Комбінативні зміни. Трансдукція, трансформація та кон'югація. Особливості побудови генетичних карт у прокаріотів Механізми передачі генетичної інформації трансформація трансдукція кон'югація

Процес утворення геномів, що містять генетичний матеріал від двох батьківських форм. У бактерій здійснюється внаслідок кон'югації, трансформації, трансдукції.

Рекомбінації поділяють на законні та незаконні. Законна рекомбінація вимагає наявності протяжних, комплементарних ділянок ДНК у молекулах, що рекомбінуються. Вона відбувається лише між близькими видами мікроорганізмів.

Незаконна рекомбінація не потребує протяжних комплементарних ділянок ДНК.

Трансформація- процес поглинання клітиною організму вільної молекули ДНК із середовища та вбудовування її в геном, що призводить до появи у такої клітини нових для неї успадкованих ознак, характерних для організму-донора ДНК. Клітини, здатні сприймати донор
ну ДНК, називаються компетентними. Стан компетентності недовго. Воно виникає в певний період зростання бактеріальної культури. У стані компетентності клітинна стінка бактерій стає проникною для високополімерних фрагментів ДНК. Очевидно, це пов'язано з тим, що фрагмент ДНК, що трансформується, зв'язується з білком, утворюючи трансформасому, в якій він переноситься в бактеріальну клітину. Процес трансформації:

1).Адсорбція ДНК-донора на клітині-реципієнті.

2) проникнення ДНК усередину клітини-реципієнта;

3) з'єднання ДНК з гомологічною ділянкою хромосоми реципієнта з наступною рекомбінацією.

Після проникнення внутрішньо клітини трансформуюча ДНК деспіралізується. Потім відбувається фізичне включення будь-якої з двох ниток ДНК донора геном реципієнта.

Трансдукція- процес перенесення бактеріальної ДНК з однієї клітини до іншої бактеріофагом.

Неспецифічна: трансдукуючі фаги є лише переносником генетичного матеріалу від одних бактерій до інших, оскільки сама фагона ДНК не бере участі в утворенні рекомбінантів.

Специфічна: характеризується здатністю фага переносити певні гени від бактерії-донора до бактерії-
реципієнту.

Абортивна: принесений фагом фрагмент ДНК бактерії донора не включається в хромосому бактерії реципієнта, а міститься в цитоплазмі.

Кон'югація- односпрямоване перенесення частини генетичного матеріалу при безпосередньому контакті двох бактеріальних клітин.

Першим етапом є прикріплення клітини-донора до реципієнтної клітини за допомогою статевих ворсинок. Потім між обома клітинами утворюється кон'югаційний місток через який з клітини-донора в клітину-реципієнт можуть передаватися F-фактор та інші плазміди, що знаходяться в цитоплазмі бактерії-донора в автономному режимі. .

16) Біотехнологія- дисципліна, що вивчає можливості використання живих організмів, їх систем чи продуктів їхньої життєдіяльності для вирішення технологічних завдань, а також можливості створення живих організмів з необхідними властивостями методом генної інженерії.

Один із методів отримання вакцинних штамів: метод генної інженерії (інактивація гена, який відповідає за утворення факторів вірулентності патогенних мікробів).

Н-р, Векторні рекомбінантні вакциниодержують методом генної інженерії. Для цього геном вакцинного штаму вбудовують ген (вектор), що контролює утворення антигенів іншого збудника (чужорідного антигену). Наприклад, у штам вірусу віспи вакцини вбудовують антиген вірусу гепатиту В(HBs – антиген). Така векторна вакцина створює імунітет і проти віспи та гепатиту В.

Молекулярні вакцини отримують також методом генної інженерії.Так отримано вакцину проти гепатиту В, антигени якого синтезуються клітинами дріжджів.

17) Температура – важливий чинник, що впливає життєдіяльність мікроорганізмів. Для мікроорганізмів розрізняють мінімальну, оптимальну та максимальну температуру. Оптимальна- Температура, при якій відбувається найбільш інтенсивне розмноження мікробів. Мінімальна– температура, нижче за яку мікроорганізми не виявляють життєдіяльності. Максимальна- Температура, вище якої настає загибель мікроорганізмів.

Сприятлива діяоптимальної температури використовується при вирощуванні мікроорганізмів з метою лабораторної діагностики, приготування вакцин та інших препаратів.

Гальмуюча діянизьких температур використовується при зберіганні продуктів та культур мікроорганізмів в умовах холодильника. Низька температура припиняє гнильні та бродильні процеси. Механізм дії низьких температур – загальмовування у клітині процесів метаболізму та перехід у стан анабіозу.

Згубна діявисокої температури (вища за максимальну) використовується при стерилізації . Механізмдії – денатурація білка (ферментів), ушкодження рибосом, порушення осмотичного бар'єру. Найбільш чутливі до дії високої температури психрофіли та мезофіли. Особливу стійкістьвиявляють суперечкибактерій.

Фізичні методи:стерилізація високою температурою, УФ опроміненням, іонізуючим опроміненням, ультразвуком, фільтруванням через стерильні фільтри.

Пастеризація - часткова стерилізація (спори не гинуть), яка проводиться при відносно низькій температурі одноразово. Пастеризацію проводять при 70-80 ° С, 5-10 хв або при 50-60 ° С, 15-30 хв. Пастеризація використовується для об'єктів, що втрачають свої якості при високій температурі. використовують для деяких харчових продуктів: молока, вина, пива . При цьому не пошкоджується їхня товарна цінність, але суперечки залишаються життєздатними, тому ці продукти потрібно зберігати на холоді.

Контроль стерилізації.

У зв'язку з поширенням останніми роками мікроорганізмів, високо резистентних до дії факторів довкілля, посилюються способи стерилізації та контролю за її якістю.

Для контролю стерилізації використовуються:

1. Фізичні методи– максимальні та контактні термометри.

2. Хімічні речовинияк температурні індикатори Це порошкоподібні речовини із строго визначеною температурою плавлення: бензонафтол(110°С), антипірин (113°С), резорцин та сірка (119°С), бензойна кислота (120°С). Ці речовини змішують з невеликою кількістю сухої анілінової фарби (фуксин, метиленовий синій) і поміщають у запаяні скляні трубочки, які укладають між предметами, що стерилізуються. Цей метод використовують для контролю режиму стерилізації в автоклаві. Якщо температура в автоклаві була достатньою, речовина в трубочці плавиться і забарвлюється в колір барвника, який розчиняється в цій речовині.

3. Біологічні методи- Використання термостійкої спороутворюючої тест культури – Bacillus stearothermophilus. Його суперечки гинуть при 121 ° С за 15 хв при їх вмісті в 1 мл середовища 106 клітин. Біологічний тест використовують для контролю режиму стерилізації у печі Пастера . Пробірки зі смужками марлі, фільтрувального паперу, з шовковою ниткою, заражені спорами, поміщають у шафу між предметами, що стерилізуються. Після стерилізації в пробірку вносять поживний бульйон і спостерігають зростання мікроорганізмів.

