Інструкція набір препаратів для лабораторної діагностики сказу. Сучасні методи лабораторної діагностики сказу собак. Цей гост знаходиться в

Недосеков В.В., Вишняков І.О., Груздєв К.М. ВНИИВВиМ, ВГНКИ

Одним із найдавніших і найнебезпечніших інфекційних захворювань людства є сказ. Небезпека, яку становить сказ для життя людей та тварин, на жаль, не має тенденції до зниження.

Практичне значення цієї хвороби визначається широким поширенням серед багатьох видів тварин, високим летальним кінцем хворих на сказ і відсутністю ефективних засобів лікування.

Незважаючи на те, що епізоотії сказу підтримуються зараз головним чином дикими тваринами, людині загрожують насамперед собаки і кішки. Тому питанням діагностики захворювання собак приділяється пильна увага.

Сучасна та точна лабораторна діагностика сказу, особливо експрес-діагностика, залишається актуальною для практичної ветеринарної медицини.

Діагностику сказу собак проводять як посмертно, і прижиттєво.

Посмертна діагностика

а) виявлення антигену

Швидким і чутливим методом діагностики сказу собак є метод флуоресціюючих антитіл (МФА), заснований на мікроскопічному дослідженні в ультрафіолетових променях відбитків, мазків та кріоконсервованих зрізів тканин, оброблених антирабічним глобуліном кон'югованим з флуоресцеїн ізотіоціонатом. Як альтернатива МФА, в польових умовах може застосовуватися гістохімічний варіант імуноферментного аналізу, що дозволяє ідентифікувати специфічний антиген як в матеріалі, що розклався, так і в консервованому, до того ж для обліку результатів тесту достатньо світлового мікроскопа.

Широке поширення з метою діагностики сказу отримав "Сендвіч" - варіант твердофазного імуноферментного аналізу, метод заснований на сорбції антигену в різних розведеннях на іммобілізовані специфічні глобуліни з подальшим виявленням антигену глобулінами кон'югованими з пероксидазою хрону. Крім цього, реакції використовують як полі- так і моноклональні антитіла, останнім, безсумнівно, надається більша перевага у зв'язку з їх специфічністю, авидністю, стабільністю і відсутністю неспецифічних реакцій.

Одним із найбільш точних тестів детекції рабічного антигену є полімеразна ланцюгова реакція. Даний метод дозволяє діагностувати сказ навіть за наявності у матеріалі хоча б одного віріону. В основі тесту лежить комплементарне добудовування РНК матриці, яке здійснюється in vitro за допомогою ферменту РНК-полімерази. Однак полімеразна ланцюгова реакція ще недостатньо розроблена для рутинної діагностики сказу і поки не знайшла застосування у лабораторіях.

б) виділення вірусу in vitro

Виділення вірусу може бути необхідним для підтвердження результатів тестів визначення антигену і для більш детальної характеристики ізолятів. З цією метою широко використовується культура клітин мишачої нейробластоми (Na C1300). Виділення вірусу в культурі нейробластоми принаймні так само ефективно щодо виявлення невеликих кількостей вірусу сказу, як і зараження мишей. Крім того, при використанні цієї культури знижується час, потрібний для постановки діагнозу, з 10-15 до 2 днів, усувається необхідність експериментальних тварин і значно зменшується вартість досліджень. Однак, незважаючи на це, інтрацеребральне зараження мишей, як і раніше, залишається важливим методом лабораторної діагностики сказу собак.

Прижиттєва діагностика.

Важливим аспектом діагностики захворювання є прижиттєва діагностика, велике значення до ухвалення рішення про застосування засобів імунопрофілактики має постановка діагнозу як і раніше ранні терміни. Вірусний антиген може бути виявлений за допомогою МФА у відбитках рогівки або біоптатах шкіри хворих на сказ тварин. Крім цього, вірус може бути виділений з деяких тканин та рідин організму, особливо зі слини та спинно-мозкової рідини. Однак, якщо позитивний результат дослідження свідчить про захворювання на сказ, то негативний результат не виключає можливості зараження.

Інші статті цього розділу

Сказ (Б) – гостра хвороба теплокровних тварин, що характеризується поразкою ЦНС. Сприйнятливі домашні та дикі тварини всіх видів, а також людина.

Хвороба реєструється у різних регіонах земної кулі. Не зазначено випадків поширення хвороби в Австралії, Великій Британії, Японії. Захворювання майже завжди закінчується смертю. Є фактично документовані випадки одужання від сказу людини та собак після експериментальної інфекції.

Вірус сказу (СБ) відноситься до сімейства Rhabdoviridae, роду Lyssavirus. В даний час встановлено, що ВБ має 4 серотипи, що зумовлено, мабуть, різницею у складі мембранних білків. Усі варіанти СБ в імунобіологічному відношенні споріднені, але різняться по вірулентності. ВБ має ГА та ГАД властивостями. Між інфекційною та ГА активністю існує лінійна залежність. Тварини, імунізовані проти сказу, продукують ВНА, КСА, антиГА та літичні (руйнівні клітини, заражені вірусом у присутності комплементу) АТ.

Діагноз ставлять на підставі епізоотологічних даних, симптомів хвороби, патологоанатомічних змін (вони мають менше значення) та, головним чином, результатів лабораторних досліджень.

Лабораторна діагностикаполягає у дослідженні головного мозку тварин з метою виявлення вірусного АГ в ІФ, РДП, виявленні тілець Бабеша – Негрі та біопробі на білих мишах.

У Російській Федерації в даний час організовано виробництво наборів для діагностики Б в ІФ та РДП у ВНІТІБП та КазНІВІ.

Виділення вірусу.До лабораторії для дослідження направляють свіжі трупи дрібних тварин, від великих тварин - голову або головний мозок. У деяких випадках допускається консервування головного мозку в 50% гліцерині. Труп або голова повинні бути ретельно упаковані в поліетиленовий мішок, мозок - у банку з притертою скляною або гумовою пробкою, залитою парафіном. Матеріал упаковується у вологонепроникну тару. Для вірусологічних досліджень придатний лише консервований мозок. Необхідно пам'ятати, що розтин трупа, вилучення мозку та інші операції з патологічним матеріалом слід проводити в умовах стерильності та суворого дотримання заходів особистої профілактики: міцно фіксують голову тварини, захищають руки двома парами рукавичок (хірургічні та анатомічні), для захисту очей надягають , а на ніс і рот-6-шарову марлеву пов'язку.

Лабораторні дослідження матеріалуна сказ проводять поза всякою чергою; результати негайно повідомляють лікаря господарства та головного лікаря району (міста).

Порядок проведення досліджень: з кожного відділу головного мозку лівої та правої сторін (амонова роги, мозочка, кори півкуль і довгастого) готують по 4 мазки-відбитки для ІФ та виявлення тілець Бабеша - Негрі; з мозковою тканиною ставлять РДП; за негативних результатів ставлять біопробу.

Виявлення специфічних тілець-включень. Мазки-відбитки фарбують за Селлерсом, Муромцевим або іншими методами. Після фарбування препарати проглядають у світловому мікроскопі з імерсійною системою. Позитивним результатом вважають наявність специфічних тілець Бабеша - Негрі (при фарбуванні по Селлерсу - чітко окреслені овальні або довгасті гранулярні утворення рожево-червоного кольору в протоплазмі, при фарбуванні по Муромцеву - світло-фіолетові з темно-синіми включеннями тільця Бабеша - Негри поза нервовими клітинами.

Найбільш характерна особливість тілець Бабеша - Негрі - їхня внутрішня структура, що дозволяє абсолютно точно диференціювати їх. Усередині видно маленькі зернятка - базофільні зернистості темно-блакитного, навіть чорного кольору завбільшки 0,2-0,5 мкм.

Діагностична цінність виявлення тілець-включень для доказу зараження СБ загальновизнана. Однак і у здорових тварин, особливо у кішок та білих мишей, є утворення, присутність яких може спричинити діагностичні труднощі. В окремих випадках у мозку кішки можна з упевненістю диференціювати подібні включення від тілець Бабеша – Негрі, і тут рекомендується скористатися методами ідентифікації, особливо ІФ. Так само і у собак, які загинули в результаті отруєння зміїною отрутою або ураження електричним струмом, можна знайти тільця-включення, що нагадують тільця Бабеша - Негрі. Тельця Бабеша - Негрі виявляють лише у 65-85% випадків сказу, тому відсутність їх є негативним відповіддю, і матеріал досліджується інших тестах (ИФ, РДП, біопроба).

ІФ.Один з основних тестів при діагностиці Б. При висококваліфікованому виконанні одержують 99-100% збіги з методом біопроби. Зазвичай у діагностичній практиці використовують прямий метод ІФ, який проводять із застосуванням антирабічного флюоресцентного Ig. Фіксацію препаратів в охолодженому (8-10 ° С) ацетоні проводять не менше 4-х год. Як негативний контроль використовують мазки-відбитки головного мозку здорових білих мишей. Враховують результати візуально у люмінесцентному мікроскопі на основі оцінки інтенсивності світіння комплексу АГ-АТ. АГ ВБ виявляється у вигляді яскравих жовто-зелених або зелених гранул різної форми та величини у клітинах (частіше поза клітинами). Діагноз вважають встановленим, якщо в кількох полях зору виявляють достатню кількість (не менше 10) типових гранул з яскравим зеленим світінням або безліч дрібних точок, У контролі такого свічення не повинно бути.

Для доказу специфічності світіння комплексу АГ-АТ використовують метод придушення ІФ, який полягає у здатності рабичного АГ, пов'язаного з нефлюоресцентними AT, вдруге не вступати в з'єднання з флюоресцентними специфічними AT. Для цього на фіксовані препарати, приготовані з досліджуваного головного мозку, наносять 5%-ний антирабічний нефлюоресцентний Ig, витримують 30 хв при 37°С у вологій камері, промивають фізрозчином, а потім забарвлюють флюоресцентним антирабічним Ig загальноприйнятим прямим методом. У оброблених у такий спосіб препаратах флюоресценції не повинно бути.

Метод ІФ дає можливість виявляти СБ у клітинах рогівки очей та попередньо поставити діагноз прижиттєво: під час хвороби тварин, а також за 1-2 дні та більше до клінічного її прояву. Метод може бути використаний для дослідження підозрюваних у захворюванні Б тварин, а також клінічно здорових собак і кішок, що покусали людей та тварин. Для цього готують відбитки з рогівки, дотримуючись всіх правил особистої безпеки, розкривають очну щілину тварини великим і вказівним пальцями і на злегка випнуте очне яблуко натискають поверхнею предметного скла, відступивши 0,5 см від кінця. Потрібно стежити, щоб тварина не моргала третім століттям, оскільки зі скла видаляються епітеліальні клітини і виходить неякісний мазок. З кожного ока роблять не менше 2 препаратів, що містять по 2 відбитки. Для контролю аналогічно готують відбитки рогівки від здорових тварин. Їх можна приготувати у господарстві. Відбитки висушують на повітрі, фіксують в ацетоні протягом 4 годин при 4°С, пакують і відправляють у лабораторію. Фарбують препарати, як за ІФ, за загальноприйнятою методикою.

У препаратах, отриманих від хворих тварин або що знаходяться в кінці інкубаційного періоду хвороби, в цитоплазмі багатьох епітеліальних клітин спостерігаються різної форми гранули, що яскраво світяться різного розміру - від пилоподібних точок до 2 мкм і більше. З метою отримання достовірних результатів у кожному препараті проглядають по 50-100 клітин, а від тварини - не менше 200-400 клітин. Результати мікроскопії вважають позитивними, якщо у відбитках рогівки тварини виявляють 11% і більше клітин з характерними вогнищами свічення. Необхідно мати на увазі, що в препаратах від здорових тварин (контроль), внаслідок аутофлюоресценції, можуть зустрічатися поодинокі клітини з подібними за формою та свіченням вогнищами.

ІФ дає можливість прискорити відповідь при остаточній постановці діагнозу шляхом біопроби, оскільки діагноз при Б може бути встановлений тільки на 4-8-й день після зараження мишей досліджуваним матеріалом, а інкубаційний період захворювання мишей може досягати і 20 дн. ІФ може виявляти СБ у тканинах підщелепної слинної залози. З підщелепних слинних залоз готують препарати-мазки, беручи матеріал щонайменше ніж із 6 різних ділянок залози, оскільки розподіл у ній вірусу нерівномірно. Часто, щоб отримати відбиток, доводиться робити сильний тиск, оскільки через велику кількість муцину на склі залишається мало матеріалу.

Показана можливість ідентифікації СБ у шкірі методом ІФ. З цією метою беруть проби шкіри голови, а також фолікули сенсорного та тактильного волосся морди або латеральних сенсорних сосочків (на щоці собаки). Проби зберігають при -20-70°С. З них роблять кріосрізи, які обробляють флюоресцентним глобуліном. Результати ІФ аналізу, отримані при ідентифікації СБ у шкірі, високою мірою корелюють з даними, отриманими при дослідженні мозку тієї ж тварини. Показано близьку кореляцію між виявленням АГ вірусу в пробах мозку та тканинах губи методом ІФ.

РДП.Застосовують для виявлення АГ ВБ у неконсервованому головному мозку тварин, що загинули від вуличного сказу, або мишенят, що використовуються в біопробі. РДП ставлять мікрометодом на предметних стеклах, використовуючи 1-1,5%-ний агаровий гель за загальноприйнятою методикою. Найбільший відсоток позитивних результатів виявляють при використанні наступного трафарету: А - ріг амонів (права сторона); В – кора головного мозку (права сторона); С - мозок (права сторона); Д - довгастий мозок (правий бік); + (плюс) – позитивний контроль; - (мінус) – негативний контроль; 1, 2, 3, 4 - лунки з розведенням специфічного імуноглобуліну 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 відповідно

З кожного відділу головного мозку за допомогою пінцету готують гомогенну пастоподібну масу, яку поміщають у відповідні лунки. Від мишей досліджують весь головний мозок. З відділів головного мозку лівої сторони готують АГ аналогічним чином (на кожну експертизу загалом потрібно 4 предметні стекла з агаровим гелем). Реакцію враховують через 6, 24, 48 год. За наявності 1 або 2-3 ліній преципітації між лунками, що містять артеріальну гіпертензію та імуноглобулін, реакцію вважають позитивною.

РДП проста у виконанні і специфічна, але відсоток виявлення вірусного АГ у досліджуваному матеріалі становить 45-70. При дослідженні мозку мишей, отриманого при позитивної біопробі, РДП виявляє до 100% випадків. Відсутність у досліджуваному матеріалі тілець Бабеша - Негрі, специфічної флюоресценції та негативна РДП не дають підстави виключити наявність вірусу. І тут остаточний діагноз ставлять за результатами біопроби на білих мишах з наступною ідентифікацією вірусу.

Біопробу.Прийнято вважати, що біопроба є ефективнішим методом, ніж виявлення тілець Бабеша - Негри, ІФ та інших. Проте й у окремих випадках виявлялася негативною, попри підтвердження діагнозу Б шляхом виявлення телець-включенні та ІФ. Відсоток негативних результатів біопроби коливався від 1,3 до 12.

Відомості про різну ефективність біопроби можуть бути пояснені рядом факторів: вибору експериментальної тварини, кількості їх у досвіді, способу зараження, способу та терміну зберігання матеріалу до вступу в лабораторію. Може відігравати роль та явище інтерференції інфекційних частинок неактивними частинками, якщо для інокуляції використовують недостатньо розведений матеріал.

У мозку та слинних залозах лисиць і скунсів, що загинули від сказу, виявлено речовину, що інгібує інфекційність вірусу, що не дозволяє провести діагностику хвороби у цих тварин методом внутрішньомозкового зараження мишей. Наявність інгібуючої речовини в матеріалі, що досліджується, не перешкоджає виявленню вірусного АГ методом ІФ; для скунсів та лисиць це найчутливіший метод діагностики.

З тварин всіх видів (кролики, морські свинки, дорослі білі миші та хом'ячки), використаних для біопроби, багато хто віддає перевагу мишам-сосунам, оскільки вони більш чутливі до різних штамів СБ і менш небезпечні в роботі. Сирійські хом'яки за чутливістю не поступаються мишам, але менш доступні.

РЗК.Виявлення специфічного АГ в РЗК при діагностиці сказу застосовується рідше, ніж інші методи. З надісланого на дослідження мозку готують АГ. Для цього мозкову тканину (особливо багаті на АГ, що зв'язує комплемент, шматочки таламуса і стовбурового відділу мозку) розтирають у вероналовому буфері у співвідношенні 1:10 і залишають при кімнатній температурі на 1 год, після чого суспензію інактивують при 56°С протягом 5 год. Така обробка вбиває вірус та знімає антикомплементарність мозкової тканини, не пошкоджуючи специфічної артеріальної гіпертензії. Суспензію центрифугують 15 хв при 3500 хв- 1 з надосадової рідини, яка являє собою матеріал для дослідження на наявність АГ, готують 2-кратно зростаючі розведення від 1:2 до 1:64 і використовують для дослідження РСК.

ІФА.В ІФА специфічне фарбування АГ у клітинах мозку полеглих від сказу тварин виявляють як у свіжозятих, що зберігалися в гліцерині, а також у пробах, що зберігалися без гліцерину при 20°С 8-18 год. Даний тест придатний для рутинної діагностики сказу АГ ВБ у тканинних парафінових зрізах при фіксації препаратів 10%-ним розчином формаліну з рН 5,3 і подальшої обробки препаратів, укладених у парафін, пепсином.

На відміну від РН на мишах і культурі клітин ІФА дозволяє виявити AT у тварин протягом кількох годин, ІФА - найбільш перспективний лабораторний метод виявлення AT та індикації самого вірусу. Експрес-методом діагностики сказу є техніка захоплення та метод ІФ для виявлення АГ ВР. Доведено, що метод виявлення АГ ВБ у парафінізованих зрізах пероксидазо-антиперокісдазним методом значно перевищує метод ІФА. У 1987 р. створено набір для швидкої ензимімудіагностики сказу (RREID), прийнятний для епідеміологічних та лабораторних досліджень.

Варіантна ідентифікація за допомогою МОНАТ. За допомогою монАТ до глікопротеїнів СБ селектовані АГ варіанти, серед яких виділені фенотипно термолабільні (авірулентні) варіанти. При використанні 2-х груп МонАТ показано, що штами дикування відрізняються від шт. Fixe (Пастера), CVS, Flury HEP, ERA та "качиних" штамів за АГ детермінантами. Вивчення за допомогою монАТ 7 штамів, виділених від хворих Б людей, дозволило виявити певні відмінності їх від вакцинного штаму щодо АГ детермінант.

Загальновизнано, що відмінності AT між дикими штамами вдається виявити, використовуючи монАТ проти нуклеокапсидного AT N, які реагують з цитоплазматичними включеннями заражених вірусом клітин; проти глікопротеїну (G АГ), які реагують з мембранами інфікованих клітин, лізують ці клітини у присутності комплементу та нейтралізують вірус. У зв'язку з можливою АГ варіабельністю поверхневого глікопротеїну ВБ з різних географічних зон як протективний АГ використовували рибонуклеопротеїн, що характеризується консервативністю АГ структури. Таким чином, не тільки G білок, а й РНП ВБ мають протективну активність.

. Ці методи для сказу нетипові, оскільки використовуються тільки для перевірки поствакцинального імунітету. Для виявлення та титрування поствакцинальних AT використовують РН, яку ставлять загальноприйнятим методом. Як АГ використовують фіксований СБ. РН на клітинах ВНК-21 була чутливішою, ніж непряма ІФ при виявленні AT в сироватках вакцинованих лисиць. Крім того, запропоновані РТГА та ELISA.

РТГА.Поки ще не знайшла широкого застосування в діагностичній практиці через наявність у сироватках крові неспецифічних інгібіторів, до яких ВБ високочутливий, а головне, ГА АГ, які не піддавалися достатньому очищенню, мали низьку чутливість. Для приготування ГА АГ ВБ запропоновано використати шт. Москва, вирощена в культурі клітин ВНК-21, після його обробки сапоніном з подальшим очищенням і концентруванням. ГА відокремлюють від інших компонентів віріону ультрацентрифугуванням. Отриманий препарат мав ступінь очищення 99,92%, мав високу ГА активність (1:128), що добре зберігається протягом 1 міс при рН 5-9.

Перед постановкою РТГА слід проводити помірну двократну трипсинізацію гусячих еритроцитів для їх сенсибілізації. При використанні 0,25%-ної суспензії трипсі-нізованих еритроцитів (краще 10 7 клітин на 1 мл) чутливість РТГА підвищується в 4 рази. Для розведення АГ і сироваток застосовують боратно-сольовий розчин (рН 9) з додаванням 0,4% бичачого сироваткового альбуміну. Суспензію еритроцитів готують у сольовому розчині з кислим рН, щоб після з'єднання з сумішшю вірусу і сироваток, рН якої 9, остаточний рН встановився б в межах 6,2. Після внесення лунки суспензії еритроцитів панель струшують, заклеюють прозорою плівкою і ставлять на лід. Результати РТГА враховують через 40-50 хв, і з еритроцитами 2-дн курчат чи макаки-резус - через 1-1,5 год.

Розроблено радіоімунологічний аналіз, заснований на здатності AT зв'язуватися з міченим 125 1-АГ ВБ. Мічений IgG, виділений з антирабічної гіперімунної сироватки, можна застосовувати для виявлення АГ ВБ твердофазним РІА. Найкращі результати отримані при використанні фосфатно-сольового розчину (рН 6,0) з іонною силою 0,01 М та міченого IgG з активністю 200-250 тис. імп./хв.

Твердофазний конкурентний РІА застосовується для виявлення антирабічних AT в сироватці та гібридомних супернатантах.

Диференційна діагностика. Необхідно виключити хворобу Ауески, коли хворі тварини неагресивні, немає викривлення апетиту. У собак виключають нервову форму чуми. Підозра на сказ може виникнути при інфекційному енцефаломієліті коней. Комплекс лабораторних досліджень дозволяє поставити точний діагноз на сказ. Запропоновано новий метод диференціації різних штамів СБ, заснований на рестриктазному розщепленні продуктів ампліфікації ПЛР сегмента гена N.

