2. Серологічні реакції, що використовуються для діагностики вірусних інфекцій.

Серологічні методи, тобто методи вивчення антитіл та антигенів за допомогою реакцій антиген-антитіло, що визначаються у сироватці крові та інших рідинах, а також тканинах організму. Виявлення в сироватці крові хворого на антитіл проти антигенів збудника дозволяє поставити діагноз хвороби. Серологічні дослідження застосовують також для ідентифікації антигенів мікробів, різних біологічно активних речовин, груп крові, тканинних та пухлинних антигенів, імунних комплексів, рецепторів клітин та ін. е. сироваток крові гіперімунізованих тварин, що містять специфічні антитіла. Це звана серологічна ідентифікація мікроорганізмів. Особливості взаємодії антитіла з антигеном є основою діагностичних реакцій у лабораторіях. Реакція in vitro між антигеном та антитілом складається зі специфічної та неспецифічної фази. У специфічну фазу відбувається швидке специфічне зв'язування активного центру антитіла з антигеном детермінантою. Потім настає неспецифічна фаза - повільніша, яка проявляється видимими фізичними явищами, наприклад утворенням пластівців (феномен аглютинації) або преципітату у вигляді помутніння. Ця фаза потребує певних умов (електролітів, оптимального рН середовища). Зв'язування детермінанти антигену (епітопу) з активним центром Fab-фрагменту антитіл обумовлено ван-дер-ваальсовими силами, водневими зв'язками та гідрофобною взаємодією. Міцність і кількість антигену, що зв'язався, антитілами залежать від афінності, авидності антитіл та їх валентності.

3. Збудники малярії. Малярія –антропонозна інфекційна хвороба, що викликається декількома видами найпростіших роду Plasmodium, що передається комарами (Anopheles), що супроводжується лихоманкою, анемією, збільшенням печінки та селезінки. Збудники малярії відносяться до Protozoa, типу Apicomplexa, класу Sporozoa та видів Pl. vivax, Pl.malariae, Pl.falciparum, Pl.ovale.

Епідеміологія.Джерело інфекції – інвазована людина; переносник - самка комара роду Anopheles. Основний механізм передачі – трансмісивний через укус інвазованої самки комара.

Лікування та профілактика.Протималярійні препарати мають різну дію на безстатеві, статеві стадії плазмодіїв. До основних протималярійних препаратів відносять хінін, хлорохін, акрихін, примахін, хіноцид, бігумаль, хлоридин та ін. Профілактичні заходи спрямовані на джерело збудника (лікування хворих на малярію та носіїв) та знищення переносників збудника – комарів. Розробляються методи вакцинації з урахуванням антигенів, отриманих методом генетичної інженерії.

1.Класифікація антибіотиків за хімічною структурою, механізмом, спектром і типом дії.За хім. структ. 1клас-В-лактам - пеніцилін, цефалоспорин. 2 клас-макроліди-еритроміцин, азитроміцин. 3 клас-аміноглікозиди-стрептоміцин, канаміцин. 4 клас-тетрацикліни-окситетрациклін, доксициклін. 5 кл-поліпептиди-поліміксин. 6 кл-полієн-ністатин 7кл-анзаміцин-рифампіцин .

2. Залежно від механізму дії розрізняють п'ять груп антибіотиків: 1.гр антибіотики, що порушують синтез клітинної стінки-β-лактами. 2. гр антибіотики, що порушують молекулярну організацію і синтез клітинних мембран - поліміксини, полієни; 3. гр антибіотики, що порушують синтез білка -аміноглікозиди, тетрацикліни, макролі-ди, левоміцетин. , рифампіцин - синтез РНК; 5.гр антибіотики, що пригнічують синтез пуринів і амінокислот-сульфаніламіди. Кожна з цих груп включає дві підгрупи: антибіотики широкого та вузького спектра дії.1гр. Антибактеріальні антибіотики становлять найчисленнішу групу препаратів.

а) антибіотики широкого спектра дії впливають на представників усіх трьох відділів бактерій-аміноглікозиди, тетрацикліни та ін.

б) Антибіотики вузького спектра дії ефективні щодо невеликого кола бактерій-політ-міксини діють на грацилікутні, ванкоміцин впливає на грампозитивні бактерії.

2гр - протитуберкульозні, протилепрозні, протисифілітичні препарати.

3.Протигрибкові антибіотики.

а) Широкий спектр дії має амфотерицин В, ефективний при кандидозах, бластомікозах, аспергільозах; в той же час

б) антибіотиком вузького спектра дії. - ністатин, що діє на гриби роду Candida, є

4. Антипротозойні та антивірусні антибіотики налічують невелику кількість препаратів.

5.Протипухлинні антибіотики - препарати, що мають цитотоксичну дію. Більшість із них застосовують при багатьох видах пухлин-мітоміцин С. Дія антибіотиків на мікроорганізми пов'язана з їхньою здатністю пригнічувати ті чи інші біохімічні реакції, що відбуваються в мікробній клітині.

2. Теорії імунітету.1.Теорія імунітету Мечникова – фагоцитоз грає вирішальну роль антибактеріальному імунітеті. І.І.Мечников першим розглядав запалення як захисне, а чи не руйнівне явище. Вчений назвав захисні клітини, що діють таким чином, "пожираючими клітинами". Його молоді французькі колеги запропонували використати грецьке коріння того ж значення. І.І.Мечніков прийняв цей варіант, і з'явився термін "фагоцит". 2.Теорія імунітетуЕрліха - одна з перших теорій антитілоутворення, згідно з якою у клітин є антигенспецифічні рецептори, що вивільняються як антитіла під дією антигену. Протимікробні речовини крові Ерліх назвав "антитіло". П.Ерліх усвідомив, що і до контакту з конкретним мікробом в організмі вже є антитіла у вигляді, який він назвав "бічними ланцюгами" - це рецептори лімфоцитів антигенів. Потім Ерліх "вжив" до фармакології: у своїй теорії хіміотерапії він передбачав передіснування в організмі рецепторів для лікарських речовин. 1908 р. П.Ерліху вручили Нобелівську премію за гуморальну теорію імунітету. 3.Теорія імунітету Безрідкі- теорія, що пояснює захист організму від низки інфекційних хвороб виникненням специфічної місцевої несприйнятливості клітин до збудників. 4. Інструктивні теоріїімунітету - загальна назва теорій антитілоутворення, згідно з якими провідна роль в імунній відповіді відводиться антигену, що прямо бере участь в якості матриці при формуванні специфічної конфігурації антидетермінанти або виступає як фактор, спрямовано змінює біосинтез імуноглобулінів плазматичними клітинами.