18) Стерилізація текучою парою.

Метод заснованийна бактерицидній дії пари (100°С) щодо лише вегетативних клітин.

Апаратура– автоклав із незакрученою кришкою або апарат Коха.

Апарат Коха -це металевий циліндр із подвійним дном, простір у якому на 2/3 заповнено водою. У кришці – отвори для термометра та для виходу пари. Зовнішня стінка фанерована матеріалом, що погано проводить тепло (лінолеум, азбест). Початок стерилізації – час від закипання води та надходження пари до стерилізаційної камери.

Матеріал і режим стерилізації. Цим методом стерилізують матеріал, який не витримує температуру вище 100 ° С: живильні середовища з вітамінами, вуглеводами (середовища Гісса, Ендо, Плоскірєва, Левіна), желатином, молоко.

При 100°С суперечки не гинуть, тому стерилізацію проводять кілька разів. дробова стерилізація - 20-30 хв щодня протягом 3 днів.

У проміжках між стерилізаціями матеріал витримують за кімнатної температури для того, щоб проросли суперечки у вегетативні форми. Вони гинуть при наступному нагріванні при 100°С.

Тиндалізація та пастеризація.

Тиндалізація -метод дробової стерилізації за температури нижче 100°С. Вона використовується для стерилізації об'єктів, які не витримують 100°С: сироватка, асцитична рідина, вітаміни . Тиндалізація проводиться у водяній бані при 56 ° С по 1 годині 5-6 днів.

Подібна інформація.

Рекомбінація – сукупність процесів, пов'язаних із заміщенням ділянки вихідної нуклеїнової кислоти на гомологічну (подібну) ділянку.

При цьому ступінь гомології може бути різним: від повної ідентичності вихідної та нової нуклеотидних послідовностей до помітних розбіжностей, що призводять до зміни фенотипу. В результаті рекомбінації утворюються нові поєднання алелів, наприклад: AB + ab → Ab + aB.

У прокаріотів існує три способи включення в геном чужорідної ДНК: трансформація, кон'югація та трансдукція.

Трансформація

Трансформацією називається перенесення чистої ДНК з одних клітин до інших. Трансформація була відкрита бактеріологом Ф. Гріффітсом в 1928 р. у дослідах з пневмококами. У пневмококів відомо два типи штамів: S-і R-форми.

S-форма характеризується наявністю полісахаридної капсули, завдяки чому при штучному культивуванні вона утворює гладкі блискучі колонії; ця форма патогенна для мишей. R-форма не має капсули, при штучному культивуванні вона утворює шорсткі колонії; ця форма непатогенна для мишей. Але якщо мишам одночасно ввести вбиті S-клітини та живі R-клітини, миші гинуть. Отже, генетичні властивості одного штаму впливають генетичні властивості іншого штаму.

У 1944 р. О. Евері, К. МакЛеод та М. МакКарті довели, що зміна спадкових властивостей клітин пов'язана з перенесенням ДНК.

Здатність клітини до трансформації можлива за особливого її стану, що називається компетентністю. У компетентних клітин змінюється склад клітинної стінки і плазмалеми: стінка стає пористою, плазмалема утворює численні вп'ячування, але в зовнішній поверхні виникають особливі антигени – чинники компетентності (зокрема, специфічні білки з низькою молекулярної масою).

У природних умовах чиста позаклітинна ДНК утворюється при загибелі (лізисі) прокаріотів.

Як правило, трансформація відбувається в межах одного виду прокаріотів, але за наявності гомологічних генів спостерігається і міжвидова трансформація.

Процес трансформації включає такі стадії:

1. Приєднання трансформуючої двониткової ДНК до рецепторів на поверхні клітини-реципієнта.

2. Перетворення двониткової ДНК на однониткову.

3. Проникнення однониткової ДНК у клітину.

4. Інтеграція трансформуючої ДНК у хромосому реципієнта та рекомбінація генетичного матеріалу.

Довжина трансформуючої ДНК має бути від 500 до 200 тисяч понеділка. Енергія, що виділяється при деградації однієї з ниток ДНК, використовується для активного транспорту нитки, що залишилася, всередину клітини.

Перші три стадії трансформації залежить від нуклеотидного складу ДНК. Однак процес інтеграції трансформуючої ДНК у хромосому реципієнта більш вірогідний при високій гомологічності цієї ДНК по відношенню до ДНК реципієнта.

Процес трансформації зображено на схемі. Кожен відрізок прямої відповідає одному ланцюзі ДНК. Трансформуюча ДНК позначена чорним кольором, а ДНК клітини-реципієнта – сірим кольором.

На першій стадії трансформуюча ДНК приєднується до рецепторних сайтів на поверхні клітини-реципієнта.

На другому етапі двониткова ДНК на поверхні клітини перетворюється на однониткову за рахунок розщеплення однієї з ниток бактеріальними нуклеазами.

На третьому етапі нитка ДНК, що залишилася, транспортується через мембрану в цитоплазму. При цьому використовується енергія, що виділилася під час деградації комплементарного ланцюга.

При реплікації бактеріальної хромосоми трансформуюча нитка ДНК приєднується до гомологічної (частково комплементарної) ділянки ДНК клітини-реципієнта. При цьому через відсутність повної комплементарності утворюється гетеродуплекс («молекулярна гетерозигота») – ділянка двониткової ДНК, на якій не у всіх нуклеотидних парах азотисті основи пов'язані водневими зв'язками. Решта ДНК реплікується нормально.

Після закінчення реплікації ДНК клітина-реципієнт ділиться з утворенням двох клітин: частково трансформованої клітини з хромосомою, що включає гетеродуплексну ділянку ДНК, та нетрансформованої клітини. При реплікації ДНК у частково трансформованій клітині обох ланцюгах ДНК відбувається добудовування комплементарних ланцюгів. Один ланцюг зберігає вихідні послідовності нуклеотидів, а інший стає повністю трансформованим. Після поділу частково трансформованої клітини утворюється одна нетрансформована клітина і одна повністю трансформована, у якої вихідна послідовність нуклеотидів заміщена на послідовність нуклеотидів ДНК, що трансформує.

Таким чином, при трансформації відбувається заміщення генів реципієнта на гомологічні нуклеотидні послідовності. Що ступінь гомології, то успішніше протікає трансформація.

Частота трансформації у прокаріотів залежить від властивостей трансформуючої ДНК, від її концентрації, від стану клітини-реципієнта, від виду бактерій. Максимальна частота трансформованих клітин не перевищує 1 на 100 клітин.

Трансформація відома і для еукаріотів. Однак на поверхні еукаріотичних клітин відсутні рецепторні сайти, і ДНК, що трансформує, вводять у клітини штучно. Наприклад, в яйцеклітини тварин ДНК вводять шляхом прямої мікроін'єкції, а в яйцеклітини рослин - шляхом мікроін'єкції в пилкову трубку. Широко використовуються методи біобалістики (біолістики), що дозволяють вводити будь-які фрагменти ДНК у культурі тканин рослини.

