Культивування та репродукція

Патогенез та імунітет

Епідеміологія

Профілактика

Сказ

Лабораторна діагностика

Метод флуоресцентних антитіл

Виявлення тілець Бабеша-Негрі

Метод виявлення включень Бабеша-Негрі

Біопроба на мишах

Серологічні дослідження

Сказ (Б) – гостра хвороба теплокровних тварин, що характеризується поразкою ЦНС. Сприйнятливі домашні та дикі тварини всіх видів, а також людина.

Хвороба реєструється у різних регіонах земної кулі. Не зазначено випадків поширення хвороби в Австралії, Великій Британії, Японії. Захворювання майже завжди закінчується смертю. Є фактично документовані випадки одужання від сказу людини та собак після експериментальної інфекції.

Вірус сказу (СБ) відноситься до сімейства Rhabdoviridae, роду Lyssavirus. В даний час встановлено, що ВБ має 4 серотипи, що зумовлено, мабуть, різницею у складі мембранних білків. Усі варіанти СБ в імунобіологічному відношенні споріднені, але різняться по вірулентності. ВБ має ГА та ГАД властивостями. Між інфекційною та ГА активністю існує лінійна залежність. Тварини, імунізовані проти сказу, продукують ВНА, КСА, антиГА та літичні (руйнівні клітини, заражені вірусом у присутності комплементу) АТ.

Діагноз ставлять на підставі епізоотологічних даних, симптомів хвороби, патологоанатомічних змін (вони мають менше значення) та, головним чином, результатів лабораторних досліджень.

Лабораторна діагностикаполягає у дослідженні головного мозку тварин з метою виявлення вірусного АГ в ІФ, РДП, виявленні тілець Бабеша – Негрі та біопробі на білих мишах.

У Російській Федерації в даний час організовано виробництво наборів для діагностики Б в ІФ та РДП у ВНІТІБП та КазНІВІ.

Виділення вірусу.До лабораторії для дослідження направляють свіжі трупи дрібних тварин, від великих тварин - голову або головний мозок. У деяких випадках допускається консервування головного мозку в 50% гліцерині. Труп або голова повинні бути ретельно упаковані в поліетиленовий мішок, мозок - у банку з притертою скляною або гумовою пробкою, залитою парафіном. Матеріал упаковується у вологонепроникну тару. Для вірусологічних досліджень придатний лише консервований мозок. Необхідно пам'ятати, що розтин трупа, вилучення мозку та інші операції з патологічним матеріалом слід проводити в умовах стерильності та суворого дотримання заходів особистої профілактики: міцно фіксують голову тварини, захищають руки двома парами рукавичок (хірургічні та анатомічні), для захисту очей надягають , а на ніс і рот-6-шарову марлеву пов'язку.

Лабораторні дослідження матеріалуна сказ проводять поза всякою чергою; результати негайно повідомляють лікаря господарства та головного лікаря району (міста).

Порядок проведення досліджень: з кожного відділу головного мозку лівої та правої сторін (амонова роги, мозочка, кори півкуль і довгастого) готують по 4 мазки-відбитки для ІФ та виявлення тілець Бабеша - Негрі; з мозковою тканиною ставлять РДП; за негативних результатів ставлять біопробу.

Виявлення специфічних тілець-включень. Мазки-відбитки фарбують за Селлерсом, Муромцевим або іншими методами. Після фарбування препарати проглядають у світловому мікроскопі з імерсійною системою. Позитивним результатом вважають наявність специфічних тілець Бабеша - Негрі (при фарбуванні по Селлерсу - чітко окреслені овальні або довгасті гранулярні утворення рожево-червоного кольору в протоплазмі, при фарбуванні по Муромцеву - світло-фіолетові з темно-синіми включеннями тільця Бабеша - Негри поза нервовими клітинами.

Найбільш характерна особливість тілець Бабеша - Негрі - їхня внутрішня структура, що дозволяє абсолютно точно диференціювати їх. Усередині видно маленькі зернятка - базофільні зернистості темно-блакитного, навіть чорного кольору завбільшки 0,2-0,5 мкм.

Діагностична цінність виявлення тілець-включень для доказу зараження СБ загальновизнана. Однак і у здорових тварин, особливо у кішок та білих мишей, є утворення, присутність яких може спричинити діагностичні труднощі. В окремих випадках у мозку кішки можна з упевненістю диференціювати подібні включення від тілець Бабеша – Негрі, і тут рекомендується скористатися методами ідентифікації, особливо ІФ. Так само і у собак, які загинули в результаті отруєння зміїною отрутою або ураження електричним струмом, можна знайти тільця-включення, що нагадують тільця Бабеша - Негрі. Тельця Бабеша - Негрі виявляють лише у 65-85% випадків сказу, тому відсутність їх є негативним відповіддю, і матеріал досліджується інших тестах (ИФ, РДП, біопроба).

ІФ.Один з основних тестів при діагностиці Б. При висококваліфікованому виконанні одержують 99-100% збіги з методом біопроби. Зазвичай у діагностичній практиці використовують прямий метод ІФ, який проводять із застосуванням антирабічного флюоресцентного Ig. Фіксацію препаратів в охолодженому (8-10 ° С) ацетоні проводять не менше 4-х год. Як негативний контроль використовують мазки-відбитки головного мозку здорових білих мишей. Враховують результати візуально у люмінесцентному мікроскопі на основі оцінки інтенсивності світіння комплексу АГ-АТ. АГ ВБ виявляється у вигляді яскравих жовто-зелених або зелених гранул різної форми та величини у клітинах (частіше поза клітинами). Діагноз вважають встановленим, якщо в кількох полях зору виявляють достатню кількість (не менше 10) типових гранул з яскравим зеленим світінням або безліч дрібних точок, У контролі такого свічення не повинно бути.

Для доказу специфічності світіння комплексу АГ-АТ використовують метод придушення ІФ, який полягає у здатності рабичного АГ, пов'язаного з нефлюоресцентними AT, вдруге не вступати в з'єднання з флюоресцентними специфічними AT. Для цього на фіксовані препарати, приготовані з досліджуваного головного мозку, наносять 5%-ний антирабічний нефлюоресцентний Ig, витримують 30 хв при 37°С у вологій камері, промивають фізрозчином, а потім забарвлюють флюоресцентним антирабічним Ig загальноприйнятим прямим методом. У оброблених у такий спосіб препаратах флюоресценції не повинно бути.

Метод ІФ дає можливість виявляти СБ у клітинах рогівки очей та попередньо поставити діагноз прижиттєво: під час хвороби тварин, а також за 1-2 дні та більше до клінічного її прояву. Метод може бути використаний для дослідження підозрюваних у захворюванні Б тварин, а також клінічно здорових собак і кішок, що покусали людей та тварин. Для цього готують відбитки з рогівки, дотримуючись всіх правил особистої безпеки, розкривають очну щілину тварини великим і вказівним пальцями і на злегка випнуте очне яблуко натискають поверхнею предметного скла, відступивши 0,5 см від кінця. Потрібно стежити, щоб тварина не моргала третім століттям, оскільки зі скла видаляються епітеліальні клітини і виходить неякісний мазок. З кожного ока роблять не менше 2 препаратів, що містять по 2 відбитки. Для контролю аналогічно готують відбитки рогівки від здорових тварин. Їх можна приготувати у господарстві. Відбитки висушують на повітрі, фіксують в ацетоні протягом 4 годин при 4°С, пакують і відправляють у лабораторію. Фарбують препарати, як за ІФ, за загальноприйнятою методикою.

У препаратах, отриманих від хворих тварин або що знаходяться в кінці інкубаційного періоду хвороби, в цитоплазмі багатьох епітеліальних клітин спостерігаються різної форми гранули, що яскраво світяться різного розміру - від пилоподібних точок до 2 мкм і більше. З метою отримання достовірних результатів у кожному препараті проглядають по 50-100 клітин, а від тварини - не менше 200-400 клітин. Результати мікроскопії вважають позитивними, якщо у відбитках рогівки тварини виявляють 11% і більше клітин з характерними вогнищами свічення. Необхідно мати на увазі, що в препаратах від здорових тварин (контроль), внаслідок аутофлюоресценції, можуть зустрічатися поодинокі клітини з подібними за формою та свіченням вогнищами.

ІФ дає можливість прискорити відповідь при остаточній постановці діагнозу шляхом біопроби, оскільки діагноз при Б може бути встановлений тільки на 4-8-й день після зараження мишей досліджуваним матеріалом, а інкубаційний період захворювання мишей може досягати і 20 дн. ІФ може виявляти СБ у тканинах підщелепної слинної залози. З підщелепних слинних залоз готують препарати-мазки, беручи матеріал щонайменше ніж із 6 різних ділянок залози, оскільки розподіл у ній вірусу нерівномірно. Часто, щоб отримати відбиток, доводиться робити сильний тиск, оскільки через велику кількість муцину на склі залишається мало матеріалу.

Показана можливість ідентифікації СБ у шкірі методом ІФ. З цією метою беруть проби шкіри голови, а також фолікули сенсорного та тактильного волосся морди або латеральних сенсорних сосочків (на щоці собаки). Проби зберігають при -20-70°С. З них роблять кріосрізи, які обробляють флюоресцентним глобуліном. Результати ІФ аналізу, отримані при ідентифікації СБ у шкірі, високою мірою корелюють з даними, отриманими при дослідженні мозку тієї ж тварини. Показано близьку кореляцію між виявленням АГ вірусу в пробах мозку та тканинах губи методом ІФ.