Лабораторна діагностика інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби

Інфекційний ринотрахеїт (ІРТ, пухирцевий висип, інфекційний вульвовагініт, інфекційний некротичний ринотрахеїт, інфекційний риніт, «червоний ніс», контагіозна бронхопневмонія, інфекційний катар верхніх дихальних шляхів, гостропротека пригніченням та кон'юнктивітом, а також розвитком пустульозного вульвовагініту при попаданні вірусу в статеві органи тварини та абортами. Хвороба поширена повсюдно.

Вірус інфекційного ринотрахеїту (ІРТ) ВРХ відноситься до сімейства Herpesviridae, підродини Alphaherpesvirinae, роду Varicellavirus.

В антигенному відношенні вірус ІРТ ВРХ не однорідний, існують варіанти. Між вірусами ІРТ ВРХ та БА існує АГ спорідненість. В організмі тварин вірус викликає утворення ВНА, КСА. Вірус має ГА властивостями щодо мишачих еритроцитів.

Лабораторна діагностика включає: 1) виділення вірусу з патологічного матеріалу у культурі клітин та його ідентифікації в РН або РІФ; 2) виявлення антигену вірусу ІРТ у патологічному матеріалі РІФ; 3) виявлення антитіл у сироватці крові хворих та перехворілих тварин (ретроспективна діагностика) у РН або РНГА. Для лабораторної діагностики ІРТ використовують набір діагностикумів інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби та набір еритроцитарного діагностикуму для серодіагностики ІРТ великої рогатої худоби в РНГА.

Діагностику інфекційного ринотрахеїту проводять паралельно з дослідженням матеріалу на парагрипозну (ПГ-3), аденовірусну (1 та 11), респіраторно-синцитіальну інфекцію та вірусну діарею. Схема проведення лабораторної діагностики ІРТ аналогічна аденовірусної інфекції, що застосовується при діагностиці.

Попередній діагноз на інфекційний ринотрахеїт великої рогатої худоби ставлять на підставі позитивних результатів виявлення антигену в патологічному матеріалі РІФ з урахуванням епізоотологічних та клінічних даних, а також патологічних змін.

Остаточний діагноз ставлять на підставі збігу результатів РІФ із виділенням та ідентифікацією вірусу; збігу результатів РІФ з виявленням антитіл у 30% і більше других проб сироваток у титрах не нижче 1:2 у РН та 1:16 у РНГА та виявленням 4-кратного та більше збільшення титру антитіл у парних пробах сироваток. Попередній діагноз ставлять у ветеринарних лабораторіях протягом 2-3 днів, остаточний – протягом 15-30 днів.

Виділення вірусу. Взяття та підготовка матеріалу.В лабораторію направляють патологічний матеріал, взятий протягом перших 2-3 днів хвороби при вираженій клінічній картині хвороби або з діагностичною метою безпосередньо при забої від тварин із гострою стадією захворювання.

Від хворих тварин беруть 15-20 проб: змив зі слизової оболонки носової порожнини, очей, піхви, препуція, проби сперми. Для змивів використовують стерильні ватно-марлеві тампони; змиви з препуціальної порожнини та сперму беруть відповідно до Методичних вказівок щодо відбору проб, транспортування та підготовки до вірусологічного дослідження сперми та змиву з препуціальної порожнини бугаїв; проби крові, не менше 5 мл, отримують у перші 3 дні хвороби і через 3 тижні від тих же тварин у стерильні пробірки. Тампони з матеріалом поміщають у стерильні пеніцилін лінові флакони або пробірки з 2-3 мл стерильного фізіологічного розчину або розчину Хенкса, що містить від 500 до 1000 ОД/мл антибіотиків (канаміцин, мономіцин, неоміцин, пеніцилін, стрептоміцин).

Після зсідання крові стерильно зливають 2-3 мл сироватки і доставляють останню в лабораторію.

Від тварин, убитих з діагностичною метою, беруть із дотриманням правил асептики шматочки легень з бронхом (на межі ураженої та здорової ділянок), селезінки, середостінні, бронхіальні та брижові лімфатичні вузли, мигдалики, уражені ділянки слизових оболонок носової та ротової -кишкового тракту, а також пробу крові, від абортованих плодів – шматочки паренхіматозних органів. Шматочки матеріалу масою до 20 г поміщають у стерильну посудину.

Консервування патологічного матеріалу, доставка в лабораторію та його підготовка до дослідження такі ж, як при діагностиці аденовірусної інфекції.

Проби сперми до дослідження допускається зберігати при мінус 20 ° С трохи більше 5 діб. Сперму досліджують протягом 24 годин після розморожування. Її розводять 1:10 живильним середовищем для культури клітин з додаванням відповідних антибіотиків (500 ОД на 1 мл), заморожують 2-3 рази при мінус 30 °С, відтають при 37 °С, центрифугують при 2000 об/хв протягом 10 хв . Надосадову рідину використовують для зараження культури клітин. Зараження культур клітин. Методика його аналогічна така при діагностиці аденовірусної інфекції. Ізолят вважається виділеним у разі, якщо він викликає стабільну однотипну цитопатогенну дію не менше ніж у трьох послідовних пасажах. І тут можлива його наступна ідентифікація в РН. Цитопатогенна дія вірусу ІРТ у культурі клітин характеризується утворенням вікон у моношарі, округленням клітин, скупченням їх у вигляді «грон» з подальшим відшаруванням їх від поверхні скла.

Зараження тварин.Роблять дуже рідко з метою ідентифікації вірусу інфекційного ринотрахеїту. Телятам 6-8-місячного віку патологічний матеріал вводять інтраназально у вагіну, під шкіру та наносять на кон'юнктиву. Якщо в досліджуваному матеріалі є вірус, у заражених тварин розвивається ринотрахеїт з кон'юнктивітом. Від хворих телят вірус виділяють головним чином із ураженої трахеї та гортані. У інфікованих тварин розвиваються симптоми, подібні до спостережуваних при природному перебігу хвороби. Перші клінічні ознаки хвороби з'являються через 20 годин після інфікування та реєструються 7-10 днів. Заражені телята, як правило, одужують та залишаються вірусоносіями.

Виділити вірус з носової порожнини, піхви та з кон'юнктиви вдається з 5-го по 10-й день, а антитіла, що нейтралізують, - з 5-8-го дня після зараження. Вищий титр антитіл спостерігається після 35 днів, потім починається повільне зниження.

Встановлено, що максимальна кількість вірусу виділяється під час підвищення температури тіла на 4-7-й день хвороби і триває до 10-14 днів.

Індикація та ідентифікація вірусу. Виявлення специфічних тілець-включень. У ядрах клітин епітелію уражених слизових оболонок носової порожнини, вульви, вагіни та кон'юнктиви знаходять специфічні тільця-вмикання. Через 18-20 год після їх зараження можна виявити і в клітинах зараженої культури тканини, пофарбованої гематоксилін-еозином. Біопробу.

Серологічна ідентифікація

РІФ.Техніка постановки її така сама, як і при діагностиці аденовірусної інфекції великої рогатої худоби. Звертають увагу на свічення антигену в цитоплазмі та перинуклеарній зоні неушкоджених клітин. Яскраво-зелена флюоресценція у вигляді гранул або дифузного світіння цитоплазми не менше ніж у 10% клітин дозволяє оцінити препарат як позитивний. Попередній діагноз ставлять за наявності щонайменше 30% позитивних препаратів від загальної кількості досліджених проб. У мазках з піхви та кон'юнктиви специфічну флюоресценцію відзначали через 24 год, з препуція - через 48, з носа та трахеї через 72 год після зараження. Присутність специфічного антигену вдається підтвердити зараженням культури клітин нирки телят, у якій виявляється специфічна перинуклеарна та дифузна цптоплазматична флюоресценція, властива ринотрахеїтній інфекції. Використання культури клітин нирки кроля дозволяє звільнитися від неспецифічного свічення.

Збіг результатів РІФ та патогістологічних змін становить 87%, а імунофлюоресценції та вірусологічних досліджень – 44%. При паралельному дослідженні сироваток у РН та РІГА результати збігалися у 94% випадків.

У польових умовах РІФ виявилася позитивною у 18,5%, а метод вірусовиділення – у 15,9% випадків.

Таким чином, РІФ можна використовувати для експрес-діагноз діагностики ІРТ з подальшим підтвердженням діагнозу вірусологічними методами.

РН.За наявності ЦПД в культурах клітин, заражених ізолятом, і позитивної імунофлюоресценції проводять остаточне типування вірусу в РН. Перед її постановкою специфічну та негативну сироватки розводять у співвідношенні 1:10 розчином Хенкса або живильним середовищем для куліури клітин, що містять ангіонотики, і прогрівають у водяній бані 30 хв при 56 °С. РН ставлять загальноприйнятим методом в первинній культурі ПЕК або лінії клітин МДВК, що перевивається.

Результати РН враховують ЦПД вірусу, для чого визначають титр типованого ізоляту в присутності специфічної та негативної (контрольної) сироваток. Титр розраховують за методом Ріда та Менча та виражають у lg ТЦД 50 /мл.

Потім обчислюють індекс нейтралізації (І) за формулою І = Т1: Т2,

де Т 1 - титр ізоляту у присутності контрольної сироватки; Т 2 - титр ізоляту у присутності специфічної сироватки.

Видову приналежність ізоляту встановлюють при різниці в титрах вірусу щонайменше 2 lg. При індексі нейтралізації від 1 до 2 lg реакцію вважають сумнівною, в цьому випадку її повторюють. Індекс нейтралізації менше 1 lg вважають негативним. За позитивних результатів РН ізолят вважають повністю ідентифікованим.

Приготування гіперімунної сироватки для РН.Гіперімунну віруснейтралізуючу сироватку готують за наступною схемою: підшкірно вводять кроликам 1 мл культурального вірусу з ад'ювантом Фрейнда, далі трикратне внутрішньовенне введення вірусу в об'ємі 1 мл з інтервалом через 7 днів. Через 10 днів після останньої інокуляції вірусу кроликів знекровлюють, заморожують сироватку і зберігають при мінус 30 °С.

РТГА.Ставлять її мікрометодом при 4 ° С з 0,5 - 1%-суспензією еритроцитів білих мишей, розріджувач - трис-буферний розчин з 0,2% бичачого сироваткового альбуміну. Як антиген використовують культуральну вірусовмісну рідину, яку концентрують ПЕГ-6000 або ультрацентрифугуванням.

Після виявлення гемагглютинуючого агента, визначення його гемагглютинуючого титру готують 4 ГАЕ і проводять його ідентифікацію в РТГА з позитивною еталонною сироваткою.

Імуноферментна ідентифікація вірусу.Імунопероксидазний метод можна використовувати для дослідження прижиттєво взятих нозофарингіальних мазків-відбитків у клітинах, отриманих з легеневих

Крім того, рекомендовано непрямий антикомплементарний імунопероксидазний метод (НАІП) для лабораторної ідентифікації вірусу ІРТ. Методика полягає в наступному: на покривному склі, в пробірках готують чутливу культуру клітин до вірусу ІРТ (ПЕК, ТБ та ін) за загальноприйнятою методикою. Моносар заражають досліджуваним вірусом. Через 48 годин скла з інфікованими клітинами вилучають, відмивають у фосфатно-буферному розчині з рН 7,2-7,4 і фіксують в охолодженому ацетоні 5-10 хв.

На фіксований моношар клітин наносять 1-2 краплі суміші зі специфічної імунної сироватки та комплементу морської свинки у розведенні 1:10. Перед роботою противірусні сироватки сорбують гетерологічними вірусами, що досліджуються, т. с. отримують моносироватки. При обробці контрольних препаратів на моношар наносять суміш комплементу та нормальної сироватки.

Препарати інкубують у вологій камері при 37 °С протягом 40-60 хв, потім промивають проточною водою 5-10 хв, злегка підсушують і обробляють міченою пероксидазою антикомплементарною сироваткою (1-2 краплі), попередньо розведеною 1:20 фосфатним буфером поміщають препарат на 40-60 хв у вологу камеру за 37 °С. Потім їх промивають, підсушують і для виявлення комплексу, що утворився (антигенан-тітіло-пероксидаза) на препарат наносять на 40-60 хв бензидиновий реагент (50 мг бензидину в 100 мл трис-НС1-буфера з рН 6,8 з додаванням після фільтрації 6- 7 крапель 3%-ного перекису водню на кожні 5 мл робочого розчину). Препарат витримують у вологій камері, промивають у дистильованій воді, висушують, монтують на предметному склі та вивчають у світловому мікроскопі під об'єктивом з імерсією.

При світловій мікроскопії непрямий антикомплементарний імунопероксидазний метод забезпечує чітке виявлення вірусного антигену в цитоплазмі інфікованих клітин у вигляді забарвлених у коричневий колір утворень, що видно при збільшенні у 140 разів.

Специфіка показників, отриманих цим методом, підтверджується постановкою спеціальних імунологічних контролів. При постановці перехресної імунопероксидазної реакції з гетерологічними антитілами ця реакція має виражений видоспецифічний характер: антиген реагує лише з гомологічною сироваткою. Ендогенна пероксидаза у культурі клітин ПЕК та LF не виявляється.

Непрямий антикомплементарний імунопероксидазний метод є перспективним при діагностиці гострих респіраторних вірусних інфекцій великої рогатої худоби.

При використанні імунопероксидазного методу для індикації вірусу ІРТ у культурі клітин ПЕК антиген виявляється через 18, 22 години після зараження. Три прямі серологічні методи швидкого виявлення вірусних антигенів (РІФ, імунопероксидазний та ELISA) однаково застосовні для виявлення вірусу під час лихоманки, але не на пізніх стадіях хвороби.

Вірусний антиген виявляють у носових змивах методом ELISA з 3-го по 10-й день після зараження. У кон'юнктивальних змивах його виявляють на 5 добу.

ІдентифікаціявірусуІРТ за допомогою рестрикційного аналізу вірусної ДНК. Описано метод клонування фрагментів геному вірусу ІРТ, виділення та характеристика рекомбінантного ДНК-зонда, що дозволяє визначати вірус у клінічних пробах. За допомогою методу дот-блот-гібридизації виявлено ДНК вірусу ІРТ у пробах сперми, отриманої від серопозитивних тварин, коли виділення вірусу в культурі клітин давало негативний результат. Хороший результат також отримано з використанням інфікованих культур клітин.

Серодіагностика та ретроспективна діагностика. Антитіла до вірусу ІРТ можна виявити в сироватках крові хворих і перехворіли тварин у РН, РНГА та ін. Для постановки ретроспективного діагнозу використовують парні проби сироваток, взяті з інтервалом у 3 тижні. Результат серодиагностики враховують зростання титру антитіл у парних пробах сироватки, і навіть числа серопозитивных тварин через зазначений інтервал. Перед дослідженням сироватки прогрівають у водяній бані за температури 56 °С протягом 30 хв.

РН.Ставлять методом розведення випробуваних сироваток з постійною дозою вірусу в культурі клітин "ПЕК або ТБ. Вірус попередньо титрують в культурі клітин. Для цього сухий вірус ІРТ з набору діагностикумою стерильно розводять в обсязі, зазначеному на етикетці, і готують з нього десятиразові розведення від 10 1 до 10 -6 на живильному середовищі (кінцевий титр су.хого вірусу вказаний на етикетці).

Розведення готують у загальному обсязі 5 мл, потім заражають по 4 пробірки з культурою клітин, попередньо відмитою від ростового середовища, кожним розведенням вірусу в об'ємі I мл. Заражені та контрольні культури клітин (4-6) інкубують при 37 °С, щодня враховують ЦПД вірусу заключно - на 5-7 добу.

Титром вірусу вважають зворотну величину його найбільшого розведення, що викликає ЦПД у 50% культур клітин, який вираховують за методом Ріда та Менча плі Кербера та виражають у ТЦД 50/мл. Титри 1:32, 1:64 виявляються рідко. У неблагополучних з цієї хвороби стадах ВНА виявляються у 12% клінічно здорового худоби. Ретроспективний діагноз на ІРГ ставлять при 4-кратному та більше прирості AT у пробах сироваток реконвалесцентів. Нині широко використовують мікрометод РН.

РНДА.Біологічна промисловість нашої країни виготовляє еритроцитарний діагностикум. РНГА ставлять згідно з методичними вказівками в мікропанелях з U-подібними лунками наборів мікротитрування Такачі або Тітертек за загальноприйнятою методикою. Результати РНГА з сироватками, що використовуються, оцінюють за титрами; позитивні – 1:16 і вище, сумнівні – 1:8, негативні – 1:4, 1:2 та нульові. Збільшення титрів АТ у парних сироватках у 2-4 рази свідчить про наявність інфекції. Застосовуючи РНГА, можна виявити AT у ранній період інфекції, ніж з допомогою РН. Встановлено відповідність результатів РНДА та РН у 95% випадків. За допомогою цієї реакції легше і швидше, ніж РН проводити типування АТ до вірусу ІРТ. Титри AT були в 7-10 разів вищі за РН.

РДП.Не знайшла широкого застосування у діагностичній практиці, дослідники рекомендують її використовувати для серодіагностики ІРТ. За наявності ПА можна вловити нещодавно інфекцію, тоді як ВНА тривалий час циркулюють в організмі, і захворювання можна вловити по парних сироватках. При виявленні ПА кров краще брати на 8-й та наступні дні хвороби.

РТГА.Може використовуватися для виявлення та кількісної оцінки AT до вірусу ІРТ. Титр анти-ГА корелює з титром ВНА. Позитивний результат РТГА вже в 1-му розведенні сироватки (1:4) вказує на наявність AT до вірусу ІРГ у цій пробі сироватки. 4-кратний і більше приріст титрів анти-ГА у парних пробах сироватки є показником активної інфекції.

ELISA. Широко застосовують у Нідерландах, США, Великій Британії, Швеції, країнах колишнього СРСР. Він виявився придатним виявлення AT до вірусу ІРГ в молоці. Для цього достатньо одержання проб змішаного молока від 5-10 корів. AT визначають після попереднього концентрування Ig. Збіг даних серологічних реакцій у пробах сироватки крові та молока становила 92,8%. За допомогою даного методу можна оперативно визначати імунологічний статус поголів'я лактуючих корів цілого регіону, а також проводити обстеження тварин, що експортуються та імпортуються. У ФРН розроблено та застосовується метод ТРАХІТЕСТ для ІФА проб збірного молока порів з метою діагностики прихованого вірусоносійства.

Запропоновано непрямий метод IgM-ELISA для визначення нещодавньої інфекції ІРТ. Ранні AT IgM виділені на 6-й дн після зараження, до 9-го дн відбувалося зростання титру AT Ig, a до 13-го дн - ВНА. У телят, щеплених інактивованою вакциною, ранньої імунної відповіді не відбувалося - AT IgM не виявлялися, a IgM та ВНА з'являлися пізніше, ніж після зараження. Однак при цьому слід мати на увазі, що наявність у сироватці ВРХ ревматоїдного фактора може призвести до хибно-позитивних результатів діагностики в IgM-ELISA. У цьому випадку попередня обробка проб сироватки антибичачими IgM дозволяє уникнути хибнопозитивних результатів. Тест IgM-ELISA має велику цінність у діагностиці ІРТ, особливо у молодих тварин. У групі позитивних сироваткових проб кореляція між ELISA та РНГА становила 98,3% a EL1SA з ІФ - 95,7%.

ELISAз використанням монАТ. Заснований на конкуренції між AT сироватки крові ВРХ та нейтралізуючими мишачими монАТами. Для проведення лунки мікротитраційних панелей обробляють очищеним вірусом ІРТ, і після висушування їх можна використовувати негайно або зберігати при - 20°С. У оброблені вірусом лунки панелей послідовно вносять нерозведену випробувану сироватку, специфічні до вірусу ІРТ монАТ, кон'юговані пероксидазою, субстрат пероксидази. Результати реакції враховують у спектрофотометрі при А405. У разі позитивної реакції зв'язування монАТ пригнічується AT сироватки крові. Метод виявився набагато чутливішим і специфічнішим за РН.

Лабораторна діагностика ротавірусної інфекції великої рогатої худоби

Ротавірусна інфекція (РВІ) ВРХ (діарея неонатальних телят) - гостра контагіозна хвороба новонароджених телят, що характеризується ураженням ШКТ. Хвороба поширена у всіх географічних регіонах земної кулі. Майже її реєстрували скрізь, де проводили дослідження. Доведено широку дисимінацію ротавірусів (РВ) телят серед тварин різних видів та наявність АТ у гризунів (морських свинок, щурів, хом'яків, мишей).

На підставі епізоотологічних, клінічних та патологоанатомічних даних ставлять попередній діагноз, остаточний встановлюють лише лабораторними методами. Останні базуються на виявленні вірусу або вірусного АГ у фекалі хворих телят, вмісті кишечника, клітинах слизової оболонки тонкого кишечника загиблих і вимушено вбитих тварин, а також на виявленні АТ до РВ у сироватках крові хворих та перехворілих телят та у сироватках крові та молозиві коровма .

Експрес-методи діагностики.Розроблено тест-систему ІФА на основі РВ свиней при виявленні специфічного АГ РВ ВРХ, яка має високу чутливість і специфічність. Її доцільно застосовувати у лабораторних умовах для експрес-діагностики. Оскільки поліпептид VР5 містить перехресний груповий АГ, локалізований у консервативному домені, який є загальним для всіх РВ групи А. Показано можливість індикації рота- та коронавірусів методом флюоресцентних зондів та АТ до них. Він заснований на реєстрації ранніх етапів взаємодії вірусів із рецепторами клітин.