3. Збудник ботулізму.рід Clostridium вид Clostridium botulinum викликає ботулізм - харчову інтоксикацію, що характеризується ураженням цнс. Хвороба виникає в результаті вживання харчових продуктів, що містять токсини С. Botulinum - грамлоложітельние палички із закругленими кінцями. має форму тенісної ракетки. Чи не утворюють капсулу. Рухливі. Облігатні анаероби. За антигенними властивостями яких поділяються на 7 сероварів. Ботулінічний екзотоксин - найсильніший з усіх біологічних отрут-надаючи нейротоксичну дію (смертельна доза для людини становить близько 0,3 мкг). Мікробіологічна діагностика. Виявлення та ідентифікація ботулінічного токсину у досліджуваному матеріалі за допомогою реакції зворотної непрямої гемаглютинації (РОНГА), реакції нейтралізації токсину антитоксином (антитоксичною сироваткою) на лабораторних тваринах. Бактеріологічний метод для виявлення збудника в досліджуваному матеріалі. Специфічна профілактика.Ботулінічні анатоксин А, В, Е входять до складу секстанатоксину, що застосовується за показаннями. Для екстреної пасивної профілактики можливе застосування протиботулінічних антитоксичних сироваток. Лікування.Використовують антитоксичні протиботулінічні гетерологічні сироватки та гомологічні імуноглобуліни.

Культивування. На кров'яному агарі утворює невеликі прозорі колонії, оточені зоною гемолізу. резистентність.Спори С. botulinum мають дуже високу резистентність до високих температур.

Епідеміологія.З ґрунту ботулінічна паличка потрапляє у харчові продукти, де розмножується та виділяє екзотоксин. Шлях передачі інфекції – харчовий. Найчастіше чинником передачі інфекції є консерви (грибні, овочеві, м'ясні, рибні). Від людини людині захворювання не передається. Патогенез.Ботулінічний токсин потрапляє з їжею до травного тракту. Стійкий до дії травних ферментів, токсин всмоктується через стінку кишечника в кров та зумовлює тривалу токсинемію. Токсин зв'язується нервовими клітинами та блокує передачу імпульсів через нервово-м'язові синапси. В результаті розвивається параліч м'язів гортані, глотки, дихальних м'язів, що призводить до порушення ковтання та дихання, спостерігаються зміни з боку органів зору. Клінічна картина.Інкубаційний період продовжується від 6-24 год до 2-6 днів. Чим коротший період інкубації, тим важче протікає хвороба. Зазвичай захворювання починається гостро, але температура тіла залишається нормальною. Можливі різні варіанти ботулізму – з величезним переважанням симптомів ураження травного тракту, розладів зору чи дихальної функції. У першому випадку захворювання починається з появи сухості у роті, нудоти, блювання, проносу. У другому – перші прояви хвороби пов'язані з порушеннями зору (хворий скаржиться на «туман» перед очима та двоїння). В результаті паралічу м'язів гортані з'являється осиплість, а потім голос зникає. Хворі можуть загинути від паралічу дихання. Захворювання може ускладнитися гострою пневмонією, токсичним міокардитом, сепсисом. Летальність за ботулізму становить 15-30%. Імунітет. не формується. Антитіла, що виробляються протягом захворювання, спрямовані проти певного серовару.

1.Методи визначення чутливості бактерій до антибіотиків. 1) Метод дифузії в агар.На агаризоване живильне середовище засівають мікроб, що досліджується, а потім вносять антибіотики. препарати вносять або спеціальні лунки в агарі, або поверхні посіву розкладають диски з антибіотиками («метод дисків»). Облік результатів проводять через добу за наявністю чи відсутністю зростання бактерій навколо лунок (дисків). 2)Методи визначення. мінімального рівня антибіотика,який дозволяє in vitro запобігти видимому зростанню мікробів у поживному середовищі або повністю його стерилізує. А)Визначення чутливості бактерій до антибіотиків методом дисків. Досліджувану бактеріальну культуру засівають газоном на живильний агар або середовище АГВ у чашці Петрі. В)На засіяну поверхню пінцетом поміщають на однаковій відстані один від одного паперові диски, які містять певні дози різних антибіотиків. Посіви інкубують при 37 С до наступного дня. По діаметру зон затримки зростання досліджуваної культури бактерій судять про її чутливість до антибіотиків.

Г)Визначення чутливості бактерій до антибіотиків методом серійних розведень. визначають мінімальну концентрацію антибіотика, що інгібує зростання досліджуваної культури бактерій.

Д) Оцінку результатів визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків проводять за спеціальною готовою таблицею, яка містить прикордонні значення діаметрів зон затримки росту для стійких, помірно стійких та чутливих штамів, а також значення МІК антибіотиків для стійких та чутливих штамів. 3)Визначення антибіотика в крові, сечі та інших рідинах організму людини.У штатив встановлюють два ряди пробірок. В одному з них готують розведення еталонного антибіотика, в іншому – досліджуваної рідини. Потім у кожну пробірку вносять завись тест-бактерій, приготовлену серед Гісса з глюкозою. При визначенні в досліджуваній рідині пеніциліну, тетрациклінів, еритроміцину як тест-бактерії використовують стандартний штам S. aureus, а при визначенні стрептоміцину – Е. coli. Після інкубування посівів при 37 °С протягом 18-20 год відзначають результати досвіду з помутніння середовища та його фарбування індикатором внаслідок розщеплення глюкози тест-бактеріями. Концентрація антибіотика визначається множенням найбільшого розведення досліджуваної рідини, що затримує зростання тест-бактерій, на мінімальну концентрацію еталонного антибіотика, що затримує зростання тих же тест-бактерій. Наприклад, якщо максимальне розведення досліджуваної рідини, що затримує зростання тест-бактерій, дорівнює 1:1024, а мінімальна концентрація еталонного антибіотика, що затримує зростання тих же тест-бактерій, 0,313 мкг/мл, твір 1024-0,313=320 мкг/мл антибіотика на 1 мл.

4) Визначення здатності S. aureus продукувати бета-лактамазу.У колбу з 0,5 мл добової бульйонної культури стандартного штаму стафілококу, чутливого до пеніциліну, вносять 20 мл розплавленого та охолодженого до 45 °С живильного агару, перемішують і виливають у чашку Петрі. Після застигання агару в центр чашки поверхню середовища поміщають диск, що містить пеніцилін. По радіусах диска петлею засівають досліджувані культури. Посіви інкубують при 37 С до наступного дня, після чого відзначають результати досвіду. Про здатність досліджуваних бактерій продукувати бета-лакта-мазу судять за наявністю зростання стандартного штаму стафілококу навколо тієї чи іншої досліджуваної культури (навколо диска).

2.Розлади імунної системи: первинні та вторинні імунодефіцити.Імунодефіцити - це порушення нормального імунного статусу, обумовлені дефектом одного або декількох механізмів імунної відповіді. Первинні, або вроджені імунодефіцити. Можливі комбіновані та селективні варіанти імунних розладів. Залежно від рівня та характеру порушень розрізняють гуморальні, клітинні та комбіновані імунодефіцити.

Причини: подвоєння хромосом, точкові мутації, дефект ферментів обміну нуклеїнових кислот, генетично обумовлені порушення мембран, пошкодження геному в ембріональному періоді та ін. Прояви- Недостатність фагоцитозу, системи комплементу, гуморального імунітету (В-системи), клітинного імунітету (Т-системи). Вторинні, або набуті, імунодефіцити Вторинні імунодефіцити на відміну від первинних розвиваються в осіб з імунною системою, що нормально функціонувала від народження. Вони формуються під впливом навколишнього середовища на рівні фенотипу та обумовлені порушенням функції імунної системи внаслідок різних захворювань або несприятливих впливів на організм. Уражатися Т-і В-системи імунітету, фактори неспецифічної резистентності, можливі також їх поєднання. Побічні імунодефіцити зустрічаються значно частіше, ніж первинні. Вторинні імунодефіцити піддаються імунокорекції,

Вторинні імунодефіцити можуть бути:

після перенесених інфекцій (особливо вірусних) та інвазій (протозойні та гельмінтози);

при опіковій хворобі;

при уремії; при пухлинах;

при порушенні обміну речовин та виснаженні;

при дисбіоз;

при тяжких травмах, великих хірургічних операціях, що особливо виконуються під загальним наркозом; при опроміненні, дії хімічних речовин;

при старінні,

медикаментозні, пов'язані із прийомом ліків.

