Знову сконструйований багатопараметричний мікроскоп фірми Leitz дозволяє одночасно проводити аналіз поглинання гемоглобіну еритроцитів і флуоресценції мічених ФІТЦ клітин, що містять гемоглобін S, причому можна аналізувати мільйони клітин. Система (LEYTAS), з'єднана з аналізуючим зображення комп'ютером, спочатку фокусується і вважає всі еритроцити вздовж одного ряду полів зору, використовуючи нижнє освітлення фіолетовим світлом (415 нм). Після сканування по одній лінії довжиною 8 см освітлення по команді комп'ютера змінюється з проходить на падаюче, і всі поля зору вздовж лінії сканування аналізуються повторно, причому сканування для визначення об'єктів флуоресціюють ведеться відповідно до кривої раніше визначених положень фокусу. Для кожного певного об'єкта його флуоресцентне та поглинаюче зображення зберігаються у пам'яті у вигляді рівнів сірого. З пам'яті зображення виводиться на екран, що дозволяє візуально оцінити вибрані об'єкти (рис. 6.9). Від кожного підозрілого сигналу в пам'яті зберігається одне флуоресцентне і два зображення, що поглинають. Візуальне порівняння флуоресцентного та поглинаючого зображень при великому збільшенні дозволяє визначити природу цього сигналу. Таким чином артефакти можна відрізнити від клітин, що заслуговують на увагу. Те, що сигнал дійсно відповідає мутантній клітині, підтверджується мікроскопом. Оскільки всі координати зберігаються у пам'яті, виставлення клітин проводиться автоматично. Більшість сигналів є артефактами. На рис. 6.9 тільки кадр № 79 відноситься, ймовірно, до мутантної клітини, що можна було б підтвердити мікроскопом.

Рис. 6.9. Виявлення за допомогою системи LEYTAS підозрілих зображень у препараті, пофарбованому міченою ФІТЦ сироваткою проти S-гемоглобіну. Ці зображення відображаються на моніторі. Зліва направо: номер кадру, його флуоресцентне зображення та зображення того ж кадру, що формується за рахунок поглинання при більшому збільшенні

Інші антитіла проти мутантних еритроцитів були використані Ленглейсом з співавт. визначали мутантні клітини за допомогою проточної цитометрії Можна припустити, що частота виявлених у цій роботі мутантів була значно вищою, ніж частота народження клітин з HbS.

Крім визначення рідкісних мутантів, аналіз зображення може бути застосований для визначення рідкісних ракових клітин у період ремісії, а також інфікованих вірусом клітин на ранній стадії інфекційного захворювання.

7. Скануюча лазерна мікроскопія

Зазвичай у мікроскопії зображення дуже дрібних структур одержують шляхом освітлення всього препарату та збільшення зображення об'єктивом. При використанні разом із мікроскопом телевізійної камери принцип отримання зображення не змінюється – зображення також створюється об'єктом, і лише потім сканується телекамерою. Фактично всі методи сканування застосовувалися в основному в дуже обмеженій ділянці мікрофотометрії - для визначення величини поглинання, флуоресценції або відображення. Нещодавно техніка сканування була застосована для створення високоякісних зображень за допомогою потужних та добре сколімованих лазерних пучків. В оптичній лазерній скануючій мікроскопії об'єкт не висвітлюється повністю, а сканується крок за кроком . У кожній освітленій точці вимірюється минуле, відбите або випромінюване світло. Зображення створюється за рахунок накопичення результатів цих вимірювань для кожної точки після аналогової або цифрової обробки, як матриця в пам'яті комп'ютера.

У приладі, який є в нашій лабораторії (Zeiss, ФРН), сканування виконується за допомогою гальванометрів із сервоприводами. Час сканування порівняно короткий (2 с на полі 512x512 пікселів). Процес сканування контролюється процесором. Як фотодетектор використовується ФЕУ. Його сигнал проходить через блок аналогової обробки, який контролює яскравість та контрастність.