Виділення вірусу.В лабораторію для дослідження направляють не менше 10 проб рідких фекалій, тонкий кишечник із вмістом (не пізніше 2-3 години з моменту загибелі або вимушеного забою телят), 10-15 проб парних сироваток хворих і перехворілих тварин, 6-10 проб сироватки крові та 6-10 проб молозива. З найбільшою сталістю вірус вдається виявити в пробах фекалій, взятих у перші дні хвороби, тому для дослідження придатні фекалії, взяті від 2-14 днів телят з клінічними ознаками діареї на 1-3-й день хвороби. Відразу після доставки в лабораторію проби обробляють або зберігають при 4°С не більше доби, при -20-50°С до 1 міс. Сироватки крові зберігають при 4-10 ° С не більше 1 тиж, при -20 ° С до 1 міс; молозиво – при 4°С не більше 2 діб, при –20°С – до 1 міс. Для вірусологічних або електронно-мікроскопічних досліджень готують 10% суспензію фекалій на р-рі Хенкса. Суспензію гомогенізують і центрифугують 1 год при 3 тис. об/хв, надосадову рідину переносять у стерильний флакон, додають пеніцилін і стрептоміцин (1000 ОД/мл), витримують 10-12 год (ніч) при 4°С і досліджують.

Виділення РВ у культурі клітин.Показано кореляцію між захворюванням новонароджених телят діареєю з присутністю РВ АГ у фекаліях. Слід мати на увазі, що звичайними методами вірус не культивується, а застосування додаткових впливів – хімічних (трипсин) та фізичних (центрифугування вірусу на шарі клітин) – дає позитивні результати при високих концентраціях вірусу у фекаліях, що перевіряється електронною мікроскопією. Для цього вміст однієї пробірки після заморожування та відтавання та обробки поліетиленгліколем ресуспендують у 0,1 мл дистильованої води та досліджують в електронному мікроскопі. У позитивному випадку виявляють типові частки РВ та їх скупчення. Специфічний характер частинок підтверджують методом імуноелектронної мікроскопії.

Індикація та ідентифікація вірусу.ЕМ та ІЕМ. Метод електронної мікроскопії (ЕМ) суспензії вірусу з рідкої частини фекалій найбільш широко застосовується для діагностики інфекції при концентрації вірусу в фекаліях не нижче 104-105 частинок/мл рідини. Препарати готують із освітленої низьким центрифугуванням рідкої частини фекалій, Однак кращі препарати отримують при розведенні фекалій дистильованою водою 1:1-1:10 і подальшому освітленні суспензії центрифугуванням при 4-10 тис. об/хв протягом 15 хв. Простий метод приготування препаратів з фекалій, що не поступається за чутливістю до ультрацентрифутування, полягає в наступному. До 4 мл освітленої низьким центрифугуванням рідкої частини фекалій додають 60% насиченого розчину (NН 4) 2 SО 4 змішують, залишають на 1 год при 4°С, а потім центрифугують 10 хв при 10000 об/хв. Надосадову рідину зливають, а осад ресуспендують у 4-х краплях дистильованої води та готують препарати. Існують різні способи і модифікації приготування препаратів. Найбільш широко використовується крапельний спосіб. Більше доцільно застосовувати ІЕМ. Для цього можна використовувати сироватку лабораторних тварин (кроликів, морських свинок), імунізованих РВ мавп або сироватку реконвалесцентів. Зміст і специфічність АТ в сироватках реконвалесцентів можуть бути перевірені в серологічних реакціях з використанням вірусу SА 11. При обробці фекальної суспензії імунною сироваткою одночасно з виявленням типових частинок РВ встановлюється їх специфічність, на що вказує виявлення агрегатів. Найчастіше використовують три модифікації імуноелектронної мікроскопії.

При позитивному результаті РВ частки виявляються у препаратах як специфічних скупчень (імунних комплексів). Оцінку специфічності реакції проводять шляхом підрахунку числа та розмірів подібних скупчень, а також за ступенем покриття окремих віріонів АТ сироватки. Виразність цього ефекту при певному навичці можна оцінювати за шкалою умовних одиниць від 0 до 4 плюсів.

ІФ.Для виявлення вірусного АГ у заморожених зрізах тонкого кишечника, мазках фекалій та культурі клітин успішно застосовують прямий та непрямий методи. При дослідженні кріосрізів кишечника та мазків із фекалій телят найкращі результати отримують протягом 4-6 годин після виявлення ознак діареї. Епітеліальні клітини швидко десква-муються з поверхні ворсинок кишечника і видаляються з фекальними масами. Найчастіше суспензією фекалій заражають культуру клітин та ідентифікують вірусний АГ реакції ІФ. Розроблено прямий метод ІФ у клітинах МДВК, інфікованих культуральним чи фекальним вірусним матеріалом. У методичних рекомендаціях по індикації РВ ВРХ непрямим методом ІФ передбачається використання діагностичного набору, що включає антиген специфічний - культуральну суспензію, що містить вірус ПЕК або МА-104; АГ нормальний – неінфіковану суспензію клітин ПЕК або МА-104; специфічну сироватку, одержану шляхом гіперімунізації телят, лабораторних тварин; нормальну сироватку від здорової ВРХ, що не містить АТ до РВ; антивидову сироватку проти глобулінів ВРХ, кон'юговану ФІТЦ (випускає Інститут епідеміології та мікробіології ім. Н.Ф. Гамалеї). НІФ можна використовувати для виявлення та ідентифікації РВ АГ в інфікованих культурах клітин, фекаліях та кишечнику хворих та полеглих телят для виявлення та кількісної оцінки АТ до РВ.

РДП.Це - простий і доступний метод виявлення РВ АГ у фекаліях хворих на телят, вміст кишечника і суспензії слизової оболонки кишечника загиблих або вимушено вбитих телят. Для цього 20% суспензію фекалій у фосфатно-буферному сольовому розчині прогрівають у водяній бані при 37°С 30 хв, періодично перемішуючи. Потім центрифугують 15 хв при 8000 g. Надосадову рідину фільтрують через фільтр "Міліпор" і фільтрат концентрують у 25 разів за допомогою діалізного концентратора. Внаслідок всіх етапів обробки 0,2 мл концентрату відповідає 1 г вихідного матеріалу фекалій. Джерелом специфічних АТ служать сироватки реконвалесцентів після ротавірусного гастроентериту, попередньо перевірені в інших серологічних реакціях.

РДП проводять в гелі агарози на скляних пластинках 0,9% агарози в буферному розчині, що містить 0,1 М NaС1, 0,01 М трис(гідроксиметил)-амінометану і 0,001 М етилендіа-мінтетраацетату. Компоненти реакції поміщають у вирізані у шарі агарози лунки діаметром 3 мм, віддалені один від одного на 3 мм. Платівки з гелем витримують протягом ночі за кімнатної температури, після чого враховують результати. Між лунками з АГ та АТ у позитивних випадках формується одна чітка лінія преципітації. У РДП випробовується АГ - рідка частина фекалій або надосадова рідина після центрифугування суспензії фекалій або кишечника, випробувана сироватка від телят, що перехворіли, молозиво і молоко в натуральному вигляді (у вигляді сироватки) після обробки сичужним ферментом.

Реакція імунопреципітації з фарбуванням преципітатів флюоресцентними АТ може застосовуватися для виявлення у фекаліях РВ людини та РВ діареї телят. Розроблено її прискорену модифікацію. Діагностикум, що включає специфічний та нормальний АГ, специфічну сироватку, готують за методикою ВІЕВ, а як нормальна сироватка використовують фетальну сироватку або сироватку безмолозивних телят. Реакцію оцінюють за освітою характерних ліній преципітату.

РЗК.Для виявлення АГ застосовується рідше за інші методи. Вона менш чутлива, ніж електронна мікроскопія та РІФ, частіше дає хибнопозитивні результати через антикомплементарність багатьох проб фекалій. Однак при обробці фекалій комплементом, фетальною сироваткою, фреоном, очищенням ПЕГ 6000 або ультрацентрифугування РСК не поступається за чутливістю електронної мікроскопії. Реакцію ставлять мікрометодом зі специфічною сироваткою або сироваткою телят, що недавно перехворіли, вільної від АТ до інших вірусів.

ВІЕФ.При цій реакції утворюється лінія преципітації між АГ, що рухається до анода, і АТ, що рухається до катода. Якість і чистота агароз є основним фактором отримання відтворюваних результатів. Більшість дослідників вважають, що цей тест не поступається електронною мікроскопією або навіть перевершує її.

ВІЕФ запропонований для виявлення РВ у фекаліях та патологічному матеріалі та для виявлення АТ у сироватках крові. Для дослідження беруть рідку частину фекалій. Якщо для дослідження рідкої частини недостатньо, проби фекалій центрифугують 10-15 хв при 4 тис. об/хв при 4-10°С. Досліджують надосадову рідину. Кишечник дрібно подрібнюють, додають рівний обсяг фізіологічного розчину, потім гомогенізують у ступці зі склом, центрифугують 10-15 хв при 2 тис. об/хв при 4-10°С. Надосадову рідину використовують у реакції. ВІЕФ ставлять у 0,85%-му розчині агарози, приготовленої на 0,5 М веронал-мединаловому буфері (рН 8,6).

ЕLISА.За чутливістю вище, ніж ЕІ, ІФ, РЗК, ВІЕФ. Може бути використаний у прямому та непрямому варіантах, а також у постановці на латексі. За допомогою ЕLISА можна виявити РВ у фекаліях телят при розведенні досліджуваної проби до 1:5000. Описаний твердофазний ЕLISА для типування та поділу на підгрупи РВ людини та тварин. Для цього використовують IgG у концентрації 5 мкг/мл; розведення кролячої антисироватки до IgG ВРХ до 1:400. Тривалість інкубації IgG -4 год, реакції АГ РВ з IgG -3 год, реакції антисироватки до РВ з комплексом IgG - РВ АГ -16 год, для з'єднання з кон'югатом - 4 год, зміни кольору субстрату (фосфату Р-нітрофенілу) - 10 хв. Перед дослідженням фекалії телят розводять у 4 рази фосфатно-буферним розчином, освітлюють центрифугуванням та обробляють сумішшю Твіна-20 з азидом натрію. Показання ЕLISА у 100% випадків збігаються з результатами електронної мікроскопії.

Розроблено тест-систему ІФА на основі РВ свиней для виявлення специфічного АГ РВ ВРХ, яка має високу чутливість та специфічність. У Російській Федерації розроблено імуноферментний діагностикум, що випускається ВІЕВ. Набір включає: специфічний ліофілізований РВ АГ - вірусовмісна суспензія, отримана на культурі клітин МА-104, концентрована ПЕГ 6000 і центрифугована при 6000g, контрольний АГ, ліофілізована специфічна антиротавірусна сироватка, одержана; сухі імуноглобуліни, виділені з гіперімунної антиротавірусної сироватки методом висолювання насиченим розчином (NН 4) 2 SО 4 з подальшою іонообмінною хроматографією на колонці з ДЕАЕ-целюлозою.

Існує низка інших методів для виявлення РВ АГ у фекаліях хворих на діарею телят: реакція зворотної пасивної гемаглютинації, метод імуноагрегатної ГА, реакція аглютинації латексу та ін. Так, запропонований простий стафілококовий метод для виявлення РВ у фекаліях новонароджених Метод заснований на виявленні РВ аглютинуючого стафілокока в 10% суспензії зразків фекалій на предметних стеклах з золотистим стафілококом, навантаженим РВ АТ. Контролем служать стафілококи, оброблені неімунною кролячою сироваткою. Аглютинація видно під мікроскопом через 2-3 хв після кругового похитування скла. Щоб уникнути неспецифічних реакцій проводять попередню обробку зразків фекалій нагріванням, фільтрацією та І-ацетилцистеїном. Така обробка не знижує специфічність методу. У порівнянні з ЕLISА даний метод виявився чутливішим; переваги його – швидкість, простота та низька вартість, що дуже важливо для скринінгу великої кількості зразків фекалій.

Метод аглютинації латексу з використанням комерційного набору Rotalех для виявлення РВ у фекаліях хворих настільки ж специфічний, чутливий, як і методи електронної мікроскопії, ІФ та ЕЛІСА. Для диференціації підгруп та серотипів ізолятів РВ описаний метод гібридизації нуклеїнових кислот, електрофорез у ПААГ віріонної РНК вірусів. Метод точкової гібридизації високо специфічний, що дозволяє виявляти 8 нг вірусної РНК і в 10-100 разів більш чутливий, ніж ЕLISА.

Варіантна ідентифікація за допомогою МОНАТ.Отримано монАТ до шт. RIT4237 (серотип I) РВ ВРХ. Нейтралізація АГ виявила варіабельну специфічність до групових та підгрупових детермінантів. Використанням монАТ проти субгрупових АГ в ЕLISА було встановлено домінування серотипу II РВ людини у пробах калу хворих дітей. Наявність таких АТ збільшує чутливість та специфічність тест-систем.

Серодіагностика та ретроспективна діагностика. Серологічне дослідження сироваток крові телят має дуже обмежену цінність. Протягом перших тижнів життя не вдається виявити приросту АТ, незважаючи на минулу хворобу. Рівень гуморальних АТ у дорослих тварин не дозволяє прогнозувати виникнення епізоотії у стаді.

РЗК.Для діагностики РВІ показана можливість постановки РЗК з парними сироватками перехворілих тварин. У перші дні хвороби КСА більшість тварин відсутні. До 7-10 дня рівень їх зростає, досягаючи максимуму до 21 дня, потім відбувається зниження і до 30-35 дня титр КСА доходить до нуля. РСК ставлять загальноприйнятим методом у мікро- та макрообсягах.

РТГА.Ставлять за стандартною методикою, що використовується діагностичними вірусологічними лабораторіями. Застосовують скляні пробірки та звичайні обсяги реагентів або одноразові пластикові панелі з лунками та мікрооб'єми реагентів. Для постановки реакції використовують еритроцити людини групи або еритроцити морської свинки. Досліджувані сироватки обробляють каоліном та еритроцитарною масою (останнє – при використанні еритроцитів людини). Всі розведення готують на фізіологічному сольовому розчині з додаванням 0,04% альбуміну сироватки ВРХ.

Непряма ІФ, РН, радіоімунологічний методставляться за загальноприйнятими методиками.

Диференційна діагностика. РВІ у новонароджених телят слід диференціювати від коронавірусної інфекції, колібактеріозу. Необхідно виключати диспепсію новонароджених телят аліментарного походження. Для титрування вірусів групи А розроблені методи дот- та блот-гібридизації РНК із зондами до ДНК геномного сегмента 4, отриманими за допомогою ампліфікації в ПЛР гіпердивергентних областей гена білка VР4 (нуклеотиди 211-686) до ДНК шт. ІЧ, IND, NCDV та Сr з використанням олігонуклеотидних праймерів. Зонди 3 типоспецифічні (VР4) і не реагують перехресно з 2-нитковими РНК гетерологічних Р-типів РВ.

Лабораторна діагностикавірусної діареї

великої рогатої худоби

Вірусна діарея - хвороба слизових оболонок (ВД-БС) - інфекційна контагіозна хвороба ВРХ, переважно молодих тварин, що характеризується ерозивно-виразковим запаленням слизових оболонок травного тракту, ринітом, збільшенням лімфовузлів, високою лихоманкою, високою лихоманкою, і виразковим стоматитом з рясним слиновиділенням, появою слизово-гнійних витікань із носової порожнини. У корів можливі аборти. Вперше як самостійне захворювання ВД-БС було визначено в штаті Нью-Йорк (США) у 1946 р. при спалаху гострої, часто зі смертельним результатом хвороби ВРХ, що характеризувалась діареєю та ерозійними ураженнями шлунково-кишкового тракту. В даний час ВД-БС широко поширена на територіях багатьох країн і разом з двома іншими пестивірусами (ВКНС і вірус ПБО) інфікує 173 види домашніх та диких жуйних тварин та 11 видів свиней. Є публікації про виявлення АТ і АГ пестивірусу у людини, але можливість його інфікування лише передбачається.

На підставі відмінностей у клінічних проявах вірусну діарею та хворобу слизових оболонок ВРХ спочатку розглядали як різні хвороби. Пізніше на підставі аналізу патологічних змін, особливостей епізоотології та клінічних проявів ці 2 хвороби стали позначати під назвою вірусна діарея – хвороба слизових оболонок ВРХ . Оскільки встановлено ідентичність збудників цих хвороб, їх вважають однією інфекцією з різними клінічними проявами, переважним розвитком респіраторного чи діарейного синдрому, у зв'язку з чим хворобу частіше почали називати вірусна діарея ВРХ.

Хвороба зареєстрована у всіх країнах світу. У деяких штатах США можна знайти до 70-90% серопозитивних тварин.

Діагноз ставлять на підставі клінічних, епізоотологічних даних та лабораторних методів дослідження. Однак епізоотологічні дані, симптоми хвороби та характер патологічних змін дають підставу лише запідозрити хворобу. Оскільки ВД-БС нагадує багато інших хвороб (чуму, інфекційний виразковий стоматит, грибковий стоматит, ПГ-3, катаральну лихоманку ВРХ, паратуберкульоз та аліментарні отруєння), лабораторні дослідження у діагностиці мають вирішальне значення. При постановці діагнозу на ВД-БС слід враховувати наступне: хворіють окремі тварини у віці 3-36 місяців, типові клінічні зміни проявляються ураженням слизових оболонок або кров'янистим проносом з ерозією або без ерозії слизових мембран, всі хворі тварини гинуть протягом декількох днів, у хворих тварин немає специфічний АТ у крові, хоча решта поголів'я має їх у високих титрах.

Лабораторна діагностикаВД-БС включає: 1) виявлення у патологічному матеріалі (мазках, відбитках, зрізах), отриманому від хворих тварин АГ у РІФ; 2) виділення збудника з патологічного матеріалу в культурі клітин ТБ, ПЕК або ЛЕК ідентифікація в РН або РІФ; 3) виявлення АТ у сироватці крові хворих та перехворілих тварин (ретроспективна діагностика) у РСК та РН.

Лабораторну діагностику ВД-БС проводять із використанням набору діагностикумів, що випускаються біологічною промисловістю. Її ведуть паралельно з дослідженням матеріалу на ПГ-3, аденовірусну (адено 1 та 2), РС та ІРТ.

Попередній діагноз на ВД-БС ВРХ ставлять на підставі позитивних результатів виявлення АГ у патологічному матеріалі в ІФ та ПЛР з урахуванням епізоотологічних та клінічних даних, а також патологоанатомічних змін. Остаточний діагноз ставлять на підставі: збігу результатів ІФ з ПЛР, виділенням та ідентифікацією вірусу; збіги результатів ІФ з виявленням АТ в 30% і більше других проб парних сироваток в титрах не нижче 1:4 РСК і 1:16 РН; виявлення 4-кратного та більше приросту АТ у парних пробах сироваток. Попередній діагноз ставлять у ветеринарних лабораторіях протягом 2-3 днів, остаточний - до 30 днів.

Виділення вірусу.В лабораторію направляють патологічний матеріал від хворих тварин, взятий у перші 2-3 дні при виражених симптомах хвороби або від тварин, убитих з діагностичною метою на гострій стадії захворювання. Від болючих тварин беруть 15-20 проб наступного матеріалу: змив зі слизової оболонки носової порожнини, одержувані шляхом введення стерильного ватно-марлевого або поролонового тампона в носові ходи; проби крові в перші 3 дні хвороби і через 3 тижні від тих же тварин з дотриманням правил асептики в стерильні пробірки по 8-10 мл; зіскрібки з виразки ленних або ерозованих ділянок слизових оболонок ротової порожнини і носового дзеркала, взяті жорсткими ватно-марлевими тампонами або скальпелем. Тампони з матері лом поміщають у стерильні пеніцилі нові флакони або пробірки з 2-3 мл стерильної фізіологічного розчину або розчину Хенкса, що містить 500-1000 ОД/мл антибіотики (канаміцину, мономіцину, неоміцину, пеніциліну, дрепт). . З крові після згортання стерильно зливають 3-4 мл сироватки та доставляють у лабораторію.

Від тварин, убитих з діагностичною метою, беруть із дотриманням правил асептики шматочки легень з бронхом (на межі ураженої та здорової ділянок), селезінки, середостінні, бронхіальні та брижові лімфовузли, мигдалики, уражені ділянки слизових оболонок носової та ротової порожнин, трахеї, ШКТ, а також пробу крові. Шматочки матеріалу масою до 20 г поміщають у стерильну посудину, що щільно закривається. Легше вірус виділити на початку хвороби і в період загострення з крові, легень, різних учасників тонкого кишечника (особливо з клітин слизової оболонки 12-палої кишки лімфовузлів і селезінки. При хронічному перебігу хвороби його вдається регулярно виділяти з різних відділів кишечника, але не з крові Дослідження носових змивів і фекалій у цих випадках також дає негативні результати, хоча в окремих випадках вірус виділяли з фекалій навіть через 5 місяців після хвороби. натрію або гелю рину і поміщають їх у термос з льодом.З крові експериментально заражених тварин виділяли вірус з 1-14-го дня після зараження.Виділяли його також з тканин абортованих або мертвонароджених плодів, плаценти та навколоплідної рідини.

Зараження культур клітин.Вірус виділяють у первинних субкультурах клітин ембріона ВРХ (ПЕК, ЛЕК, СЕК) або ТБ. Ізолят вважається виділеним у разі, якщо він викликає стабільне однотипне ЦПД не менше ніж у 2-х послідовних пасажах. І тут можлива його ідентифікація в РН. У первинних культурах клітин нирки ембріона корів перші ЦПІ виявляють через 2-5 днів після інокуляції. Вони виражаються у появі дрібнозернистої інфільтрації у клітинах фібробластоїдного типу. У міру розвитку інфекції клітини поступово відкидаються від поверхні скла, але деякі довго зберігаються, утворюючи острівці клітин епітеліоїдного типу. Зрештою на склі залишається лише мережа зернистого матеріалу.