За клінічнимперебігу виділяють: 1) компенсовану, - підвищеною сприйнятливістю організму до інфекційних агентів. 2) субкомпенсовану-хронізація інфекційних процесів.

3) декомпенсовану – генералізованих інфекцій, викликаних умовно-патогенними мікробами (УПМ) та злоякісними новоутвореннями.

3. Збудник амебіазу. Таксономія. Характеристики. Мікробіологічна діагностика Специфічне лікування. Амебіаз – інфекційна хвороба, що викликається Entamoeba histolytica, що супроводжується виразковим ураженням товстої кишки; можливе утворення абсцесів у різних органах; протікає хронічно. Protozoa, типу Sarcomastidophora, підтипу Sarcodina.

Морфологія та культивування.Збудник існує у двох стадіях розвитку: вегетативної та цистної. Вегетативна стадія має кілька форм (тканинна, велика вегетативна, просвітня та передцистна). Циста (стадія, що спочиває) має овальну форму, утворюється з вегетативних форм в кишечнику. Інфікування відбувається при попаданні цист збудника в кишечник, де їх утворюються кишкові вегетативні форми.

Резистентність. Поза організмом швидко (через 30 хв) гинуть тканинна та просвітна форми збудника. Цисти стійкі у навколишньому середовищі, зберігаючись у фекаліях та воді при температурі 20ºС протягом місяця. У продуктах харчування, на овочах та фруктах цисти зберігаються протягом кількох днів.

Механізм передачі –фекально-оральний. Зараження відбувається при занесенні цист із продуктами харчування, особливо овочами та фруктами, рідше – з водою, через предмети домашнього вжитку. Поширенню цист сприяють мухи та таргани.

Патогенез та клінічна картина.Цисти, що потрапили в кишечник, і форми амеб, що утворилися просвітню, можуть мешкати в ньому, не викликаючи захворювання. При зниженні резистентності організму амеби проникають у стінку кишечника і розмножуються. Розвивається кишковий амебіаз. Цьому процесу сприяють деякі представники мікрофлори кишківника. Уражаються з утворенням виразок верхній відділ товстої кишки, іноді пряма кишка. Відзначається частий рідкий стілець. У випорожненнях виявляють гнійні елементи та слиз. Може відбуватись перфорація кишкової стінки з розвитком гнійного перитоніту. Амеби зі струмом крові можуть потрапляти до печінки, легень, головного мозку – розвивається позакишковий амебіаз. Можлива поява шкірного амебіазу, що розвивається як результат вторинного процесу. На шкірі періанальної області, промежини та сідниць утворюються ерозії та малоболючі виразки. Імунітет. При амебіазі імунітет нестійкий. Лікування та профілактика. У лікуванні використовуються такі препарати: що діють на амеб, що знаходяться у просвіті кишечника (похідні оксихіноліну – хініофон, ентеросептол, мексаформ, інтестопан, а також сполуки миш'яку – амінарсон, осарсол та ін.); що діють на тканинні форми амеб (препарати еметину); діють на просвітні форми амеб і амеб, що у стінці кишки (тетрациклини); діють на амеб за будь-якої їх локалізації (похідні імідазолу – метронідазол). Профілактикаамебіаза пов'язана з виявленням та лікуванням цистовидільників та носіїв амеб.

Мікробіологічна діагностикаОсновний метод – мікроскопічне дослідження випорожнень хворого, а також вмісту абсцесів внутрішніх органів. Мазки забарвлюють розчином Люголв або гематоксиліном з метою ідентифікації цист та трофозоїтів. Серологічний метод: РІГА, ІФА, РЗК та ін. Найбільш високий титр антитіл виявляють при позакишковому амебіазі.

Віч інфекція
ВІЛ-інфекція - захворювання, що викликається вірусом імунодефіциту людини (ВІЛ), який тривалий час персистує в лімфоцитах, макрофагах, клітинах нервової тканини, внаслідок чого розвивається повільно прогресуюче ураження імунної та нервової систем організму, що проявляється вторинними інфекціями, пухлинами, змінами.
Збудники - віруси імунодефіциту людини t-го та 2-го типів - ВІЛ-1, ВІЛ-2 (HIV-I, HIV-2, Human Immunodeficiency viruses, types I, 11) - відносяться до сімейства ретро-вірусів, підродини повільних вірусів . Віріони є сферичними частинками діаметром 100-140 нм. Вірусна частка має зовнішню фосфоліпідну оболонку, що включає глікопротеїни (структурні білки) з певною молекулярною масою, що вимірюється в кілодальтонах. У ВІЛ-1 це gp 160, gp 120, gp 41. Внутрішня оболонка вірусу, що покриває ядро, також представлена ​​білками з відомою молекулярною масою - р 17, р 24, р 55 (ВІЛ-2 містить gp 140, gp 105, gp 36, p 16, p 25, p 55).
До складу геному ВІЛ входить РНК та фермент зворотної транскриптази (ревертази). Щоб геном ретровируса з'єднався з геномом клітини господаря, спочатку з допомогою ревертази відбувається синтез ДНК на матриці вірусної РНК. Потім ДНК провірусу вбудовується в геном клітини-хазяїна. ВІЛ має виражену антигенну мінливість, що значно перевищує таку у вірусу грипу.
В організмі людини основною мішенню ВІЛ є Т-лімфоцити, що несуть на поверхні найбільшу кількість CD4-рецепторів. Після проникнення ВІЛ у клітину за допомогою ревертази на зразок своєї РНК вірус синтезує ДНК, яка вбудовується в генетичний апарат клітини-господаря (Т-лімфоцити) і залишається там довічно в стані провірусу. Крім Т-лімфоцитів-хелперів, уражаються макрофаги, В-лімфоцити. клітини нейроглії, слизової оболонки кишечника та деякі інші клітини. Причиною зниження кількості Т-лімфоцитів (клітини CD4) є не лише пряма цитопатична дія вірусу, а й їхнє злиття з неінфікованими клітинами. Поряд з ураженням Т-лімфоцитів у хворих на ВІЛ-інфекцію відзначається поліклональна активація В-лімфоцитів зі збільшенням синтезу імуноглобулінів усіх класів, особливо IgG та IgA, н подальшим виснаженням цього відділу імунної системи. Порушення регуляції імунних процесів проявляється також підвищенням рівня альфа-інтерферону, бета-2-мікро глобуліну, зниженням рівня інтерлейкіну-2. Внаслідок порушення функції імунної системи, особливо при зниженні числа Т-лімфоцитів (CD4) до 400 і менше клітин на 1 мкл крові, виникають умови для неконтрольованої реплікації ВІЛ зі значним збільшенням кількості віріонів у різних середовищах організму. Внаслідок ураження багатьох ланок імунної системи людина, заражена ВІЛ, стає беззахисною перед збудниками різних інфекцій. На фойє імунодепресії, що наростає, розвиваються важкі прогресуючі хвороби, які не зустрічаються у людини з нормально функціонуючої імунної системою. Ці хвороби ВООЗ визначила як СНІД-маркерні (індикаторні).
Перша група - захворювання, які притаманні лише тяжкому імунодефіциту (рівень CD4 нижче 200). Клінічний діагноз ставлять за відсутності анти-ВІЛ-антитіл або ВІЛ-антигенів.
Друга група - захворювання, що розвиваються як на тлі тяжкого імунодефіциту, так і в ряді випадків без нього. Тому в таких випадках потрібне лабораторне підтвердження діагнозу.