Кон'югація

Кон'югацією у прокаріотів називається прямий контакт двох різноякісних клітин, що супроводжується хоча б частковим перенесенням генетичного матеріалу від клітини-донора до клітини-реципієнта. (Процес кон'югації було відкрито 1946 р. Дж. Ледербергом і Еге. Татумом).

У кишкової палички клітина-донор («чоловіча») має довгасту форму, клітина-реципієнт («жіноча») – ізодіаметричну. Клітина-донор утворює статеві ворсинки (пили), які притягують її до клітини-реципієнта та утворюють цитоплазматичні канали. Цими каналами ДНК із клітини-донора перетворюється на клітину-реципієнт. Існує три типи клітин-донорів: F + (еф-плюс), Hfr (ейч-еф-а) і F ' (еф-прим).

F + -донори містять у цитоплазмі статевий фактор - специфічну F-плазміду.

F-плазміда - це автономний реплікон довжиною близько 100 тпн. У складі F-плазміди вивчено понад 20 генів. Приблизно половина їх утворює гігантський оперон tra (довжиною близько 30 тпн); продукти цього оперону контролюють утворення контакту між донором та реципієнтом та власне перенесення ДНК. Інші гени регулюють роботу tra–оперона.

Клітина-реципієнт не містить F-плазміди і позначається як F-клітка.

При утворенні цитоплазматичного містка один з ланцюгів F-плазміди надрізається в певній точці (точка О), а на комплементарному ланцюзі починається реплікація ДНК за принципом кільця, що «котиться». Копія комплементарного ланцюга по цитоплазматичному містку переходить в цитоплазму клітини-реципієнта, і на ньому добудовується ланцюг, що бракує. Після закінчення реплікації двониткова плазмідна ДНК замикається в кільце, і F - клітина перетворюється на F + - клітину. Повний час перенесення копії F-плазміди в клітину-реципієнт становить приблизно 5 хвилин.

Однак при схрещуванні F + × F - в клітину-реципієнт потрапляють тільки гени, що містяться в F-плазміді; гени домашнього господарства, локалізовані в бактеріальній хромосомі, в клітину-реципієнт не переносяться.

У той же час F-плазміда може вбудовуватись у бактеріальну хромосому, тобто переходити в інтегрований стан. У бактеріальній хромосомі є близько 20 сайтів інтеграції F-плазміди. Тоді при перенесенні копії одного з ланцюгів F-плазміди в клітину-реципієнт за нею захоплюється і копія одного з ланцюгів бактеріальної хромосоми. Клітини з інтегрованою F-плазмідою називаються Hfr-донори (від англ. «висока частота рекомбінацій»). Залежно від умов можливе повне або часткове перенесення копії бактеріальної хромосоми Hfr-донора в цитоплазму реципієнта. В результаті утворюється клітина з однією вихідною двонитковою бактеріальною хромосомою та однією повною або неповною гомологічною однонитковою молекулою ДНК. Така клітина називається мерозигота («часткова зигота»). Далі при реплікації ДНК відбувається рекомбінація. Цей процес принципово не відрізняється від рекомбінації під час трансформації.

Перенесення копії ДНК починається приблизно з середини F-плазмідної ДНК (з точки О, в якій один з ланцюгів ДНК надрізається, і починається реплікація F-плазмідної ДНК). Таким чином, половина F-плазмідної ДНК проникає в клітину-реципієнт на початку кон'югації, а друга половина - тільки після повного перенесення копії хромосомної ДНК. Для завершення цього процесу при t = 37 0 С потрібно більше 100 хвилин. Однак у природних умовах кон'югація переривається значно раніше, у клітину-реципієнт переходить лише частина копії хромосоми донора і лише перша половина F-плазмідної ДНК. Таким чином, клітина-реципієнт не приймає властивості Hfr-донора.

Однак існують штами бактерій, у яких копія бактеріальної хромосоми разом з копією F-плазмідної ДНК переноситься повністю. Такі клітини називаються vHfr–донори (від англ. «дуже висока частота рекомбінацій»).

Імовірність перенесення певного гена в клітину-реципієнт залежить від його видалення від F-плазмідної ДНК, а точніше, від точки О, в якій починається реплікація F-плазмідної ДНК. Чим більший час кон'югації, тим вища ймовірність перенесення цього гена. Це дозволяє скласти генетичну карту бактерій у хвилинах кон'югації. Наприклад, у кишкової палички ген thr (оперон із трьох генів, що контролюють біосинтез треоніну) знаходиться в нульовій точці (тобто безпосередньо поряд з F–плазмідною ДНК), ген lac переноситься через 8 хв, ген recE – через 30 хв, ген argR – через 70 хв і т.д.

F-плазміда може переходити з інтегрованого стану в автономне шляхом самовирізування з бактеріальної хромосоми. У цьому випадку можливе захоплення частини хромосомної ДНК (до 50% хромосомних генів). F-плазміда, що включає хромосомні гени, називається F -фактором. Перенесення генетичного матеріалу при схрещуваннях F′×F – називається сексдукцією.

Крім F-плазміди у прокаріотів відомі й інші типи статевих факторів (R, Ent, Hly, Col), які забезпечують перенесення генетичного матеріалу від бактерії до бактерії. На основі природних плазмід (у тому числі ДНК хлоропластів та мітохондрій) отримані напівсинтетичні молекули ДНК, що забезпечують перенесення генетичного матеріалу з однієї клітини до іншої, називаються вектори. Вектори повинні забезпечувати як стійке перенесення генів, а й регуляцію їх транскрипції.

Прокаріотичні плазміди можуть реплікуватись лише у прокаріотичних клітинах. У той же час існує необхідність перенесення генів від еукаріотів до прокаріотів і навпаки. Для цього використовуються човникові плазміди, які містять два реплікатори (прокаріотичний та еукаріотичний) і здатні реплікуватися і в прокаріотичних, і в еукаріотичних клітинах, наприклад, Ti– та Ri–плазміди, здатні до реплікації в прокаріотичних та рослинних клітинах, та напівсин з їхньої основі. Для захисту векторів від руйнування нуклеазами їх укладають у фосфоліпідні бульбашки – ліпосоми.

Трансдукція

Трансдукцією називається перенесення генетичного матеріалу за допомогою вірусів із клітини-донора до клітини-реципієнта. (Явлення трансдукції відкрив у 1951 р. Н. Зіндер (учень Дж. Ледерберга)).

При трансдукції у віріони потрапляє ДНК клітини-хазяїна. Віріони заражають інші клітини і ДНК вихідної бактеріальної клітини проникає в іншу бактеріальну клітину. Вірусна ДНК інтегрується в бактеріальну хромосому, а привнесена бактеріальна ДНК рекомбінує ДНК бактеріальної хромосоми. В результаті 50% клітин виявляються трансформованими.