Після оцифрування цей сигнал потрапляє в буферну пам'ять, куди записується з відеочастотою. Відповідно, стаціонарне зображення на моніторі виходить за умови, що під час зчитування столик стоїть нерухомо. Плавно змінюється може бути отримано за допомогою блоку змінного збільшення. Скануючий лазерний мікроскоп можна використовувати як із звичайним, так і з лазерним джерелом світла. За допомогою лазера можна отримати як падаюче освітлення (для відображення і флуоресценції), так і проходить освітлення (для поглинання, фазового або диференціального інтерференційного розмаїття). Як звичайне джерело світла можна використовувати тільки лампу розжарювання, забезпечену світловодом. Для забезпечення кращого фокусування та можливостей пошуку на препараті, а також для дослідження препаратів із подвійним фарбуванням, ми додали до лазерного сканера звичайний блок епіосвітлення. Принциповими перевагами лазерного сканування є:

1) низький рівень аутофлуоресценції в оптичному шляху, що досягається завдяки точковому освітленню;

2) висока чутливість мікроскопа, що виникає внаслідок використання потужного лазерного світла, сфокусованого у точці. Можна спостерігати навіть слабо флуоресцентніДНК-зонди;

3) використання оптики із малим збільшенням. Інтенсивність флуоресценції є досить високою, що дозволяє працювати з об'єктивом Х2,5. Це важлива перевага при проведенні досліджень мозку;

4) низький рівень вицвітання, оскільки час висвітлення кожної точки дуже короткий;

5) можливість проведення багатофакторного аналізу;

6) послідовне сканування на різних рівнях при конфокальній скануючій мікроскопії. Даний метод застосовується у тих дослідженнях, де треба працювати з дуже слабкою флуоресценцією,

наприклад, при проведенні реакції гібридизації. Лазерна мікроскопія, що сканує, багато дала також для досліджень мозку, оскільки вона дозволяє використовувати оптику з малим збільшенням, необхідну при дослідженні зв'язків в нервових мережах. На рис. 6.10 представлені нервові клітини з гіпокампу щура. Ці клітини були марковані виявлення специфічних молекул. У порівнянні з нормальною флуоресцентною мікроскопією контраст між зображенням та фоном, що отримується за допомогою лазерного сканування, набагато вищий: тут залишається лише дуже низький рівень небажаного фонового свічення. За допомогою лазерного сканування реакцію можна також оцінити кількісно, ​​оскільки дана техніка дозволяє встановити поріг між клітинами і тлом для поліпшення розмаїття зображення, одержуваного з препаратів дуже низьким вмістом продукту реакції.

Крім того, лазерне сканування відкриває нові можливості для дослідження за допомогою світлової мікроскопії без додаткового фарбування ультратонких зрізів, виготовлених для електронної мікроскопії.

Рис. 6.10. Флуоресцентне зображення гіпокампа щура, отримане за допомогою лазерного мікроскопа, що сканує. Зрізи були оброблені флуоресцентно міченими антитілами до гуанінмонофосфату. Збільшення: об'єктив Х40; окуляр ХЮ. Шкала 100 мкм.

8. Література

1. Yong, M. R. (1961) Quart. J. Microsc. Sci., 102, 419.

2. Price, Z. H. (1965) Am. J. Med. Technol., 31, 45.

3. Rost, F. W. (1972) В історіїхемії, театральних і застосованих. Everson Pearse, AG (ed.), Churchill Livingstone, Edinburgh, Vol. 2, p. 1171,

4. Siegel, J. I. (1982) Int. Lab., 12, 46.

5. Ploem, J. S. and Tanke, H. (1987) Introduction to Fluorescence Microscopy. Royal Microscopical Society, University Press, Oxford.

6. Lansing Taylor, D., Waggoner, A. S., Murphy, R. F., Lanni, F. and Birge, R. R. (1986) Applications of Fluorescence in the Biomedical Sciences. Alan Liss, Нью-Йорк.

7 Patzett, W. (1972) Lietz-Mitt. Wiss. und Techn., Bd V, Nr 7, 226.

8 Giloh, H. and Sedat, J. W. (1982) Science, 217, 1252.

9 Джонсон, Г. Д. і де С. Ногуейра Аруйо, Г. М. (1981) J. Immunol. Methods, 43, 349.