Лабораторна діагностика

УДК -078

Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

Н.М. Носік, В.М. Стаханова

Інститут вірусології ім. Д.І. Іванівського РАМН, Москва

Laboratory Diagnosis of Viral Infections

N.N. Nosik, V.M. Stachanova

Вступ

Розширення можливостей у лікуванні та профілактиці вірусних хвороб з використанням противірусних препаратів, імуномодуляторів та вакцин з різним механізмом дії потребує швидкої та точної лабораторної діагностики. Вузька специфічність деяких противірусних препаратів також потребує швидкої та високоспецифічної діагностики інфікуючого агента. З'явилася потреба у кількісних методах визначення вірусів для моніторингу противірусної терапії. Крім встановлення етіології захворювання, лабораторна діагностика має важливе значення в організації протиепідемічних заходів.

Рання діагностика перших випадків епідемічних інфекцій дозволяє своєчасно провести протиепідемічні заходи – карантин, госпіталізацію, вакцинацію та ін. Реалізація програм ліквідації інфекційних захворювань, наприклад натуральної віспи, показала, що з їх виконання зростає роль лабораторної діагностики. Істотну роль відіграє лабораторна діагностика у службі крові та акушерській практиці, наприклад, виявлення донорів, інфікованих вірусом імунодефіциту людини(ВІЛ), вірусом гепатиту В (HBV), діагностика краснухи та цитомегаловірусної інфекції у вагітних.

Діагностичні методи

У лабораторній діагностиці вірусних інфекцій є три основні підходи (табл. 1, табл. 2):

1) безпосереднє дослідження матеріалу на наявність вірусного антигену чи нуклеїнових кислот;

2) ізоляція та ідентифікація вірусу з клінічного матеріалу;

3) серологічна діагностика, що ґрунтується на встановленні значного приросту вірусних антитіл протягом хвороби.

За будь-якого обраного підходу до вірусної діагностики одним з найважливіших факторів є якість досліджуваного матеріалу. Так, наприклад, для прямого аналізу зразка або для ізоляції вірусу досліджуваний матеріал повинен бути отриманий на самому початку захворювання, коли збудник ще екскретується відносно великих кількостях і не пов'язаний поки антитілами, а обсяг зразка повинен бути достатній для проведення прямого дослідження. Також важливим є вибір матеріалу відповідно до передбачуваного захворювання, тобто того матеріалу, в якому виходячи з патогенезу інфекції ймовірність присутності вірусу найбільша.

Не останню роль успішної діагностиці грає середовище, у яку береться матеріал, як і транспортується як і зберігається. Так, носоглоткові або ректальні мазки, вміст везикул поміщають у середовище, що містить білок, що запобігає швидкій втраті інфекційності вірусу (якщо планується його ізоляція), або у відповідний буфер (якщо планується робота з нуклеїновими кислотами).

Прямі методи діагностики клінічного матеріалу

Прямі методи – це методи, які дозволяють виявити вірус, вірусний антиген чи вірусну нуклеїнову кислоту(НК) безпосередньо у клінічному матеріалі, тобто є найшвидшими (2–24 год). Однак через ряд особливостей збудників прямі методи мають свої обмеження (можливість отримання хибнопозитивних і хибнонегативних результатів). Тому часто вимагають підтвердження непрямими методами.

Електронна мікроскопія (ЕМ). За допомогою цього можна виявити власне вірус. Для успішного визначення вірусу його концентрація в пробі повинна бути приблизно 110 6 частинок в 1 мл. Але оскільки концентрація збудника, як правило, у матеріалі від хворих незначна, пошук вірусу утруднений і вимагає попереднього його осадження за допомогою високошвидкісного центрифугування з подальшим негативним контрастуванням. Крім того, ЕМ не дозволяє типувати віруси, так як у багатьох немає морфологічних відмінностей всередині сімейства. Наприклад, віруси простого герпесу, цитомегалії або оперізувального герпесу морфологічно практично не відрізняються.

Одним з варіантів ЕМ, що використовується в діагностичних цілях, є імунна електронна мікроскопія(ІЕМ), при якій застосовуються специфічні антитіла до вірусів. Внаслідок взаємодії антитіл з вірусами утворюються комплекси, які після негативного контрастування легше виявляються.

ІЕМ дещо чутливіша, ніж ЕМ, і використовується в тих випадках, коли вірус не вдається культивувати in vitroнаприклад при пошуку збудників вірусних гепатитів.

Реакція імунофлюоресценції (РІФ). Метод заснований на використанні антитіл, пов'язаних з барвником, наприклад флюоресцеїнізотіоціанатом. РІФ широко застосовується для виявлення вірусних антигенів у матеріалі хворих та для швидкої діагностики.

У практиці застосовуються два варіанти РІФ: прямийі непрямий. У першому випадку застосовуються мічені барвником антитіла до вірусів, які наносяться на інфіковані клітини (мазок, культура клітин). Отже, реакція протікає одноетапно. Незручністю методу є необхідність мати великий набір кон'югованих специфічних сироваток до багатьох вірусів.

При непрямому варіанті РІФ на досліджуваний матеріал наноситься специфічна сироватка, антитіла якої зв'язуються з вірусним антигеном, що знаходиться в матеріалі, а потім нашаровується антивидова сироватка до гамма-глобулінів тварини, в якому готувалася специфічна імунна сироватка, наприклад антикролича. непрямого варіанта РІФ полягає у потребі лише одного виду мічених антитіл.

Метод РІФ широко застосовується для швидкого розшифрування етіології гострих респіраторних вірусних інфекцій під час аналізу мазків-відбитків зі слизової оболонки верхніх дихальних шляхів. Успішне застосування РІФ для прямої детекції вірусу в клінічному матеріалі можливе лише у разі вмісту в ньому досить великої кількості інфікованих клітин та незначної контамінації мікроорганізмами, які можуть давати неспецифічне свічення.

Імуноферментний аналіз (ІФА). Імуноферментні методи визначення вірусних антигенів у принципі подібні до РІФ, але ґрунтуються на міченні антитіл ферментами, а не барвниками. Найбільш широко використовується пероксидаза хрону та лужна фосфатаза, застосовують також -галактозидазу та -лактамази. Мічені антитіла зв'язуються з антигеном і такий комплекс виявляється при додаванні субстрату для ферменту, з яким кон'юговані антитіла. Кінцевий продукт реакції може бути у вигляді нерозчинного осаду, і тоді облік проводиться за допомогою звичайного світлового мікроскопа, або у вигляді розчинного продукту, який зазвичай пофарбований (або флюоресціювати або люмінесцувати) і реєструється інструментально.