При використанні вторинних культур клітин цитопатичні зміни з'являються майже одночасно у всіх клітинах моношару, причому вони стають подовженими, незграбними і здаються переплетеними. У пофарбованих препаратах клітинного моношару за наявності цитопатичних змін виявляють вакуолізацію протоплазми та зміну ядер, що виражаються у скороченні мембрани, пікнозі та каріорексисі. У деяких випадках вакуолізація буває така виражена, що її спостерігають при мікроскопії незабарвлених препаратів. Розвиток ЦПІ відповідає зростанню титру вірусу. До 72-96 год після інокуляції, коли титри вірусу досягають максимуму (10 55 -10 65 ТЦД 50) відзначають лише початок ЦПД. За відсутності ЦПД в 3-х послідовних пасажах клітин 4-й пасаж проводять із спробою виявлення вірусу в моношаровій культурі на покривних скельцях в ІФ. За негативної реакції подальше дослідження припиняють. Проте негативний результат у разі не дає права постановку діагнозу. Для ідентифікації таких штамів японські дослідники пропонують використовувати феномен екзальтації вірусу БН у присутності збудника ВД-БС. Сутність методу зводиться до появи ЦПІ при спільному вирощуванні цих агентів у культурах клітин тестикулярної тканини ВРХ. Методика дослідження ось у чому. Дисперговані трипсином клітини тестикулярної тканини ВРХ суспендують до концентрації 210 6 клітин в 1 мл у 0,5%-ному розчині ГЛАХ з сироваткою ВРХ, перевіреної на відсутність ЗНА до збудника ВД-БС. Суспензію розподіляють по 0,5 мл пробірки. У кожну з них інокулюють по 0,5 мл вірусного матеріалу (розведеного ВД) і інкубують при 37°З похилому стаціонарному положенні. Як контроль у кожен досвід включають не інокульовані культури. Після 4 днів інкубування рідину видаляють, а культури заражають вірусом БН (10 6 БОЕ в 0,5 мл середовища). Після додаткового 3-дн інкубування при 37°З культури досліджують наявність ЦПД. У культурах, що спочатку інфіковані нецитопатогенним штамом ВД, після зараження вірусом БН з'являється чітко виражені ЦПІ. У контрольних культурах один вірус БН зазвичай викликає ЦПИ. Незаражені культури, у яких не вводили жодні з вірусних агентів, повинні залишатися нормальними.

Для пасування не цитопатогенних штамів культури, інокульовані вірусом діареї кожного пасажу, інкубують 3 дні при 37°С, після чого збирають культуральну рідину, яку використовують для подальших пасажів, а культури інфікують вірусом БН і додатково інкубують для індикації ВД за допомогою феномену.

Зараження телят. Біопробу на телятах ставлять у тих випадках, коли спроби виділити специфічний вірус виявилися безуспішними або виникає сумнів щодо його наявності у зв'язку з тим, що в заражених культурах клітин немає ЦПІ. Використовують телят 2-6 місяців віку, перевірених на відсутність ЗНА до ВД, або телят 4-6-дн віку, отриманих з благополучного господарства. Як матеріал для зараження використовують культуральну рідину 3-5 пасажів, 5-10 мл якої вводять внутрішньовенно. Якщо у досліджуваному матеріалі є вірус діареї, у телят на 4-7-й день після зараження відзначають підвищення температури, лейкопенію, поява слизових оболонок з носової порожнини та діарею; у деяких тварин можуть спостерігатися тенезми. У разі позитивного результату, у заражених тварин вірус порівняно легко вдається виділити з крові. У найбільшій концентрації (10 3 -10 5 ВД 50 /мл) вірус виявляють через 4 дні після зараження, хоча присутність його в крові підтверджується протягом 15 днів.

Серологічна ідентифікація.

ІФ.Аналогічна така при діагностиці аденовірусної інфекції. Цим методом АГ ВД виявляють у клітинах слизової оболонки прямої кишки, селезінки, легень та лімфовузлів експериментально заражених тварин. Вивчено розподіл АГ ВД-БС у тканинах тварин гострому та хронічному перебігах хвороби. У лімфоїдних тканинах АГ розташовується у клітинах системи фагоцитуючих мононуклеарів. Між початковим виявленням АГ у слизовій оболонці кишечнику, кератинізованому епітелії верхніх відділів травної системи та шкіри та прогресуванням патологічних ознак є прихований період.

ІФ біопсійного матеріалу слизових оболонок ротової та носової порожнин придатна для ранньої прижиттєвої діагностики вірусу діареї. ІФ виявлення АГ вірусу в клітинах з носоглоточных змивів - надійний і швидкий спосіб виявлення тварин, персистентно інфікованих вірусом. При дослідженні препаратів звертають увагу на свічення артеріальної гіпертензії в цитоплазмі не зруйнованих клітин. Яскрава зелена флюоресценція у вигляді гранул чи дифузного світіння цитоплазми щонайменше ніж 10% клітин дозволяє оцінити препарат як позитивний. Попередній діагноз ставлять за наявності щонайменше 30% позитивних препаратів від загальної кількості досліджених проб. Зручним виявився непрямий метод ІФ із використанням кон'югованих РаЬ-фрагментів АТ із гіперімунної свинячої сироватки проти ВД-БС ВРХ. Специфічна флюоресценція вірусного АГ у культурі бичачих макрофагів виявлялася у цитоплазмі клітин. Для ідентифікації цитопатогенних ізолятів метод ІФ практично єдиний. За наявності ЦПД у культурах клітин, заражених ізолятом, та позитивної флюоресценції проводять остаточне типування вірусу в РН.

РН.Це основний метод ідентифікації вірусу. Нові ізоляти збудника ВБ-БС, які не мають цитопатогенної активності, можуть бути ідентифіковані за допомогою гіперімунної сироватки до вірусу діареї щодо придушення феномену екзальтації вірусу НБ, який використовують для індикації подібних штамів.

РДП.Забезпечує швидку та точну постановку діагнозу, проте поки що чутливість методу невелика, і його слід використовувати в комплексі з іншими методами лабораторної діагностики та ідентифікації збудника. Приготування випробуваного АГ та методика постановки РДП описані раніше. Антисироватку для РДП готують на ВРХ. Для імунізації тварин використовують нітровану кров, взяту асептично від експериментально заражених тварин під час підйому температури. Кров вводять внутрішньовенно (деяким тваринам роблять кілька таких ін'єкцій). Кров беруть через 60-90 I днів після інокуляції.

Виявлення вірусу ПЛР.Цей метод рекомендований для швидкої діагностики ВД-БС. Після циклу зворотної транскрипції зразки тканини інфікованої культури клітин. ампліфікують з використанням праймерів, що забезпечують реплікацію певного сегмента гена білка gр48 ВД. Для виявлення ампліфікованих послідовностей використовують електрофорез у ПААГ та гібридизацію з біотинільованим, ДНК-зондом на послідовності геному вірусу лейкозу. При ідентифікації молочних стад, інфікованих вірусом ВД-БС ВРХ, також запропоновано метод ПЛР для роботи із пробами молока. Вірусну ДНК виділяють із соматичних клітин незбираного молока методом екстракції ізотіоціанатом гуанідину та фенолом-хлороформом. При гострій інфекції РНК вірусу виявлялася через 6-10 днів після зараження, а при хронічній - з використанням обох праймерів (5"-нетрансльована область (S"-НТ) і область р80) до розведення молока 1:640. ПЛР виявилася в 14,6 рази чутливішою за інші методи виділення вірусу. Для з'ясування РНК ВД методом ПЛР необхідно щонайменше 580 соматичних клітин, тоді як виділення вірусу - щонайменше 8500 клітин. Чутливість та специфічність ПЛР підтверджена гібридизацією за Соузереном . Чутливість методу перевищує чутливість виділення вірусу в культурі клітин у 102-104 рази. Показано можливість виявлення персистентної інфекції ВД-БС ВРХ методом ДНК-гібридизації та ПЛР.

Біотинільовані зонди комплементарної ДНК вже широко використовуються для виявлення пестивірусів (КНС, ВД-БС ВРХ та ПБО). У Бельгії розроблено метод виявлення специфічних АТ до ВД за допомогою ІФА, що проводиться з рекомбінантним АГ та монАТ. ІФА з монАТом зручний для виявлення віремії у тварин; з його допомогою в лейкоцитах виявляли 2 родинні неструктурні білки (р80К і р120-130К). Вірусний АГ був виявлений у В- та Т-лімфоцитах, моноцитах. Крім загальноприйнятого методу ІФА запропоновано імуноферментну реакцію захоплення АГ ВД ВРХ в лімфоцитах периферичної крові ВРХ. В реакції для захоплення АГ використовують монАТ до консервативного АГ домену неструктурного білка (р125/р80) ВД.

Крім ІФА розроблено та запропоновано метод взаємодії специфічної антисироватки з вірусним АГ ВД у лімфоцитах інфікованих тварин за допомогою проточної цитометрії. Метод відрізняється високою чутливістю та специфічністю. Для підвищення чутливості реакції лімфоцити фіксують, їх клітинні мембрани солюбілізують, і вірусний АГ виявляють при використанні біотинілованих Ig антисироватки свиней з подальшою інкубацією з ФІТЦем, кон'югованим авідином.

ІФА.ІФА дозволяє легко ідентифікувати культури клітин, інфіковані У Д. Ідентифікація за допомогою монАТ у практичному діагностичному застосуванні не розроблена. Однак отримано 5 монАТ (XI А9, АЕЗЕ2, АМ2G5, ВТ48, ВТ6G9) проти вірусу ВД-БС ВРХ з ВН-активністю, які дозволили розділити ізоляти ВД на 4 групи. Отримано та вивчено панель монАТ проти Singer-ізоляту, за допомогою якої були виявлені поліпептиди мол.м. 56-58 кД і доведено, що глікопротеїн, локалізується на поверхні віріонів і є носієм епітопів, що нейтралізують. Аналіз із панеллю монАТ показав АГ гетерогенність серед ізолятів цього вірусу.

Серодіагностика захворювання скрутна, тому що при хронічному перебігу інфекції АТ виявляються непостійно і бувають у невисоких титрах. Діагноз на минулу інфекцію, а також латентне номінація вірусу зазвичай ставлять за допомогою РН в культурі клітин, визначаючи титри АТ в сироватках реконвалесцентів. Для цього краще досліджувати парні сироватки, взяті з інтервалом 3-4 тижні. При діагностиці прихованого перебігу інфекції частіше використовують сироватки крові забійної худоби, що надходить із клінікою не діагностованої інфекції кишкового та респіраторного трактів. Зазвичай у разі відсоток позитивних сироваток (титри від 1:16 до 1:128) варіює у межах і може досягати 30-50 (іноді до 80). У клінічно здорових тварин відсоток позитивних спроб може коливатися від 6-8 до 20-30. Динаміка появи та згасання титрів ВНА недостатньо вивчена. Перед дослідженням сироватки прогрівають у водяній бані за температури 57-58°С 30 хв.

У США розроблено швидкий кількісний метод титрування ВД ВРХ. Він полягає в мікротитруванні з використанням цитопатогенних і не цитопатогенних ізолятів вірусу і лінії клітин, що перевивається, бичачої нирки - МДВК. Для цього серійні розведення вірус-містить рідини та суспензію клітин у концентрації 1-10 5 в середовищі з 2% сироватки крові коні заливають у лунки пластин Теrasaki і проводять мікротитрування в НІФ, яку враховують на дні лунок пластин, використовуючи водно-імерсійний об'єктив. Вірус також титрують і за бляшкоутворенням. Специфічну флюоресценцію у клітинах спостерігали вже через 12 годин після зараження, остаточні результати вважали через 72 години інкубування. Результати титрування вірусу по бляшках та в мікротитруванні збігалися. Мікротитрування вірусу ІФ має ряд переваг над стандартним методом титрування по бляшках: вимагає менше часу і матеріалів і особливо незамінне при титруванні не цитопатогенних ізолятів ВД.

РН.Її ставлять методом розведення випробуваних сироваток з постійною дозою стам дартного вірусу в культурі клітин ПЕК або ТБ. Позитивними вважають сироватки титром АТ 1:16 і вище, у парних сироватках - підвищення титру АТ у другій пробі у рази та більше. При експериментальному зараженні у всіх телят через 15-61 день виявляли ВНА у титрі 1:64 – 1:1024. Реакція, суть якої полягає у придушенні утворення бляшок АТ досліджуваної сироватки, виявилася придатною для серологічних досліджень при ВД-БС. Після одержання гомогенного шару клітин культуру промивають 1 раз фосфатним буферним розчином і заражають 15 мл суспензії вірусу в такому розведенні, щоб в 1 мл її містилося близько 20 БОЄ. Після адсорбції вірусу при 37°С протягом 30 хв сушію відсмоктують і наносять на культуру 15 мл агару. Після застигання агару на його поведін ності розкладають кружки фільтрувального паперу, насиченого нерозведеною сироваткою. Після 4 днів інкубації при 37°З враховують результати. Доказом того, що досліджувана сироватка містить АТ, є відсутність пошкодження шару клітин навколо насиченого нею кружечка фільтрувального паперу, що виявляється у вигляді вінок клітин.

РЗК.Ставлять мікрометод з використанням мікротитратора Такачі або Тітертека. За їх відсутності можлива постановка РЗК у пробірках у загальному обсязі 0,5 мл.

РДП.Не знайшла широкого застосування у ветеринарній діагностичній практиці при виявленні АТ у сироватках тварин. ПА з'являються порівняно пізні терміни (3-4 тижні) після інфікування і можуть зберігатися 4 міс (титри АТ до 1:16).

ЕLISА.У 500 разів чутливіше за РН, менш трудомісткий і швидше виконаємо. В якості АГ використовували вірус, концентрований ПЕГ і очищений градієнтною рівновазі ультрацентрифугуванням. Оптимальна концентрація артеріальної гіпертензії становила 1 мкг на лунку.

Диференційна діагностика. При постановці діагнозу на ВД-БС необхідно виключити ІРТ, аденовірусну інфекцію, ПГ-3, злоякісну катаральну лихоманку, ящур, паратуберкульозний ентед та ін. Через те, що ВД-БС може виявлятися в різних формах (від гострої до латентної), часто з такими інфекціями, як ПГ-3, аденоінфекція, хламідіози та ін., для остаточного діагнозу необхідні лабораторні дослідження. Лише в якості підозри на ВД-БС слід враховувати швидке поширення в стаді хвороби, що супроводжується лихоманкою, діареєю, ерозіями в ротовій порожнині та ранньою лейкопенією.

Лабораторна діагностика парагрипу -3 великої рогатої худоби

Парагрип-3 (ПГ-3) ВРХ (транспортна лихоманка ВРХ, параінфлюєнца-3) - гостра контагіозна вірусна хвороба, головним чином телят, що характеризується ураженням органів дихання.

В даний час ПГ-3 зареєстровано у всіх країнах світу з розвиненим тваринництвом.

Лабораторна діагностикавключає: а) виявлення АГ у патологічному матеріалі (мазках, відбитках, зрізах), отриманому від хворих тварин у РІФ; б) виділення збудника з патологічного матеріалу в культурі клітин нирки ембріона корови (ПЕК) або легких ембріона корови (ЛЕК) та його ідентифікацію в РТГА, РІФ та ін; в) виявлення АТ у сироватці крові хворих та перехворілих тварин (ретроспективна діагностика) у РТГА. Лабораторну діагностику ПГ-3 проводять із використанням набору діагностикумів, що випускається біологічною промисловістю. Її зазвичай ведуть паралельно з дослідженням матеріалу на аденовірусну та РС-інфекцію, ІРТ та ВД-БС ВРХ. Схема проведення досліджень на ПГ 3 аналогічна схемі діагностики аденовірусної інфекції ВРХ. Попередній діагно: на ПГ-3 ставлять протягом 2-3 днів на підставі позитивних результатів виявлення АГ у патологічному матеріалі в РІФ з урахуванням епізоотологічних та клінічних даних, а також патологоанатомічних змін, а остаточний - протягом 10-30 днів на підставі збігу результатів РІФ з виділенням та ідентифікацією вірусу. В даний час для швидкої індикації вірусу ПГ-3 може бути використана ПЛР; г) виявлення 4-кратного та більше приросту АТ у парних пробах сироваток.

Виділення вірусу. Зважаючи на малу стійкість парагрипозного вірусу випробуваний матеріал рекомендується поміщати в контейнери зі звичайним льодом, негайно доставляти в лабораторію і відразу використовувати для зараження культури клітин. Якщо зробити це неможливо, потрібно заморозити матеріал у суміші сухого льоду та спирту та зберігати при - 20-60°С до дослідження.

ВПГ-3 виділяють у первинних субкультурах клітин ПЕК, ЛЕК, ПТ, ТБ та ін, які готують за загальноприйнятою методикою. Для парагрипозних вірусів характерним є дифузний характер РГАд, яка проявляється раніше, ніж ЦПД вірусу.

Перші ЦПІ зараженої культури можна спостерігати іноді через 48 годин після інокуляції. Вони складаються в появі клітин, що округляються, сильніше заломлюють світло, надалі утворюється синцитій і дегенерація клітин. При негативному результаті першому пасажі проводять другий пасаж у тому виді культури клітин. Паралельно з пробірковими культурами її вирощують і на покривному склі для ІФ. Усього рекомендується не менше 4-х "сліпих" пасажів. Ізолят вважають виділеним, якщо він викликає стабільне однотипне ЦПД та позитивну ДАД. У цьому випадку можлива його ідентифікація у РТГАд, РН, РТГА та інших реакціях. Метод виділення вірусу на ембріонах менш чутливий, ніж зараження культур клітин та застосовується порівняно рідко.

Зараження природно-сприйнятливих тварин.Застосовують рідко внаслідок; дорожнечі та великі труднощі у підборі телят, сприйнятливих до ПГ-3, що не мають специфічних АТ. Заражати сприйнятливих тварин вірусом ПГ-3 краще нанесенням на слизову оболонку носової порожнини та трахеї. Від експериментально заражених телят вірус вдається виділити з ексудату носової порожнини під час підйому температури або з крові на 4-6-й день після інтраназального і на 2-й день після внутрішньовенного зараження. З носовим закінченням вірус зазвичай виділяється з 2-го до 10-го дня.

Індикація та вірусу. У клітинах НеLа та КВ вірус розмножується менш активно, ніж у клітинах нирки теляти. У культурі цих клітин, а також клітини нирки мавпи, крім синцитію, вірус викликає утворення цитоплазматичних, а іноді внутрішньоядерних включень. Їх знаходять і в епітеліальних клітинах бронхів та бронхіол.

Для прискореної індикації вірусів ІРТ, ПГ-3 стафілококи обробляють імунною сироваткою. Готують мазок, на який наносять досліджуваний матеріал, що містить вірус, обробляють його імунною противірусною сироваткою і вірусспецифічним імуноглобуліном, міченим ФИТЦем. По специфічному світінню поверхні стафілокока здійснюють індикацію вірусу. З використанням прискореного методу індикації час індикації скорочується до 3-4 год.

Серологічна ідентифікація

РІФ.В основному артеріальна гіпертензія локалізується в цитоплазмі клітин, проте в ранні терміни інфікування одночасно спостерігається свічення ядерців. Парагрипозний АГ виявляють у перші дні хвороби і до 10-14 днів. При ускладнених формах хвороби АГ виявляють триваліший час. У деяких випадках його вдається виявити навіть під час інкубаційного періоду за 1-2 дні до появи клінічних симптомів. Специфіка ІФ становить 94% у порівнянні з результатами серологічного дослідження. Існує однозначна думка про більшу чутливість ІФ порівняно з РДАд при індикації парагрипозних вірусів, що робить її перспективною для швидкої діагностики.

РТГАд.Є швидким методом ідентифікації виділеного вірусу. Для цього використовують імунні сироватки кроликів чи морських свинок. РТГАд ставлять загальноприйнятим способом з еритроцитами морської свинки. Досліджуваний вірус вважають ідентифікованим, якщо імунна сироватка ПГ-3 блокує гемадсорбцію.

РНГАд.Використовують 100 ГАд одиниць вірусу. За реакцією гемадсорбції вірус ПГ-3 можна титрувати в культурі тканини, використовуючи для зараження культури послідовні 10-кратні розведення. Після 3 днів інкубації ставлять РГАд із вмістом усіх пробірок і реєструють наявність гемадсорбції. За одну ГАд одиницю приймають кінцеве розведення вірусу, що спричинив гемадсорбцію. Позитивна РГАд у контрольних пробірках, відсутність реакції у пробірках із сумішшю вірусу та сироватки свідчить про ідентичність виділеного вірусу даного типу сироватки.

РТГА.Застосовується для типування виділеного вірусу за наявності в рідкій фракції заражених культур клітин гемаглютиніну в титрі, достатньому для вибору 4 ГАЄ. Слід мати на увазі, що вірус парагрипу, вирощений у культурі клітин нирки ВРХ, аглютинує еритроцити гусей, індиків та морських свинок, на відміну від еритроцитів курей та качок. Аглютинація розвивається в наступні терміни: еритроцити гусей за - 1-3 хв, індика - за 2-5, морської свинки - за 60-90 хв. Найбільш високі та стабільні титри виявляються з еритроцитами індика та при значеннях рН: еритроцити гусей при 5,7; індика 5,7-7,2; морської свинки 6,8-7,2. Імунні сироватки, які використовуються в РТГА, повинні бути звільнені від термолабільних та термостабільних інгібіторів, для цього сироватки прогрівають при 56°С 30 хв і обробляють каоліном або фільтратом вібріона холерного. РТГА ставлять загальноприйнятим способом.

Імуноферментна ідентифікація.Співробітниками ВНІТІБП розроблено методику ідентифікації вірусу ПГ-3 в ЕLISА.

Імунодифузія (ІД) може бути успішно використана для діагностики ПГ-3 інфекції. В ВД виявлено 2 лінії преципітації, що відповідає 2-му АГ ПГ-3.

