментально показано, що на початковому етапі еволюції прокаріоти могли відтворюватися і передавати інформацію потомству без участі нуклеїнових кислот. Для подальшої еволюції прокаріотів було необхідно створення спеціального апарату, який би забезпечував точне відтворення поліпептидів. Це спричинило формуванню нового механізму синтезу – матричного синтезу, основу якого лежить використання властивостей полінуклеотидів. Властивістю полінуклеїнових молекул є здатність до точного відтворення, що базується на принципі структурної компліментарності.

Головна подія в еволюції: перехід від первинної атмосфери, що відновлює, до атмосфери, що містить кисень. У бактерій з'явився новий тип метаболізму - аеробне дихання, що стало можливо в результаті перетворення цитохромів на термінальні оксидази, використовуючи молекули О 2 як акцептор електронів. Припускають, що 2 млрд років тому вже існують усі фототрофні прокаріоти, кіт і зараз. Прокаріоти первинно займали багато різних екологічних ніш, кіт потім поступово поступилися еукаріотів. Вироблення різноманітних типів метаболізму у прокаріотів була обумовлена ​​простою структурною клітиною, високорозвиненою системою регуляції, швидким зростанням, наявністю дек механізмів переносу генів.

42.ПАТОГЕН МІКРООРГ І ІМУНІТЕТ.

Імунітет захищає нас від інфекційних агентів: бактерій, вірусів та найпростіших, тобто захищає організм від усього чужорідного.

Інфекція – складний біологічний процес, що виникає внаслідок проникнення патогенних мікробів в організм та порушення сталості його внутрішнього середовища.

Патогенність – це здатність мікроба певного виду за відповідних умов викликати характерне йому інфекційне захворювання. Отже, патогенність є видовою ознакою.

У природному середовищі зустрічаються біологічні забруднювачі, які викликають у людини різні захворювання. Це хвороботворні мікроорганізми, віруси, гельмінти, найпростіші. Вони можуть бути в атмосфері, воді, грунті, в тілі інших живих організмів, у тому числі і в самій людині.

Найбільш небезпечні збудники інфекційних захворювань. Вони мають різну стійкість у навколишньому середовищі. Одні здатні жити поза організмом людини лише кілька годин; знаходячись у повітрі, у воді, на різних предметах, вони швидко гинуть. Інші можуть жити у навколишньому середовищі від кількох днів до кількох років. Для третіх навколишнє середовище є природним місцем проживання. Для четвертих - інші організми, наприклад дикі тварини, є місцем збереження та розмноження.

Часто джерелом інфекції є ґрунт, в якому постійно мешкають збудники правця, ботулізму, газової гангрени, деяких грибкових захворювань. В організм людини вони можуть потрапити при пошкодженні шкірних покривів з немитими продуктами харчування, при порушенні правил гігієни.