Оскільки за допомогою ІФА можна вимірювати розчинні антигени, то не потрібна наявність інтактних клітин у зразку і таким чином можуть використовуватися різні види клінічного матеріалу.

Інша важлива перевага методу ІФА – можливість кількісного визначення антигенів, що дозволяє застосовувати його для оцінки клінічного перебігу хвороби та ефективності хіміотерапії. ІФА, як і РІФ, може застосовуватися як у прямому, так і непрямому варіанті.

Твердофазний ІФА, що дає розчинний забарвлений продукт реакції, знайшов найбільше поширення. ІФА може бути використаний як визначення антигену (тоді на тверду фазу - дно лунки полістиролового планшета - наносяться антитіла), так і для визначення антитіл (тоді на тверду фазу наносяться антигени) .

Радіоімунний аналіз (РІА) . Метод ґрунтується на мітці антитіл радіоізотопами, що забезпечувало високу чутливість у визначенні вірусного антигену. Широке поширення метод отримав у 80-ті роки, особливо визначення маркерів HBV та інших некультивируемых вірусів. До недоліків методу належить необхідність працювати з радіоактивними речовинами та використання дорогого обладнання (гамма-лічильників).

Молекулярні методи. Спочатку класичним методом виявлення вірусного геному вважався високоспецифічний метод гібридизації ПК, але в даний час все ширше використовується виділення геномів вірусу за допомогою полімеразної ланцюгової реакції(ПЛР).

Молекулярна гібридизація нуклеїнових кислот.Метод заснований на гібридизації комплементарних ниток ДНК або РНК з утворенням двониткових структур та виявлення їх за допомогою мітки. З цією метою використовуються спеціальні ДНК- або РНК-зонди, мічені ізотопом (32 Р) або біотином, що виявляють комплементарні нитки ДНК або РНК. Існують кілька варіантів методу: – точкова гібридизація – виділену та денатуровану ПК наносять на фільтри і потім додають мічений зонд; індикація результатів - авторадіографія при використанні 32 Р або забарвлення - при авідін-біотині; – блот-гібридизація – метод виділення фрагментів ПК, нарізаних рестрикційними ендонуклеазами із сумарної ДНК та перенесених на нітроцелюлозні фільтри та тестовані міченими зондами; використовується як підтверджуючий тест при ВІЛ-інфекції; - Гібридизація in situ- дозволяє визначати ПК в інфікованих клітинах.

ПЛРґрунтується на принципі природної реплікації ДНК. Суть методу полягає у багаторазовому повторенні циклів синтезу (ампліфікації) вірусспецифічної послідовності ДНК за допомогою термостабільної Taq ДНК-полімерази та двох специфічних затравок – так званих праймерів.

Кожен цикл складається з трьох стадій із різним температурним режимом. У кожному циклі подвоюється кількість копій ділянки, що синтезується. Знову синтезовані фрагменти ДНК служать як матриця для синтезу нових ниток у наступному циклі ампліфікації, що дозволяє за 25-35 циклів напрацювати достатню кількість копій обраної ділянки ДНК для її визначення, як правило, за допомогою електрофорезу в агарозному гелі.

Метод високоспецифічний і дуже чутливий. Він дозволяє виявити кілька копій вірусної ДНК у досліджуваному матеріалі. В останні роки ПЛР знаходить все ширше застосування для діагностики та моніторингу вірусних інфекцій (віруси гепатитів, герпесу, цитомегалії, папіломи та ін.).

Розроблено варіант кількісної ПЛР, що дозволяє визначати кількість копій ампліфікованого сайту ДНК. Методика проведення складна, дорога і поки що недостатньо уніфікована для рутинного застосування.

Цитологічні методи в даний час мають обмежене діагностичне значення, але при ряді інфекцій, як і раніше, повинні застосовуватися. Досліджуються матеріали аутопсії, біопсії, мазки, які після відповідної обробки фарбуються та аналізуються під мікроскопом. При цитомегаловірусної інфекції, наприклад, у зрізах тканини або в сечі виявляються характерні гігантські клітини - "совине око", при сказі - включення в цитоплазмі клітин (тільця Бабеша - Негрі). У деяких випадках, наприклад, при диференціальній діагностиці хронічних гепатитів, має значення оцінка стану тканини печінки.

Для діагностики вірусних захворювань застосовують такі методи:

1) Вірусоскопічний.

2) Імунної електронної мікроскопії.

3) Вірусологічний.

4) Серологічний.

5) Імунофлуоресцентний.

6) Біологічний.

7) Використання ДНК-(РНК)-зондів.

8) Ланцюгова полімеразна реакція.

Про розмноження (репродукції) вірусів у культурі клітин судять за цитопатичною дією (ЦПД), яке може бути виявлено мікроскопічно і характеризується морфологічними змінами клітин.

Характер ЦПД вірусів використовують як їх виявлення (індикації), так орієнтовної ідентифікації, т. е. визначення їх видової приналежності.

Методи індикації вірусів:

1) Реакція гемадсорбції – заснований на здатності поверхні клітин, у яких вони репродукуються, адсорбувати еритроцити – реакція гемадсорбції. Для її постановки в культуру клітин, заражених вірусами, додають завись еритроцитів і після деякого часу контакту клітини промивають ізотонічним розчином натрію хлориду. На поверхні уражених вірусами клітин залишаються прилиплі еритроцити.

2) Реакція гемаглютинації (РГ). Застосовується для виявлення вірусів у культуральній рідині культури клітин або хоріоналантоїсної або амніотичної рідини курячого ембріона.

Серологічні методи можуть бути використані для виявлення у досліджуваному матеріалі як специфічних антитіл, так і антигенів вірусних. Для цих цілей можуть бути використані всі відомі серологічні реакції:

1) Реакція зв'язування комплементу.

2) Реакція пасивної гемаглютинації та її варіанти (РНАг, РНАт).

3) Реакція гальмування гемаглютинації.

4) Реакція гемаглютинації імунного прилипання (комплекс антиген + антитіло у присутності комплементу адсорбується на еритроцитах).

5) Реакції преципітації у гелі.

6) Реакція нейтралізації вірусів.

7) Радіоімунний метод.

8) Методи імуноферментного аналізу.

З перерахованих методів все більшою популярністю користуються методи імуноферментного аналізу, що відрізняються високою специфічністю та зручністю використання.

7. Реакція гемаглютинації, її механізм у вірусів грипу. Реакція гальмування гемаглютинації, її практичне застосування.

Реакція гемаглютинації (РГ). Застосовується для виявлення вірусів у культуральній рідині культури клітин або хоріоналантоїсної або амніотичної рідини курячого ембріона.

8. Особливості противірусного імунітету. Роль фагоцитозу та гуморальних факторів в імунітеті. Інтерферони, характеристика основних властивостей, класифікація. Особливості дії інтерферонів на віруси .