РДП.Застосовують для виявлення АГ ВБ у неконсервованому головному мозку тварин, що загинули від вуличного сказу, або мишенят, що використовуються в біопробі. РДП ставлять мікрометодом на предметних стеклах, використовуючи 1-1,5%-ний агаровий гель за загальноприйнятою методикою. Найбільший відсоток позитивних результатів виявляють при використанні наступного трафарету: А - ріг амонів (права сторона); В – кора головного мозку (права сторона); С - мозок (права сторона); Д - довгастий мозок (правий бік); + (плюс) – позитивний контроль; - (мінус) – негативний контроль; 1, 2, 3, 4 - лунки з розведенням специфічного імуноглобуліну 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 відповідно

З кожного відділу головного мозку за допомогою пінцету готують гомогенну пастоподібну масу, яку поміщають у відповідні лунки. Від мишей досліджують весь головний мозок. З відділів головного мозку лівої сторони готують АГ аналогічним чином (на кожну експертизу загалом потрібно 4 предметні стекла з агаровим гелем). Реакцію враховують через 6, 24, 48 год. За наявності 1 або 2-3 ліній преципітації між лунками, що містять артеріальну гіпертензію та імуноглобулін, реакцію вважають позитивною.

РДП проста у виконанні і специфічна, але відсоток виявлення вірусного АГ у досліджуваному матеріалі становить 45-70. При дослідженні мозку мишей, отриманого при позитивної біопробі, РДП виявляє до 100% випадків. Відсутність у досліджуваному матеріалі тілець Бабеша - Негрі, специфічної флюоресценції та негативна РДП не дають підстави виключити наявність вірусу. І тут остаточний діагноз ставлять за результатами біопроби на білих мишах з наступною ідентифікацією вірусу.

Біопробу.Прийнято вважати, що біопроба є ефективнішим методом, ніж виявлення тілець Бабеша - Негри, ІФ та інших. Проте й у окремих випадках виявлялася негативною, попри підтвердження діагнозу Б шляхом виявлення телець-включенні та ІФ. Відсоток негативних результатів біопроби коливався від 1,3 до 12.

Відомості про різну ефективність біопроби можуть бути пояснені рядом факторів: вибору експериментальної тварини, кількості їх у досвіді, способу зараження, способу та терміну зберігання матеріалу до вступу в лабораторію. Може відігравати роль та явище інтерференції інфекційних частинок неактивними частинками, якщо для інокуляції використовують недостатньо розведений матеріал.

У мозку та слинних залозах лисиць і скунсів, що загинули від сказу, виявлено речовину, що інгібує інфекційність вірусу, що не дозволяє провести діагностику хвороби у цих тварин методом внутрішньомозкового зараження мишей. Наявність інгібуючої речовини в матеріалі, що досліджується, не перешкоджає виявленню вірусного АГ методом ІФ; для скунсів та лисиць це найчутливіший метод діагностики.

З тварин всіх видів (кролики, морські свинки, дорослі білі миші та хом'ячки), використаних для біопроби, багато хто віддає перевагу мишам-сосунам, оскільки вони більш чутливі до різних штамів СБ і менш небезпечні в роботі. Сирійські хом'яки за чутливістю не поступаються мишам, але менш доступні.

РЗК.Виявлення специфічного АГ в РЗК при діагностиці сказу застосовується рідше, ніж інші методи. З надісланого на дослідження мозку готують АГ. Для цього мозкову тканину (особливо багаті на АГ, що зв'язує комплемент, шматочки таламуса і стовбурового відділу мозку) розтирають у вероналовому буфері у співвідношенні 1:10 і залишають при кімнатній температурі на 1 год, після чого суспензію інактивують при 56°С протягом 5 год. Така обробка вбиває вірус та знімає антикомплементарність мозкової тканини, не пошкоджуючи специфічної артеріальної гіпертензії. Суспензію центрифугують 15 хв при 3500 хв- 1 з надосадової рідини, яка являє собою матеріал для дослідження на наявність АГ, готують 2-кратно зростаючі розведення від 1:2 до 1:64 і використовують для дослідження РСК.

ІФА.В ІФА специфічне фарбування АГ у клітинах мозку полеглих від сказу тварин виявляють як у свіжозятих, що зберігалися в гліцерині, а також у пробах, що зберігалися без гліцерину при 20°С 8-18 год. Даний тест придатний для рутинної діагностики сказу АГ ВБ у тканинних парафінових зрізах при фіксації препаратів 10%-ним розчином формаліну з рН 5,3 і подальшої обробки препаратів, укладених у парафін, пепсином.

На відміну від РН на мишах і культурі клітин ІФА дозволяє виявити AT у тварин протягом кількох годин, ІФА - найбільш перспективний лабораторний метод виявлення AT та індикації самого вірусу. Експрес-методом діагностики сказу є техніка захоплення та метод ІФ для виявлення АГ ВР. Доведено, що метод виявлення АГ ВБ у парафінізованих зрізах пероксидазо-антиперокісдазним методом значно перевищує метод ІФА. У 1987 р. створено набір для швидкої ензимімудіагностики сказу (RREID), прийнятний для епідеміологічних та лабораторних досліджень.

Варіантна ідентифікація за допомогою МОНАТ. За допомогою монАТ до глікопротеїнів СБ селектовані АГ варіанти, серед яких виділені фенотипно термолабільні (авірулентні) варіанти. При використанні 2-х груп МонАТ показано, що штами дикування відрізняються від шт. Fixe (Пастера), CVS, Flury HEP, ERA та "качиних" штамів за АГ детермінантами. Вивчення за допомогою монАТ 7 штамів, виділених від хворих Б людей, дозволило виявити певні відмінності їх від вакцинного штаму щодо АГ детермінант.

Загальновизнано, що відмінності AT між дикими штамами вдається виявити, використовуючи монАТ проти нуклеокапсидного AT N, які реагують з цитоплазматичними включеннями заражених вірусом клітин; проти глікопротеїну (G АГ), які реагують з мембранами інфікованих клітин, лізують ці клітини у присутності комплементу та нейтралізують вірус. У зв'язку з можливою АГ варіабельністю поверхневого глікопротеїну ВБ з різних географічних зон як протективний АГ використовували рибонуклеопротеїн, що характеризується консервативністю АГ структури. Таким чином, не тільки G білок, а й РНП ВБ мають протективну активність.

. Ці методи для сказу нетипові, оскільки використовуються тільки для перевірки поствакцинального імунітету. Для виявлення та титрування поствакцинальних AT використовують РН, яку ставлять загальноприйнятим методом. Як АГ використовують фіксований СБ. РН на клітинах ВНК-21 була чутливішою, ніж непряма ІФ при виявленні AT в сироватках вакцинованих лисиць. Крім того, запропоновані РТГА та ELISA.

РТГА.Поки ще не знайшла широкого застосування в діагностичній практиці через наявність у сироватках крові неспецифічних інгібіторів, до яких ВБ високочутливий, а головне, ГА АГ, які не піддавалися достатньому очищенню, мали низьку чутливість. Для приготування ГА АГ ВБ запропоновано використати шт. Москва, вирощена в культурі клітин ВНК-21, після його обробки сапоніном з подальшим очищенням і концентруванням. ГА відокремлюють від інших компонентів віріону ультрацентрифугуванням. Отриманий препарат мав ступінь очищення 99,92%, мав високу ГА активність (1:128), що добре зберігається протягом 1 міс при рН 5-9.

Перед постановкою РТГА слід проводити помірну двократну трипсинізацію гусячих еритроцитів для їх сенсибілізації. При використанні 0,25%-ної суспензії трипсі-нізованих еритроцитів (краще 10 7 клітин на 1 мл) чутливість РТГА підвищується в 4 рази. Для розведення АГ і сироваток застосовують боратно-сольовий розчин (рН 9) з додаванням 0,4% бичачого сироваткового альбуміну. Суспензію еритроцитів готують у сольовому розчині з кислим рН, щоб після з'єднання з сумішшю вірусу і сироваток, рН якої 9, остаточний рН встановився б в межах 6,2. Після внесення лунки суспензії еритроцитів панель струшують, заклеюють прозорою плівкою і ставлять на лід. Результати РТГА враховують через 40-50 хв, і з еритроцитами 2-дн курчат чи макаки-резус - через 1-1,5 год.

Розроблено радіоімунологічний аналіз, заснований на здатності AT зв'язуватися з міченим 125 1-АГ ВБ. Мічений IgG, виділений з антирабічної гіперімунної сироватки, можна застосовувати для виявлення АГ ВБ твердофазним РІА. Найкращі результати отримані при використанні фосфатно-сольового розчину (рН 6,0) з іонною силою 0,01 М та міченого IgG з активністю 200-250 тис. імп./хв.

Твердофазний конкурентний РІА застосовується для виявлення антирабічних AT в сироватці та гібридомних супернатантах.

Диференційна діагностика. Необхідно виключити хворобу Ауески, коли хворі тварини неагресивні, немає викривлення апетиту. У собак виключають нервову форму чуми. Підозра на сказ може виникнути при інфекційному енцефаломієліті коней. Комплекс лабораторних досліджень дозволяє поставити точний діагноз на сказ. Запропоновано новий метод диференціації різних штамів СБ, заснований на рестриктазному розщепленні продуктів ампліфікації ПЛР сегмента гена N.

Лабораторна діагностика інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби

Інфекційний ринотрахеїт (ІРТ, пухирцевий висип, інфекційний вульвовагініт, інфекційний некротичний ринотрахеїт, інфекційний риніт, «червоний ніс», контагіозна бронхопневмонія, інфекційний катар верхніх дихальних шляхів, гостропротека пригніченням та кон'юнктивітом, а також розвитком пустульозного вульвовагініту при попаданні вірусу в статеві органи тварини та абортами. Хвороба поширена повсюдно.

Вірус інфекційного ринотрахеїту (ІРТ) ВРХ відноситься до сімейства Herpesviridae, підродини Alphaherpesvirinae, роду Varicellavirus.

В антигенному відношенні вірус ІРТ ВРХ не однорідний, існують варіанти. Між вірусами ІРТ ВРХ та БА існує АГ спорідненість. В організмі тварин вірус викликає утворення ВНА, КСА. Вірус має ГА властивостями щодо мишачих еритроцитів.