10 Ploem, J. S. (1967) Zeitschrift Wiss. Microskopie, 68, 129.

11 Nairn R. З (1976) Fluorescent Protein Tracing. Livingstone, Едінбург.

12. Kraft, W. (1973) Leitz Techn. Inform., 2, 97.

Антоні ван Левенгука найчастіше називають винахідником мікроскопа. З історичної точки зору це не зовсім правильно: задовго до нього і знаменитий Галілей, і батько і син Янсени, і Корнеліус Дреббель представили публіці свої оптичні прилади. Однак слава Левенгука зовсім не є безпідставною: саме йому вперше вдалося розглянути одноклітинні організми, клітини крові, будову очей комах — тобто справді вийти на мікрорівень.

Змусити краплю повиснути і не впасти - найскладніше завдання. Для цього підійде олівець чи корпус від кулькової ручки. Варто поекспериментувати з кутами нахилу та кількістю води.

Всупереч поширеному уявленню, мікроскоп Левенгука зовсім не був схожим на сучасний. Він був однією-єдиною лінзою, затиснутою в спеціальному штативі. Людина необізнана швидше назвала б цей прилад лупою.

Потрапити лазером у краплю води не так просто. Можливість надійно закріпити вказівку дуже важлива. Ми використовували кронштейни для паяння з радіомагазину.

Крапля води – це та сама лінза. Погляньте на визначення: лінза - це деталь із прозорого однорідного матеріалу, обмежена двома полірованими заломлюючими поверхнями обертання (сферичними поверхнями). Крапля має форму сфери, вода однорідна, поверхневий натяг працює на ній краще за будь-яке полірування, і, нарешті, коефіцієнт заломлення води не дорівнює такому у повітря. Отже, крапля — це лінза, хоча й не дуже хороша.

Площа зображення на екрані багаторазово перевищує переріз лазерного променя. Тому, щоб зображення було яскравим, варто роздобути потужну лазерну указку із зеленим променем.

Якщо направити на краплю промінь лазерної указки та спроектувати його на білий аркуш паперу, ми побачимо, що відбувається усередині краплі. Лазер пропонує когерентне (образно кажучи, паралельне) випромінювання, тому можна сказати, що його промінь спочатку ідеально сфокусований. Теоретично можна було б використовувати і звичайну лампу, але для точного фокусування її світла в краплі знадобилася б більш складна оптична система. Не варто тішитись: це непоганий досвід з оптики, але не з біології. Коефіцієнт збільшення краплі невеликий, тому об'єкти, які ви побачите на екрані, це зовсім не мікроорганізми, а просто частинки пилу або дрібні волоски. Ефект руху створюється з допомогою перемішування води всередині краплі. І все ж у видовищності досвіду не відмовиш.

Конфокальна мікроскопія – це один із методів оптичної мікроскопії, який має суттєвий контрастом у порівнянні зі звичайними класичними мікроскопами. Відмінною особливістю даного методу є використання діафрагми, здатної відсікати потік розсіяного фонового світла.

У конфокальному мікроскопі у кожний час відбувається реєстрація зображення однієї струми об'єкта. Повноцінне зображення виходить за рахунок сканування пересування зразка або розбудови оптичної системи. Після об'єктивної лінзи розташована діафрагма невеликого розміру так, щоб світло, що випускається точкою, що досліджується, проходив через неї і реєструвався, а світло, що виходить від інших точок, затримувався діафрагмою.

Описаний метод дослідження дає змогу вивчати внутрішню структуру різних клітин. З його допомогою можна ідентифікувати окремі молекули та структури клітини, мікроорганізми, а також динамічні процеси, що протікають у клітинах.

Опис методу конфокальної мікроскопії

Завдяки конфокальній флуоресцентній мікроскопії з'явилася можливість отримувати тривимірне субмікронне розширення об'єктів, а також значно розширилася можливість проведення неруйнівного аналізу прозорих зразків. Завдяки використанню в зазначених мікроскопах як джерела світла лазерів, досягається підвищення їх роздільної здатності.