У захисті організму від вірусів беруть участь усі системи імунітету, проте противірусний імунітет має суттєві специфічні риси. Вони визначаються тим, що насамперед на проникнення вірусу в організм реагують не системи комплементу і макрофагів, а системи інтерферонів і Т-кілерних клітин. Інша особливість формування імунітету пов'язана з тим, що віруси мають слабкий антигенний вплив на В-лімфоцити і для їх активування, проліферації та диференціювання необхідна участь Т-хелперів і відповідно представлення останнім процесованого вірусного антигену (пептидних фрагментів) за участю молекул МНС класу II. Тому роль макрофагів та інших антигенпредставляючих клітин полягає не стільки в самому фагоцитозі, скільки в процесуванні та поданні антигену.

На проникнення вірусу насамперед реагує система інтерферонів, які пригнічують внутрішньоклітинне розмноження вірусів. Крім того, противірусну дію мають сироватку крові a- і b-інгібітори. Альфа-інгібітор – термостабільний субстрат, входить до складу а-глобулінів, перешкоджає адсорбції вірусів на клітині, руйнується нейрамінідазою орто- та параміксовірусів. Бета-інгібітор – термолабільний мукопептид, входить до складу b-глобулінів, пригнічує розмноження орто- та параміксовірусів.

Проте інтерферонів та інгібіторів виявилося замало захисту від вірусів, тому природа створила проти вірусів інший, дуже потужний механізм захисту лише на рівні організму. Він представлений насамперед Т-цитотоксичними лімфоцитами та іншими кілерними клітинами. Ці клітини розпізнають всі чужорідні антигени, у тому числі й вірусні, що їх молекули МНС класу I. Головне біологічне значення Т-кілерних клітин і полягає у виявленні та знищенні будь-яких клітин, інфікованих чужорідними антигенами.

Інтерферон є сімейством білків-глікопротеїдів, які синтезуються клітинами імунної системи та сполучної тканини. Залежно від цього, якими клітинами синтезується інтерферон, виділяють три типу: ?, ? та?-інтерферони.

Альфа-інтерферон виробляється лейкоцитами і отримав назву лейкоцитарного; бета-інтерферон називають фібробластним, оскільки він синтезується фібробластами – клітинами сполучної тканини, а гамма-інтерферон – імунним, оскільки він виробляється активованими Т-лімфоцитами, макрофагами, природними кілерами, тобто імунними клітинами.

Вироблення інтерферону різко зростає при інфікуванні вірусами, крім противірусної дії інтерферон має протипухлинний захист, так як затримує проліферацію (розмноження) пухлинних клітин, а також імуномодулюючою активністю, стимулюючи фагоцитоз, природні кілестри, регулюючи антитіло.

Механізм дії. Інтерферон безпосередньо на вірус поза клітиною не діє, а зв'язується зі спеціальними рецепторами клітин і впливає на процес репродукції вірусу всередині клітини на стадії синтезу білків.

Вірусологія приватна

1. Віруси-збудники гострих респіраторних захворювань (ГРЗ). Класифікація. Загальна характеристика ортоміксовірусів. Структура віріона грипу. Особливості його геному і реалізації інформації, що міститься в ньому. Реплікація віріонної РНК.

1.Віруси – збудники орз. класифікація.

Збудниками ГРЗ є такі віруси:

1. Віруси грипу А, В, С (Orthomyxoviridae)

2. Параміксовіруси (Paramyxoviridae) – це сімейство включає три роди: paramyxovirus – віруси парагрипу людини (ВПГЧ) 1, 2, 3, 4-го типів, хвороби Ньюкасл, парагрипу птахів та паротиту; Pneumovirus – респіраторно-синцитіальний вірус (RS-вірус); Morbillivirus - вірус кору.

3. Респіраторні коронавіруси (Coronaviridae).

4. Респіраторні реовіруси (Reoviridae).

5. Пікорнавіруси (Picornaviridae).

Вірус грипу А

Віріон має сферичну форму та діаметр 80-120 нм. Геном вірусу представлений однониткової фрагментованої (8 фрагментів) негативної РНК із загальною м. м. 5 МД. Тип симетрії нуклеокапсиду спіральний. Віріон має суперкапсид (мембрану), що містить два глікопротеїди - гемагглютинін та нейрамінідазу, які виступають над мембраною у вигляді різних шипів.

Віруси – збудники гострих респіраторних захворювань. Особливості прояву захворювань, що викликаються вірусами грипу, парагрипу, риновірусами, респіраторно-синцитіальним вірусом та аденовірусами. Лабораторні методи їхньої діагностики.

Віріон має сферичну форму та діаметр 80-120 нм. Геном вірусу представлений однониткової фрагментованої (8 фрагментів) негативної РНК із загальною м. м. 5 МД. Тип симетрії нуклеокапсиду спіральний. Віріон має суперкапсид (мембрану), що містить два глікопротеїди – гемагглютинін та нейрамінідазу, які виступають над мембраною у вигляді різних шипів.

У вірусів грипу А людини, ссавців і птахів виявлено 13 типів гемаглютиніну, що відрізняються за антигеном, яким присвоєна наскрізна нумерація (відН1доН13).

Нейрамінідаза (N) є тетрамер з м. м. 200-250 кД, кожен мономер має м. м. 50-60 кД.

У вірусу грипу А виявлено 10 різних варіантів ней-рамінідази

Лабораторна діагностика. Матеріалом для дослідження служить носоглотки, що відокремлюється, яке отримують або шляхом змиву, або за допомогою ватно-марлевих тампонів, і кров. Методи діагностики застосовують такі:

1. Вірусологічний – зараження курячих ембріонів, культур клітин нирок зелених мавп (Vero) та собак (МДСК). Культури клітин особливо ефективні виділення вірусів A (H3N2) і У.

2. Серологічний – виявлення специфічних антитіл та зростання їх титру (у парних сироватках) за допомогою РТГА, РСК, імуноферментного методу.

3. Як прискорену діагностику використовують імунофлуоресцентний метод, що дозволяє швидко виявити вірусний антиген у мазках-відбитках зі слизової оболонки носа або у змивах із носоглотки хворих.

4. Для виявлення та ідентифікації вірусу (вірусних антигенів) запропоновано методи РНК-зонду та ПЛР.

Специфічна профілактика

1) жива з атенуйованого вірусу; 2) вбита цільновіріон-на; 3) субвіріонна вакцина (з розщеплених віріонів); 4) субодинична -вакцина, що містить лише гемагглютинін та нейрамінідазу.

Віруси грипу (ортоміксовіруси). Загальна характеристика. Білки суперкапсиду, їх функції, значення мінливості (шифту та дрейфу) для епідеміології грипу. Методи лабораторної діагностики Вакцини для профілактики грипу.

Гостра інфекційна хвороба з лихоманкою, ураженням печінки. Антропоноз.

Таксономія, морфологія, антигенна структура: Сімейство Picornaviridae рід Hepatovirus. Типовий вигляд має один серотип. Це РНК-вірус, просто організований, має один вірусоспецифічний антиген.

Культивування: Вірус вирощують у культурах клітин. Цикл репродукції триваліший, ніж у ентеровірусів, цитопатичний ефект не виражений.

Резистентність: Стійкість до нагрівання; інактивується при кип'ятінні протягом 5 хв. Відносно стійкий у зовнішньому середовищі (воді).