Лабораторна діагностика включає: 1) виділення вірусу з патологічного матеріалу у культурі клітин та його ідентифікації в РН або РІФ; 2) виявлення антигену вірусу ІРТ у патологічному матеріалі РІФ; 3) виявлення антитіл у сироватці крові хворих та перехворілих тварин (ретроспективна діагностика) у РН або РНГА. Для лабораторної діагностики ІРТ використовують набір діагностикумів інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби та набір еритроцитарного діагностикуму для серодіагностики ІРТ великої рогатої худоби в РНГА.

Діагностику інфекційного ринотрахеїту проводять паралельно з дослідженням матеріалу на парагрипозну (ПГ-3), аденовірусну (1 та 11), респіраторно-синцитіальну інфекцію та вірусну діарею. Схема проведення лабораторної діагностики ІРТ аналогічна аденовірусної інфекції, що застосовується при діагностиці.

Попередній діагноз на інфекційний ринотрахеїт великої рогатої худоби ставлять на підставі позитивних результатів виявлення антигену в патологічному матеріалі РІФ з урахуванням епізоотологічних та клінічних даних, а також патологічних змін.

Остаточний діагноз ставлять на підставі збігу результатів РІФ із виділенням та ідентифікацією вірусу; збігу результатів РІФ з виявленням антитіл у 30% і більше других проб сироваток у титрах не нижче 1:2 у РН та 1:16 у РНГА та виявленням 4-кратного та більше збільшення титру антитіл у парних пробах сироваток. Попередній діагноз ставлять у ветеринарних лабораторіях протягом 2-3 днів, остаточний – протягом 15-30 днів.

Виділення вірусу. Взяття та підготовка матеріалу.В лабораторію направляють патологічний матеріал, взятий протягом перших 2-3 днів хвороби при вираженій клінічній картині хвороби або з діагностичною метою безпосередньо при забої від тварин із гострою стадією захворювання.

Від хворих тварин беруть 15-20 проб: змив зі слизової оболонки носової порожнини, очей, піхви, препуція, проби сперми. Для змивів використовують стерильні ватно-марлеві тампони; змиви з препуціальної порожнини та сперму беруть відповідно до Методичних вказівок щодо відбору проб, транспортування та підготовки до вірусологічного дослідження сперми та змиву з препуціальної порожнини бугаїв; проби крові, не менше 5 мл, отримують у перші 3 дні хвороби і через 3 тижні від тих же тварин у стерильні пробірки. Тампони з матеріалом поміщають у стерильні пеніцилін лінові флакони або пробірки з 2-3 мл стерильного фізіологічного розчину або розчину Хенкса, що містить від 500 до 1000 ОД/мл антибіотиків (канаміцин, мономіцин, неоміцин, пеніцилін, стрептоміцин).

Після зсідання крові стерильно зливають 2-3 мл сироватки і доставляють останню в лабораторію.

Від тварин, убитих з діагностичною метою, беруть із дотриманням правил асептики шматочки легень з бронхом (на межі ураженої та здорової ділянок), селезінки, середостінні, бронхіальні та брижові лімфатичні вузли, мигдалики, уражені ділянки слизових оболонок носової та ротової -кишкового тракту, а також пробу крові, від абортованих плодів – шматочки паренхіматозних органів. Шматочки матеріалу масою до 20 г поміщають у стерильну посудину.

Консервування патологічного матеріалу, доставка в лабораторію та його підготовка до дослідження такі ж, як при діагностиці аденовірусної інфекції.

Проби сперми до дослідження допускається зберігати при мінус 20 ° С трохи більше 5 діб. Сперму досліджують протягом 24 годин після розморожування. Її розводять 1:10 живильним середовищем для культури клітин з додаванням відповідних антибіотиків (500 ОД на 1 мл), заморожують 2-3 рази при мінус 30 °С, відтають при 37 °С, центрифугують при 2000 об/хв протягом 10 хв . Надосадову рідину використовують для зараження культури клітин. Зараження культур клітин. Методика його аналогічна така при діагностиці аденовірусної інфекції. Ізолят вважається виділеним у разі, якщо він викликає стабільну однотипну цитопатогенну дію не менше ніж у трьох послідовних пасажах. І тут можлива його наступна ідентифікація в РН. Цитопатогенна дія вірусу ІРТ у культурі клітин характеризується утворенням вікон у моношарі, округленням клітин, скупченням їх у вигляді «грон» з подальшим відшаруванням їх від поверхні скла.

Зараження тварин.Роблять дуже рідко з метою ідентифікації вірусу інфекційного ринотрахеїту. Телятам 6-8-місячного віку патологічний матеріал вводять інтраназально у вагіну, під шкіру та наносять на кон'юнктиву. Якщо в досліджуваному матеріалі є вірус, у заражених тварин розвивається ринотрахеїт з кон'юнктивітом. Від хворих телят вірус виділяють головним чином із ураженої трахеї та гортані. У інфікованих тварин розвиваються симптоми, подібні до спостережуваних при природному перебігу хвороби. Перші клінічні ознаки хвороби з'являються через 20 годин після інфікування та реєструються 7-10 днів. Заражені телята, як правило, одужують та залишаються вірусоносіями.

Виділити вірус з носової порожнини, піхви та з кон'юнктиви вдається з 5-го по 10-й день, а антитіла, що нейтралізують, - з 5-8-го дня після зараження. Вищий титр антитіл спостерігається після 35 днів, потім починається повільне зниження.

Встановлено, що максимальна кількість вірусу виділяється під час підвищення температури тіла на 4-7-й день хвороби і триває до 10-14 днів.

Індикація та ідентифікація вірусу. Виявлення специфічних тілець-включень. У ядрах клітин епітелію уражених слизових оболонок носової порожнини, вульви, вагіни та кон'юнктиви знаходять специфічні тільця-вмикання. Через 18-20 год після їх зараження можна виявити і в клітинах зараженої культури тканини, пофарбованої гематоксилін-еозином. Біопробу.

Серологічна ідентифікація

РІФ.Техніка постановки її така сама, як і при діагностиці аденовірусної інфекції великої рогатої худоби. Звертають увагу на свічення антигену в цитоплазмі та перинуклеарній зоні неушкоджених клітин. Яскраво-зелена флюоресценція у вигляді гранул або дифузного світіння цитоплазми не менше ніж у 10% клітин дозволяє оцінити препарат як позитивний. Попередній діагноз ставлять за наявності щонайменше 30% позитивних препаратів від загальної кількості досліджених проб. У мазках з піхви та кон'юнктиви специфічну флюоресценцію відзначали через 24 год, з препуція - через 48, з носа та трахеї через 72 год після зараження. Присутність специфічного антигену вдається підтвердити зараженням культури клітин нирки телят, у якій виявляється специфічна перинуклеарна та дифузна цптоплазматична флюоресценція, властива ринотрахеїтній інфекції. Використання культури клітин нирки кроля дозволяє звільнитися від неспецифічного свічення.

Збіг результатів РІФ та патогістологічних змін становить 87%, а імунофлюоресценції та вірусологічних досліджень – 44%. При паралельному дослідженні сироваток у РН та РІГА результати збігалися у 94% випадків.

У польових умовах РІФ виявилася позитивною у 18,5%, а метод вірусовиділення – у 15,9% випадків.

Таким чином, РІФ можна використовувати для експрес-діагноз діагностики ІРТ з подальшим підтвердженням діагнозу вірусологічними методами.

РН.За наявності ЦПД в культурах клітин, заражених ізолятом, і позитивної імунофлюоресценції проводять остаточне типування вірусу в РН. Перед її постановкою специфічну та негативну сироватки розводять у співвідношенні 1:10 розчином Хенкса або живильним середовищем для куліури клітин, що містять ангіонотики, і прогрівають у водяній бані 30 хв при 56 °С. РН ставлять загальноприйнятим методом в первинній культурі ПЕК або лінії клітин МДВК, що перевивається.

Результати РН враховують ЦПД вірусу, для чого визначають титр типованого ізоляту в присутності специфічної та негативної (контрольної) сироваток. Титр розраховують за методом Ріда та Менча та виражають у lg ТЦД 50 /мл.

Потім обчислюють індекс нейтралізації (І) за формулою І = Т1: Т2,

де Т 1 - титр ізоляту у присутності контрольної сироватки; Т 2 - титр ізоляту у присутності специфічної сироватки.

Видову приналежність ізоляту встановлюють при різниці в титрах вірусу щонайменше 2 lg. При індексі нейтралізації від 1 до 2 lg реакцію вважають сумнівною, в цьому випадку її повторюють. Індекс нейтралізації менше 1 lg вважають негативним. За позитивних результатів РН ізолят вважають повністю ідентифікованим.

Приготування гіперімунної сироватки для РН.Гіперімунну віруснейтралізуючу сироватку готують за наступною схемою: підшкірно вводять кроликам 1 мл культурального вірусу з ад'ювантом Фрейнда, далі трикратне внутрішньовенне введення вірусу в об'ємі 1 мл з інтервалом через 7 днів. Через 10 днів після останньої інокуляції вірусу кроликів знекровлюють, заморожують сироватку і зберігають при мінус 30 °С.

РТГА.Ставлять її мікрометодом при 4 ° С з 0,5 - 1%-суспензією еритроцитів білих мишей, розріджувач - трис-буферний розчин з 0,2% бичачого сироваткового альбуміну. Як антиген використовують культуральну вірусовмісну рідину, яку концентрують ПЕГ-6000 або ультрацентрифугуванням.

Після виявлення гемагглютинуючого агента, визначення його гемагглютинуючого титру готують 4 ГАЕ і проводять його ідентифікацію в РТГА з позитивною еталонною сироваткою.

Імуноферментна ідентифікація вірусу.Імунопероксидазний метод можна використовувати для дослідження прижиттєво взятих нозофарингіальних мазків-відбитків у клітинах, отриманих з легеневих

Крім того, рекомендовано непрямий антикомплементарний імунопероксидазний метод (НАІП) для лабораторної ідентифікації вірусу ІРТ. Методика полягає в наступному: на покривному склі, в пробірках готують чутливу культуру клітин до вірусу ІРТ (ПЕК, ТБ та ін) за загальноприйнятою методикою. Моносар заражають досліджуваним вірусом. Через 48 годин скла з інфікованими клітинами вилучають, відмивають у фосфатно-буферному розчині з рН 7,2-7,4 і фіксують в охолодженому ацетоні 5-10 хв.