Серодіагностика та ретроспективна діагностика.При серологічній діагностиці ПГ-3 ВРХ досліджують парні сироватки телят чи дорослих тварин виявлення приросту АТ. Інтервал між взяттям проб 2-3 тижні. РДА, РН, РЗГАд та РСК дають загалом ідентичні результати при дослідженні АТ у період розвитку хвороби та реконвалесценції. Однак РТГА найчутливіша і найпростіша. Крім дослідження парних сироваток крові, при серодіагностиці ПГ-3 рекомендується метод виявлення секреторних АТ у РТГА. Для цього беруть парні проби носових секретів від 8-10 тварин, що виявили клінічні ознаки хвороби (підвищення температури, витікання з носової порожнини та ін), і повторюють дослідження через 6-8 днів.

Перед постановкою РТГА проби розморожують, центрифугують 10 хв при 2 000 хв- 1 потім обробляють наступним чином: до 0,2 мл надосадової рідини додають 0,2 мл 20%-ної суспензії еритроцитів морської свинки, струшують, витримують 30 хв З 10 хв центрифугують при 1500 хв- 1 ; надосадову рідину в об'ємі 0,3 мл змішують з 25%-ною суспензією каоліну на фізіологічному розчині, струшують 25 хв, центрифугують 15 хв при 2000 хв- 1 . Після цього надосадову рідину використовують у РТГА.

Позитивний результат дослідження на ПГ-3 вважають у разі виявлення АТ у 2-й пробі носових секретів у титрі 1:16 і вище (за відсутності титрів АТ у 1-й пробі) або встановлення 4-кратного та більше збільшення титру АТ у 2- й пробі носових секретів порівняно з 1-ою.

При позитивній РНГАд у контролю вірусу (пробірки з культурою клітин, куди було внесено вірус у робочому розведенні з рівним обсягом живильного середовища), враховують її відсутність у пробірках, куди була залита суміш того чи іншого розведення сироватки та вірусу. Діагностичним є не менш ніж 4-кратний приріст нейтралізуючих гемадсорбцію АТ у реконвалесцентній сироватці порівняно із сироваткою, взятою на початку хвороби. РСК не знайшла широкого застосування у ветеринарній діагностичній практиці.

Максимального терміну виявлення АТ у сироватках крові телят після інфікування вірусом ПГ-3 точно не встановлено. Ряд дослідників вважають, що АТ зберігаються протягом 4-6 місяців. Рівень освіти ВНА та анти-ГА досягав піку 1:320 та вище до 14-21 дня після зараження. ЕLISА широко використовується за кордоном для індикації та титрування АТ. Він у 4 – 64 рази чутливіший, ніж РТГА.

Диференційна діагностика.При постановці діагнозу на ПГ-3 необхідно виключити ІРТ, ВД-БС, адено- та РС-інфекції, що мають дуже подібні епізоотологічні, клінічні та патологоанатомічні дані. Тому матеріал, що надійшов з підозрою на ПГ-3, в лабораторії досліджують паралельно на вищевказані інфекції.

Лабораторна діагностика лейкозу

Лейкоз ВРХ - хронічна інфекційна хвороба пухлинної природи, основна ознака якої - злоякісне розростання клітин кровотворних органів з порушенням їхнього дозрівання, внаслідок чого відбувається дифузна інфільтрація органів цими клітинами або з'являються пухлини.

Лейкози тварин діагностують майже у всіх країнах світу. Найбільш широко вони поширені у США, низці країн центральної Європи, Данії, Швеції та країнах Близького Сходу.

У нашій країні виникнення лейкозу пов'язані з завезенням племінної худоби 1940, 1945 – 1947 гг. з Німеччини до господарств Західного Сибіру, ​​Московської, Ленінградської, Калінінградської областей, а також України, Латвії та Литви. Надалі лейкоз поширився на Таджикистан, Псковську, Новгородську області.

У природних умовах ВЛКРС поширений серед ВРХ, овець, зебу та буйволів.

Вірус лейкозу ВРХ (ВЛКРС) відноситься до сімейства Retroviridae, роду ретровірусів лейкозу ВРХ та Т-клітинного лейкозу людини. ВЛКРС має виражену антигенну активність і індукує синтез ВНА і КСА. ГА якості. ВЛКРС аглютинує тільки еритроцити мишей

Діагноз на лейкоз ставлять на підставі епізоотологічних даних, клінічних ознак, патологоанатомічних змін та результатів лабораторних досліджень, які включають гематологічні та гістологічні та серологічні дослідження.

Основні характеристики деяких ретровірусів

Усі форми лейкозу характеризуються збільшенням різною мірою лімфовузлів. При лімфолейкозі вони збільшені рівномірно, не зрощені з навколишніми тканинами, капсула знімається легко, на розрізі вузли сіро-білого кольору, соковиті та салоподібні. Лімфовузли при лімфогранулематозі, лімфосаркомі та гістіоцитарній саркомі бугристі, капсула зрощена з паренхімою, на розрізі часто виявляють крововиливи та некрози; в органах черевної, тазової порожнин, на серозних оболонках відзначають пухлинні розростання вузлів у вигляді конгломератів сіро-білого, жовто-сірого кольору. Селезінка при лімфоїдному та мієлоїдному лейкозах збільшена. За перших 2-х форм вона буро-червоного кольору з чітко вираженою червоною і білою пульпою за рахунок гіперплазії фолікулів. У пізнішій стадії хвороби межа між білою та червоною пульпою стерта. При мієлоїдному лейкозі селезінка червоно-малинового кольору фолікули погано помітні, а в окремих ділянках відсутні тканина пухкої консистенції з крововиливами. При лімфоретикулосаркомі селезінка не збільшена. При всіх формах лейкозу відзначають осередкові або дифузні розростання сіро-білого або сіро-рожевого кольору в печінці, нирках, товщі серцевого м'яза, органах травлення, матці, скелетних м'язах, діафрагмі та інших органах.

Взяття та підготовка матеріалу. Для гематологічного дослідження кров беруть з часової вени в пробірки з антикоагулянтом - 10% розчином динатрієвої солі етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА, трилон Б) з розрахунку 0,02 мл розчину на 1 мл крові. Не дозволяється брати кров від тварин за 15 днів до отелення та 15 днів після нього. Для серологічного дослідження кров беруть від тварин віком 6 місяців і старше. У лабораторію термосі з льодом направляють 5-6 мл сироватки. Для гістологічного дослідження шматочки уражених органів (селезінки, лімфовузлів, грудної кістки, печінки, нирок, легенів, серця та правого вушка серцевого м'яза, стінки сичуга, матки та скелетних м'язів) посилають у свіжому вигляді в термосі з льодом або в 10%-ному р. -Ре формаліну.

ГОСТ 26075-2013

МІЖДЕРЖАВНИЙ СТАНДАРТ

ТВАРИННІ

Методи лабораторної діагностики сказу

Animals. Methods of Laboratory Diagnostic of Rabies

Дата введення 2015-01-01

Передмова

Цілі, основні принципи та основний порядок проведення робіт з міждержавної стандартизації встановлено ГОСТ 1.0-92 "Міждержавна система стандартизації. Основні положення" та ГОСТ 1.2-2009 "Міждержавна система стандартизації. Стандарти міждержавні, правила та рекомендації щодо міждержавної розробки, Правила, міждержавної стандартизації. застосування, оновлення та скасування"

Відомості про стандарт

1 РОЗРОБЛЕН Федеральною державною бюджетною установою "Всеросійський державний Центр якості та стандартизації лікарських засобів для тварин і кормів" (ФДБУ "ВДНКІ")

2 ВНЕСЕН Федеральним агентством з технічного регулювання та метрології Російської Федерації

3 ПРИЙНЯТЬ Міждержавною радою зі стандартизації, метрології та сертифікації (протокол від 27 червня 2013 р. N 57-П)

За ухвалення проголосували:

4 Наказом Федерального агентства з технічного регулювання та метрології від 30 вересня 2013 р. N 1127-ст міждержавний стандарт ГОСТ 26075-2013 введено в дію як національний стандарт Російської Федерації з 1 січня 2015 року

5 ВЗАМІН ГОСТ 26075-84


Інформація про зміни до цього стандарту публікується в інформаційному покажчику "Національні стандарти", що щорічно видається, а текст змін і поправок - у щомісячно видається інформаційному покажчику "Національні стандарти". У разі перегляду (заміни) або скасування цього стандарту відповідне повідомлення буде опубліковане у щомісячному інформаційному покажчику "Національні стандарти". Відповідна інформація, повідомлення та тексти розміщуються також в інформаційній системі загального користування - на офіційному сайті Федерального агентства з технічного регулювання та метрології в мережі Інтернет

1 Область застосування

1 Область застосування

Цей стандарт поширюється на всі види ссавців і встановлює такі методи лабораторної діагностики сказу:

- метод флуоресціюючих антитіл (МФА);

- метод виділення вірусу сказу в культурі клітин мишачої нейробластоми CCL-131 (або невриноми Гассерова вузла щура – ​​НГУК-1);

- біопроба на білих мишах;

- метод імуноферментного аналізу (ІФА);

- Реакція дифузійної преципітації (РДП).

Примітки

1 Дані методи застосовуються до всіх представників роду Lyssavirus.

2 Вуличний вірус сказу відноситься до мікроорганізмів 2 класу патогенності (представляє смертельну небезпеку для людини та тварин).

3 За необхідності генотипування вірусу сказу за допомогою готових тест-систем застосовують метод назад транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції (від ПЛР).

2 Нормативні посилання

У цьому стандарті використано нормативні посилання на такі стандарти:

ГОСТ ІСО/МЕК 17025-2009 Загальні вимоги до компетентності випробувальних та калібрувальних лабораторій

ГОСТ 12.0.004-90 Система стандартів безпеки праці. Організація навчання безпеки праці. загальні положення

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартів безпеки праці. Загальні санітарно-гігієнічні вимоги до повітря робочої зони

ГОСТ 12.1.008-76 Система стандартів безпеки праці. Біологічна безпека. Загальні вимоги

ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартів безпеки праці. Засоби захисту працюючих. Загальні вимоги та класифікація

ГОСТ 17.0.0.01-76 Система стандартів у галузі охорони природи та покращення використання природних ресурсів. Основні положення

ГОСТ 177-88 Водню перекис. Технічні умови

ГОСТ 2603-79 Реактиви. Ацетон. Технічні умови

ГОСТ 2768-84 Ацетон технічний. Технічні умови

ГОСТ 4204-77 Реактиви. Кислота сірчана. Технічні умови

ГОСТ 6709-72 Вода дистильована. Технічні умови.

ГОСТ ISO 7218-2011 Мікробіологія харчових продуктів та кормів для тварин. Загальні вимоги та рекомендації щодо мікробіологічних досліджень

ГОСТ 8074-82 Мікроскопи інструментальні. Типи, основні параметри та розміри. Технічні вимоги.

ГОСТ 9147-80 Посуд та обладнання лабораторні фарфорові. Технічні умови

ГОСТ 9284-75 Скло предметне для мікропрепаратів. Технічні умови

ГОСТ 12026-76 Папір фільтрувальний лабораторний. Технічні умови

ГОСТ 13739-78 Олія імерсійна для мікроскопії. Технічні вимоги. Методи випробувань

ГОСТ 16317-87 Холодильні прилади електричні побутові. Загальні технічні умови

ДЕРЖСТАНДАРТ 21241-89 Пінцети медичні. Загальні технічні умови

ГОСТ 22967-90 Шприци медичні ін'єкційні багаторазового застосування. Загальні технічні вимоги та методи випробувань

ГОСТ 24861-91 (ІСО 7886-84) Шприци ін'єкційні одноразового застосування

ГОСТ 25046-81 (ІСО 7864-81) Голки ін'єкційні одноразового застосування. Основні розміри. Технічні вимоги. Методи випробувань

ГОСТ 25336-82 Посуд та обладнання лабораторні скляні. Типи, основні параметри та розміри

ГОСТ 29230-91 (ІСО 835-4-81) Посуд лабораторний скляний. Піпетки градуйовані. Частина 4. Піпетки видувні

Примітка - При користуванні цим стандартом доцільно перевірити дію стандартів посилань в інформаційній системі загального користування - на офіційному сайті Федерального агентства з технічного регулювання та метрології в мережі Інтернет або за щорічним інформаційним покажчиком "Національні стандарти", який опублікований станом на 1 січня поточного року та за випусками щомісячного інформаційного покажчика "Національні стандарти" за поточний рік. Якщо стандарт посилається (змінений), то при користуванні цим стандартом слід керуватися замінним (зміненим) стандартом. Якщо стандарт зв'язку скасовано без заміни, то положення, в якому дано посилання на нього, застосовується в частині, що не зачіпає це посилання.

3 Терміни, визначення та скорочення

3.1 У цьому стандарті застосовані такі терміни з відповідними визначеннями:

3.1.1 сказ:Інфекційне захворювання людини та тварин, що викликається представниками сімейства Rhabdoviridaeроду Lyssavirus(рабдовірус), що призводить до летального результату в 100% випадків.

3.1.2 вірус сказу:Збудник інфекційного захворювання людини та тварин.

3.1.3 антиген вірусу сказу:Поверхневі білкові структури вірусу сказу, на які виробляються антитіла.

3.1.2* метод флуоресціюючих антитіл (МФА):Метод виявлення антигену вірусу сказу міченими флуоресцеїнізотиоціанатом антирабічними антитілами, з утворенням характерних світящих комплексів-включень, що виявляються в полі зору люмінесцентного мікроскопа.
________________

3.1.3 Метод виділення вірусу сказу в культурі клітин мишачої нейробластоми CCL-131 (або невриноми Гассерова вузла щура - НГУК-1): Метод виділення антигену вірусу сказу, заснований на розмноженні вірусу в культурі клітин та його ідентифікації методом флуоресціюючих антитіл.

3.1.3* біопроба:Метод виділення вірусу сказу на білих мишах шляхом введення ним суспензії патологічного матеріалу з подальшою ідентифікацією вірусу методом флуоресціюючих антитіл.
________________
* Нумерація відповідає оригіналу. - Примітка виробника бази даних.

3.1.4 метод імуноферментного аналізу (ІФА):Метод виявлення антигену вірусу сказу, заснований на його специфічній взаємодії з антирабічним антитілом, іммобілізованому на твердому носії, з подальшим виявленням антигену, що зв'язався, за допомогою другого міченого ферментом антитіла шляхом фарбування продукту реакції хромогеном.

3.1.5 реакція дифузійної преципітації (РДП):Метод виявлення вірусу сказу, заснований на здатності антитіл і вірусного антигену сказу дифундувати в агаровому гелі і при специфічній взаємодії утворювати комплекс "антиген-антитіло", що спостерігається неозброєним оком у вигляді лінії преципітації.

3.1.6 метод назад транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції (від-ПЛР):Метод виявлення геному вірусу сказу шляхом перекладу специфічної послідовності РНК вірусу в ДНК з подальшим багаторазовим копіюванням отриманої ДНК та виявленням продуктів реакції, що здійснюється in vitro.

3.2 У цьому стандарті застосовані такі скорочення:

ФАГ - флуоресцентний антирабічний імуноглобулін;

АнГ – антирабічний глобулін;

КФГ - контрольний флуоресцентний глобулін;

ФБР – фосфатно-буферний розчин;

НГУК-1 – невринома Гассерова вузла щура;

ФІТЦ - флуоресцеїнізотіоцинат;

РНК – рибонуклеїнова кислота;

ДНК – дезоксирибонуклеїнова кислота;

CCL-131 - культура клітин мишачої нейробластоми;

ОФД – ортофенілдіамін;

ТМБ – тетраметилбензидин.

4 Умови виконання досліджень та вимоги безпеки

4.1 Умови виконання досліджень

4.1.1 Загальні вимоги проведення мікробіологічного аналізу та роботи з мікроорганізмами І-ІІ груп патогенності – за ГОСТом ISO 7218 .

4.1.2 Загальні вимоги до приміщень згідно з ГОСТом ISO 7218 .

4.1.3 Вимоги до персоналу - за ГОСТом ISO 7218, ГОСТ ІСО/МЕК 17025, .

До проведення досліджень допускаються кваліфіковані співробітники, які мають досвід роботи з мікроорганізмами І-ІІ груп патогенності, що вивчили методики мікробіологічних робіт, вакциновані проти сказу.

4.2 Вимоги безпеки

4.2.1 Загальні вимоги безпеки під час проведення робіт згідно з ГОСТ 12.1.008.

4.2.2 Засоби захисту працюючих повинні відповідати вимогам ГОСТ 12.4.011.

4.2.3 Повітря робочої зони повинне відповідати вимогам ГОСТ 12.1.005.

4.2.4 Навчання персоналу безпеки праці відповідно до ГОСТ 12.0.004.

4.2.5 Утилізацію отриманого для дослідження матеріалу, а також використаних індивідуальних засобів захисту, інструментів тощо. проводять шляхом кип'ятіння протягом 30 хв або автоклавування протягом 15 хв при тиску (0,11±0,20) МПа.

5 Засоби вимірювань, обладнання, матеріали, реактиви та тварини

5.1 Для проведення досліджень використовують:

- спектрофотометр скануючий із спектральним діапазоном вимірювання довжин хвиль від 190 до 1100 нм з похибкою не більше ±0,5 нм та діапазоном вимірювання оптичної щільності (ОП) від 0,1 до 3,0;

- планшети для імунологічних реакцій 96-лункові;

- термостат, що забезпечує підтримання температури від 20 до 50 °С;

- Холодильник побутовий, що забезпечує підтримання температури від 0 ° С до 10 ° С за ГОСТ 16317;

- центрифугу лабораторну;

- лазню водяну;

- мікроскоп люмінесцентний інвертований за ГОСТ 8074;

- ступки порцелянові з маточкою за ГОСТ 9147 або гомогенізатор за ГОСТ ІСО/МЕК 17025;

- скла предметні за ГОСТ 9284;

- пробірки скляні за ГОСТ 25336;

- чашки Петрі за ГОСТ 25336;

- кювету за ГОСТ 25336;

- піпетки місткістю 1,0; 2,0 і 10,0 см за ГОСТ 29230;

- піпетки автоматичні місткістю від 0,05 до 0,20 см із наконечниками;

- пінцети медичні за ГОСТ 21241;

- шприци інсулінові місткістю 1,0 см за ГОСТ 22967 або ГОСТ 24861;

- голки ін'єкційні за ГОСТ 25046;

- скло культуральне на вісім лунок;

- Клітини для утримання мишей;

- ацетон за ГОСТ 2603 або ГОСТ 2768;

- флуоресцентний антирабічний імуноглобулін (ФАГ);

- антирабічний глобулін (АнГ);

- контрольний флуоресцентний глобулін (КФГ);

- олія нефлуоресціююча імерсійна за ГОСТ 13739;

- воду дистильовану за ГОСТ 6709;

- розчин фосфатно-буферної молярної концентрації 0,01 моль/дм (ФБР), рН 7,2-7,4;

- розчин натрію хлориду стерильний 0,9%-ний ізотонічний;

- культуру клітин мишачої нейробластоми CCL-131 або невриноми Гассерова вузла щура – ​​НГУК-1;

- пеніцилін;

- стрептоміцин;

- середовище Голка МЕМ з подвійним набором амінокислот та вітамінів (ДМЕМ), рН 7,2;

- Розчин трипсину 0,25%-ний;

- сироватку ембріональної крові великої рогатої худоби для культур клітин 10%-ву;

- Глютамін 3%-ний:

- перекис водню 3%-ну за ГОСТ 177;

- Набір препаратів для лабораторної діагностики сказу тварин методом ІФА;

- розчин сірчаної кислоти молярної концентрації 2 моль/дм за ГОСТ 4204;

- папір фільтрувальний за ГОСТ 12026;

- штамп для приготування лунок;

- мертіолят;

- агар "Діфко" або аналогічний;

- розчин метилового помаранчевого 1%-ний в 50%-му етиловому спирті;

- антигени позитивний та негативний;

- Сироватку антирабічну або імуноглобулін;

- мишей білих клінічно здорових масою 6-8 р.

5.2 Допускається застосування інших засобів вимірювань з метрологічними характеристиками та обладнання з технічними характеристиками не гірше, а також реактивів та матеріалів за якістю не нижче зазначених вище. Допускається використання одноразового посуду.

6 Відбір проб

6.1 Для проведення досліджень на наявність вірусу сказу в лабораторію направляють патологічний матеріал - свіжий труп або голову дрібних тварин, голову або мозок великих тварин.

6.2 Відібраний для досліджень патологічний матеріал упаковують у вологонепроникну тару та доставляють у лабораторію у металевих контейнерах. Заморожений матеріал поміщають у кріоконтейнер.

6.3 Патологічний матеріал супроводжують документом, що містить такі дані: найменування та адресу відправника, вид тварини, анамнестичні та клініко-епізоотологічні дані.

6.4 Лабораторні дослідження проводять відразу при отриманні патологічного матеріалу.

6.5 Для дослідження відбирають від великих тварин шматочки тканини з кожного відділу головного мозку (амонові роги, мозок, кору великих півкуль, довгастий мозок) розміром 0,5-1,0 см, мозок дрібних тварин, наприклад мишей, досліджують цілком.

Для дослідження МФА та методом виділення вірусу сказу в культурі клітин мишачої нейробластоми CCL-131 (або НГУК-1) придатні лише свіжі чи свіжозаморожені проби тканини головного мозку. Не допускаються для досліджень проби мозку тварин, що розкладаються (у стадії загнивання), консервовані гліцерином, фіксовані метиловим спиртом, формаліном або іншими засобами, що сприяють виникненню неспецифічної флуоресценції.

Для постановки біопроби допускається використовувати проби мозку, консервовані в 30%-50% розчині гліцерину. Використання інших консервантів не допускається. Для безпеки патологічний матеріал може бути заморожений при температурі не вище мінус 10 °С.

7 Метод флуоресціюючих антитіл (МФА)

7.1 Сутність методу

Сутність методу флуоресціюючих антитіл полягає в специфічній взаємодії флуоресціюючих антирабічних антитіл з гомологічним антигеном вірусу сказу. Комплекс "антиген-антитіло", що утворюється при цьому, мічений ФІТЦ, виявляється візуально по характерному світінню в полі зору при розгляді під люмінесцентним мікроскопом.