У порівнянні з ксеновими або ртутними лампами лазери відрізняються суттєвими перевагами, так як мають здатність монохроматичності, а також високої паралельності пучка світла, що випускається. Такі властивості лазерного випромінювання забезпечують оптичній системі ефективнішу роботу, а також знижують кількість відблисків і збільшують точність фокусування пучка світла.

На досліджуваному зразку лазер висвітлює в повному обсязі поле зору, а фокусується у певній точці. Конфокальна діафрагма дозволяє позбавитися позафокусної флуоресценції, при цьому змінюючи діаметр діафрагми, можна точно визначати товщину оптичного шару біля фокусу лазерного променя. Завдяки описаній властивості конфокальна мікроскопія дозволяє отримувати поліпшену роздільну здатність вздовж осі Z.

Спеціальні програми, якими оснащені конфокальні мікроскопи, дозволяють із серії оптичних зрізів створювати об'ємні зображення об'єктів, а також розглядати їх під різними кутами зору.

Застосування мультиспектрального лазерного конфокального скануючого мікроскопа дає можливість вивчати колоколізацію в клітині різних речовин. Мультиспектральний режим дозволяє проводити на конфокальному мікроскопі дослідження методом FISH.

Приклади досліджень, які проводяться за допомогою конфокального мікроскопа

Конфокальна мікроскопія допомагає вивчати здатність різних речовин накопичуватися в ядрі, цитоплазмі або інших клітинних структурах. Ці здібності найчастіше застосовують у процесі проведення досліджень механізмів дії канцерогенів, протипухлинних сполук, лікарських препаратів, і навіть дозволяють розраховувати їх ефективні концентрації.

Летальне вивчення інтенсивності, а також форми спектрів власної флуоресценції дає можливість розпізнавати запалені та нормальні клітини. Цей метод використовується на ранніх термінах діагностики раку шийки матки.

Правильно підібрана комбінація різних фільтрів, призначених для кількох типів власної флуоресценції, може виходити без трудомісткого дослідження множини зрізів. Таким чином, можна швидко та точно виявляти злоякісні тканинні структури та відрізняти їх від нормальних.

Методи конфокальної мікроскопії досить широко використовуються в гідробіології та ембріології, в ботаніці та зоології у процесі вивчення структури гамет, а також розвитку та формування організмів.

Конфокальні лазерні мікроскопи в сучасному світі знайшли широке застосування в галузі біології, біофізики, медицини, клітинної та молекулярної біології. Конфокальна мікроскопія – унікальна безконтактна методика, яка сьогодні використовується для вивчення рогівки ока. Вона дозволяє максимально точно оцінити наявний ступінь клітинних змін та позаклітинних структур, а також зробити висновки про можливе пошкодження рогівки загалом.

Лазерні конфокальні мікроскопи мають високу роздільну здатність, тому дозволяють досліджувати структуру флуоресцентно мічених клітин і навіть окремих генів. Застосування різноманітних технологій специфічного багатобарвного флуоресцентного забарвлення для біологічно активних молекул, а також надмолекулярних комплексів дає можливість вивчати складні механізми функціонування не лише окремих клітин, а й цілих систем. Ця технологія широко використовується в експериментальній біології, а також у медицині.

Устаткування - конфокальні мікроскопи

Сучасні надточні конфокальні мікроскопи, такі як Leica TCS SP8, дозволяють отримати максимально чіткі та достовірні дані при проведенні різних досліджень. Широкий інтерес до таких приладів виник у вісімдесятих роках минулого століття через швидкий розвиток комп'ютерної техніки та лазерних технологій.

Конфокальна лазерна скануюча мікроскопія є різновидом оптичної мікроскопії. Її особливістю є те, що лазерний промінь фокусується на певну область по осях Х і У і формує таким чином зображення. Відбите світло демонструється на екрані у вигляді растру. Розміри зображення безпосередньо залежать від роздільної здатності сучасної електроніки, а також від розмірів растру, що сканується.