На фіксований моношар клітин наносять 1-2 краплі суміші зі специфічної імунної сироватки та комплементу морської свинки у розведенні 1:10. Перед роботою противірусні сироватки сорбують гетерологічними вірусами, що досліджуються, т. с. отримують моносироватки. При обробці контрольних препаратів на моношар наносять суміш комплементу та нормальної сироватки.

Препарати інкубують у вологій камері при 37 °С протягом 40-60 хв, потім промивають проточною водою 5-10 хв, злегка підсушують і обробляють міченою пероксидазою антикомплементарною сироваткою (1-2 краплі), попередньо розведеною 1:20 фосфатним буфером поміщають препарат на 40-60 хв у вологу камеру за 37 °С. Потім їх промивають, підсушують і для виявлення комплексу, що утворився (антигенан-тітіло-пероксидаза) на препарат наносять на 40-60 хв бензидиновий реагент (50 мг бензидину в 100 мл трис-НС1-буфера з рН 6,8 з додаванням після фільтрації 6- 7 крапель 3%-ного перекису водню на кожні 5 мл робочого розчину). Препарат витримують у вологій камері, промивають у дистильованій воді, висушують, монтують на предметному склі та вивчають у світловому мікроскопі під об'єктивом з імерсією.

При світловій мікроскопії непрямий антикомплементарний імунопероксидазний метод забезпечує чітке виявлення вірусного антигену в цитоплазмі інфікованих клітин у вигляді забарвлених у коричневий колір утворень, що видно при збільшенні у 140 разів.

Специфіка показників, отриманих цим методом, підтверджується постановкою спеціальних імунологічних контролів. При постановці перехресної імунопероксидазної реакції з гетерологічними антитілами ця реакція має виражений видоспецифічний характер: антиген реагує лише з гомологічною сироваткою. Ендогенна пероксидаза у культурі клітин ПЕК та LF не виявляється.

Непрямий антикомплементарний імунопероксидазний метод є перспективним при діагностиці гострих респіраторних вірусних інфекцій великої рогатої худоби.

При використанні імунопероксидазного методу для індикації вірусу ІРТ у культурі клітин ПЕК антиген виявляється через 18, 22 години після зараження. Три прямі серологічні методи швидкого виявлення вірусних антигенів (РІФ, імунопероксидазний та ELISA) однаково застосовні для виявлення вірусу під час лихоманки, але не на пізніх стадіях хвороби.

Вірусний антиген виявляють у носових змивах методом ELISA з 3-го по 10-й день після зараження. У кон'юнктивальних змивах його виявляють на 5 добу.

ІдентифікаціявірусуІРТ за допомогою рестрикційного аналізу вірусної ДНК. Описано метод клонування фрагментів геному вірусу ІРТ, виділення та характеристика рекомбінантного ДНК-зонда, що дозволяє визначати вірус у клінічних пробах. За допомогою методу дот-блот-гібридизації виявлено ДНК вірусу ІРТ у пробах сперми, отриманої від серопозитивних тварин, коли виділення вірусу в культурі клітин давало негативний результат. Хороший результат також отримано з використанням інфікованих культур клітин.

Серодіагностика та ретроспективна діагностика. Антитіла до вірусу ІРТ можна виявити в сироватках крові хворих і перехворіли тварин у РН, РНГА та ін. Для постановки ретроспективного діагнозу використовують парні проби сироваток, взяті з інтервалом у 3 тижні. Результат серодиагностики враховують зростання титру антитіл у парних пробах сироватки, і навіть числа серопозитивных тварин через зазначений інтервал. Перед дослідженням сироватки прогрівають у водяній бані за температури 56 °С протягом 30 хв.

РН.Ставлять методом розведення випробуваних сироваток з постійною дозою вірусу в культурі клітин "ПЕК або ТБ. Вірус попередньо титрують в культурі клітин. Для цього сухий вірус ІРТ з набору діагностикумою стерильно розводять в обсязі, зазначеному на етикетці, і готують з нього десятиразові розведення від 10 1 до 10 -6 на живильному середовищі (кінцевий титр су.хого вірусу вказаний на етикетці).

Розведення готують у загальному обсязі 5 мл, потім заражають по 4 пробірки з культурою клітин, попередньо відмитою від ростового середовища, кожним розведенням вірусу в об'ємі I мл. Заражені та контрольні культури клітин (4-6) інкубують при 37 °С, щодня враховують ЦПД вірусу заключно - на 5-7 добу.

Титром вірусу вважають зворотну величину його найбільшого розведення, що викликає ЦПД у 50% культур клітин, який вираховують за методом Ріда та Менча плі Кербера та виражають у ТЦД 50/мл. Титри 1:32, 1:64 виявляються рідко. У неблагополучних з цієї хвороби стадах ВНА виявляються у 12% клінічно здорового худоби. Ретроспективний діагноз на ІРГ ставлять при 4-кратному та більше прирості AT у пробах сироваток реконвалесцентів. Нині широко використовують мікрометод РН.

РНДА.Біологічна промисловість нашої країни виготовляє еритроцитарний діагностикум. РНГА ставлять згідно з методичними вказівками в мікропанелях з U-подібними лунками наборів мікротитрування Такачі або Тітертек за загальноприйнятою методикою. Результати РНГА з сироватками, що використовуються, оцінюють за титрами; позитивні – 1:16 і вище, сумнівні – 1:8, негативні – 1:4, 1:2 та нульові. Збільшення титрів АТ у парних сироватках у 2-4 рази свідчить про наявність інфекції. Застосовуючи РНГА, можна виявити AT у ранній період інфекції, ніж з допомогою РН. Встановлено відповідність результатів РНДА та РН у 95% випадків. За допомогою цієї реакції легше і швидше, ніж РН проводити типування АТ до вірусу ІРТ. Титри AT були в 7-10 разів вищі за РН.

РДП.Не знайшла широкого застосування у діагностичній практиці, дослідники рекомендують її використовувати для серодіагностики ІРТ. За наявності ПА можна вловити нещодавно інфекцію, тоді як ВНА тривалий час циркулюють в організмі, і захворювання можна вловити по парних сироватках. При виявленні ПА кров краще брати на 8-й та наступні дні хвороби.

РТГА.Може використовуватися для виявлення та кількісної оцінки AT до вірусу ІРТ. Титр анти-ГА корелює з титром ВНА. Позитивний результат РТГА вже в 1-му розведенні сироватки (1:4) вказує на наявність AT до вірусу ІРГ у цій пробі сироватки. 4-кратний і більше приріст титрів анти-ГА у парних пробах сироватки є показником активної інфекції.

ELISA. Широко застосовують у Нідерландах, США, Великій Британії, Швеції, країнах колишнього СРСР. Він виявився придатним виявлення AT до вірусу ІРГ в молоці. Для цього достатньо одержання проб змішаного молока від 5-10 корів. AT визначають після попереднього концентрування Ig. Збіг даних серологічних реакцій у пробах сироватки крові та молока становила 92,8%. За допомогою даного методу можна оперативно визначати імунологічний статус поголів'я лактуючих корів цілого регіону, а також проводити обстеження тварин, що експортуються та імпортуються. У ФРН розроблено та застосовується метод ТРАХІТЕСТ для ІФА проб збірного молока порів з метою діагностики прихованого вірусоносійства.

Запропоновано непрямий метод IgM-ELISA для визначення нещодавньої інфекції ІРТ. Ранні AT IgM виділені на 6-й дн після зараження, до 9-го дн відбувалося зростання титру AT Ig, a до 13-го дн - ВНА. У телят, щеплених інактивованою вакциною, ранньої імунної відповіді не відбувалося - AT IgM не виявлялися, a IgM та ВНА з'являлися пізніше, ніж після зараження. Однак при цьому слід мати на увазі, що наявність у сироватці ВРХ ревматоїдного фактора може призвести до хибно-позитивних результатів діагностики в IgM-ELISA. У цьому випадку попередня обробка проб сироватки антибичачими IgM дозволяє уникнути хибнопозитивних результатів. Тест IgM-ELISA має велику цінність у діагностиці ІРТ, особливо у молодих тварин. У групі позитивних сироваткових проб кореляція між ELISA та РНГА становила 98,3% a EL1SA з ІФ - 95,7%.

ELISAз використанням монАТ. Заснований на конкуренції між AT сироватки крові ВРХ та нейтралізуючими мишачими монАТами. Для проведення лунки мікротитраційних панелей обробляють очищеним вірусом ІРТ, і після висушування їх можна використовувати негайно або зберігати при - 20°С. У оброблені вірусом лунки панелей послідовно вносять нерозведену випробувану сироватку, специфічні до вірусу ІРТ монАТ, кон'юговані пероксидазою, субстрат пероксидази. Результати реакції враховують у спектрофотометрі при А405. У разі позитивної реакції зв'язування монАТ пригнічується AT сироватки крові. Метод виявився набагато чутливішим і специфічнішим за РН.

Лабораторна діагностика ротавірусної інфекції великої рогатої худоби

Ротавірусна інфекція (РВІ) ВРХ (діарея неонатальних телят) - гостра контагіозна хвороба новонароджених телят, що характеризується ураженням ШКТ. Хвороба поширена у всіх географічних регіонах земної кулі. Майже її реєстрували скрізь, де проводили дослідження. Доведено широку дисимінацію ротавірусів (РВ) телят серед тварин різних видів та наявність АТ у гризунів (морських свинок, щурів, хом'яків, мишей).