7.2 Підготовка до дослідження

7.2.1 Підготовка проб

7.2.1.1 З шматочків тканини, відібраних по 6.5, готують не менше трьох препаратів (відбитків або мазків) з кожного відділу мозку на ретельно знежирених предметних шибках. Якщо стан патологічного матеріалу дозволяє, то готують відбитки, у решті випадків роблять мазки.

7.2.1.2 Приготування відбитків

Шматочки тканини, відібрані по 6.5, кладуть на фільтрувальний папір, складений у чотири-шість шарів. Мозок дрібних тварин розрізають упоперек, захоплюючи всі його відділи, і кладуть його пінцетом зрізом вгору на фільтрувальний папір, складений у чотири-шість шарів. До поверхні зрізу торкаються предметного скла, злегка натискаючи його до отримання на склі тонкого відбитка.

7.2.1.3 Приготування мазків

Шматок тканини з кожного відділу мозку (у дрібних тварин весь мозок цілком), відібраний по 6.5, розтирають у фарфоровій ступці маточкою до утворення гомогенної маси, з якої роблять мазки на предметних стеклах.

7.2.1.4 Для контролю роблять мазки або відбитки з мозку здорових, не хворих на сказ і не вакцинованих проти сказу, білих мишей, як описано в 7.3.1.2 та 7.3.1.3.

7.2.1.5 Після приготування мазки або відбитки висушують на повітрі протягом 20-30 хв, фіксують в охолодженому ацетоні при температурі 4 °С протягом 4-12 год або при температурі мінус 20 °С протягом 1 год, після чого витягають з ацетону та висушують на повітрі протягом 10-15 хв.

7.2.2 Підготовка реактивів

ФАГ, АнГ та КФГ розчиняють дистильованою водою до зазначеного на етикетці ампули початкового об'єму. Термін зберігання розчинених ФАГ, АнГ та КФГ при температурі (5±2) °С – не більше двох тижнів.

Безпосередньо для дослідження необхідну кількість розчинених ФАГ, АнГ та КФГ розводять ФБР до робочого розведення, вказаного на етикетці ампули. Робочі розведення розчинених ФАГ, АнГ та КФГ використовують у день приготування.

7.3 Проведення дослідження

Предметне скло з препаратами (мазками або відбитками) по 7.2.1 поміщають у вологу камеру (чашку Петрі або кювету з зволоженим дном). Потім на один із трьох приготовлених препаратів наносять ФАГ у робочому розведенні рівномірно на всю поверхню мазка або відбитка за допомогою піпетки. На другий препарат наносять робоче розведення КФГ. Закривають камеру з препаратами, поміщають до термостату при температурі (37±1) °С і витримують протягом 30 хв. Паралельно фарбують контрольні препарати. Після закінчення фарбування препарати триразово промивають, занурюючи їх щоразу на 10 хв у посудину з ФБР, обполіскують дистильованою водою і висушують повітря протягом 20-30 хв.

На третій препарат наносять робоче розведення АнГ, поміщають у термостат при температурі (37±1)°З витримують протягом 30 хв. Потім препарат триразово промивають, занурюючи щоразу на 10 хв у посудину з ФБР, обполіскують дистильованою водою, висушують на повітрі протягом 20-30 хв і фарбують робочим розведенням ФАГ, як описано вище.

7.4 Обробка результатів

У забарвлених препаратах не уражена вірусом сказу мозкова тканина світиться тьмяним, сірувато-жовтим кольором.

Антиген вірусу сказу виявляється в нейронах і поза клітинами у вигляді яскравих зелених гранул різної форми і величини - від ледь помітних до розмірів, що мають, в діаметрі 15-20 мкм. Іноді відзначається велика кількість дрібних яскравих зелених частинок (розміром до 1 мкм) округлої та овальної форми.

Діагноз сказ вважається встановленим, якщо в кількох полях зору мікроскопа в досліджуваному препараті виявляють типові жовтувато-зелені гранули. При цьому в контрольних препаратах (у мазках або відбитках з мозку здорових білих мишей, що не хворіли на сказ, пофарбованих ФАГ), а також у досліджуваних препаратах, пофарбованих КФГ і попередньо оброблених АнГ і пофарбованих ФАГ, подібних утворень бути не повинно.

Про результати дослідження повідомляють компетентні органи відповідно до порядку, що діє на території держави, яка прийняла стандарт.

У разі негативного результату проводять дослідження з 8 або 9.

8 Метод виділення вірусу сказу в культурі клітин мишачої нейробластоми CCL-131 (або невриноми Гассерова вузла щура - НГУК-1)

8.1 Сутність методу

Сутність методу полягає у виділенні вірусу сказу в культурі клітин мишачої нейробластоми CCL31 або НГУК-1 з подальшою його ідентифікацією методом флуоресціюючих антитіл.

Метод є альтернативним біопробі на білих мишах по 9.

8.2 Підготовка до дослідження

8.2.1 Підготовка проб

Рівні частини тканини, стерильно відібрані з кожної ділянки головного мозку дрібної тварини (амонові роги, мозок, кора великих півкуль, довгастий мозок), або шматочки тканини з кожного відділу головного мозку великої тварини, відібрані по 6.5, подрібнюють ножицями і розтирають у ступці , поступово додаючи стерильний 0,9%-ний ізотонічний розчин натрію хлориду до отримання 10% суспензії. У суспензію мозку додають пеніцилін та стрептоміцин по 100 ОД/см та 1 мг/см відповідно.

Отриману суспензію ретельно перемішують і центрифугують протягом 5-10 хв при швидкості 2000 об/хв. Надосадову рідину переносять у стерильну пробірку і зберігають при температурі не вище 4 ° С до використання.

8.2.2 Підготовка культурального скла

Добову культуру клітин мишачої нейробластоми CCL-131 (або НГУК-1) знімають з культурального флакона за допомогою 0,25%-ного розчину трипсину і розводять середовищем ДМЕМ з 10%-ною ембріональною сироваткою крові великої рогатої худоби і 3%-ним глютаміном концентрації 210 клітин/див. У лунки культурального скла вносять по 0,1 см отриманої суспензії клітин, накривають кришкою і поміщають у вологий інкубатор з вмістом 5% при температурі (37±1) °С на 18-20 год.

8.3 Проведення дослідження

У дві лунки культурального скла 8.2.2 вносять по 0,05 см суспензії з кожного відділу головного мозку. На кожному склі залишають дві лунки для позитивного та негативного контролю. Як позитивний контроль використовують суспензію мозку миші, зараженої вірусом сказу - штамом CVS. Як негативний контроль вносять суспензію мозку клінічно здорової миші. Культуральне скло поміщають у вологий інкубатор із вмістом 5% при температурі (37±1) °С на 42-48 год.

Після закінчення інкубації за допомогою автоматичної піпетки з лунок культурального скла видаляють середовище, промивають один раз клітини ФБР (за допомогою автоматичної піпетки вносять по 0,2 см розчину в кожну лунку) і підсушують в ламінарному потоці повітря протягом 20-30 хв. Потім кожну лунку вносять по 0,1 см охолодженого до температури мінус 20 ° С ацетону і залишають при кімнатній температурі на 30 хв.

Після фіксації клітин культуральне скло перевертають та струшують для видалення ацетону, а потім висушують у ламінарному потоці повітря протягом 20-30 хв. За допомогою скальпеля та пінцета видаляють пластикову насадку та підсушують скло ще протягом 5-10 хв. У кожну лунку додають по 0,05-0,10 см ФАГ у робочому розведенні (підбирають дослідним шляхом), приготованому у ФБР, поміщають у вологу чашку Петрі та інкубують при температурі (37±1) °С протягом 30 хв.

Після закінчення фарбування скла триразово промивають, занурюючи їх щоразу на 10 хв у посудину з ФБР. Потім препарати обполіскують дистильованою водою та висушують на повітрі протягом 20-30 хв.

На пофарбовані препарати наносять нефлуоресціюючу іммерсійну олію та переглядають у люмінесцентному мікроскопі.

8.4 Обробка результатів

У забарвлених препаратах не уражена вірусом сказу культура клітин світиться тьмяним, сірувато-жовтим кольором (негативний контроль). Антиген вірусу сказу виявляється у цитоплазмі культури клітин у вигляді яскравих зелених гранул різної форми та величини з чіткими окресленими краями (позитивний контроль).

Діагноз на сказ вважається встановленим, якщо у кількох полях зору мікроскопа в досліджуваному препараті виявляють типові жовто-зелені гранули.

Якщо культурі клітин вірус сказу не виявлено, то ставиться негативний діагноз.

Результати виділення вірусу сказу у культурі клітин остаточні, подальші дослідження не проводять.

9 Біопроба на білих мишах

9.1 Сутність методу

Сутність методу полягає у виділенні вірусу сказу шляхом інтрацеребрального введення патологічного матеріалу білим мишам з подальшою ідентифікацією вірусу методом флуоресціюючих антитіл по 7.

9.2 Підготовка проб до дослідження – по 8.2.1.

9.3 Проведення дослідження

П'ять-шість білих мишей заражають 10%-ною суспензією патологічного матеріалу інтрацеребрально в обсязі 0,02-0,03 см. матеріалу. Спостереження за тваринами проводять щонайменше 30 днів. Кількість здорових, хворих та загиблих мишей реєструють у журналі.

9.4 Обробка результатів

При оцінці результатів враховують наявність клінічних ознак у заражених мишей (оскушеність вовни, поїдання корму, порушення координації руху, паралічі, тремор, прострація). Загибель мишей у перші дві доби після зараження не враховують. Проби мозку від хворих та загиблих тварин, починаючи з третьої доби, досліджують МФА по 7.

Біопробу вважають позитивною, якщо, починаючи з третьої доби після зараження, захворіла і загинула хоча б одна миша і в пробі мозку за допомогою МФА виявлено специфічні включення вірусу сказу.

Негативний діагноз може бути дано тільки через 30 діб спостереження за умови, що всі заражені тварини залишаться живими і здоровими.

Результати біопроби вважаються остаточними, подальші дослідження не проводять.

10 Метод імуноферментного аналізу (ІФА)

10.1 Сутність методу

В основі ІФА лежить специфічна взаємодія антигену вірусу сказу з антитілом, іммобілізованим на твердому носії. Пов'язаний антиген виявляється за допомогою другого антирабічного антитіла, міченого пероксидазою, продукт реакції якої фарбується при додаванні хромогену. Інтенсивність фарбування продукту реакції прямо пропорційна кількості антигену.

10.2 Підготовка до дослідження

10.2.1 Як досліджуваний матеріал (антиген) використовують проби тканини головного мозку загиблих, вимушено вбитих, підозрюваних у захворюванні на сказ або експериментально заражених вірусом сказу тварин.

10.2.2 Приготування антигену, що досліджується.

Проби тканини головного мозку, отримані по 6.5, подрібнюють, розтирають у ступці і готують 10% суспензії в 0,9% ізотонічному розчині хлористого натрію, прогрівають у водяній бані при температурі 60 °С протягом 15 хв і центрифугують протягом 5-10 хв при швидкості 2000 об/хв. Надосадову рідину використовують як досліджуваний антиген.

10.2.3 Підготовка реагентів

Усі розчини і реагенти перед постановкою реакції необхідно витримати щонайменше 30 хв за нормальної температури (22±1) °З.

Підготовку компонентів набору проводять згідно з інструкцією із застосування.

10.3 Проведення дослідження

10.3.1 ІФА проводять у сендвіч-варіанті з використанням компонентів, що входять до набору для виявлення антигену збудника сказу у патологічному матеріалі.

Для проведення ІФА використовують планшети для імунологічних реакцій із плоским дном.

Об'єм інгредієнтів, що вносяться поетапно в лунки планшета, дорівнює між собою і становить 0,1 см.

10.3.2 Сенсибілізація планшета

У лунки полістиролового планшета вносять АнГ у робочому розведенні, вказаному на етикетці. Планшет з АнГ накривають кришкою і інкубують у термостаті при температурі (37±0,5) °С протягом 3 годин або при температурі 4 °С протягом 18 годин. При кожному відмиванні вміст лунок витрушують, а залишки розчину видаляють постукуванням про фільтрувальний папір.

10.3.3 Внесення антигенів

У ряди планшета A, B і C вносять буфер, що відмиває. У лунки планшета вносять контрольні позитивний (лунка A1) та негативний (лунка A2) антигени, що входять до складу набору, а також досліджувані проби (лунки A3, A4 тощо) і титрують по вертикалі, отримуючи розведення від 1:2 до 1:8. При великій кількості проб заповнюють інші ряди планшета. Планшет накривають кришкою і інкубують у термостаті при температурі (37±0,5) °С протягом 1 год. Після закінчення інкубації проводять триразове відмивання лунок планшета від антигенів, що не зв'язалися з імуноглобуліном, як описано в 10.3.2.

10.3.4 Внесення антирабічного пероксидазного кон'югату

У лунки планшета вносять антирабічний пероксидазний кон'югат у робочому розведенні, після чого накривають кришкою і інкубують у термостаті при температурі (37±0,5) °С протягом 1 год. Потім лунки планшета тричі відмивають, як описано в 10.3.2.

10.3.5 Внесення субстратної суміші

Для прояву реакції в лунки планшета вносять готову субстратну суміш. Реакцію виявляють протягом 15-30 хв при температурі (22±0,5) °С у темряві. Реакцію зупиняють додаванням розчину сірчаної кислоти молярної концентрації 2 моль/дм.

10.4 Обробка результатів

Облік реакції проводять візуально або на спектрофотометрі, що сканує, відповідно до інструкції із застосування набору.

Якщо в субстратній суміші як хромоген використовують ОФД, то вимірювання оптичної щільності проводять при 490 нм, якщо використовують ТМБ, то при 450 нм.

Реакцію враховують лише в тому випадку, якщо в лунках з контрольним негативним антигеном специфічне фарбування відсутнє при інтенсивному фарбуванні в лунках з позитивним контрольним антигеном. При візуальному обліку пробу вважають позитивною, якщо хоча б у одному (першому) розведенні спостерігається специфічне фарбування.

При спектрофотометрическом обліку результату ІФА проводять розрахунок коефіцієнта специфічності , який дорівнює відношенню оптичної щільності (ОП) продукту реакції в лунках з позитивним контрольним антигеном або досліджуваним матеріалом (ОП) до оптичної щільності субстратної суміші в лунках з контрольним негативним антигеном (ОП). Реакцію вважають позитивною, якщо коефіцієнт специфічності більше 2,1 та негативною, якщо менше 2,1.

приклад

ВП 0,641, ВП 0,120, 5,34 - позитивна реакція або ОП 0,180, ВП 0,120 1,5 – реакція негативна.

У разі позитивної реакції діагноз вважають встановленим. Негативний результат може бути підтверджений іншими методами по 7-9.

11 Реакція дифузійної преципітації (РДП)

11.1 Сутність методу

Сутність методу РДП полягає в здатності антитіл і вірусного антигену дифундувати в агаровом гелі і при специфічній взаємодії утворювати комплекс антиген-антитіло, що спостерігається неозброєним оком у вигляді лінії преципітації.

11.2 Підготовка до дослідження

11.2.1 Підготовка проб

Підготовка проб до дослідження – по 8.2.1.

Дослідження допускаються несвіжі проби мозку тварин, контаміновані бактеріальною мікрофлорою.

11.2.2 Підготовка агару

Для приготування агару змішують 1,5 г агару "Діфко", 1 см 1%-ного розчину метилового помаранчевого в 50%-му етиловому спирті, 0,01 г мертіоляту, 100 см ізотонічного розчину натрію хлориду. Отриману суміш кип'ятять до повного розплавлення агару, розливають пробірками, автоклавують при тиску 0,5 атм протягом 30 хв і зберігають в холодильнику при температурі 4 °С.

11.2.3 Підготовка предметного скла (чашок Петрі)

Реакцію ставлять або на предметних шибках, або на чашках Петрі. На знежирене скло наносять краплю розплавленого агару, рівномірно розподіляють по склу і залишають при кімнатній температурі на 20-30 хв для застигання агару. Потім наносять на скло 2,5 см розплавленого агару, утворюючи шар завтовшки близько 2 мм і залишають на 20-30 хв. У застиглому шарі агару за допомогою спеціального штампу або металевої тонкостінної трубочки діаметром 4-5 мм роблять лунки. Стовпчики агару обережно виймають, не пошкоджуючи і не допускаючи відшаровування від скла тонкого шару агарового гелю, за допомогою пінцету очного або іншого інструменту.

Чашки Петрі готують аналогічно, вносячи до них 10-15 см розплавленого агару отримання шару товщиною 2-3 мм.

11.3 Проведення дослідження

Безпосередньо перед постановкою реакції готують розведення антирабічної сироватки (імуноглобуліну), для чого чотири пробірки вносять по 1,0 см ізотонічного розчину натрію хлориду. У першу пробірку додають 1,0 см антирабічної сироватки, отримуючи розведення 1:2, перемішують і переносять 1,0 см суміші в другу пробірку і т.д. Таким чином, одержують чотири пробірки з розведеннями 1:2, 1:4, 1:8 та 1:16.

У приготовлені лунки вносять по 0,05-0,07 см проби мозку (кожну пробу в окрему лунку), отриманої по 8.2.1, і розведення антирабічної сироватки або імуноглобуліну (1:2; 1:4; 1:8; 1: 16) згідно з малюнком 1.

Малюнок 1 - Схема внесення матеріалу

Ар - амонів ріг; Пм - довгастий мозок; А+ – позитивний контрольний антиген; М - мозок; К – кора великих півкуль; А - негативний контрольний антиген

Можливе застосування інших схем внесення матеріалу, але обов'язково використання позитивного і негативного антигенів.

Предметні скла з досліджуваним матеріалом поміщають у чашки Петрі з зволоженим дном або вологий ексікатор, а потім термостат при температурі (37±1) °С на 48 год (чашки Петрі накривають кришкою і поміщають в термостат).

Реакцію враховують через 6, 24 та 48 год.

11.4 Обробка результатів

Реакцію вважають позитивною у разі навіть однієї лінії преципітації будь-якої інтенсивності між лунками, що містять досліджуваний матеріал і антирабічну сироватку (імуноглобулін).

При цьому між позитивним антигеном та антирабічною сироваткою (імуноглобуліном) повинна спостерігатися помітна лінія преципітації, а між негативним антигеном та антирабічною сироваткою (імуноглобуліном) лінії преципітації не повинно бути.

У разі позитивної реакції діагноз вважають встановленим. Негативний результат може бути підтверджений іншими методами по 7-10.

Бібліографія

ЄС Guide to Good Manufacturing Practice for Medicinal Products for Human and Veterinary Use



УДК 619:616.98:579.852.1:615371 МКС 11.220

Ключові слова: сказ, діагностика, метод флуоресціюючих антитіл, імуноферментний аналіз, біопроба, реакція дифузійної преципітації

____________________________________________________________________________________

Електронний текст документа
підготовлений ЗАТ "Кодекс" та звірений за:
офіційне видання
М: Стандартінформ, 2014

ЕКСПРЕС-ДІАГНОСТИКА ШАЛУ

Методи виявлення антигенів. При сказі для експрес-діагностики можна використовувати методи флуоресціюючих антитіл (МФА), реакції преципітації (РП) в агаровому гелі, методи імуноферментного аналізу (ІФА), полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Для прижиттєвої діагностики сказу в людини потрібно кілька тестів.

Визначення антитіл до антигенів вірусу сказу. Виявлення антитіл у сироватці крові або в цереброспінальній рідині – важливий метод діагностики. Серологічне дослідження рабієс-специфічних антитіл проводиться в сироватці крові для визначення перед- та постекспозиційної вакцинації та визначення часу бустерної імунізації з метою підвищення імунної відповіді.

Виділення вірусу. Для виділення та ідентифікації вірусу використовують метод біопроби на білих мишах. Досліджуваний матеріал суспендують у фізіологічному розчині, що містить антибіотики та ембріональну сироватку великої рогатої худоби. Суспензія вводиться інтрацеребрально білим мишам масою 5-6 г. Для доказу розвитку інфекції за мишами щодня спостерігають до 30-го дня після інокуляції. Миші, у яких цей період розвивається захворювання, негайно піддаються евтаназії, і тканини мозку досліджуються методом прямої МФА.

Перевага даного підходу полягає у можливості визначити малі кількості вірусу сказу у матеріалі. Недолік методу – необхідність багатоденного (7–18 діб) очікування між інокуляцією та проявом перших ознак захворювання. Для скорочення інкубаційного періоду застосовують мишей-сусунків. Для експрес-діагностики можна використовувати мишей у віці менше 3 днів: у мишей, забитих через 3 дні, виявляється антиген вірусу в мозку, який можна виявити методом МФА.

Такий метод виділення вірусу практикується в якості підтверджуючого діагностичного тесту при негативних результатах виявлення антигену і тілець Бабеша - Негрі і в разі укусу людини підозрілим на сказ тваринам. Він забезпечує належну чутливість та специфічність, тобто розцінюється на рівні діагностичної значущості методу прямої імунофлуоресценції. Крім того, цей метод є основним для ідентифікації варіантів вірусу і є перспективним для розробки діагностичних реагентів.

Виділення та ідентифікація вірусу на культурі клітин. Основним недоліком виділення вірусу під час інфікування лабораторних тварин є тривалість методу. Уникнути цього можна під час використання культур клітин. Зазвичай цих цілей використовують культуру клітин нейробластомы мишей, якщо потрібно досліджувати тканини мозку. Мозок суспендують в культуральному поживному середовищі, наносять суспензію на моношар культури клітин і інкубують від одного до декількох днів.

Чутливість даної культури до вірусу можна підвищити обробкою її ДЕАЕ декстраном. Моношар клітин потім відмивають, фіксують на холоді ацетоном або сумішшю формаліну з метанолом і досліджують методом імунофлюоресценції. Якщо тварина була інфікована вірусом сказу, то монослое культури клітин виявляються цитоплазматичні включення антигену вірусу сказу.