Розрізняють загальну (неспецифічну), обмежену (специфічну) та абортивну трансдукцію.

Загальна трансдукція

При загальній трансдукції фрагменти бактеріальної ДНК донора випадково включаються в дозріваючу фагову частинку разом з фаговою ДНК або замість фагової ДНК. Фрагменти бактеріальної ДНК утворюються під час її розрізання ферментом, контрольованим фагом. До складу фагової частки може включатись до 100 бактеріальних генів.

Обмежена трансдукція

При обмеженій трансдукції відбувається рекомбінація – бактеріальна ДНК замінює частину фагової ДНК. До складу рекомбінантної ДНК входить невелика кількість бактеріальних генів, що належать до фагової ДНК, інтегрованої в бактеріальну хромосому.

При загальній та обмеженій трансдукції донорська ДНК замінює гомологічні ділянки ДНК реципієнта. Цей процес подібний до трансформації.

Абортивна трансдукція може бути і неспецифічною, і специфічною. Її сутність полягає в тому, що трансдукований фагом фрагмент ДНК не включається в хромосому реципієнта, а існує як цитоплазматичний реплікон. Рано чи пізно цей реплікон втрачається.

Явище трансдукції вірусами широко використовується при перенесенні генів у еукаріотів. Якщо застосовується вірус, нездатний формувати капсид (тобто існуючий тільки у формі ДНК), то трансдукція принципово не відрізняється від трансформації чи кон'югативного перенесення генетичного матеріалу з допомогою плазмид-векторів. Створено системи векторів на основі модифікованих вірусів SV40 (вони утворюють у клітині до 100 тисяч копій), герпесу, вісповакцини, вірусу мозаїки цвітної капусти.

Слід ще раз наголосити, що всі описані типи рекомбінації пов'язані не з додаванням нових ділянок ДНК, а із заміщенням вже наявних нуклеотидних послідовностей. Чим вищий ступінь гомології трансформуючої та вихідної ДНК, тим вища ймовірність успішної рекомбінації. Найлегше вдається рекомбінація ферментів, що є у всіх організмів. Найважче ввести в геном нові регулятори, що відрізняються високою специфічністю. Тому для впровадження в геном нових генів використовуються складніші методи, пов'язані з біохімічними модифікаціями ДНК.

Тема 7: Цитоплазматичне успадкування . Генетика соматичних клітин та тканин.

1. Цитоплазматичне успадкування. Генетичний матеріал напівавтономних органоїдів. Пластидне успадкування. Спадкування через мітохондрії. Цитоплазматична чоловіча стерильність

2. Особливі типи наслідування. Передетермінація цитоплазми. Спадкування через інфекцію та ендосімбіонтів

3. Генетика соматичних клітин. Соматичні мутації. Хімери. Генетика онкологічних захворювань.

Генетичні рекомбінації- Перерозподіл генетичного матеріалу батьків у потомстві, що обумовлює комбінативну мінливість організмів. Вони відбуваються за участю ферментів у межах окремих генів.

Кон'югація –перенесення генетичного матеріалу з клітини-донора у клітину реципієнта при тісному контакті. Донорами генетичного матеріалу є клітини, що несуть F-плазміду. Бактеріальні клітини, які не мають F-плазміди, є реципієнтами.

Першим етапом кон'югації є прикріплення клітини донора до реципієнта за допомогою статевих ворсинок. Між клітинами утворюється кон'югаційний місток, через який із клітини-донора в клітину-реципієнт передається F-плазміда.

Якщо F-плазміда вбудована у хромосому бактерії, відбувається розрив однієї нитки ДНК за участю ендонуклеази. Проксимальний кінець ДНК через кон'югаційний місток проникає в клітину-реципієнт і відразу ж добудовується до двониткової структури. Нитка, що залишилася в клітині донора, є матрицею для синтезу другої нитки.

Трансформація- Безпосередня передача генетичного матеріалу донора реципієнтної клітини. Трансформація ефективно відбувається лише між бактеріями одного виду, що мають різний генотип.

Клітини, здатні приймати донорську ДНК, називають компетентними. Стан компетентності виникає у період зростання клітини і збігається з кінцем логарифмічної фази.

Трансформуючу активність мають двониткові фрагменти ДНК з молекулярною масою не менше 0,5-1х10 6

Процес трансформації складається з фаз:

1) адсорбція ДНК донора на клітині-реципієнті,

2) проникнення ДНК всередину клітини-реципієнта з подальшою деспіралізацією,

3) з'єднання однієї нитки ДНК з гомологічною ділянкою хромосоми реципієнта.

Трансдукція –передача генетичного матеріалу від однієї бактерії до іншої за допомогою фагів. Розрізняють:

1) неспецифічну трансдукцію– коли в клітину-реципієнт разом із фаговою ДНК переноситься будь-який ген донора. Перенесений фагом фрагмент ДНК бактерії-донора здатний включатися до гомологічної області ДНК клітини-реципієнта шляхом рекомбінації. Трансдукувальний фаг є тільки переносником генетичного матеріалу від одних бактерій до інших, а сама фагова ДНК не бере участі в утворенні рекомбінантів,

2) специфічну трансдукцію –фаг переносить специфічні гени від бактерії-донора до бактерії-реципієнта. При взаємодії трансдукуючих фагів з клітинами реципієнтного штаму відбувається включення гена бактерії-донора разом із ДНК дефектного фага в хромосому бактерії-реципієнта.

3) абортивну- коли принесений фагом фрагмент ДНК бактерії-донора не включається в хромосому бактерії-реципієнта, а знаходиться в її цитоплазмі і може у такому вигляді функціонувати. Під час поділу бактеріальної клітини-рекомбінанту принесений фрагмент ДНК донора передається лише одній із дочірніх клітин та згодом зникає.

Тема 6: Вчення про інфекцію. Хіміотерапевтичні препарати. Антибіотики.

Запитання для самопідготовки:

1. Інфекція. Умови виникнення та шляхи передачі збудника.

2. Форми інфекції та їх характеристика.

3. Періоди інфекційної хвороби.

4. Характеристика бактеріальних токсинів.

5. Антибіотики: класифікація, застосування, ускладнення прийому антибіотиків.

6. Методи визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків.

7. Найважливіші групи хіміотерапевтичних препаратів та механізми їх дії.

Теоретичний матеріал для самопідготовки :

Дата завантаження: 2015-09-03 | Перегляди: 888 | Порушення авторських прав

| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 21 | | | | | | | | | | | |

мікроб травлення інфекція

Рекомбінація - процес обміну генетичним матеріалом шляхом розриву та з'єднання різних молекул. Рекомбінація відбувається при репарації двониткових розривів у ДНК та для продовження реплікації у разі зупинки реплікаційної вилки у еукаріотів, бактерій та архей. У вірусів можлива рекомбінація між молекулами РНК їхніх геномів.