На підставі епізоотологічних, клінічних та патологоанатомічних даних ставлять попередній діагноз, остаточний встановлюють лише лабораторними методами. Останні базуються на виявленні вірусу або вірусного АГ у фекалі хворих телят, вмісті кишечника, клітинах слизової оболонки тонкого кишечника загиблих і вимушено вбитих тварин, а також на виявленні АТ до РВ у сироватках крові хворих та перехворілих телят та у сироватках крові та молозиві коровма .

Експрес-методи діагностики.Розроблено тест-систему ІФА на основі РВ свиней при виявленні специфічного АГ РВ ВРХ, яка має високу чутливість і специфічність. Її доцільно застосовувати у лабораторних умовах для експрес-діагностики. Оскільки поліпептид VР5 містить перехресний груповий АГ, локалізований у консервативному домені, який є загальним для всіх РВ групи А. Показано можливість індикації рота- та коронавірусів методом флюоресцентних зондів та АТ до них. Він заснований на реєстрації ранніх етапів взаємодії вірусів із рецепторами клітин.

Виділення вірусу.В лабораторію для дослідження направляють не менше 10 проб рідких фекалій, тонкий кишечник із вмістом (не пізніше 2-3 години з моменту загибелі або вимушеного забою телят), 10-15 проб парних сироваток хворих і перехворілих тварин, 6-10 проб сироватки крові та 6-10 проб молозива. З найбільшою сталістю вірус вдається виявити в пробах фекалій, взятих у перші дні хвороби, тому для дослідження придатні фекалії, взяті від 2-14 днів телят з клінічними ознаками діареї на 1-3-й день хвороби. Відразу після доставки в лабораторію проби обробляють або зберігають при 4°С не більше доби, при -20-50°С до 1 міс. Сироватки крові зберігають при 4-10 ° С не більше 1 тиж, при -20 ° С до 1 міс; молозиво – при 4°С не більше 2 діб, при –20°С – до 1 міс. Для вірусологічних або електронно-мікроскопічних досліджень готують 10% суспензію фекалій на р-рі Хенкса. Суспензію гомогенізують і центрифугують 1 год при 3 тис. об/хв, надосадову рідину переносять у стерильний флакон, додають пеніцилін і стрептоміцин (1000 ОД/мл), витримують 10-12 год (ніч) при 4°С і досліджують.

Виділення РВ у культурі клітин.Показано кореляцію між захворюванням новонароджених телят діареєю з присутністю РВ АГ у фекаліях. Слід мати на увазі, що звичайними методами вірус не культивується, а застосування додаткових впливів – хімічних (трипсин) та фізичних (центрифугування вірусу на шарі клітин) – дає позитивні результати при високих концентраціях вірусу у фекаліях, що перевіряється електронною мікроскопією. Для цього вміст однієї пробірки після заморожування та відтавання та обробки поліетиленгліколем ресуспендують у 0,1 мл дистильованої води та досліджують в електронному мікроскопі. У позитивному випадку виявляють типові частки РВ та їх скупчення. Специфічний характер частинок підтверджують методом імуноелектронної мікроскопії.

Індикація та ідентифікація вірусу.ЕМ та ІЕМ. Метод електронної мікроскопії (ЕМ) суспензії вірусу з рідкої частини фекалій найбільш широко застосовується для діагностики інфекції при концентрації вірусу в фекаліях не нижче 104-105 частинок/мл рідини. Препарати готують із освітленої низьким центрифугуванням рідкої частини фекалій, Однак кращі препарати отримують при розведенні фекалій дистильованою водою 1:1-1:10 і подальшому освітленні суспензії центрифугуванням при 4-10 тис. об/хв протягом 15 хв. Простий метод приготування препаратів з фекалій, що не поступається за чутливістю до ультрацентрифутування, полягає в наступному. До 4 мл освітленої низьким центрифугуванням рідкої частини фекалій додають 60% насиченого розчину (NН 4) 2 SО 4 змішують, залишають на 1 год при 4°С, а потім центрифугують 10 хв при 10000 об/хв. Надосадову рідину зливають, а осад ресуспендують у 4-х краплях дистильованої води та готують препарати. Існують різні способи і модифікації приготування препаратів. Найбільш широко використовується крапельний спосіб. Більше доцільно застосовувати ІЕМ. Для цього можна використовувати сироватку лабораторних тварин (кроликів, морських свинок), імунізованих РВ мавп або сироватку реконвалесцентів. Зміст і специфічність АТ в сироватках реконвалесцентів можуть бути перевірені в серологічних реакціях з використанням вірусу SА 11. При обробці фекальної суспензії імунною сироваткою одночасно з виявленням типових частинок РВ встановлюється їх специфічність, на що вказує виявлення агрегатів. Найчастіше використовують три модифікації імуноелектронної мікроскопії.

При позитивному результаті РВ частки виявляються у препаратах як специфічних скупчень (імунних комплексів). Оцінку специфічності реакції проводять шляхом підрахунку числа та розмірів подібних скупчень, а також за ступенем покриття окремих віріонів АТ сироватки. Виразність цього ефекту при певному навичці можна оцінювати за шкалою умовних одиниць від 0 до 4 плюсів.

ІФ.Для виявлення вірусного АГ у заморожених зрізах тонкого кишечника, мазках фекалій та культурі клітин успішно застосовують прямий та непрямий методи. При дослідженні кріосрізів кишечника та мазків із фекалій телят найкращі результати отримують протягом 4-6 годин після виявлення ознак діареї. Епітеліальні клітини швидко десква-муються з поверхні ворсинок кишечника і видаляються з фекальними масами. Найчастіше суспензією фекалій заражають культуру клітин та ідентифікують вірусний АГ реакції ІФ. Розроблено прямий метод ІФ у клітинах МДВК, інфікованих культуральним чи фекальним вірусним матеріалом. У методичних рекомендаціях по індикації РВ ВРХ непрямим методом ІФ передбачається використання діагностичного набору, що включає антиген специфічний - культуральну суспензію, що містить вірус ПЕК або МА-104; АГ нормальний – неінфіковану суспензію клітин ПЕК або МА-104; специфічну сироватку, одержану шляхом гіперімунізації телят, лабораторних тварин; нормальну сироватку від здорової ВРХ, що не містить АТ до РВ; антивидову сироватку проти глобулінів ВРХ, кон'юговану ФІТЦ (випускає Інститут епідеміології та мікробіології ім. Н.Ф. Гамалеї). НІФ можна використовувати для виявлення та ідентифікації РВ АГ в інфікованих культурах клітин, фекаліях та кишечнику хворих та полеглих телят для виявлення та кількісної оцінки АТ до РВ.

РДП.Це - простий і доступний метод виявлення РВ АГ у фекаліях хворих на телят, вміст кишечника і суспензії слизової оболонки кишечника загиблих або вимушено вбитих телят. Для цього 20% суспензію фекалій у фосфатно-буферному сольовому розчині прогрівають у водяній бані при 37°С 30 хв, періодично перемішуючи. Потім центрифугують 15 хв при 8000 g. Надосадову рідину фільтрують через фільтр "Міліпор" і фільтрат концентрують у 25 разів за допомогою діалізного концентратора. Внаслідок всіх етапів обробки 0,2 мл концентрату відповідає 1 г вихідного матеріалу фекалій. Джерелом специфічних АТ служать сироватки реконвалесцентів після ротавірусного гастроентериту, попередньо перевірені в інших серологічних реакціях.

РДП проводять в гелі агарози на скляних пластинках 0,9% агарози в буферному розчині, що містить 0,1 М NaС1, 0,01 М трис(гідроксиметил)-амінометану і 0,001 М етилендіа-мінтетраацетату. Компоненти реакції поміщають у вирізані у шарі агарози лунки діаметром 3 мм, віддалені один від одного на 3 мм. Платівки з гелем витримують протягом ночі за кімнатної температури, після чого враховують результати. Між лунками з АГ та АТ у позитивних випадках формується одна чітка лінія преципітації. У РДП випробовується АГ - рідка частина фекалій або надосадова рідина після центрифугування суспензії фекалій або кишечника, випробувана сироватка від телят, що перехворіли, молозиво і молоко в натуральному вигляді (у вигляді сироватки) після обробки сичужним ферментом.

Реакція імунопреципітації з фарбуванням преципітатів флюоресцентними АТ може застосовуватися для виявлення у фекаліях РВ людини та РВ діареї телят. Розроблено її прискорену модифікацію. Діагностикум, що включає специфічний та нормальний АГ, специфічну сироватку, готують за методикою ВІЕВ, а як нормальна сироватка використовують фетальну сироватку або сироватку безмолозивних телят. Реакцію оцінюють за освітою характерних ліній преципітату.

РЗК.Для виявлення АГ застосовується рідше за інші методи. Вона менш чутлива, ніж електронна мікроскопія та РІФ, частіше дає хибнопозитивні результати через антикомплементарність багатьох проб фекалій. Однак при обробці фекалій комплементом, фетальною сироваткою, фреоном, очищенням ПЕГ 6000 або ультрацентрифугування РСК не поступається за чутливістю електронної мікроскопії. Реакцію ставлять мікрометодом зі специфічною сироваткою або сироваткою телят, що недавно перехворіли, вільної від АТ до інших вірусів.

ВІЕФ.При цій реакції утворюється лінія преципітації між АГ, що рухається до анода, і АТ, що рухається до катода. Якість і чистота агароз є основним фактором отримання відтворюваних результатів. Більшість дослідників вважають, що цей тест не поступається електронною мікроскопією або навіть перевершує її.

ВІЕФ запропонований для виявлення РВ у фекаліях та патологічному матеріалі та для виявлення АТ у сироватках крові. Для дослідження беруть рідку частину фекалій. Якщо для дослідження рідкої частини недостатньо, проби фекалій центрифугують 10-15 хв при 4 тис. об/хв при 4-10°С. Досліджують надосадову рідину. Кишечник дрібно подрібнюють, додають рівний обсяг фізіологічного розчину, потім гомогенізують у ступці зі склом, центрифугують 10-15 хв при 2 тис. об/хв при 4-10°С. Надосадову рідину використовують у реакції. ВІЕФ ставлять у 0,85%-му розчині агарози, приготовленої на 0,5 М веронал-мединаловому буфері (рН 8,6).