Показано, що на клітинах мишачої нейробластоми лінії Na C1 300 у поєднанні з МФА антиген вірусу сказу можна виявити через 2 дні. Чутливість методу можна порівняти з методом ізоляції вірусу на мишах.

Хоча вірус сказу має облігатну нейропатогенність in vivo, він здатний інфікувати широке коло клітин-господарів in vitro, що можна використовувати для дослідження інших тканин та органів на наявність вірусу сказу. Встановлено, що вірус сказу розмножується у клітинах ВНК-21 і Vero, у первинних клітинах курячих ембріонів чи нирок хом'яка. Показано, що адсорбція вірусу та впровадження його у клітину відбуваються протягом 7 годин. Через 24–48 годин усередині клітини утворюються нові вірусні частки, через 72 години відбувається брунькування їх із клітинної оболонки в міжклітинний простір.

Методи дослідження

Для експрес-діагностики сказуможуть бути використані:

а) метод БФА- для виявлення антигену вірусу сказу у відбитках рогівки або заднього відділу шиї хворого, що містить цибулини волосся;
б) метод ПЛР- для виявлення РНК вірусу в біоптатах тканин, слині, спинномозкової або слізної рідини;
в) метод ІФА- для виявлення специфічних антитіл (антигену) у хворих з типовим або атиповим перебігом.
г) метод біопроби- для виділення вірусу на ранніх етапах захворювання або виявлення антитіл у крові або спинномозкової рідини на пізніх стадіях захворювання. Для експрес-діагностики використовується комплексний метод (біопробу + МФА), що полягає в зараженні досліджуваним матеріалом 2-денних новонароджених мишей та дослідження їх мозку на 3-4 добу в МФА.

Вибір методів прижиттєвої діагностики значною мірою залежить від стадії хвороби: метод, заснований на виявленні антигенів, як правило, має високу чутливість наприкінці інкубаційного періоду, протягом перших кількох днів захворювання, тоді як віруснейтралізуючі антитіла зазвичай з'являються у спинномозковій рідині та сироватці. крові після 7-10 днів з початку хвороби.

Реакція імунофлюоресценції. Метод заснований на використанні антитіл, пов'язаних з барвником, наприклад, флюоресцеїнізотіоціанатом. РІФ широко застосовується для виявлення вірусних антигенів у матеріалі хворих та для швидкої діагностики.

Метод має найбільш високий ступінь чутливості, він покладено в основу експрес-діагностики і дозволяє виявляти вірусні антигени протягом декількох годин.

Основні переваги МФА: швидкість виконання, висока специфічність (100%). Витрачений час на діагностику захворювання за його допомогою – менше одного дня. Застосовуються прямий та непрямий варіанти МФА.

Пряма імунофлуоресценціязалишається найбільш відданим методом діагностики сказу. Предметне скло, що містить мазки-відбитки тканин мозку, або скла з моношаром культури тканин фіксують в ацетоні протягом 1-4 годин. Потім препарати висушують і обробляють поліклональними флуоресцирующими антинуклеокапсидними антитілами (імунофлуоресцентний реагент).

Цей реагент являє собою кон'югат, виготовлений із специфічних поліклональних антитіл IgG класу до нуклеокапсидного антигену вірусу та флуоресцеїну ізоціанату (ФІТЦ). Специфічні антитіла одержують шляхом гіперімунізації тварин (кролів, хом'яків або коней) сумішшю епітопів нуклеокапсиду вірусу.

В даний час для цих цілей все ширше використовують мишачі моноклональні антитіла до нуклеокапсиду вірусу сказу. Після 30-хвилинної інкубації при 37 С діагностичні препарати багаторазово відмивають фізіологічним розчином і дистильованою водою.

Антитіла, мічені ФІТЦ, фіксуються лише у місцях локалізації вірусних нуклеопротеїдних антигенів. Потім препарати висушують на повітрі та досліджують методом світлової мікроскопії, використовуючи як джерело світла ксенонову лампу та відповідний фільтр.

При непрямому варіантіантиген спочатку з'єднують з незабарвленою специфічною імунною сироваткою. Потім на утворені нефлуоресціюючі комплекси антиген-антитіло впливають міченою флуорохромом імунною сироваткою, що містить антитіла до білків специфічної сироватки. Непрямий варіант МФА поряд з виявленням антигену дозволяє кількісно визначати антитіла в сироватці, що досліджується, шляхом відповідного її розведення.

Мічені ФІТЦ утворення у клітинах різних тканин виявляються у вигляді жовто-зеленого флуоресцентного фарбування на темному тлі (у вигляді округлої або овальної форми внутрішньоцитоплазматичних включень).

Імуноферментний аналіз. Метод заснований на принципі сорбції білків на твердій фазі з подальшим утворенням комплексів антиген-антитіло, що виявляються субстрат-індикаторним розчином. Антиген, що додається в лунки, специфічно зв'язується з антитілами. На шар антигену наносять досліджувані сироватки у потрібних розведеннях. За наявності специфічних антитіл у них зв'язуються з антигеном. Для виявлення зв'язування на шар антитіл наносять імуноглобулін проти глобулінів сироватки людей, кон'югований з пероксидазою хрону. Кількість сорбуючого кон'югату пропорційно кількості людей, що зв'язалися з антигеном антитіл сироваток. Це можна визначити, використовуючи індикаторний розчин (ортофенілілендіамін + перекис водню), компоненти якого в результаті дії пероксидази кон'югату забарвлюють рідину коричнево-жовтий колір. При обстеженні неясних випадків застосування ІФА додатково до методів РП або РЗК дозволяє збільшити достовірність лабораторної діагностики сказу завдяки великій чутливості цього методу. Метод дозволяє виявляти інфекційні та дефектні частки.

Для визначення антирабічних антитіл у процесі вакцинації можна застосовувати непрямий метод ІФА, використовуючи як антиген очищений вірус, а для визначення антитіл класу IgG в людській сироватці - А-білок стафілококу, пов'язаний з пероксидазою хрону. Результати ІФА можна порівняти з отриманими в тестах вірусної нейтралізації на мишах. Метод дозволяє виявляти присутність IgМ на початку процесу імунізації.

Імуноферментні методи - дуже перспективні виявлення нуклеокапсидного антигену вірусу при посмертної діагностиці в тканинах мозку. Серед них, наприклад, швидкий імуноферментний метод діагностики сказу, заснований на приготуванні плашок сенсибілізованих антитілами IgG ізотипу до нуклеокапсиду першого серотипу, розведених у карбонатному буфері.

Матеріал для дослідження гомогенезують у буфері або культуральному середовищі, освітлюють центрифугуванням, вносять у лунки та інкубують у плашках. Фіксований специфічними антитілами нуклеокапсидний антиген ідентифікують додаванням пероксидазного кон'югату з антинуклеокапсидними протирабічними антитілами іншої видоспецифічності та хромогенного субстрату. Чутливість методу становить 0,8-1,0 нг/мл.

Цим методом можна виявляти антигени вірусів різних серотипів. Застосування кон'югатів нуклеокапсидспецифічних антитіл, мічених біотином, підвищує чутливість до 0,1–0,2 нг/мл.

Методом ІФА успішно виявляється антиген нуклеокапсиду, але матеріал, що навіть розклався, не повинен фіксуватися формаліном.

Метод полімеразної ланцюгової реакції. Для експрес-діагностики вірусу сказу та ідентифікації лісовірусів найбільш зручний метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Метод ПЛР - найнадійніший і найшвидший для виділення віріонної РНК з будь-яких проб, що містять вірус у низькій концентрації. З його допомогою можна створити багато копій РНК вірусу. Цей метод використовується для підтвердження результатів МФА та для визначення вірусу в слині, цибулинах волосся заднього відділу шиї та голови.

ПЛР заснована на принципі природної реплікації ДНК. Суть методу полягає у багаторазовому повторенні циклів синтезу (ампліфікації) вірусоспецифічної послідовності ДНК за допомогою термостабільної Taq ДНК-полімерази та двох специфічних затравок, так званих праймерів.

Кожен цикл складається з трьох стадій із різним температурним режимом. У кожному циклі подвоюється кількість копій ділянки, що синтезується. Знову синтезовані фрагменти ДНК служать як матриця для синтезу нових ниток у наступному циклі ампліфікації, що дозволяє за 25-35 циклів напрацювати достатню кількість копій обраної ділянки ДНК для її визначення, як правило, за допомогою електрофорезу в агарозному гелі.

Особливо висока чутливість ПЛР при використанні праймерів комплементарних N-гену, коли вдається виявляти РНК вірусу в пробах, що містять вірус в титрі 10 МЛД50. Методом ПЛР можна виявляти РНК вірусу навіть у патологічному матеріалі, що розклався.

В даний час розроблені та широко використовуються на практиці підтверджуючі (конфірматорні) тести, такі як ПЛР у зворотно-транскриптазному виконанні (ВІД-ПЛР). Метод ОТ-ПЛР – високочутливий та найбільш ефективний. РНК екстрагується з тканин інфікованого вірусом органу, транскрибується в кДНК, яка потім ампліфікується методом ПЛР. Для постановки ОТ-ПЛР необхідні праймери, отримані до консервативних областей геному вірусу сказу. Зазвичай використовуються гени, що кодують нуклеопротеїн або N-білок.

Метод ПЛР високоспецифічний і дуже чутливий. Є одним із найбільш точних тестів детекції рабічного антигену, що дозволяє діагностувати сказ навіть за наявності в матеріалі хоча б одного віріону. В основі тесту лежить комплементарне добудовування РНК-матриці, яке здійснюється in vitro за допомогою ферменту РНК-полімерази. В останні роки ПЛР знаходить дедалі ширше застосування для діагностики та моніторингу вірусних інфекцій. Однак методика проведення складна, дорога і поки що недостатньо уніфікована для рутинного застосування.

Цитологічні методи в даний час мають обмежене діагностичне значення, але при ряді інфекцій, як і раніше, повинні застосовуватися. Досліджуються матеріали аутопсії, біопсії, мазки, які після відповідної обробки фарбуються та аналізуються під мікроскопом. При сказі – це виявлення включень у цитоплазмі клітин (тільця Бабеша – Негрі).

Виділення вірусу. Виділення вірусу може бути необхідним для підтвердження результатів тестів визначення антигену і для більш детальної характеристики ізолятів. І хоча цей метод є одним із найстаріших і трудомістких методів діагностики, сьогодні виділення вірусу з подальшою ідентифікацією за допомогою одного із сучасних методів (ІФА з моноклональними антитілами або ПЛР) є найбільш достовірним методом діагностики, т.з. "золотий стандарт".

Результативність методів діагностики сказу може варіювати в залежності від ряду факторів (стадії хвороби, термінів забору матеріалу, якості отриманих проб, умов їх зберігання, досвідченості персоналу, якості реактивів та ін.). Якщо позитивний результат підтверджує сказ, то негативний який завжди свідчить про відсутність хвороби. Тому за сказу експерти ВООЗ рекомендують використовувати кілька тестів, особливо МФА у поєднанні з біопробою на новонароджених (2–3 денних) білих мишах.

Заходи особистої профілактики

Усі роботи з матеріалом, що, ймовірно, містить вірус сказу, так само як і з тваринами, підозрілими на сказ, повинні проводитися з дотриманням заходів особистої безпеки. Медичні працівники та ветеринарні лікарі повинні працювати у халатах, рукавичках, масках.

Після закінчення роботи бокси обробляють 3% розчином перекису водню.

Флакони, ампули та інструменти, а також матеріали, що містять вірус сказу, і весь посуд після роботи знезаражують автоклавуванням протягом 1 години при 1,5 атм (режим «вбивки»).

Кошти індивідуального захисту знезаражують кип'ятінням або автоклавуванням. Робочу поверхню столу та руки знезаражують дезрозчином (0,5% розчин хлораміну).

Гідрофобія, рабієс або сказ – це назва однієї хвороби, яка є вірусним захворюванням найчастіше з тривалим інкубаційним періодом та несприятливим прогнозом. Гостро протікає захворювання закінчується смертю хворого, хоча сьогодні у світі є кілька випадків успішного лікування.

У давнину вважалося, що сказ – це одержимість дияволом, і тому назва цього захворювання походить від слова «біс». Щодо латині, то зі словом «rabies» спостерігається та сама етимологія.

Небезпечне захворювання провокує розвиток запалення головного мозку (енцефаліту), уражається нервова система хворого. Збудник відноситься до сімейства рабдовірусів роду Lyssavirus. За своїми розмірами не перевищує показник 150 нм. Має у своєму складі РНК. Але збудник не надто стійкий до довкілля, він гине при температурі від 56 градусів приблизно за 13-16 хвилин, при кип'ятінні - за 2-3 хвилини. Рабдовірус чутливий до етанолу (одноатомний спирт), до дезінфікуючих препаратів, до УФ-променів. Вірус сказу стійкий до антибактеріальних препаратів, фенолу (гідроксибензол), а також до низьких температур. Заразитися вірусом може і людина, і будь-яка теплокровна тварина.

Потрапляючи в організм людини чи тварини, вірус сказу розмножується безпосередньо у клітинах нервової системи. За допомогою аксонів нейронів збудник з невеликою швидкістю (приблизно 3 мм за 60 секунд) досягає головного та спинного мозку. Далі розвивається менінгоенцефаліт. Вражаючи нервову систему, збудник провокує розвиток запальних процесів, некротичні деформації та дистрофічні зміни. У результаті заражена сказом людина або теплокровна тварина гине через ядуху, серце зупиняється.

Перші письмові наукові матеріали, пов'язані зі сказом, були описані римським лікарем у 1-му столітті нашої ери. Тоді Авл Корнелій Цельс називав хворобу водобояздю, попереджав про зараження через укуси собак і радив у перші хвилини після нападу хворої тварини припікати пошкоджені ділянки шкіри, щоб знищити збудника.

Влітку 1885 року французький мікробіолог та хімік Л. Пастер зміг створити вакцину від сказу. Її і сьогодні застосовують, але у поєднанні з імуноглобуліном чи сироваткою антирабічного типу. Ліки за допомогою ін'єкції вводять углиб рани, також обколюються м'які тканини навколо ураженої ділянки.

Чи будуть ефективними ліки – все залежить від часу, тобто через який тимчасовий проміжок постраждалий звернувся за лікарською допомогою. Чим швидше буде надано першу допомогу і введено вакцину, тим сприятливішим буде результат. Терміново введена постраждалому після укусу хворої тварини найчастіше дозволяє врятувати життя людині.

Практично до кінця 2004 року сказ вважався виключно смертельним захворюванням, якщо у хворого виявлялися симптоми зараження. Саме в 2005 році американським лікарям завдяки інноваційному лікувальному методу вдалося знищити вірус сказу, який почав проявлятися у п'ятнадцятирічної дівчинки. Далі подібний випадок одужання був зафіксований у Бразилії, і подолати хворобу за допомогою цієї методики зміг п'ятнадцятирічний хлопчик. Так, у 2008 році вже було нараховано понад 5 випадків успішного одужання.

Сьогодні сказ, як і раніше, залишається однією з найстрашніших і смертельно небезпечних інфекцій, що вражають людство. Цю хворобу легко можна поставити поряд із ВІЛ чи правцем.

Інкубаційний період, симптоми, стадії розвитку хвороби і в дорослих, і в дітей віком практично однакові. Інфекція за тим самим принципом проникає в організм людини і вражає його нервову систему.

Варто відзначити лише ті факти, що діти більш схильні до вірусу сказу. Так, серед усіх укушених хворими тваринами людей заражаються інфекцією менше 35% постраждалих, але серед них більшу частину займають саме діти від 7 до 12 років.

Сказ, як захворювання інфекційної природи, у дитини протікає трьома періодами, що виділяють:

• продромальний;
• збуджений;
• період появи паралічів.

Перший період хвороби у дитини може характеризуватись больовими відчуттями в зоні проникнення інфекції. Місце укусу може почервоніти, шкіра часто набрякає, може свербіти або палити. Починаються головний біль, може нудити, простежується слабкість і нездужання.

Також у перші дні клінічних проявів сказу може:

• збільшиться показник температури тіла до 38 градусів;
• з'явиться блювання;
• прогресувати психологічні розлади, так з'являється відчуття тривоги та постійних необґрунтованих переживань, почуття страху.

Переважно хворі на цей вірус діти на перших етапах розвитку хвороби поводяться відчужено, замикаються в собі, мало сплять, відмовляються навіть від улюблених страв.

Наприкінці першої стадії сказу дитина надмірно неспокійна, може діагностуватися прискорене серцебиття, а також утруднене дихання.

Друга, стадія сказу у дітей пов'язана з острахом води. У хворого може спостерігатися спазм глотки тільки за одного її виду. Дитина може жбурнути чашку з водою убік, кричати, махати руками, закидати голову. Такі рухи в момент нападу спотворюють особу хворого. Може виникнути синюшність шкірних покривів у сфері шиї та обличчя (через спазм мускулатури). Зіниці очей розширюються, повіки широко відкриті. Іноді такий напад закінчується летальним кінцем, але найчастіше все ж таки напад триває всього кілька секунд, після чого дитині на перший погляд стає краще.

Далі спазми можуть з'явитися через різні подразники, навіть гучний шум, яскраве освітлення або рух повітря. У момент нападу дитина не усвідомлює, що робить, її свідомість затьмарена. Він здатний бризкати слиною, адже найчастіше ковтнути її не може через м'язового спазму в глотці.

Якщо терапія буде призначена неправильно, то хвора дитина може різко втрачати вагу, починається зневоднення, риси обличчя можуть загострюватися. Часто з'являються судоми кінцівок, підвищується температура тіла. Як правило, один із таких нападів закінчується зупинкою дихання та серця. У поодиноких випадках заражений сказом дитина доживає до третьої стадії.

На третій стадії сказу страх води вже не турбує, дитина стає спокійною, млявою, впадає в депресію. Свідомість хворого стає зрозумілим, але таке покращення стану має лише видимий поверхневий ефект. Починаються паралічі, що зачіпають нижні та верхні кінцівки. Температурні показники тіла зростають миттєво та зупиняються лише на позначці 43 градуси. Тиск в артеріях знижений. Летальний результат на тлі паралічу дихальних центрів та серцево-судинної системи неминучий.

Діагностують сказ у людини, а точніше у дитини лише медичні спеціалісти. Самостійно ставити діагноз і тим більше приступати до лікування небезпечно.

Під час огляду дитини лікар враховує її настрій, збудливість, руховий неспокій. Фахівець медичної сфери, який проводить діагностику стану дитини, повинен знати про всі укуси або будь-які інші контакти з дикими або домашніми тваринами. Призначають лабораторні тести із застосуванням методу флюоресціюючих антитіл. У такий спосіб знаходять вірус і в організмі мертвих людей, а також загиблих тварин. Антиген можуть виявити у відбитках мозку та рогівки, а також слинних залозах. Для комплексної діагностики можна рекомендувати і гістологічний аналіз.

При діагностиці сказу у людини і зокрема у дитини лікар повинен виключити інші хвороби, які можуть спровокувати розвиток запалення головного мозку. Тут слід виділити арбовірусну, герпетичну та ентеровірусну інфекції.

Ефективне лікування при сказі не розроблене. Незначних позитивних результатів вдається досягти завдяки комплексній дії лейкоцитарного інтерферону та антирабічного імуноглобуліну. Для полегшення стану пацієнта призначають симптоматичну терапію. Дитину визначають у спеціальну палату або ізольований бокс, де зовнішні подразники у вигляді яскравого світла та гучних звуків практично відсутні.

Нервове перезбудження приглушують ліками, зокрема снодійними та болезаспокійливими медикаментами. Лікар може призначити терапію, спрямовану на попередження судом. На третій стадії сказу хворому призначають стимулятори дихальної та серцевої діяльності. Але це лікування дає мінімальний позитивний ефект. Йдеться в цьому випадку, швидше за все, не йдеться про лікування, а лише про продовження життя пацієнта максимум на кілька місяців.

Загальноприйнятою думкою вважається той факт, що сказ – це зоонозне захворювання. Заразитися людина може:

• Через укус тварини: собаки, кішки, єнота, лисиці, білки та інших теплокровних представників міської та паркової фауни.
• При обробітку туші хворої тварини, за умови, що на руках людини є пошкодження шкірних покривів.
• При пересадці тканин чи органів хворої людини. Це поодинокі випадки, але вони відомі. Аналізи на сказ при трансплантації не проводяться, адже захворювання може перебувати в інкубаційному періоді і ніяк не проявляти себе. Так у Китаї людині були пересаджені заражені вірусом сказу нирки дитини, яка померла від запалення мозку нібито невідомої природи. Відомий випадок зараження на сказ і після пересадки рогівки ока.
• Повітряно-краплинним шляхом. Такий спосіб зараження рідкісний, але цілком ймовірний, наприклад, у печері, де мешкає велика кількість хворих на сказ кажанів.

Експерти говорять і ще про один можливий шлях зараження, який стосується вживання молока та м'яса хворої тварини. Але сьогодні не зафіксовано жодного випадку такого інфікування, тому ні про яку доказову базу не йдеться. Це лише припущення.

Найчастіше хвороба розвивається після укусу хворої тварини або після ослинення ним слизових оболонок та пошкоджених ділянок шкіри. Найстрашніші поразки, коли укус був зроблений в області шиї і обличчя, а також кистей верхніх кінцівок.

Хворий звір може бути заразним за 7-10 днів до появи перших симптомів сказу. Особливо небезпечною стає тварина під час активних симптоматичних проявів вірусного ураження. Більшість випадків зараження сказом реєструється в теплу пору року, зокрема влітку та ранньої осені.

Науковці встановили, що не всі укуси хворої тварини призводять до зараження. За статистикою хворіють на мене 35% укушених.