Рекомбінація у еукаріотів зазвичай відбувається в ході кросинговеру в процесі мейозу, зокрема, при формуванні сперматозоїдів та яйцеклітин у тварин. Рекомбінація, поряд з реплікацією ДНК, транскрипцією РНК та трансляцією білків, відноситься до фундаментальних, раногомологічну рекомбінацію.

Гомологічна рекомбінація

Класифікація типів гомологічної рекомбінації: алельна, ектопічна та гомеологічна; реципрокна (кросинговер) та нереципрокна (генна конверсія).

Реципрокна рекомбінація. Ранні уявлення про природу кросинговера: гіпотези "розрив і з'єднання" та "вибіркове копіювання". Досліди Мезелсона за доказом механізму "розрив та з'єднання". Розробка методичних підходів щодо вивчення молекулярних механізмів рекомбінації. Два етапи формування рекомбінантної ДНК: “зістикована” (joint) та первинна рекомбінантна молекули.

Генетичний контроль гомологічної рекомбінації у бактеріофагів. Система Red у бактеріофага l. Екзонуклеаза l. Система Orf. Бактеріофаг Т4: роль генів 30, 32, 43, 46, 47, 49 та uvsX. Ензимологія рекомбінаційних реакцій: ендо- та екзонуклеази, ДНК-полімераза, ДНК-лігаза, білок UvsX, білок SSB та інші білки. Процеси "витіснення нитки", утворення D-петлі, "міграції розгалуження", корекції гетеродуплексу. Основні стадії кросинговеру: пресинапсис, синапсис та постсинапсис. Схеми кросинговера у бактеріофагів. Спільність процесів рекомбінації та репарації ДНК.

Основні моделі гомологічної рекомбінації. Модель Холлідея. Причини моделі, сутність, значення. Розвиток моделі у подальших дослідженнях, її сучасний стан. Модель Мезелсона-Редінга. Модель репарації двониткових розривів (ДНР) ДНК у дріжджів (Жостак та ін.) стосовно кросинговеру та конверсії.

Рекомбінація під час трансформації хромосомної ДНК у бактерій. Параметри рекомбінації. Розміри фрагментів донорної ДНК, що інтегруються. Кінетика та ефективність трансформації. Докази інтеграції однониткових фрагментів донорної ДНК Генетичний контроль та основні етапи процесу трансформації у Bacillus subtilis та Streptococcus pneumoniae. Донорно-реципієнтний комплекс. Генетичний контроль та механізм рекомбінації при трансформації у Haemophilus influenzae. Трансформосоми.

Рекомбінація при кон'югації у Escherichia coli. Характеристика кон'югаційного перенесення ДНК. Механізми інтеграції донорної ДНК у хромосому реципієнтної клітини.

Генетичний контроль гомологічної рекомбінації E.coli. Гени, що у пресинапсисе: recA, recB, recC, recD, recE, recJ та інших. Плейотропний ефект мутацій recB і recC. АТФ-залежна RecBCD-нуклеаза, її активність, механізми дії та ролі в різних генетичних процесах. Chi-сайт як гаряча точка рекомбінації. Універсальність АТФ-залежних нуклеазів для бактерій. Гени, що контролюють процес синапсису: recA, recF, recO, recR, ssb та ін. Властивості recA-мутантів. Білок RecA, його характеристика. Реакції, що каталізуються білком RecA, його ключова роль у перших етапах процесу кросинговеру: пресинапсис та синапсис. Природа синапсису при гомологічній рекомбінації. RecA-ДНК-філаменти, їх структура та функції у рекомбінації. Схема кросинговера у E.coli за участю RecBCD-нуклеази та білка RecA. RecA-гомологи в інших прокаріотичних та еукаріотичних організмів. Роль білка SSB. Гени постсинапсису: ruvA, ruvB, ruvC, recG та їх продукти. Роль у здійсненні міграції напівхіазми Холлідея та її вирішенні.

Супресорні мутації sbcA, sbcB, sbcC та sbcD. Екзонуклеази І та VIII. SbcCD-нуклеаза. Три шляхи рекомбінації хромосомної ДНК у E.coli K-12 за Кларком: RecBCD, RecF та RecE, їх характеристика. Роль шляхів RecF та RecE у гомологічній рекомбінації плазмід.

Особливості процесу кросинговера у еукаріотів. Мейотичний кросинговер. Роль синаптонемного комплексу. Генетичний контроль мейотичної рекомбінації. Різноманітність RecA-подібних білків (рекомбіназ) у еукаріотів.

Мітотичний кросинговер: співвідношення між реципрокною та нереципрокною рекомбінацією. Кросинговер у G1-клітинах. Відмінності в генетичному контролі мейотичного та мітотичного кросинговеру у дріжджів-сахароміцетів.

Гарячі точки рекомбінації у еукаріотів. Роль ДНР ДНК в ініціації мейотичного та мітотичного кросинговера.

Рекомбінаційна репарація ДНР у хромосомній та плазмідній ДНК у дріжджів. Генетичний контроль та різноманітність механізмів: модель Жостака та ін. та її модифікації, механізми “розрив та копіювання”, “відпал комплементарних ланцюгів ДНК” (“single-strand annealing”), “гомолог-зовисіме лігування”.

Ектопічна рекомбінація, її генетичний контроль, молекулярні механізми та біологічне значення.

Конверсія гена (корекція рекомбінаційного гетеродуплексу). Нереципрокність внутрішньогенної рекомбінації. Гіпотеза корекції неспарених основ (Холлідей). Генетичний контроль та шляхи корекції гетеродуплексів у E.coli. Системи репарації неспарених основ з утворенням та забудовою протяжних проломів у гетеродуплексі. Система Mut HLSU, її характеристика. Молекулярна модель корекції гетеродуплексу за участю системи MutHLSU. Еволюційний консерватизм білків MutL та MutS. Роль білків MutL і MutS у процесах корекції неспарених основ та у регуляції гомеологічної рекомбінації. Системи корекції неспарених основ у E.coli з формуванням та забудовою коротких проломів. Корекція гетеродуплексів під час бактеріальної трансформації, її генетичний контроль (система Hex), вплив на результати генетичного картування. Корекція та висока негативна інтерференція.

Конверсія гена у еукаріотів. Зошитний аналіз міжалельних схрещувань. Типи зошит. Полярність конверсії, її причини. Коконверсія. Протяжність ділянки конверсії. Питання зв'язку мейотичної конверсії з реципрокною рекомбінацією флангових маркерів. Мітотична алельна генна конверсія. Ектопічна мейотична та мітотична конверсія. Перемикання локусів MAT у гомоталлічних дріжджів. Генетичний контроль конверсії гена у екаріотів на прикладах дріжджів та людини. Еукаріотичні гомологи бактеріальних білків MutL і MutS – сімейства білків PMS, MHL, MHS та ін, їх функції у рекомбінації та інших клітинних процесах. Складність систем корекції неспарених основ еукаріотів, заснована на участі різноманітних гомологів батеріальних білків MutL і MutS.