ЕLISА.За чутливістю вище, ніж ЕІ, ІФ, РЗК, ВІЕФ. Може бути використаний у прямому та непрямому варіантах, а також у постановці на латексі. За допомогою ЕLISА можна виявити РВ у фекаліях телят при розведенні досліджуваної проби до 1:5000. Описаний твердофазний ЕLISА для типування та поділу на підгрупи РВ людини та тварин. Для цього використовують IgG у концентрації 5 мкг/мл; розведення кролячої антисироватки до IgG ВРХ до 1:400. Тривалість інкубації IgG -4 год, реакції АГ РВ з IgG -3 год, реакції антисироватки до РВ з комплексом IgG - РВ АГ -16 год, для з'єднання з кон'югатом - 4 год, зміни кольору субстрату (фосфату Р-нітрофенілу) - 10 хв. Перед дослідженням фекалії телят розводять у 4 рази фосфатно-буферним розчином, освітлюють центрифугуванням та обробляють сумішшю Твіна-20 з азидом натрію. Показання ЕLISА у 100% випадків збігаються з результатами електронної мікроскопії.

Розроблено тест-систему ІФА на основі РВ свиней для виявлення специфічного АГ РВ ВРХ, яка має високу чутливість та специфічність. У Російській Федерації розроблено імуноферментний діагностикум, що випускається ВІЕВ. Набір включає: специфічний ліофілізований РВ АГ - вірусовмісна суспензія, отримана на культурі клітин МА-104, концентрована ПЕГ 6000 і центрифугована при 6000g, контрольний АГ, ліофілізована специфічна антиротавірусна сироватка, одержана; сухі імуноглобуліни, виділені з гіперімунної антиротавірусної сироватки методом висолювання насиченим розчином (NН 4) 2 SО 4 з подальшою іонообмінною хроматографією на колонці з ДЕАЕ-целюлозою.

Існує низка інших методів для виявлення РВ АГ у фекаліях хворих на діарею телят: реакція зворотної пасивної гемаглютинації, метод імуноагрегатної ГА, реакція аглютинації латексу та ін. Так, запропонований простий стафілококовий метод для виявлення РВ у фекаліях новонароджених Метод заснований на виявленні РВ аглютинуючого стафілокока в 10% суспензії зразків фекалій на предметних стеклах з золотистим стафілококом, навантаженим РВ АТ. Контролем служать стафілококи, оброблені неімунною кролячою сироваткою. Аглютинація видно під мікроскопом через 2-3 хв після кругового похитування скла. Щоб уникнути неспецифічних реакцій проводять попередню обробку зразків фекалій нагріванням, фільтрацією та І-ацетилцистеїном. Така обробка не знижує специфічність методу. У порівнянні з ЕLISА даний метод виявився чутливішим; переваги його – швидкість, простота та низька вартість, що дуже важливо для скринінгу великої кількості зразків фекалій.

Метод аглютинації латексу з використанням комерційного набору Rotalех для виявлення РВ у фекаліях хворих настільки ж специфічний, чутливий, як і методи електронної мікроскопії, ІФ та ЕЛІСА. Для диференціації підгруп та серотипів ізолятів РВ описаний метод гібридизації нуклеїнових кислот, електрофорез у ПААГ віріонної РНК вірусів. Метод точкової гібридизації високо специфічний, що дозволяє виявляти 8 нг вірусної РНК і в 10-100 разів більш чутливий, ніж ЕLISА.

Варіантна ідентифікація за допомогою МОНАТ.Отримано монАТ до шт. RIT4237 (серотип I) РВ ВРХ. Нейтралізація АГ виявила варіабельну специфічність до групових та підгрупових детермінантів. Використанням монАТ проти субгрупових АГ в ЕLISА було встановлено домінування серотипу II РВ людини у пробах калу хворих дітей. Наявність таких АТ збільшує чутливість та специфічність тест-систем.

Серодіагностика та ретроспективна діагностика. Серологічне дослідження сироваток крові телят має дуже обмежену цінність. Протягом перших тижнів життя не вдається виявити приросту АТ, незважаючи на минулу хворобу. Рівень гуморальних АТ у дорослих тварин не дозволяє прогнозувати виникнення епізоотії у стаді.

РЗК.Для діагностики РВІ показана можливість постановки РЗК з парними сироватками перехворілих тварин. У перші дні хвороби КСА більшість тварин відсутні. До 7-10 дня рівень їх зростає, досягаючи максимуму до 21 дня, потім відбувається зниження і до 30-35 дня титр КСА доходить до нуля. РСК ставлять загальноприйнятим методом у мікро- та макрообсягах.

РТГА.Ставлять за стандартною методикою, що використовується діагностичними вірусологічними лабораторіями. Застосовують скляні пробірки та звичайні обсяги реагентів або одноразові пластикові панелі з лунками та мікрооб'єми реагентів. Для постановки реакції використовують еритроцити людини групи або еритроцити морської свинки. Досліджувані сироватки обробляють каоліном та еритроцитарною масою (останнє – при використанні еритроцитів людини). Всі розведення готують на фізіологічному сольовому розчині з додаванням 0,04% альбуміну сироватки ВРХ.

Непряма ІФ, РН, радіоімунологічний методставляться за загальноприйнятими методиками.

Диференційна діагностика. РВІ у новонароджених телят слід диференціювати від коронавірусної інфекції, колібактеріозу. Необхідно виключати диспепсію новонароджених телят аліментарного походження. Для титрування вірусів групи А розроблені методи дот- та блот-гібридизації РНК із зондами до ДНК геномного сегмента 4, отриманими за допомогою ампліфікації в ПЛР гіпердивергентних областей гена білка VР4 (нуклеотиди 211-686) до ДНК шт. ІЧ, IND, NCDV та Сr з використанням олігонуклеотидних праймерів. Зонди 3 типоспецифічні (VР4) і не реагують перехресно з 2-нитковими РНК гетерологічних Р-типів РВ.

Лабораторна діагностикавірусної діареї

великої рогатої худоби

Вірусна діарея - хвороба слизових оболонок (ВД-БС) - інфекційна контагіозна хвороба ВРХ, переважно молодих тварин, що характеризується ерозивно-виразковим запаленням слизових оболонок травного тракту, ринітом, збільшенням лімфовузлів, високою лихоманкою, високою лихоманкою, і виразковим стоматитом з рясним слиновиділенням, появою слизово-гнійних витікань із носової порожнини. У корів можливі аборти. Вперше як самостійне захворювання ВД-БС було визначено в штаті Нью-Йорк (США) у 1946 р. при спалаху гострої, часто зі смертельним результатом хвороби ВРХ, що характеризувалась діареєю та ерозійними ураженнями шлунково-кишкового тракту. В даний час ВД-БС широко поширена на територіях багатьох країн і разом з двома іншими пестивірусами (ВКНС і вірус ПБО) інфікує 173 види домашніх та диких жуйних тварин та 11 видів свиней. Є публікації про виявлення АТ і АГ пестивірусу у людини, але можливість його інфікування лише передбачається.

На підставі відмінностей у клінічних проявах вірусну діарею та хворобу слизових оболонок ВРХ спочатку розглядали як різні хвороби. Пізніше на підставі аналізу патологічних змін, особливостей епізоотології та клінічних проявів ці 2 хвороби стали позначати під назвою вірусна діарея – хвороба слизових оболонок ВРХ . Оскільки встановлено ідентичність збудників цих хвороб, їх вважають однією інфекцією з різними клінічними проявами, переважним розвитком респіраторного чи діарейного синдрому, у зв'язку з чим хворобу частіше почали називати вірусна діарея ВРХ.

Хвороба зареєстрована у всіх країнах світу. У деяких штатах США можна знайти до 70-90% серопозитивних тварин.

Діагноз ставлять на підставі клінічних, епізоотологічних даних та лабораторних методів дослідження. Однак епізоотологічні дані, симптоми хвороби та характер патологічних змін дають підставу лише запідозрити хворобу. Оскільки ВД-БС нагадує багато інших хвороб (чуму, інфекційний виразковий стоматит, грибковий стоматит, ПГ-3, катаральну лихоманку ВРХ, паратуберкульоз та аліментарні отруєння), лабораторні дослідження у діагностиці мають вирішальне значення. При постановці діагнозу на ВД-БС слід враховувати наступне: хворіють окремі тварини у віці 3-36 місяців, типові клінічні зміни проявляються ураженням слизових оболонок або кров'янистим проносом з ерозією або без ерозії слизових мембран, всі хворі тварини гинуть протягом декількох днів, у хворих тварин немає специфічний АТ у крові, хоча решта поголів'я має їх у високих титрах.

Лабораторна діагностикаВД-БС включає: 1) виявлення у патологічному матеріалі (мазках, відбитках, зрізах), отриманому від хворих тварин АГ у РІФ; 2) виділення збудника з патологічного матеріалу в культурі клітин ТБ, ПЕК або ЛЕК ідентифікація в РН або РІФ; 3) виявлення АТ у сироватці крові хворих та перехворілих тварин (ретроспективна діагностика) у РСК та РН.

Лабораторну діагностику ВД-БС проводять із використанням набору діагностикумів, що випускаються біологічною промисловістю. Її ведуть паралельно з дослідженням матеріалу на ПГ-3, аденовірусну (адено 1 та 2), РС та ІРТ.

Попередній діагноз на ВД-БС ВРХ ставлять на підставі позитивних результатів виявлення АГ у патологічному матеріалі в ІФ та ПЛР з урахуванням епізоотологічних та клінічних даних, а також патологоанатомічних змін. Остаточний діагноз ставлять на підставі: збігу результатів ІФ з ПЛР, виділенням та ідентифікацією вірусу; збіги результатів ІФ з виявленням АТ в 30% і більше других проб парних сироваток в титрах не нижче 1:4 РСК і 1:16 РН; виявлення 4-кратного та більше приросту АТ у парних пробах сироваток. Попередній діагноз ставлять у ветеринарних лабораторіях протягом 2-3 днів, остаточний - до 30 днів.