Вимірювальні прилади, які створені за допомогою сучасного методу конфокальної лазерної мікроскопії, що сканує, в наш час набули найширшого поширення в різних сферах. У порівнянні зі звичайною світловою мікроскопією конфокальна мікроскопія має такі переваги:

• покращена роздільна здатність;
• висока контрастність зображення;
• можливість проводити мультиспектральні дослідження з високим ступенем поділу сигналів;
• можливість отримання «оптичних зрізів» із тривимірною реконструкцією;
• можливості використання способів цифрової обробки отриманих зображень;

З недоліків описаної апаратури можна виділити:

• складність налаштування приладу;
• відсутність оптичного зображення;
• висока вартість приладів, а також дорожнеча їх обслуговування.

У конфокальному мікроскопі керувати всією системою використовується спеціальний комп'ютер. Він дозволяє зберігати зображення та детально вивчати отримані дані. Для якісної обробки отриманих зображень часто потрібні досить великі обчислювальні потужності, тому комп'ютер повинен мати досить велику оперативну пам'ять. Для подальшого зберігання інформації потрібна також велика дискова пам'ять. Для передачі зображень комп'ютер повинен мати USB-порт або CD/DVDRW. Також комп'ютер має можливість підключення до глобальної Інтернету або локальної мережі.

Програмне забезпечення, встановлене на таких комп'ютерах, може бути базовим. Воно поставляється разом із технікою і дозволяє керувати всією системою та контролювати її основні функції. Також для вказаних комп'ютерів спеціально розробляються пакети прикладних завдань, які додатково замовляються. Багато моделей конфокальних мікроскопів мають спеціальний пульт управління, що дозволяє налаштовувати їхню роботу дистанційно.

Встановлюють описані прилади у звичайних лабораторних відвідин. Найважливішою процедурою в процесі експлуатації конфокальних мікроскопів є контроль за вібраціями. Для таких цілей застосовують спеціальний пристрій, який вимірює рівень вібрації. Процедура контролю схожа на процедуру вимірювання аксіальної роздільної здатності ЛСКМ за допомогою дзеркала.

Конфокальна мікроскопія швидко розвивається. Відомі компанії-виробники репрезентують на ринку новітні зразки конфокальних мікроскопів, які дозволяють ефективно розділяти лазерний промінь збудження, а також люмінесценцію. За допомогою комп'ютера в таких приладах керується світлодільник. Його спектральні властивості за необхідності можуть досить швидко перебудовуватись на кілька лазерних ліній.

Конфокальні мікроскопи у мікробіології

Конфокальний мікроскоп також незамінний у біології для детального дослідження клітини. Сьогодні на цю тему публікується безліч різних наукових статей. Найчастіше з допомогою конфокальних мікроскопів вивчають структуру клітин, і навіть їх органоїдів. Також досліджується колокалізація в клітині для того, щоб зрозуміти, чи є причинно-наслідковий зв'язок між речовинами клітини.

Під час вивчення білків конфокальними мікросокпами вони попередньо маркуються антитілами з різними флуорохромами. За допомогою звичайного класичного мікроскопа досить важко розібрати, чи розташовані вони поруч або один під одним, а от конфокальний мікроскоп дозволяє це зробити без особливих проблем. У пам'яті комп'ютера записуються дані про серію оптичних зрізів і, таким чином, проводиться об'ємна реконструкція об'єкта, а також виходить його тривимірне зображення.

Також за допомогою конфокальних мікроскопів досліджують динамічні процеси, що протікають у живих клітинах, наприклад, пересування іонів кальцію або інших речовин крізь клітинні мембрани. Використовують конфокальні мікроскопи для вивчення рухливості біоорганічних молекул за допомогою іонізації фотохімічного розкладання флуорохрому в зоні опромінення, а також подальшого його роз'єднання з молекулами. Такі молекули маркуються двома флуорохромами, які мають спектр випускання донора, який перекривається спектром поглинання акцептора. Таким чином, енергія передається від донора до акцептора на невеликих відстанях та в результаті резонансу між енергетичними рівнями. Після цього акцептор у видимій ділянці спектра випромінює енергію, яка згодом реєструється за допомогою конфокального мікроскопа.