Ролі конверсії в еволюції та в онтогенезі. Співвідношення між процесами кросинговера та конверсії у різних генетичних системах. Конверсійні процеси, що здійснюються незалежно від кросинговеру.

Рекомбінаційні процеси, що не потребують гомології для синапсису

Сайт-специфічна рекомбінація. Поширення сайт-специфічних рекомбінаційних систем у прокаріотів та еукаріотів, їх функції. Сайт-специфічні топоізомерази типу I як ключові білки сайт-специфічної рекомбінації у бактеріофагів, бактерій та дріжджів. Два сімейства сайт-специфічних топоізомераз I - інтегрази та резолвази.

Сайт-специфічна рекомбінація при інтеграції та ексцизії фага l. Схема Кемпбел. Відмінності між генетичними картами вегетативного фага та профагу. Структура сайтів attP та attB. Система Int. Int-білок як представник сімейства інтеграз. Білок IHF E. coli. Інтасома. Молекулярна модель інтеграції та ексцизії фага l. Антипаралельне будівництво att-сайтів при синапсисі. Природа синапсису при сайт-специфічній рекомбінації.

Сайт-специфічні інверсії ДНК у бактеріофагів та бактерій (система Din) та у дріжджів. Ключові білки рекомбінації – інвертази як представники сімейства резолваз. Рекомбінаційні енхансери для сайт-специфічних інверсій. Білок Fis E. coli. Інвертасома. Молекулярна модель рекомбінації, яка здійснюється резолвазами. Роль сайт-специфічних інверсій у регуляції експресії генів.

Транспозиції рухливих генетичних елементів. Транспозиції у прокаріотів. Рухомі генетичні елементи: IS-елементи, транспозони (Tn), фаг Мu. Структура рухомих елементів. Функції, контрольовані різними рухомими елементами. Транспозаза. Участь білків клітини-господаря у транспозиції. Питання специфічності інтеграції рухомого елемента в ДНК-мишень. Спільність реакцій, що становлять процеси транспозиції у різних типів рухомих елементів прокаріотів та еукаріотів.

Генетична організація найпростіших транспозонів сімейства Tn3. Гени tnpA та tnpR, їх продукти. Реплікативна транспозиція, два етапи процесу. Молекулярні моделі Шапіро. Генетичний контроль та молекулярний механізм нереплікативної транспозиції у складних транспозонів Tn5, Tn9 та Tn10. Генетичний контроль та механізми транспозиції у фага Mu. Транспозосоми.

Кон'югативні транспозони грампозитивних та грамнегативних бактерій, їх класифікація. Генетичний контроль та механізми транспозиції. Біологічне значення.

Рухливі генетичні елементи еукаріотів (дріжджі, рослини, дрозофіла, ссавці). Класифікація еукаріотичних рухомих елементів. Елементи із структурою прокаріотичного типу. Ретротранспозони типу I у дріжджів, рослин та тварин, їх структура, генетичний контроль та механізм транспозиції, класифікація. Ретротранспозони типу ІІ: особливості будови, поширення, механізм транспозиції.

Генетичні ефекти, що викликаються рухомими елементами у прокаріотів та еукаріотів: зміни експресії генів, генні мутації, хромосомні перебудови, гібридний дисгенезіз. Участь рухливих елементів у створенні структури хромосом. Роль в онтогенезі живих організмів та в еволюції генетичного матеріалу. Рухомі елементи як інструмент генетичних досліджень.

Незаконна рекомбінація. Коло явищ, що належать до незаконної рекомбінації. Негомологічна рекомбінація у бактерій, що каталізується ДНК-гіразою. Молекулярна модель (Ікеда). Негомологічна рекомбінація за участю ДНК-залежної протеїнкінази у хребетних. Роль у репарації двониткових розривів, інтеграції екзогенної ДНК у хромосоми та у перебудовах імуноглобулінових послідовностей ДНК.

Запрограмовані рекомбінаційні перебудови генетичного матеріалу в онтогенезі

З'єднання роз'єднаних частин генів за допомогою сайт-специфічної рекомбінації в процесі споруляції у Bacillus subtilis і при формуванні гетероцист у нитчастих ціанобактерій. Перебудова генетичного матеріалу під час утворення макронуклеуса у війкових інфузорій. Димінуція хроматину у ряду представників безхребетних.

Сайт-специфічна рекомбінація у хребетних, що бере участь у перебудовах імуноглобулінових послідовностей ДНК. Структура молекул імуноглобулінів. Організація та структура послідовностей ДНК, що беруть участь у формуванні генів, що кодують імуноглобуліни. Роль продуктів генів RAG1 та RAG2. Механізм сайт-специфічної рекомбінації при стикування кодуючих сегментів генів імуноглобулінів. Участь інших генетичних процесів у формуванні генів імуноглобулінів: гомологічна рекомбінація (ектопічний мітотичний кросинговер, ектопічна мітотична конверсія), незаконна рекомбінація, гіпермутагенез, альтернативний сплайсинг. Приуроченість цих процесів до певних стадій диференціювання B-лімфоцитів.

Трансформація - процес поглинання клітиною організму вільної молекули ДНК із середовища та вбудовування її в геном, що призводить до появи у такої клітини нових для неї успадкованих ознак, характерних для організму-донора ДНК. Іноді під трансформацією розуміють будь-які процеси горизонтального перенесення генів, зокрема трансдукцію, кон'югацію тощо.

Трансформація прокаріотів

У будь-якій популяції лише частина бактерій здатна до поглинання із середовища молекул ДНК. Стан клітин, у якому це можливо, називають станом компетентності. Зазвичай максимальна кількість компетентних клітин спостерігається наприкінці фази логарифмічного зростання.

У стані компетентності бактерії виробляють особливий низькомолекулярний білок (фактор компетентності), що активізує синтез аутолізину, ендонуклеази І та ДНК-зв'язуючого білка. Аутолізин частково руйнує клітинну стінку, що дозволяє ДНК пройти через неї, а також знижує стійкість бактерій до осмотичного шоку. У стані компетентності також знижується загальна інтенсивність метаболізму. Можливе штучне приведення клітин у стан компетентності. Для цього застосовують середовища з високим вмістом іонів кальцію, цезію, рубідії, електропорації або замінюють клітини реципієнта протопластами без клітинних стінок.

Ефективність трансформації визначається кількістю колоній, що виросли на чашці Петрі після додавання до клітин 1 мкг суперскрученої плазмідної ДНК і розсівання клітин на живильне середовище. Сучасні методи дозволяють домагатися ефективності 106-109.

ДНК, що поглинається, повинна бути двонитковою (ефективність трансформації однониткової ДНК на порядки нижче, проте дещо зростає в кислому середовищі), її довжина - не менше 450 пар основ. Оптимальне pH для проходження процесу - близько 7. Для деяких бактерій (Neisseria gonorrhoeae, Hemophilus) ДНК, що поглинається, повинна містити певні послідовності.