Виділення вірусу.В лабораторію направляють патологічний матеріал від хворих тварин, взятий у перші 2-3 дні при виражених симптомах хвороби або від тварин, убитих з діагностичною метою на гострій стадії захворювання. Від болючих тварин беруть 15-20 проб наступного матеріалу: змив зі слизової оболонки носової порожнини, одержувані шляхом введення стерильного ватно-марлевого або поролонового тампона в носові ходи; проби крові в перші 3 дні хвороби і через 3 тижні від тих же тварин з дотриманням правил асептики в стерильні пробірки по 8-10 мл; зіскрібки з виразки ленних або ерозованих ділянок слизових оболонок ротової порожнини і носового дзеркала, взяті жорсткими ватно-марлевими тампонами або скальпелем. Тампони з матері лом поміщають у стерильні пеніцилі нові флакони або пробірки з 2-3 мл стерильної фізіологічного розчину або розчину Хенкса, що містить 500-1000 ОД/мл антибіотики (канаміцину, мономіцину, неоміцину, пеніциліну, дрепт). . З крові після згортання стерильно зливають 3-4 мл сироватки та доставляють у лабораторію.

Від тварин, убитих з діагностичною метою, беруть із дотриманням правил асептики шматочки легень з бронхом (на межі ураженої та здорової ділянок), селезінки, середостінні, бронхіальні та брижові лімфовузли, мигдалики, уражені ділянки слизових оболонок носової та ротової порожнин, трахеї, ШКТ, а також пробу крові. Шматочки матеріалу масою до 20 г поміщають у стерильну посудину, що щільно закривається. Легше вірус виділити на початку хвороби і в період загострення з крові, легень, різних учасників тонкого кишечника (особливо з клітин слизової оболонки 12-палої кишки лімфовузлів і селезінки. При хронічному перебігу хвороби його вдається регулярно виділяти з різних відділів кишечника, але не з крові Дослідження носових змивів і фекалій у цих випадках також дає негативні результати, хоча в окремих випадках вірус виділяли з фекалій навіть через 5 місяців після хвороби. натрію або гелю рину і поміщають їх у термос з льодом.З крові експериментально заражених тварин виділяли вірус з 1-14-го дня після зараження.Виділяли його також з тканин абортованих або мертвонароджених плодів, плаценти та навколоплідної рідини.

Зараження культур клітин.Вірус виділяють у первинних субкультурах клітин ембріона ВРХ (ПЕК, ЛЕК, СЕК) або ТБ. Ізолят вважається виділеним у разі, якщо він викликає стабільне однотипне ЦПД не менше ніж у 2-х послідовних пасажах. І тут можлива його ідентифікація в РН. У первинних культурах клітин нирки ембріона корів перші ЦПІ виявляють через 2-5 днів після інокуляції. Вони виражаються у появі дрібнозернистої інфільтрації у клітинах фібробластоїдного типу. У міру розвитку інфекції клітини поступово відкидаються від поверхні скла, але деякі довго зберігаються, утворюючи острівці клітин епітеліоїдного типу. Зрештою на склі залишається лише мережа зернистого матеріалу.

При використанні вторинних культур клітин цитопатичні зміни з'являються майже одночасно у всіх клітинах моношару, причому вони стають подовженими, незграбними і здаються переплетеними. У пофарбованих препаратах клітинного моношару за наявності цитопатичних змін виявляють вакуолізацію протоплазми та зміну ядер, що виражаються у скороченні мембрани, пікнозі та каріорексисі. У деяких випадках вакуолізація буває така виражена, що її спостерігають при мікроскопії незабарвлених препаратів. Розвиток ЦПІ відповідає зростанню титру вірусу. До 72-96 год після інокуляції, коли титри вірусу досягають максимуму (10 55 -10 65 ТЦД 50) відзначають лише початок ЦПД. За відсутності ЦПД в 3-х послідовних пасажах клітин 4-й пасаж проводять із спробою виявлення вірусу в моношаровій культурі на покривних скельцях в ІФ. За негативної реакції подальше дослідження припиняють. Проте негативний результат у разі не дає права постановку діагнозу. Для ідентифікації таких штамів японські дослідники пропонують використовувати феномен екзальтації вірусу БН у присутності збудника ВД-БС. Сутність методу зводиться до появи ЦПІ при спільному вирощуванні цих агентів у культурах клітин тестикулярної тканини ВРХ. Методика дослідження ось у чому. Дисперговані трипсином клітини тестикулярної тканини ВРХ суспендують до концентрації 210 6 клітин в 1 мл у 0,5%-ному розчині ГЛАХ з сироваткою ВРХ, перевіреної на відсутність ЗНА до збудника ВД-БС. Суспензію розподіляють по 0,5 мл пробірки. У кожну з них інокулюють по 0,5 мл вірусного матеріалу (розведеного ВД) і інкубують при 37°З похилому стаціонарному положенні. Як контроль у кожен досвід включають не інокульовані культури. Після 4 днів інкубування рідину видаляють, а культури заражають вірусом БН (10 6 БОЕ в 0,5 мл середовища). Після додаткового 3-дн інкубування при 37°З культури досліджують наявність ЦПД. У культурах, що спочатку інфіковані нецитопатогенним штамом ВД, після зараження вірусом БН з'являється чітко виражені ЦПІ. У контрольних культурах один вірус БН зазвичай викликає ЦПИ. Незаражені культури, у яких не вводили жодні з вірусних агентів, повинні залишатися нормальними.

Для пасування не цитопатогенних штамів культури, інокульовані вірусом діареї кожного пасажу, інкубують 3 дні при 37°С, після чого збирають культуральну рідину, яку використовують для подальших пасажів, а культури інфікують вірусом БН і додатково інкубують для індикації ВД за допомогою феномену.

Зараження телят. Біопробу на телятах ставлять у тих випадках, коли спроби виділити специфічний вірус виявилися безуспішними або виникає сумнів щодо його наявності у зв'язку з тим, що в заражених культурах клітин немає ЦПІ. Використовують телят 2-6 місяців віку, перевірених на відсутність ЗНА до ВД, або телят 4-6-дн віку, отриманих з благополучного господарства. Як матеріал для зараження використовують культуральну рідину 3-5 пасажів, 5-10 мл якої вводять внутрішньовенно. Якщо у досліджуваному матеріалі є вірус діареї, у телят на 4-7-й день після зараження відзначають підвищення температури, лейкопенію, поява слизових оболонок з носової порожнини та діарею; у деяких тварин можуть спостерігатися тенезми. У разі позитивного результату, у заражених тварин вірус порівняно легко вдається виділити з крові. У найбільшій концентрації (10 3 -10 5 ВД 50 /мл) вірус виявляють через 4 дні після зараження, хоча присутність його в крові підтверджується протягом 15 днів.

Серологічна ідентифікація.

ІФ.Аналогічна така при діагностиці аденовірусної інфекції. Цим методом АГ ВД виявляють у клітинах слизової оболонки прямої кишки, селезінки, легень та лімфовузлів експериментально заражених тварин. Вивчено розподіл АГ ВД-БС у тканинах тварин гострому та хронічному перебігах хвороби. У лімфоїдних тканинах АГ розташовується у клітинах системи фагоцитуючих мононуклеарів. Між початковим виявленням АГ у слизовій оболонці кишечнику, кератинізованому епітелії верхніх відділів травної системи та шкіри та прогресуванням патологічних ознак є прихований період.

ІФ біопсійного матеріалу слизових оболонок ротової та носової порожнин придатна для ранньої прижиттєвої діагностики вірусу діареї. ІФ виявлення АГ вірусу в клітинах з носоглоточных змивів - надійний і швидкий спосіб виявлення тварин, персистентно інфікованих вірусом. При дослідженні препаратів звертають увагу на свічення артеріальної гіпертензії в цитоплазмі не зруйнованих клітин. Яскрава зелена флюоресценція у вигляді гранул чи дифузного світіння цитоплазми щонайменше ніж 10% клітин дозволяє оцінити препарат як позитивний. Попередній діагноз ставлять за наявності щонайменше 30% позитивних препаратів від загальної кількості досліджених проб. Зручним виявився непрямий метод ІФ із використанням кон'югованих РаЬ-фрагментів АТ із гіперімунної свинячої сироватки проти ВД-БС ВРХ. Специфічна флюоресценція вірусного АГ у культурі бичачих макрофагів виявлялася у цитоплазмі клітин. Для ідентифікації цитопатогенних ізолятів метод ІФ практично єдиний. За наявності ЦПД у культурах клітин, заражених ізолятом, та позитивної флюоресценції проводять остаточне типування вірусу в РН.

РН.Це основний метод ідентифікації вірусу. Нові ізоляти збудника ВБ-БС, які не мають цитопатогенної активності, можуть бути ідентифіковані за допомогою гіперімунної сироватки до вірусу діареї щодо придушення феномену екзальтації вірусу НБ, який використовують для індикації подібних штамів.

РДП.Забезпечує швидку та точну постановку діагнозу, проте поки що чутливість методу невелика, і його слід використовувати в комплексі з іншими методами лабораторної діагностики та ідентифікації збудника. Приготування випробуваного АГ та методика постановки РДП описані раніше. Антисироватку для РДП готують на ВРХ. Для імунізації тварин використовують нітровану кров, взяту асептично від експериментально заражених тварин під час підйому температури. Кров вводять внутрішньовенно (деяким тваринам роблять кілька таких ін'єкцій). Кров беруть через 60-90 I днів після інокуляції.