Розвиток конфокальної мікроскопії продовжується. Компанії-виробники зазначеного обладнання щорічно представляють на ринку все більш сучасні, функціональні та вдосконалені мікроскопи, що дозволяють вченим робити нові корисні відкриття в різних сферах. Удосконалюється програмне забезпечення, призначене для комп'ютерів, якими оснащені конфокальні мікроскопи. Воно дозволяє втілювати у життя найскладніші завдання, які дозволяють проводити дослідження на молекулярному і клітинному рівні. Сьогодні з упевненістю можна сказати, що за конфокальними мікроскопами майбутнє, оскільки за своїми функціональними характеристиками та технічними можливостями вони суттєво перевершили звичайні мікроскопи. Серед досить широкого асортименту оптичної контурної апаратури кожен користувач зможе підібрати для себе саме торт мікроскоп, який дозволить йому активно розвивати свої дослідження.

NS-3500 є високошвидкісним конфокальним лазерним скануючим мікроскопом (CLSM) для проведення високоточних і надійних тривимірних вимірювань топографії поверхні. Отримання конфокального мікроскопічного зображення в реальному часі досягається за рахунок використання швидких оптичних модулюючих модулів і алгоритмів обробки даних.

Ця система є перспективним рішенням для вимірювання та перевірки тривимірних мікроскопічних структур, таких як напівпровідникові підкладки, FPD панелі, MEMS пристрої, скляні підкладки та просто різні поверхні. Мікроскоп NS-3500 дозволяє проводити вимірювання в різних областях (область сканування розміром до 10х10 мм) зразків з розмірами до 150х150 мм за рахунок великого діапазону переміщення предметного столика. Також є опціональна можливість розширення платформи до 200х200 мм.

При необхідності вимірювання різних точок/областей габаритніших зразків доступна модифікація вимірювальної головки промислового типу (див. NS-3800).

• Оптичний 3D-контроль, що не руйнує, з високою роздільною здатністю
• Отримання конфокального зображення у реальному часі
• Різне оптичне збільшення для області, що спостерігається
• Одночасна конфокальна мікроскопія та мікроскопія білого світла
• Автоматичний пошук посилення для тонкого фокусування
• Компенсація нахилу
• Простота аналізу отриманих даних
• Високоточний та високошвидкісний вимір висоти
• Можливість якісного аналізу товщини напівпрозорих матеріалів
• Відсутність пробопідготовки
• Режим подвійного сканування вздовж вертикальної осі Z
• Зшивання зображень для аналізу великих областей

Області застосування

Лазерний скануючий мікроскоп NS-3500 є ідеальним рішенням для вимірювання висоти, ширини, глибини, кутів, площі, а також об'ємної візуалізації мікроструктур, таких як:

• Напівпровідники - IC підкладки, висота виступів/східців та дротяних петлів, аналіз дефектів, CPM процеси (хіміко-механічна планаризація)
• Плоскопанельні дисплеї (FPD) - аналіз сенсорних панелей, ITO підкладок, висота розділової колони в РК-дисплеї
• МЕМС пристрою - тривимірний профіль структури, шорсткість поверхні, підкладки
• Скляні поверхні - тонкоплівкові сонячні елементи, текстура сонячного елемента, аналіз малюнка після лазерного впливу
• Дослідження матеріалів - аналіз опорних поверхонь затискного пристрою, шорсткості та сколів.

Програмне забезпечення NSWorks & NSViewer

• Просте та інтуїтивне керування навіть для нових користувачів
• ПЗЗ зображення, конфокальне зображення, а також основна панель керування одночасно відображаються на одному екрані
• Різні параметри налаштування призначені для передових програм
• Побудова конфокального зображення в режимі реального часу забезпечує негайний зворотний зв'язок із обладнанням
• Окреме вікно аналізу зі зручними графічними інструментами для створення звітності
• Об'ємний графічний вигляд дозволяє користувачу легко розпізнати мікроскопічну структуру зразка

Зшивання зображення

При необхідності аналізу великої області сканування (до 15×15 мм макс.) доступний послідовний поточковий вимір дрібних областей з подальшим зшиванням. Ця особливість реалізована за рахунок використання моторизованого предметного столика та програмної утиліти NSMosaic. Після зшивання отримане зображення може бути проаналізоване як єдине ціле з усіма доступними функціями NSViewer.