Не всі хворі на сказ тварини виявляють агресію до оточуючих. Наприклад, у кішок вірусна інфекція може протікати у спокійній формі. Домашній вихованець або бродяча кішка може забитися в кут, під шафу або забратися в якусь нору і сидіти там до самої смерті.

Епідеміологія сказу

Поширюють вірус сказу багато теплокровних тварин.

• В американських штатах вірус підтримує своє збереження та поширення серед єнотів та скунсів, не рідкісні випадки зараження шакалів.
• В Індії, Австралії та Африці сказ найчастіше вражає кажанів.
• У Шрі-Ланці розповсюджувачами інфекційного захворювання є куниці.

Інформація про дрібні гризуни та сказ вивчена не досконально. Випадки передачі інфекції за такою ланкою не визначено. Хоча існує припущення, що саме миші та щури є природними резервуарами для вірусу, тому що саме вони можуть тривалий проміжок часу існувати з інфекцією та переносити її на далекі відстані.

Вірус може передатися від хворої людини до здорової, але такі ситуації вкрай рідкісні, хоча ще за давніх часів саме цього побоювалися найбільше.

У Росії її заражаються сказом, як від диких, і від свійських тварин. У цьому випадку можна виділити вовків, лисиць, собак та кішок. Щури, корови, коні, свині хворіють рідко.

У 2005 році на території Липецької області було відзначено різке збільшення випадків зараження тварин на сказ (понад 100 випадків). Особливо масово поширювався у період часу й у Московської області, і навіть Тульської і Брянської.

Влітку 2009 року спеціальною службою, яка здійснює ветеринарний та фітосанітарний контроль у країні, було заявлено про швидке активне поширення вірусу по Росії. І пов'язані такі припущення насамперед із тим, що попит на хутро лисиці значно впав, а орні землі обробляються дедалі рідше, що зумовлює активного зростання популяції лисиць. Також у 2009 році було зафіксовано епідеміологічне зростання у Підмосков'ї через збільшення кількості бродячих собак.

Сказ у людини або тварини може зустрічатися на всіх континентах, крім Антарктиди. До сьогодні не було жодного випадку захворюваності на вірус у Японії, Фінляндії, Іспанії, Норвегії, Новій Зеландії та на Мальті.

Проблематика загострена в Азії та Африці. Щороку у світі реєструється понад 50 тисяч випадків зараження на сказ.

Сказ як вірусна інфекція в організмі людини може проявлятися по-різному, але лікарі чітко виділяють три періоди, що послідовно змінюються.

Інкубаційний період сказу

Відразу після зараження людина не відчуває жодних симптомів сказу, адже інкубаційний період може мати різну тривалість. Загалом він займає 20-80 днів. Але якщо інфекція проникла через великі рани в ділянці шиї або голови, то перший продромальний період може початися вже через 12 днів, наприклад, після укусу дикої тварини.

Медиці відомі досить рідкісні випадки тривалого інкубаційного періоду.

• Так у іммігранта, який прибув до Америки з Лаосу, з'явилися перші ознаки сказу лише через 4 роки. Як встановили експерти, вірус у його організмі був завезений із регіону, де жив до імміграції пацієнт.
• Другий випадок був пов'язаний з інкубаційним періодом завдовжки 6 років. У цій історії іммігрант був родом із Філіппін.

Також зареєстровані випадки, коли тривалий інкубаційний період переривався під впливом зовнішнього подразника, після чого сказ починало швидко розвиватися. В даному випадку можна виділити випадок з падінням з дерева (через 5 років після укусу зараженої тварини) та ударом електричним струмом (через 1-1.5 роки після зараження).

Імовірність появи сказу навіть після укусу хворої тварини може залежати від різних факторів. Свою роль у цьому випадку грає і імунна система організму, і тип зараження і навіть у вірусу, який проник в організм. Також велике значення має місце проникнення інфекції (місце укусу). Небезпечними в даному випадку можна вважати область шиї та голову, а також кисті рук та геніталії, тобто ті ділянки, де зосереджено велику кількість нервових закінчень.

Симптоми сказу у людини спочатку починають непокоїти на місці укусу. Навіть якщо рана загоїлася, шкірні покриви можуть свербіти, іноді з'являється почервоніння та набряклість. Потерпілий часто відчуває больовий симптом у сфері рубця. Людина, заражена вірусом, погано спить, відчуває загальне нездужання, температура тіла може збільшуватися до показників 38 градусів.

У продромальному періоді стають помітними порушення психічного стану хворого:

• з'являється відчуття безпричинної тривоги та туги;
• збільшується рефлекторна збудливість.

Людина, що заразилася вірусом сказу, може відмовлятися від їжі, мучитися безсонням, замикатися в собі. Хворого часто мучать кошмари, він поводиться загальмовано, скаржиться на постійні негативні думки.

Продромальний період хвороби займає близько 1-3 днів, в окремих випадках він може затягтися до 7-8 днів. Наприкінці цього періоду можливі напади занепокоєння, що супроводжуються неприємними відчуттями сором'язливості в грудній клітці або прискореним серцебиттям.

Період збудження

І у дітей, і у дорослих період збудження при сказі найчастіше починається з появи водобоязні. Гідрофобія швидко наростає. І якщо в перші дні у хворого можуть з'являтися спазми гортані тільки при вживанні води, через деякий час провокувати напад вже здатні навіть розмови про неї.

Напад у період збудження супроводжується як спазмами гортані. Заражена вірусом людина стає агресивною, вона може жбурляти чашку з водою, кричати, витягувати тремтячі руки перед собою, закидати голову, бризкати слиною і вивертати шию. Очі у хворого широко розплющені, шкірні покриви на обличчі та шиї стають синюшними, вдих утруднений. На піку нападу можливий летальний кінець через зупинку дихання та роботи серця.

Приступ зазвичай проходить через кілька секунд. Зовнішній стан хворого значно покращується. Наступні спазми глотки можуть розпочатися будь-коли, і вдень, і вночі. Спровокувати напад може не лише вода, а й інші подразники, наприклад, різкий гучний звук, яскраве світло та навіть потік повітря. Під час спазму стан зараженої людини затьмарений, він не розуміє, що робить. Зорові та слухові галюцинації часто стають причиною агресії, яка є небезпечною для оточуючих людей.

За відсутності правильно підібраної терапії у хворого на сказ швидко починається зневоднення організму, людина різко худне. Збільшується температурні показники тіла. Іноді з'являються судоми нижніх та верхніх кінцівок. Цей період сказу в середньому триває до 5 днів. Зазвичай саме за одного з таких нападів глотки хворий вмирає. Рідко коли зараженій людині вдається дожити до третьої стадії сказу.

Третя стадія сказу – це період паралічів. У цей час хворий уже перестає боятися води, гідрофобія відступає. З'являється млявість, повна апатія. Розвивається параліч нижніх кінцівок, обличчя, язика. Температура тіла може зрости до 43 градусів. Тиск у артеріях падає. Смерть хворого настає через параліч дихальних центрів, а також серцево-судинної системи.

Бувають випадки, коли захворювання на сказ протікає без явних симптомів хвороби. Може бути водобоязнь, не підвищуватися температура тіла або, наприклад, проявитися хвороба відразу паралічами. Діагностика та симптоматичне лікування такої форми захворювання найчастіше утруднена. Іноді буває так, що діагноз пацієнту ставлять після його смерті, зокрема після розтину тіла.

Діагностика сказу у людини

При діагностиці захворювання лікар зіставить симптоми та епідеміологічні дані. Важлива інформація і про тварину, укус якої міг спричинити зараження. Також медичний фахівець відзначить наявність чи відсутність психічних порушень у поведінці пацієнта.

Лабораторна діагностика не завжди. Аналізи необхідні лише у випадках, коли лікар сумнівається у діагнозі. Може бути призначений метод виявлення антигену вірусу у відбитках рогівки.

Лікар обов'язково намагатиметься виключити інші хвороби, які також можуть провокувати розвиток запального процесу в мозку. До уваги беруть нейротропні та герпетичні інфекції, а також ентеровірусні та арбовірусні ураження. Якщо у пацієнта простежується ізольоване інфікування, що стосується ствола мозку, і при цьому свідомість хворого збережеться, то діагностика сказу значно спрощується.

Якщо інфекція потрапила в організм людини, то шанси на життя залежатимуть від того, наскільки швидко звернутися за лікарською допомогою. Медики відзначають той факт, що існує вузьке тимчасове віконце, завдяки якому можна зупинити інфекцію, поки вона не вразила всю центральну нервову систему. Після контакту з хворим (підозра на сказ) тваринам йти за допомогою потрібно терміново. З появою перших ознак сказу смерть хворого – 100% всіх випадків.

Рану, якою можливо проникла інфекція (наприклад, місце укусу) обробляють терміново. Подряпини, садна та інші пошкодження шкіри на які могла потрапити слина тварини, рясно промиваються мильним розчином. Після цього – чистою водою. Вшивати рану або висікати її краї заборонено.

Якщо до амбулаторії або травмпункту звертається потерпілий з підозрою на зараження на сказ, то після місцевої обробки йому вводять антирабічний імуноглобулін, який включає до свого складу, а також вакцину від сказу. Таке лікування за допомогою двох препаратів допомагає організму людини протистояти вірусу, доки імунітет не зможе самостійно виробляти антитіла.

Активна та пасивна імунізація має свої недоліки.

• По-перше, варто виділити, що вводиться вакцина за допомогою кількох уколів.
• По-друге, у такий спосіб не можна захистити організм заздалегідь.
• По-третє, після такої імунізації слід утриматися від переохолоджування, стресів, теплових навантажень та вживання алкоголю хоча б протягом 5-6 місяців.
• Також варто відзначити дорожнечу імуноглобуліну.

У стаціонарному відділенні лікарні вже після першого звернення залишають потерпілого, якщо:

• він перебуває у важкому стані,
• був щеплений іншими вакцинами протягом останніх 50-60 днів;
• має хронічні захворювання нервової системи;
• алергік.

На сьогоднішній день навіть таке на перший погляд потужне екстрене лікування за допомогою антирабічного імуноглобуліну дає мінімальні позитивні результати. Якщо у хворого діагностуються перші ознаки сказу, терапія буде спрямована на приглушення симптомів захворювання та полегшення стану пацієнта.

Пацієнта поміщають у спеціальний бокс чи окрему палату, завдяки чому можна захистити хворого від зовнішніх дратівливих чинників, зокрема яскравого світла, гучних звуків.

Нервове збудження приглушують за допомогою особливої ​​медикаментозної терапії, яка включає снодійні засоби, а також протисудомні та болезаспокійливі препарати. Призначаються ліки, дія яких спрямовано нормалізацію водного балансу.

У період паралічів лікар може призначити медикаменти для стимуляції роботи дихальної та серцево-судинної систем. Використовують кероване апаратне дихання, гіпербаричну оксигенацію (терапія киснем, що проводиться у спеціальних барокамерах під підвищеним тиском) та в деяких випадках церебральну гіпотермію (охолодження мозку через зовнішні покриви). Але ці методи не дають шансу на повне лікування, вони лише продовжують життя хворого, до того ж у вдалих випадках лише кілька місяців.

На жаль, сьогодні немає єдиного ефективного лікування сказу, терапія не розроблена. Але дослідження ведуться постійно, причому науковими пошуками вакцини займаються багато країн світу, зокрема Китай, США, Індія.

У середині 2012 року вчені з Індії заявили про те, що вони запустили дослідницький проект з розробки та вивчення антирабічної вакцини, що включає моноклональні антитіла. Вже доведено, що такий препарат є безпечним для людського організму, але наскільки він ефективний – не з'ясовано.

Генна інженерія з'єднаних американських штатів також радує відкриттями. На 1 рік пізніше індійських вчених (2013) вони спробували впровадити частину РНК вірусу сказу в PIV5, тобто в вірус парагрипу, для якого характерна поразка дихальних шляхів у собак. Дослідження такого роду дали свої позитивні результати. У 100% випадків піддослідні миші, заражені вірусом, виживали під час введення вакцини під шкіру чи слизові оболонки носа. Що стосується перорального застосування ліків, то тут виживання опустилося до 50%.

Дослідження ведуться постійно, але ефективних ліків від вірусу сказу немає. Саме тому в багатьох державах, де від сказу щороку гине велика кількість людей, використовують різноманітні засоби захисту від смертельної інфекції.

В Австралії була створена дитяча комп'ютерна гра, користувачі якої можуть виростити ідеального собаку, найкращу тварину села. Розвага розрахована на дітей віком до 14-15 років. У грі докладно розповідається про смертельне захворювання та як правильно вберегти свого вихованця від небезпечного вірусу сказу. Також гра містить інформацію про те, що потрібно робити, якщо людину вкусив собака або будь-яка інша тварина.

В одній з африканських країн, а точніше в Республіці Танзанія працює спеціальна система стеження за поширенням сказу, що дозволяє доносити до мешканців країни важливу інформацію. Здійснюється інформування завдяки телефонному зв'язку. Населення, що мешкає в епідеміологічних небезпечних районах, отримує повідомлення з інформацією про термінову вакцинацію. Унікальна система охоплює понад 140 тис. кв. км. та допомагає десяти мільйонам людей Танзанії бути в курсі проблем.

Науковці та інженери генної промисловості постійно працюють над створенням ефективної вакцини від сказу, але поки результати не виправдовують очікування. Колись давно і чорна віспа була однією з найстрашніших хвороб, але людство змогло її зупинити. Люди колись зможуть перемогти і сказ.

Профілактика такого захворювання, як сказ, полягає у боротьбі з його поширенням у тваринному середовищі. До методів боротьби належать вакцинування тварин (не тільки диких та безпритульних, а й домашніх), карантин та інші заходи.

У разі укусу хворим або невідомим (бродячим, вуличним, диким) тваринам потрібно швидко провести спеціальну обробку ураженої області. Чим швидше рану та будь-яке пошкодження (навіть подряпину) обробить фахівець, тим краще. Місце нанесення укусу промити великою кількістю води з використанням мила. У разі свідчення постраждалому глибоко в рану та у прилеглі м'які тканини вводиться щеплення від сказу – антирабічний препарат (імуноглобулін). Рана обробляється, після чого відразу проводиться відповідне лікування. Його суть полягає у вакцинації (імунізації) спеціальною антирабічною вакциною з метою запобігти розвитку захворювання. Вакцинування проводиться строго відповідно до певного графіка, який складається лікарем виходячи з особливостей вакцини.

Вакцина від сказу була вперше розроблена у 1881 році французьким хіміком та мікробіологом Луї Пастером, який у ході своїх досліджень у сфері імунології, отримав препарат у результаті багаторазового щеплення вірусу сказу кролям. Через чотири роки Пастер вперше застосував свій препарат, ввівши його хлопчику, якого покусав шалений собака. Дитина не захворіла.

Сучасні вакцини в більшості випадків вводяться пацієнтові 6 разів: у той день, коли потерпілий звертається за медичною допомогою (нульовий день), потім за такою схемою: день 3, день 7, день 14, день 30 та день 90. У випадках, коли за тваринам, що покусали пацієнта, є можливість спостерігати і в результаті з'ясовується, що тварина здорова протягом 10 діб з моменту інциденту, в подальшій імунізації немає необхідності, і щеплення припиняються. Згідно з інструкцією, що додається до вакцини російського виробництва, весь час введення ін'єкцій, а також протягом півроку після останньої вакцинації забороняється вживати напої, що містять алкоголь. Крім того, слід виключити з раціону (або мінімізувати) всі продукти, які можуть спровокувати появу у пацієнта алергічної реакції.

На сьогоднішній день на території Росії офіційно використовується 6 зареєстрованих вакцин від захворювання на сказ, з яких одне найменування - індійського виробництва. А також 4 позиції антирабічного імуноглобуліну, з них – 1 найменування китайського виробництва, 1 – українського. У більшості випадків імунізація пацієнтів проводиться концентрованою культуральною антирабічною вакциною, або КОКАВ. Її виготовляють два підприємства – НВО «Імунопрепарат» та ІПВЕ імені Чумакова РАМН.

Якщо людину вкусила тварина, слід якнайшвидше звернутися за кваліфікованою допомогою до будь-якого травмпункту, оскільки ефективність профілактики сказу за допомогою вакцинування безпосередньо залежить від швидкості початку лікування: чим швидше вжито заходів, тим успішніший результат.

Фахівцю у травмпункті необхідно повідомити таку інформацію:

• опис зовнішнього вигляду тварини;
• характер її поведінки під час інциденту;
• чи був на тварині нашийник;
• за яких обставин стався інцидент.

Лікар опрацює місце укусу відповідним чином, після чого розпише курс ін'єкцій вакцини. Потерпілого можуть помістити в стаціонар, що показано у таких випадках:

• якщо стан здоров'я пацієнта буде особливо тяжким;
• якщо пацієнт страждає на будь-які хвороби нервової системи;
• якщо у пацієнта є алергії;
• у разі повторного вакцинування (аналогічний інцидент вже був раніше);
• у разі вагітності;
• якщо постраждалий за останні 2 місяці прищеплювався будь-якими іншими вакцинами.

Протягом усього періоду вакцинування необхідно уникати стресових ситуацій та перевтоми, а також будь-яких різких температурних впливів (перегрівання, переохолодження).

У рамках запобігання сказу особливі вимоги пред'являються до осіб, які займаються мисливським промислом. Мисливцям рекомендується:

• пройти профілактичний курс вакцинування від сказу;
• не обробляти туші тварин, не знімати з них шкіри до того, як будуть отримані результати дослідження з ветлабораторії щодо зараження вбитої тварини;
• не залучати до полювання на звірів та птахів навчених собак, які не щеплені від сказу;
• щорічно з метою профілактики вакцинувати від сказу не лише собак та кішок, а й навіть декоративних мишей, якщо є потреба.

Негайне введення антирабічних препаратів показано у таких випадках:

• При укусах, подряпинах, ослюненні покриву шкіри або слизових тварин, які або очевидно заражені сказом, або поводяться неадекватно і підозріло, а також невідомими тваринами, у тому числі хижими птахами та кажанами.
• При нанесенні поранень предметами, які були забруднені тканинами або рідинами скажених тварин або тварин, у яких захворювання підозрюється (препарування та обробка туш, зняття шкур та інше).
• При укусах, нанесених через одяг, коли вона порвана чи проколота зубами, і навіть при укусах, нанесених через в'язану тощо одяг.
• У разі подряпування, ослюнення або укусу, нанесених імовірно здоровими (візуально) тваринами, які за час спостереження (10 днів) захворіли, зникли або загинули.
• При укусах, нанесених польовими тваринами-гризунами, що мешкають на неблагополучних у плані сказу територіях.
• У разі коли ослюнення або укус нанесений людиною, у якого спостерігається гідрофобія.

Крім абсолютних показань до вакцинування є низка умовних, нехтувати якими небажано. Антирабічні ін'єкції можуть бути призначені у випадках, коли укус нанесений відомими здоровими домашніми тваринами. За такою твариною встановлюється 10-денне спостереження. Умовний курс включає 2 щеплення антирабічного препарату об'ємом від 2 до 2,5 мл кожна, які вводяться в два місця.

Що ж до профілактичного вакцинування, воно особливо показано людям, котрі займаються певними видами діяльності. Це працівники ветлабораторій, єгері, лісники та мисливці, працівники служб з вилову собак, роздільники м'яса тощо.

Курс вакцинації від сказу прописує хірург-травматолог, спеціально підготовлений до надання населенню повної антирабічної допомоги. Процедура імунізації здійснюється у повній відповідності до рекомендацій та інструкцій щодо використання антирабічних засобів. При цьому враховуються такі фактори, як ступінь тяжкості ушкодження/рани, наявність алергії, вагітність тощо, залежно від чого пацієнт лікується або амбулаторно або стаціонарно.

У деяких людей може проявитися побічна реакція на вакцину, що вводиться проти сказу. Така реакція буває місцевою чи загальною. У першому випадку спостерігається зміна кольору, структури, стану покриву шкіри в області введення ін'єкції (почервоніння, свербіж, висипання, ущільнення). Дані прояви алергії досить швидко проходять після вживання симптоматичних препаратів, наприклад, антигістамінних ліків.

У другому випадку побічні реакції на вакцину від сказу становлять серйознішу загрозу. До таких відносяться:

• Загальне нездужання. У пацієнта піднімається температура, з'являється слабкість і млявість, починає боліти голова.
• Неврологічні проблеми (зустрічаються нечасто, проте дуже небезпечні). Порушується чутливість у руках та ногах, з'являються вегетативні ускладнення, парези. Пацієнтів із подібними порушеннями слід лікувати та спостерігати у стаціонарі. Прояви різних неврологічних порушень можуть зберігатись протягом 3 місяців.
• Генералізовані реакції, виражені набряком Квінке. Вони зустрічаються дуже рідко, але при цьому загрожують життю пацієнта. Разом з тим, при грамотному лікуванні такі реакції сприяють швидшій стабілізації стану пацієнта.

Побічні ускладнення, що виникають внаслідок введення вакцини, можуть бути різними. Якщо хворому виконана ін'єкція виключно інактивованим вірусом, реакція може бути однією, а при введенні поєднання вакцини та АІГ – зовсім інший. Введення імуноглобуліну іноді буває болючим. Пацієнт відчуває біль у місці ін'єкції, але це вважається нормальним побічним явищем, у тому числі на пізніх термінах вакцинування.

Для АІГ часто характерні такі ускладнення як місцеві алергічні прояви. Такі реакції зазвичай тривають не більше двох діб із моменту введення препарату. Більш рідкісні ускладнення - це анафілактичний шок, який виникає моментально, а також сироваткова реакція загального характеру, що спостерігається зазвичай у період з 6-ї до 9-ї доби з моменту щеплення.

Таким чином, заходи щодо проведення попередження захворювання на сказ можуть бути небезпечними і далеко не завжди проходять безболісно. Однак такі заходи необхідні, оскільки лише вакцинація від сказу, якщо вона зроблена своєчасно, здатна врятувати людині життя. Не варто забувати, що сказ – це смертельне захворювання.