Епідеміологія. Джерело-хворі. Механізм зараження – фекально-оральний. Віруси виділяються із фекаліями на початку клінічних проявів. З появою жовтяниці інтенсивність виділення вірусів знижується. Віруси передаються через воду, харчові продукти, руки.

Хворіють переважно діти віком від 4 до 15 років.

Мікробіологічна діагностика Матеріал для дослідження - сироватка та випорожнення. Діагностика заснована головним чином на визначенні крові IgM за допомогою ІФА, РІА та імунної електронної мікроскопії. Цими методами можна виявити вірусний антиген у фекаліях. Вірусологічне дослідження не проводять.

3. Вірусологічна діагностика грипу. Виділення вірусу, визначення його типу. Серологічні методи діагностики грипу: РЗК, РТГА. Прискорений метод діагностики з використанням флуоресціюючих антитіл.

Мікробіологічна діагностика Діагноз «грип» базується на (1) виділенні та ідентифікації вірусу, (2) визначенні вірусних АГ у клітинах хворого, (3) пошуку вірусоспецифічних антитіл у сироватці хворого. При відборі матеріалу для дослідження важливо отримати уражені вірусом клітини, оскільки саме в них відбувається реплікація вірусів. Матеріал для дослідження - носоглоткове відділення. Для визначення антитіл досліджують парні сироватки хворого.

Експрес-діагностика. Виявляють вірусні антигени у досліджуваному матеріалі за допомогою РІФ (прямий та непрямий варіанти) та ІФА. Можна виявити у матеріалі геном вірусів з допомогою ПЛР.

Вірусологічний метод. Оптимальна лабораторна модель для культивування штамів-курячий ембріон. Індикацію вірусів проводять залежно від лабораторної моделі (за загибеллю, за клінічними та патоморфологічними змінами, ЦПД, утворення «бляшок», «кольоровій пробі», РДА та гемадсорбції). Ідентифікують віруси за антигенною структурою. Застосовують РСК, РТГА, ІФА, РБН (реакцію біологічної нейтралізації) вірусів та ін. Зазвичай тип вірусів грипу визначають РСК, підтип - РТГА.

Серологічний метод. Діагноз ставлять при чотириразовому збільшенні титру антитіл у сироватках парних від хворого, отриманих з інтервалом в 10 днів. Застосовують РТГА, РЗК, ІФА, РБН вірусів.

Аденовіруси, характеристика властивостей, склад групи. Аденовіруси, патогенні для людини. Особливості патогенезу аденовірусних інфекцій, методи культивування аденовірусів. Діагностика аденовірусних хвороб.

Сімейство Adenoviridae поділяється на два роди: Mastadenovirus - аденовіруси ссавців, він включає аденовіруси людини (41 сероваріант), мавп (24 се-роваріанта), а також великої рогатої худоби, коней, овець, свиней, собак, мишей, земноводних; та Aviadenovirus – аденовіруси птахів (9 сіроваріантів).

Аденовіруси позбавлені суперкапсиду. Віріон має форму ікосаедра – кубічний тип симетрії, його діаметр 70-90 нм. Капсид складається з 252 капсомерів діаметром 7-9 нм.

У складі віріона виявлено щонайменше 7 антигенів. Інкубаційний період – 6-9 днів. Вірус розмножується в епітеліальних клітинах верхніх дихальних шляхів, слизової оболонки очей. Може проникати у легені, вражати бронхи та альвеоли, спричиняти важку пневмонію; характерна біологічна властивість аденовірусів – тропізм до лімфоїдної тканини.

Аденовірусні захворювання можна характеризувати як гарячкові з катаральним запаленням слизової оболонки дихальних шляхів та очей, що супроводжуються збільшенням підслизової лімфоїдної тканини та регіонарних лімфатичних вузлів.

Лабораторна діагностика. 1. Виявлення вірусних антигенів у уражених клітинах за допомогою методів імунофлуоресценції або ІФМ. 2. Виділення вірусу. Матеріалом для дослідження служать відокремлюване носоглотки і кон'юнктиви, кров, випорожнення (вірус вдається виділити не тільки на початку хвороби, але і на 7-14-й день). Для ізоляції вірусу використовують первинно-трипсинізовані культури клітин (у тому числі диплоїдні) ембріона людини, які чутливі до всіх сероваріантів аденовірусів. Віруси виявляють за їх цитопатіческій ефект і за допомогою РСК, так як всі вони мають загальний комплемент-зв'язуючим антигеном. Ідентифікацію проводять за типоспецифічними антигенами за допомогою РТГА та РН у культурі клітин. 3. Виявлення наростання титру антитіл у парних сироватках хворого за допомогою РЗК. Визначення наростання титру типоспецифічних антитіл здійснюють з еталонними сероштамм аденовірусів в РТГА або РН в культурі клітин.

5. Віруси Коксакі та ЕСНО. Характеристика їх властивостей. Склад груп. Методи мікробіологічної діагностики захворювань, що викликаються вірусами Коксакі та ЕСНО.

Коксакі є найбільш кардіотропними з усіх ентеровірусів. У 20-40% хворих віком до 20 років Коксакі-інфекція ускладнюється міокардитом. Віруси Коксакі представлені двома групами: група Коксакі А включає 23 сероваріанти (А1-А22, 24); група Коксакі включає 6 сероваріантів (В1-В6).

Віруси Коксакі А та В можуть викликати у людини крім поліоміє-літоподібних захворювань, що іноді супроводжуються паралічами, та різні інші захворювання зі своєрідною клінікою: асептичний менінгіт, епідемічна міалгія (Борнхольмська хвороба), герпангіна, мала хвороба, гастроентерити, гострі

ECHO, що означає: Е – enteric; С - cytopathogenic; H – human; Про - orphan - сирітка. налічує 32 сероваріанти.

Джерелом Коксакі- та ЕСНО-інфекцій є людина. Зараження вірусами відбувається фекально-оральним шляхом.

Патогенез захворювань, що викликаються вірусами Коксакі та ECHO, подібний до патогенезу поліомієліту. Вхідними воротами є слизова оболонка носа, глотки, тонкого кишечника, в епітеліальних клітинах яких, а також у лімфоїдній тканині і відбувається розмноження цих вірусів.

Спорідненість до лімфоїдної тканини - одна з характерних рис цих вірусів. Після розмноження віруси проникають у лімфу, а потім у кров, зумовлюючи вірусемію та генералізацію інфекції.

Потрапляючи в потік крові, віруси гематогенно поширюються по всьому організму, вибірково осідаючи в тих органах і тканинах, до яких вони мають тропізм.

Методи діагностики ентеровірусних захворювань. використовують вірусологічний метод та різні серологічні реакції. Дослідження необхідно проводити на всю групу ентеровірусів. Для їх виділення використовують кишковий вміст, змив і мазки із зіва, рідше ліквор або кров, а у разі смерті хворого досліджують шматочки тканини з різних органів. Досліджуваним матеріалом заражають культури клітин (поліовіруси, ECHO, Коксакі В та деякі серовари Коксакі А), а також новонароджених мишей (Коксакі А).