ДНК необоротно адсорбуються на ДНК-зв'язувальному білку, після чого одна з ниток розрізається ендонуклеазою на фрагменти довжиною 2-4 тис. пар основ і проникає в клітину, друга повністю руйнується. У разі, якщо ці фрагменти мають високий рівень гомології з будь-якими ділянками бактеріальної хромосоми, можлива заміна цих ділянок на них. Тому ефективність трансформації залежить від еволюційної відстані між донором та реципієнтом. Загальний час процесу не перевищує кількох хвилин. Згодом, при розподілі, в одну дочірню клітину потрапляє ДНК, побудована на основі вихідної нитки ДНК, в іншу - на основі нитки із включеним чужорідним фрагментом (вищіплення)

Трансформація еукаріотичних клітин із використанням синтетичних полімерних катіонів

Доставка чужорідних нуклеїнових кислот всередину інтактних клітин, аботрансформація лежить в основі багатьох методів генної інженерії. Транспортування функціональних генів у тканини може уможливити корекцію генної недостатності та мутацій, наслідком яких є важкі спадкові патології або ракові пухлини. В даний час розроблено цілий ряд прийомів для введення ДНК у клітини, серед яких найбільш поширені преципітація фосфатом кальцію або діетиламіноетил-декстраном (ДЕАЕ-декстраном), електропорація, мікроін'єкція, вбудовування ДНК в реконструйовану оболонку вірусів або ліпосоми (штучні мембранні ліпідні).

Незважаючи на різноманітність цих методів, пошук нових шляхів трансформації про- та еукаріотичних клітин триває. З одного боку, це викликано необхідністю підвищення ефективності трансформації, з іншого - перелічені вище методи можна застосовувати лише для обмеженого числа клітинних ліній і неефективні при спробах введення в клітини РНК. Нарешті, більшість цих підходів не можна використовувати для генетичної трансформації in vivo.

Як переносники ДНК використовуються ретровірусні вектори, вектори на основі ДНК-вірусів і ВІЛ, ліпосоми на основі катіонних ліпідів, полімерні ДНК-зв'язуючі катіони. Використання синтетичних полімерів як переносників ДНК має ряд переваг: зручність зберігання та очищення, простота тестування токсичності та безпеки та, що особливо важливо для генної терапії, зниження ризику патогенетичних та імунологічних ускладнень.

При змішуванні розчинів лінійних полікатіонів та ДНК формуються інтерполіелектролітні комплекси (ІПЕК) за рахунок утворення кооперативної системи міжланцюгових електростатичних зв'язків. При цьому полікатіонні ланцюги оточують молекулу ДНК, утворюючи сфери або тороїди, залежно від типу полімеру. Включення в ІПЕК призводить до компактизації ДНК, підвищення її стійкості до дії нуклеаз, сприяє посиленню її взаємодії з клітинною мембраною та підвищення трансформуючої активності по відношенню як до прокаріотичних, так і еукаріотичних клітин. З'єднуючи молекули полікатіону з лігандами, здатними до специфічного зв'язування з клітинною мембраною, можна забезпечити проникнення ІПЕК в клітину рецепторним шляхом, а в організмі - адресну доставку до клітин-мішеней.

Системи доставки ДНК для застосування генної терапії повинні забезпечувати проникнення ДНК в потрібний орган, тканину, або в конкретну групу клітин, а потім - в клітинне ядро. Антисенсові олігонуклеотиди, а саме вони найчастіше використовуються в генній терапії, повинні знайти ту мРНК або ділянку хромосомної ДНК, проти якої вони спрямовані. Введений ген повинен увійти до складу конструкції, здатної експресувати його.

Однак, це досить складна проблема. При введенні нуклеїнової кислоти або олігонуклеотиду в організм вони не потраплять переважно до потрібної тканини або потрібного органу, а та їхня частина, яка опиниться в потрібному місці, лише незначною мірою зможе пройти крізь гідрофобну клітинну мембрану. Крім того, в ході еволюції були вироблені механізми захисту клітин організму від вторгнення факторів довкілля, у тому числі і чужорідної ДНК. Опинившись усередині клітини, чужорідна ДНК може локалізуватись не там, де це необхідно і, більше того, може опинитися в лізосомах, де буде зруйнована під дією нуклеаз.

Проникнення в клітину та внутрішньоклітинний транспорт ІПЕК відбувається, можливо, за рахунок утворення та послідовного руйнування ендосом. На кожному з етапів цього процесу значна частина матеріалу втрачається. Убоге вивільнення векторів з ендосом у цитоплазму та неефективне перенесення їх у ядро призводять до низької ефективності трансгенної експресії.

Рестрикційна карта плазміди pBR 322:

цифрами вказано нумерацію нуклеотидів;

тонкі рисочки - поодинокі сайти, відомі рестриктазами;

товсті сірі стрілки зверху - напрямок транскрипції;

Pbla – промотор гена Ampr – стійкість до ампіциліну;

Ptet-промотор гена Tetr-стійкість до тетрацикліну;

TТ1 - Rho-незалежний термінатор транскрипції (положення 3140-3160); ТТ2 – положення 3080-3110; ROP - білок, що сприяє утворенню дуплексів між РНК 1 та РНК 2 (негативний регулятор копійності); РНК 1 – контрольна РНК (контролює копійність плазміди); РНК 2 – «праймерна» РНК (служить затравкою для реплікації); товсті чорні стрілки - напрямок транскрипції РНК 1 і РНК 2

Вектори на основі фага М13

Можна виділити три шляхи підвищення ефективності перенесення ДНК в еукаріот клітини за допомогою синтетичних полікатіонів. По-перше, це підвищення специфічності трансфекції за рахунок лігандів, сполучених з молекулою полікатіону та забезпечують виборчу взаємодію комплексів із клітинами певного фенотипу. По-друге - підвищення ефективності трансформації за рахунок підбору генів або олігонуклеотидів, що впроваджуються у клітину. По-третє - підвищення частоти трансфекції, яке досягається за рахунок застосування лігандів, що більш ефективно взаємодіють з клітинною мембраною, та речовин, що дестабілізують мембрану. Крім того, можливий синтез нових полікатіонів.

У лабораторії молекулярної вірусології та генної інженерії НДІ грипу РАМН у Санкт-Петербурзі проводиться вивчення засобів доставки ДНК та вірусних частинок у клітини. У роботі використовується набір полімерних носіїв, синтезований співробітниками Інституту високомолекулярних сполук РАН. В якості експресійних векторів використовувалися плазміди: pUC 18, що містить цитомегаловірусний промотор і ген b-галактозидази, і pBR 322, що містить цитомегаловірусний промотор і ген зеленого флуоресцентного білка водоростей.

В результаті проведених досліджень було з'ясовано, що найбільшу трансфекційну активність мають ІПЕК полі-(2-(диметиламіно)етил)метакрилату (PDMAEMA) з низькими молекулярними масами. Подальші дослідження дозволять розробити нові підходи до вирішення актуальних проблем у вірусології, молекулярної та клітинної біології, генної інженерії, генної терапії.