Відео-огляд: Зшивання зображень на конфокальному лазерному сканувальному мікроскопі NS-3500

Приклади вимірювання за допомогою NS-3500

Вимірювання висоти стандарту VLSI	Аналіз виступаючої частини на OLED	Аналіз результатів лазерної обробки OLED
Кварцова підкладка	Поверхня діаманта	Дефект на металевому дзеркалі
Нерівність на опуклій поверхні	Графен	Підкладка оксиду індія та олова
Аналіз структури мікролінзи	Аналіз вузької області підкладки	Вид досліджуваного зразка при різному оптичному збільшенні
Постобробка зображення профілю поперечного перерізу	Зшивання зображення під час аналізу монети	Аналіз профілю поверхні краплі води

Багатофункціональний високопродуктивний світловий конфокальний та лазерний конфокальний мікроскоп OPTELICS HYBRID має цілу низку переваг: 2 види конфокальної оптики в одному мікроскопі, інтерферометр на фазовому зсуві, можливість спостереження в диференціально інтерференційному контрасті, вимірювання товщин тонких плівок методом спектроскопічної.
Завантажити брошуру.

Особливості

• 24бітне кольорове спостереження високої роздільної здатності
• Широкопільні спостереження та вимірювання
• Визначення товщин прозорих плівок
• Високе збільшення
• Висока якість
• Висока контрастність
• Візуалізація нанометрових дефектів, тріщин, частинок на рівній поверхні

Аналітичні функції

Вимірювання ширини та кроку
Ідеально підходить для вимірювання ширини напівпровідникових патернів. Найкраща в галузі точність і повторюваність досягається за допомогою унікальної оптики та детекторів.

• Точність:
  ± мкм
  (Ex. ± 0.025 µm для ширини лінії 5 мкм)
• Повторюваність:
  3σ = 0.01µm

Вимірювання шорсткості поверхні
Вимірювання шорсткості поверхні відповідно до параметрів JIS та ISO. Висока роздільна здатність вимірювання шорсткості можлива для будь-якого типу зразків завдяки безконтактному методу вимірювань.

• 2 мірна шорсткість
  Шорсткість поверхні: Ra, Rp, Rv, Rc, Rt, Rq, Rsm, Rk, Rpk, Rvk і т.д.
  JIS B 0671: Rk, Rpk, Rvk, Mr1, Mr2, А1, А2 і т.д.
  Rmr
• 3D шорсткість
  Параметри шорсткості: Sa, Sp, Sv, Sz, пл і т.д.
  Параметри об'єму: Sk, SPK, СВК, SMR1, ВВК, VVV і т.д.

Аналіз геометричних властивостей
HYBRID аналізує більше 20 властивостей, включаючи площу, об'єм, положення центру тяжкості і т.д. Виведення результату аналізу доступне у форматі електронної таблиці.

2D виміри
Вимірювання двох мірних функцій, таких як довжина, кут, радіус і т.п.

Вимірювання перепадів висот
Вимірювання різниці висот у вказаній користувачем області

Вимірювання товщини плівки (XZ поперечні виміри)
Товщина плівки отримують шляхом оптичних обчислень відстані між поверхнею плівки та поверхні підкладки з використанням відбитого світла. Приклад: ПІ плівки на підкладці.