Типування виділених вірусів здійснюють у реакціях нейтралізації, РТГА, РСК, реакції преципітації, використовуючи еталонні суміші сироваток різних поєднань. Для виявлення антитіл у сироватках людей при ентеровірусних інфекціях використовують ті ж серологічні реакції (РН, кольорові реакції, РТГА, РСК, реакції преципітації), але для цього необхідно мати парні сироватки від кожного хворого (в гострий період і через 2-3 тижні. від початку хвороби). Реакції вважаються позитивними зі збільшенням титру антитіл щонайменше 4 разу. При цих двох методах використовують також ІФМ (для виявлення антитіл або антигену).

Гепатит В. Структура та характеристика основних властивостей віріону. Поверхневий антиген його значення. Особливості взаємодії вірусу із клітиною. Способи зараження. Методи лабораторної діагностики Специфічна профілактика.

Hepatitis B virus, HBV У складі віріона є три основні антигени

1. HBsAg – поверхневий (superficial), або розчинний (soluble), або австралійський антиген.

2. HBcAg – серцевинний антиген (сог-антиген).

3. HBeAg - антиген е, локалізований у серцевині віріона

Власне віріон - частка Дейна - має сферичну форму і діаметр 42 нм. Суперкапсид віріона складається з трьох білків: головного (основного), великого та середнього (рис. 88,1). Геном укладений у капсид і представлений двониткової кільцеподібної ДНК з м. м. 1,6 МД. ДНК складається приблизно з 3200 нуклеотидів, проте її «плюс»-нитку на 20-50% коротше «мінус»-нитки.

Поверхневий антиген – HBsAg – існує у вигляді трьох морфологічно різних варіантів: 1) представляє суперкапсид цільного віріону; 2) у великій кількості зустрічається у вигляді частинок діаметром 20 нм, що мають сферичну форму; 3) у вигляді ниток завдовжки 230 нм. Хімічно вони ідентичні. У складі HBsAg є один загальний антиген і дві пари взаємовиключних типоспецифічних детермінантів: d/y і w/r, тому існують чотири основних субтипу HBsAg (і відповідно HBV): adw, adr, ayw і ayr. Антиген забезпечує формування загального перехресного імунітету до всіх субтипів вірусу.

Білки, що утворюють поверхневий антиген, існують у глікозильованій (gp) та неглікозильованій формі. Глікозильованими є gp27, gp33, gp36 і gp42 (цифри позначають м. м. кД). Суперкапсид HBV складається з головного або основного S-білка (92%); середнього М-білка (4%) та великого, або довгого, L-білка (1%).

Головний білок – p24/gp27, Великий білок – p39/gp42, Середній білок – gp33/gp36.

Взаємодія із клітиною.

1. Адсорбція на клітці.

2. Проникнення в клітину за допомогою механізму рецепторопосередкованого ендоцитозу (окаймлена ямка -> облямована бульбашка -> лізосома -> вихід нук-леокапсиду та проникнення вірусного геному в ядро ​​гепатоциту).

3. Внутрішньоклітинне розмноження.

Джерелом зараження вірусом гепатиту є лише людина. Зараження відбувається як парентеральним шляхом, а й статевим, і вертикальним (від матері плоду)

В даний час основним методом діагностики гепатиту є використання реакції зворотної пасивної гемаглютинації (РОПГА) для виявлення вірусу або його поверхневого антигену - HBsAg. Як зазначалося, у крові поверхневого антигену міститься у багато разів більше, ніж самого вірусу (в 100-1000 раз). Для реакції РОПГА використовують сенсибілізовані антитілами проти вірусу гепатиту В еритроцити. За наявності антигену у крові відбувається реакція гемаглютинації. Для виявлення антитіл до вірусного антигену HBsAg використовують різні імунологічні методи (РСК, РПГА, ІФМ, РИМ та ін.)

Специфічна профілактика

Щеплення проти гепатиту В є обов'язковими і мають проводитися на першому році життя. Для вакцинації запропоновано два типи вакцин. Для приготування однієї з них як сировина використовують плазму вірусоносіїв, оскільки в ній вірусний антиген міститься в кількостях, достатніх для приготування вакцини. Головна умова для приготування цього типу вакцин - їх повна безпека. Для виготовлення вакцини іншого типу застосовують методи генної інженерії, зокрема для отримання антигенного матеріалу використовують рекомбінантний клон дріжджів, що виробляють поверхневий антиген вірусу гепатиту В.

У Росії створені вакцини як дорослих людей, так новонароджених і дітей раннього віку. Повний курс щеплення складається із трьох ін'єкцій:

I доза – відразу після народження; II доза – через 1-2 міс; ІІІ доза - до кінця 1-го року життя.

За більшості вірусних інфекційрозвиваються імунні реакції, що застосовуються для діагностики. Клітинні реакції зазвичай оцінюють у тестах цитотоксичності лімфоцитів щодо інфекційних агентів або заражених ними клітин-мішеней або визначають здатність лімфоцитів відповідати на різні Аг та мітогени. Діяльність практичних лабораторій вираженість клітинних реакцій визначають рідко. Найбільшого поширення знайшли методи ідентифікації противірусних AT.

РН заснована на пригнічення цитопатогенного ефектупісля змішування вірусу зі специфічними AT. Невідомий вірус змішують з відомими комерційними антисироватками та після відповідної інкубації вносять у моношар клітин. Відсутність загибелі клітин свідчить про невідповідність інфекційного агента та відомих AT.

Гальмування гемаглютинації

РТГА застосовують для ідентифікації вірусів, здатних аглютинувати різні еритроцити Для цього змішують культуральне середовище, що містить збудник, з відомою комерційною антисироваткою та вносять у культуру клітин. Після інкубації визначають здатність культури до гемаглютинації і за її відсутності роблять висновок про невідповідність вірусу антисироватці.

Гальмування цитопатичного ефекту інтерференцією вірусів

Реакцію гальмування цитопатичного ефекту за рахунок інтерференції вірусівзастосовують для ідентифікації збудника, що інтерферує з відомим цитопатогенним вірусом у культурі чутливих клітин. Для цього в культуральне середовище, що містить вірус, що вивчається, вносять комерційну сироватку (наприклад, до вірусу краснухи при підозрі на неї), інкубують і заражають другу культуру; через 1-2 дні до неї вносять відомий цитопатогенний вірус (наприклад, будь-який ЕСНО-вірус). За наявності цитопатогенного ефекту роблять висновок про те, що перша культура була заражена вірусом, що відповідав AT.

Пряма імунофлюоресценція

Серед інших тестів найбільшого поширення знайшла реакція прямої імунофлюоресценції(найшвидша, чутлива і відтворювана). Наприклад, ідентифікація ЦМВ за цитопатогенним ефектом вимагає не менше 2-3 тижнів, а при використанні мічених моноклональних AT ідентифікація можлива вже через 24 год. Маючи набір подібних реагентів, їх можна вносити в культури, заражені вірусом, інкубувати. досліджувати за допомогою люмінесцентної мікроскопії (дозволяє виявити наявність флюоресценції заражених клітин).

Імуноелектронна мікроскопія

Імуноелектронна мікроскопія(Аналог попереднього методу) дозволяє ідентифікувати різні види вірусів, виявлені електронною мікроскопією (наприклад, різні види герпесвірусів), що неможливо зробити, ґрунтуючись на морфологічних особливостях. Замість антисироваток для ідентифікації використовують позначені різними способами AT, але складність та дорожнеча методу обмежують його застосування.