Трансдукція (від латів. transductio - переміщення) - процес перенесення бактеріальної ДНК з однієї клітини до іншої бактеріофагом. Загальна трансдукція використовується в генетиці бактерій для картування геному та конструювання штамів. До трансдукції здатні як помірні фаги, так і вірулентні, останні проте знищують популяцію бактерій, тому трансдукція з їх допомогою не має великого значення ні в природі, ні при проведенні досліджень.

Загальна (неспецифічна) трансдукція

Здійснюється фагом P1, що існує в бактеріальній клітині у вигляді плазміди, фагами P22 і Mu, що вбудовуються в будь-яку ділянку бактеріальної хромосоми. Після індукування профагу з ймовірністю 10?5 на одну клітину можлива помилкова упаковка фрагмента ДНК бактерії в капсид фага, ДНК самого фага в ньому в цьому випадку немає. Довжина цього фрагмента дорівнює довжині нормальної фагової ДНК, його походження може бути будь-яким: випадкова ділянка хромосоми, плазміда, інші помірні фаги.

Потрапляючи в іншу бактеріальну клітину, фрагмент ДНК може включатися до її генома, зазвичай шляхом гомологічної рекомбінації. Перенесені фагом плазміди здатні замикатися в кільце та реплікуватися вже у новій клітині. У ряді випадків фрагмент ДНК не вбудовується в хромосому реципієнта, не реплікується, але зберігається у клітині та транскрибується. Це явище називається абортивної трансдукції.

Специфічна трансдукція

Найбільш добре вивчена специфічна трансдукція з прикладу фага л. Цей фаг вбудовується тільки в одну ділянку (att-сайт) хромосоми E. coli з певною послідовністю нуклеотидів (гомологічною ділянкою att-в ДНК фага). Під час індукції його виняток може пройти з помилкою (імовірність 10?3--10?5 на клітину): вирізується фрагмент тих самих розмірів що і ДНК фага, але з початком не там. У цьому частина генів фага губиться, а частина генів E. coli захоплюється ним. Імовірність перенесення гена у разі падає зі збільшенням відстані від нього до att-сайту.

Для кожного помірного фага, що специфічно вбудовується в хромосому, характерний свій att-сайт і, відповідно, розташовані поруч з ним гени, які він здатний передавати. Ряд фагів може вбудовуватись у будь-яке місце на хромосомі та переносити будь-які гени за механізмом специфічної трансдукції. Крім того, у хромосомі зазвичай є послідовності, частково гомологічні att-ділянці ДНК фага. При пошкодженні повністю гомологічного сайту Att можна домогтися включення фага в хромосому за цими послідовностями і передачу в ході специфічної трансдукції генів, сусідніх вже з ними.

Коли помірний фаг, що несе бактеріальні гени, вбудовується в хромосому нової бактерії-господаря, вона містить вже два однакові гени - власний і принесений ззовні. Оскільки фаг позбавлений частини своїх генів, часто він може індукуватися і розмножитися. Однак при зараженні цієї клітини «допоміжним» фагом того ж виду, індукування дефектного фага стає можливим. З хромосоми виходять і реплікуються як ДНК нормального «допоміжного» фага, так і ДНК дефектного, разом з бактеріальними генами, що переносяться ним. Тому близько 50% фагових частинок, що утворюються, несуть бактеріальну ДНК. Це явище зветься трансдукції з високою частотою (HFT від англ. high frequency transduction).

Кон'югамція (від лат. conjugatio - з'єднання), парасексуальний процес - односпрямоване перенесення частини генетичного матеріалу (плазмід, бактеріальної хромосоми) при безпосередньому контакті двох бактеріальних клітин. Відкритий у 1946 році Дж. Ледербергом та Е. Тайтемом. Має велике значення у природі, оскільки сприяє обміну корисними ознаками за відсутності справжнього статевого процесу. З усіх процесів горизонтального перенесення генів кон'югація дозволяє передавати найбільшу кількість генетичної інформації.

Механізм

Для успішного встановлення контакту двох клітин у клітині-донорі повинна бути кон'югативна (статева, трансмісивна) плазміда. Першою була відкрита F-плазміда: епісома (здатна вбудовуватися в бактеріальну хромосому), довжиною близько 100 тис. пар основ. Плазміда несе гени, що кодують низку функцій. Одна з них - утворення статевих пилок, що відповідають за приклепування до клітини-реципієнта.

Кон'югативні плазміди також кодують білки, що протидіють прикріпленню пилок інших бактерій до клітинної стінки даної. Тому клітини, які вже містять трансмісивні плазміди, на кілька порядків рідше виступають у ролі реципієнтів при кон'югації.

Плазмідою кодується ендонуклеаза, що розрізає одну з ниток її ДНК у певній точці (oriT). Потім розрізаний ланцюг розкручується і 5"-кінцем переноситься в клітину-реципієнт. Висувалася припущення, що ДНК передається по каналах в статевих пилях, але до цього часу показано, що перенесення йде через пори в клітинній стінці. У першому сегменті нитки, що надходить в клітину реципієнта нитки ДНК розташовані антирестрикційні гени.Ці гени повинні транскрибуватися в реципієнті відразу ж після свого надходження туди, щоб забезпечити накопичення білків, що блокують процес руйнування ДНК рестриктазами. хвилин.

Кон'югативна плазміда може вбудовуватись у хромосому шляхом гомологічної рекомбінації за участю IS-елементів. Кон'югація при цьому йде тим же механізом, проте реципієнту передається не тільки плазміда, а й хромосомний матеріал донора. У цьому випадку процес затягується на годинник, часто відбувається розрив нитки ДНК, що передається. Шляхом штучного припинення передачі ДНК у різний час та спостереження за тим, які гени були при цьому передані, була отримана карта хромосоми кишкової палички (E. coli) та показано її кільцеву будову.

При вищепленні з хромосоми плазміда може захоплювати її фрагмент і переносити його з собою в іншу клітину (аналогія трансдукції). Цей процес називається сексдукції.

Деякі дрібні плазміди, які називають мобілізованими, можуть бути перенесені при кон'югації за допомогою апарату перенесення «хелперної» трансмісивної плазміди. Для цього вони повинні містити послідовності, аналогічні oriT кон'югативної плазміди та розпізнавані її ендонуклеазами.

Незаконна рекомбінація не потребує протяжних комплементарних ділянок ДНК.

1).Адсорбція ДНК-донора на клітині-реципієнті.

2) проникнення ДНК усередину клітини-реципієнта;

3) з'єднання ДНК з гомологічною ділянкою хромосоми реципієнта з наступною рекомбінацією.

Трансдукція- процес перенесення бактеріальної ДНК з однієї клітини в іншу бактеріофаг.

Транспозиція- переміщення певних генетичних елементів із одного місця на хромосомі до іншого.