Управління даними результатів експериментів

Висока швидкість та висока точність вимірювань

• Ведуча у галузі швидкість виміру. HYBRID досягає частоту кадрів 15 Гц, приблизно в 4 рази швидше, ніж типовий CLSM (конфокальний лазерний мікроскоп, що сканує, що робить його потужним інструментом для високошвидкісного авто вимірювань, пэчворка і високошвидкісного спостереження.
• Високошвидкісний печворк. Ця функція дозволяє пошити великий об'єкт, як показано на малюнку з багатьох невеликих клаптиків зображень. Це плавно створює широке FOV зображення. Час процесу становить близько 1/6, що потрібно типового CLSM. (Кількість екранів: 1/1.5, вимірювання часу на екрані: 1/4)
• Високошвидкісна автоматична оптимізація діапазону виміру. У пэчворк, висота зазору в межах кожного FOV автоматично визначається для автоналаштування діапазону вимірювань. Це запобігає помилкам введення даних із зображення та значно скорочує час сканування.
• Мапінг відображення областей зображення. Поточна позиція вимірів, що проводяться, може бути відображена в більш широкому FOV зображення. Ця функція також дозволяє перейти до точки вимірювання одним клацанням миші, авто пэчворк у зазначеній області на карті та координувати управління інформацією у зазначеній позиції.
• Найкраща в галузі точність вимірювань та повторюваність. Висока точність потрібна для вимірювальних інструментів. Висока точність:
  Ширина лінії: ± мкм
  Вимірювання висоти: ± (0,11 + L/100) мкм
• Високий рівень повторюваності. Лінія 3σ вимір ширина: 10 нм
  Вимір висоти: 10нм
  HYBRID досягає галузі відтворюваності та виявляє справжній пік, розташований у зазорі вимірювання на основі IZ кривої, розрахованої за допомогою спеціального алгоритму.

Оптичні інтерференційні виміри

Основний принцип оптичних інтерференційних вимірів
профілі поверхні вимірюються в нанометровій роздільній здатності від аналізу моделей інтерференції, створюваних інтерференцією об'єктивів. Світло розбивається на два масиви за допомогою світлодільника всередині об'єктива. Один з масивів відбивається поверхнею зразка, тоді як інший масив переходить до референтного дзеркала і відбивається. Обидва відбиті промені накладаються на лінзу об'єктива для формування інтерференційних картин, викликаних оптичними різницями ходу. У міру того, як інструмент налаштований так, що він не має оптичної різниці ходу в положенні фокусу, інтерференційні смуги вказують на западини та опуклості на поверхні зразка.

Вертикально-скануюча інтерферометрія білого світла
Інтерференційні смуги мають сильний контраст на площині у фокусі. Пік яскравості інтерференційної смуги визначається для вимірювання висоти з надійністю конфокальної мікроскопії.

Інтерферометрія зсуву фази
Вимірювання висоти в Ангстрем масштабі ступеня точності вимірювань від фазового аналізу інтерференційних смуг в одній довжині хвилі світла (546 нм), що виходять, оскільки фаза змінюється в кілька етапів. Діапазон вимірювань обмежений у межах половини довжини хвилі, але час виміру становить кілька секунд.

Вимірювання товщини плівок методом спектральної рефлектометрії

Принцип спектроскопічної рефлектометрії
Товщина плівки може бути виміряна з використанням спектра відображення, отриманого за допомогою спектроскопічної рефлектометрії після налаштування параметрів оптичної імітаційної моделлю. Відбитий спектр показує залежність між абсолютною відбивною здатністю та довжиною хвилі. Вона змінюється залежно від товщини плівки та оптичних констант. Абсолютний коефіцієнт відображення визначається інтерференцією тонкої плівки, викликаної багаторазовим відображенням світла між поверхнею плівки та підкладки.

Шість довжин хвиль вибрано з білого світла для отримання відображеного зображення для кожного з них і обчислення відбивної здатності. Оптичні константи (показник заломлення та коефіцієнт екстинкції) для тонких плівок та підкладок використовуються в оптичній моделі для розрахунку абсолютного коефіцієнта відображення від коефіцієнта Френеля та вимірювання товщини плівки після налаштування параметрів.

Широкопольні конфокальні спостереження у білому світлі

Висока точність вимірів при малому збільшенні
За допомогою наших спеціальних об'єктивів стало можливим проводити високо точні вимірювання при малому збільшенні, що важко досягти за стандартного CLSM. Об'єктив розроблений спеціально для широкого поля зору та високої точності вимірювання, High-NA (високе значення цифрової апертури) лінзи об'єктива зі збільшенням 5x, 10x, 20x.

Широкий FOV та висока точність