Виявлення вірусу ПЛР.Цей метод рекомендований для швидкої діагностики ВД-БС. Після циклу зворотної транскрипції зразки тканини інфікованої культури клітин. ампліфікують з використанням праймерів, що забезпечують реплікацію певного сегмента гена білка gр48 ВД. Для виявлення ампліфікованих послідовностей використовують електрофорез у ПААГ та гібридизацію з біотинільованим, ДНК-зондом на послідовності геному вірусу лейкозу. При ідентифікації молочних стад, інфікованих вірусом ВД-БС ВРХ, також запропоновано метод ПЛР для роботи із пробами молока. Вірусну ДНК виділяють із соматичних клітин незбираного молока методом екстракції ізотіоціанатом гуанідину та фенолом-хлороформом. При гострій інфекції РНК вірусу виявлялася через 6-10 днів після зараження, а при хронічній - з використанням обох праймерів (5"-нетрансльована область (S"-НТ) і область р80) до розведення молока 1:640. ПЛР виявилася в 14,6 рази чутливішою за інші методи виділення вірусу. Для з'ясування РНК ВД методом ПЛР необхідно щонайменше 580 соматичних клітин, тоді як виділення вірусу - щонайменше 8500 клітин. Чутливість та специфічність ПЛР підтверджена гібридизацією за Соузереном . Чутливість методу перевищує чутливість виділення вірусу в культурі клітин у 102-104 рази. Показано можливість виявлення персистентної інфекції ВД-БС ВРХ методом ДНК-гібридизації та ПЛР.

Біотинільовані зонди комплементарної ДНК вже широко використовуються для виявлення пестивірусів (КНС, ВД-БС ВРХ та ПБО). У Бельгії розроблено метод виявлення специфічних АТ до ВД за допомогою ІФА, що проводиться з рекомбінантним АГ та монАТ. ІФА з монАТом зручний для виявлення віремії у тварин; з його допомогою в лейкоцитах виявляли 2 родинні неструктурні білки (р80К і р120-130К). Вірусний АГ був виявлений у В- та Т-лімфоцитах, моноцитах. Крім загальноприйнятого методу ІФА запропоновано імуноферментну реакцію захоплення АГ ВД ВРХ в лімфоцитах периферичної крові ВРХ. В реакції для захоплення АГ використовують монАТ до консервативного АГ домену неструктурного білка (р125/р80) ВД.

Крім ІФА розроблено та запропоновано метод взаємодії специфічної антисироватки з вірусним АГ ВД у лімфоцитах інфікованих тварин за допомогою проточної цитометрії. Метод відрізняється високою чутливістю та специфічністю. Для підвищення чутливості реакції лімфоцити фіксують, їх клітинні мембрани солюбілізують, і вірусний АГ виявляють при використанні біотинілованих Ig антисироватки свиней з подальшою інкубацією з ФІТЦем, кон'югованим авідином.

ІФА.ІФА дозволяє легко ідентифікувати культури клітин, інфіковані У Д. Ідентифікація за допомогою монАТ у практичному діагностичному застосуванні не розроблена. Однак отримано 5 монАТ (XI А9, АЕЗЕ2, АМ2G5, ВТ48, ВТ6G9) проти вірусу ВД-БС ВРХ з ВН-активністю, які дозволили розділити ізоляти ВД на 4 групи. Отримано та вивчено панель монАТ проти Singer-ізоляту, за допомогою якої були виявлені поліпептиди мол.м. 56-58 кД і доведено, що глікопротеїн, локалізується на поверхні віріонів і є носієм епітопів, що нейтралізують. Аналіз із панеллю монАТ показав АГ гетерогенність серед ізолятів цього вірусу.

Серодіагностика захворювання скрутна, тому що при хронічному перебігу інфекції АТ виявляються непостійно і бувають у невисоких титрах. Діагноз на минулу інфекцію, а також латентне номінація вірусу зазвичай ставлять за допомогою РН в культурі клітин, визначаючи титри АТ в сироватках реконвалесцентів. Для цього краще досліджувати парні сироватки, взяті з інтервалом 3-4 тижні. При діагностиці прихованого перебігу інфекції частіше використовують сироватки крові забійної худоби, що надходить із клінікою не діагностованої інфекції кишкового та респіраторного трактів. Зазвичай у разі відсоток позитивних сироваток (титри від 1:16 до 1:128) варіює у межах і може досягати 30-50 (іноді до 80). У клінічно здорових тварин відсоток позитивних спроб може коливатися від 6-8 до 20-30. Динаміка появи та згасання титрів ВНА недостатньо вивчена. Перед дослідженням сироватки прогрівають у водяній бані за температури 57-58°С 30 хв.

У США розроблено швидкий кількісний метод титрування ВД ВРХ. Він полягає в мікротитруванні з використанням цитопатогенних і не цитопатогенних ізолятів вірусу і лінії клітин, що перевивається, бичачої нирки - МДВК. Для цього серійні розведення вірус-містить рідини та суспензію клітин у концентрації 1-10 5 в середовищі з 2% сироватки крові коні заливають у лунки пластин Теrasaki і проводять мікротитрування в НІФ, яку враховують на дні лунок пластин, використовуючи водно-імерсійний об'єктив. Вірус також титрують і за бляшкоутворенням. Специфічну флюоресценцію у клітинах спостерігали вже через 12 годин після зараження, остаточні результати вважали через 72 години інкубування. Результати титрування вірусу по бляшках та в мікротитруванні збігалися. Мікротитрування вірусу ІФ має ряд переваг над стандартним методом титрування по бляшках: вимагає менше часу і матеріалів і особливо незамінне при титруванні не цитопатогенних ізолятів ВД.

РН.Її ставлять методом розведення випробуваних сироваток з постійною дозою стам дартного вірусу в культурі клітин ПЕК або ТБ. Позитивними вважають сироватки титром АТ 1:16 і вище, у парних сироватках - підвищення титру АТ у другій пробі у рази та більше. При експериментальному зараженні у всіх телят через 15-61 день виявляли ВНА у титрі 1:64 – 1:1024. Реакція, суть якої полягає у придушенні утворення бляшок АТ досліджуваної сироватки, виявилася придатною для серологічних досліджень при ВД-БС. Після одержання гомогенного шару клітин культуру промивають 1 раз фосфатним буферним розчином і заражають 15 мл суспензії вірусу в такому розведенні, щоб в 1 мл її містилося близько 20 БОЄ. Після адсорбції вірусу при 37°С протягом 30 хв сушію відсмоктують і наносять на культуру 15 мл агару. Після застигання агару на його поведін ності розкладають кружки фільтрувального паперу, насиченого нерозведеною сироваткою. Після 4 днів інкубації при 37°З враховують результати. Доказом того, що досліджувана сироватка містить АТ, є відсутність пошкодження шару клітин навколо насиченого нею кружечка фільтрувального паперу, що виявляється у вигляді вінок клітин.

РЗК.Ставлять мікрометод з використанням мікротитратора Такачі або Тітертека. За їх відсутності можлива постановка РЗК у пробірках у загальному обсязі 0,5 мл.

РДП.Не знайшла широкого застосування у ветеринарній діагностичній практиці при виявленні АТ у сироватках тварин. ПА з'являються порівняно пізні терміни (3-4 тижні) після інфікування і можуть зберігатися 4 міс (титри АТ до 1:16).

ЕLISА.У 500 разів чутливіше за РН, менш трудомісткий і швидше виконаємо. В якості АГ використовували вірус, концентрований ПЕГ і очищений градієнтною рівновазі ультрацентрифугуванням. Оптимальна концентрація артеріальної гіпертензії становила 1 мкг на лунку.

Диференційна діагностика. При постановці діагнозу на ВД-БС необхідно виключити ІРТ, аденовірусну інфекцію, ПГ-3, злоякісну катаральну лихоманку, ящур, паратуберкульозний ентед та ін. Через те, що ВД-БС може виявлятися в різних формах (від гострої до латентної), часто з такими інфекціями, як ПГ-3, аденоінфекція, хламідіози та ін., для остаточного діагнозу необхідні лабораторні дослідження. Лише в якості підозри на ВД-БС слід враховувати швидке поширення в стаді хвороби, що супроводжується лихоманкою, діареєю, ерозіями в ротовій порожнині та ранньою лейкопенією.

Лабораторна діагностика парагрипу -3 великої рогатої худоби

Парагрип-3 (ПГ-3) ВРХ (транспортна лихоманка ВРХ, параінфлюєнца-3) - гостра контагіозна вірусна хвороба, головним чином телят, що характеризується ураженням органів дихання.

В даний час ПГ-3 зареєстровано у всіх країнах світу з розвиненим тваринництвом.

Лабораторна діагностикавключає: а) виявлення АГ у патологічному матеріалі (мазках, відбитках, зрізах), отриманому від хворих тварин у РІФ; б) виділення збудника з патологічного матеріалу в культурі клітин нирки ембріона корови (ПЕК) або легких ембріона корови (ЛЕК) та його ідентифікацію в РТГА, РІФ та ін; в) виявлення АТ у сироватці крові хворих та перехворілих тварин (ретроспективна діагностика) у РТГА. Лабораторну діагностику ПГ-3 проводять із використанням набору діагностикумів, що випускається біологічною промисловістю. Її зазвичай ведуть паралельно з дослідженням матеріалу на аденовірусну та РС-інфекцію, ІРТ та ВД-БС ВРХ. Схема проведення досліджень на ПГ 3 аналогічна схемі діагностики аденовірусної інфекції ВРХ. Попередній діагно: на ПГ-3 ставлять протягом 2-3 днів на підставі позитивних результатів виявлення АГ у патологічному матеріалі в РІФ з урахуванням епізоотологічних та клінічних даних, а також патологоанатомічних змін, а остаточний - протягом 10-30 днів на підставі збігу результатів РІФ з виділенням та ідентифікацією вірусу. В даний час для швидкої індикації вірусу ПГ-3 може бути використана ПЛР; г) виявлення 4-кратного та більше приросту АТ у парних пробах сироваток.

Виділення вірусу. Зважаючи на малу стійкість парагрипозного вірусу випробуваний матеріал рекомендується поміщати в контейнери зі звичайним льодом, негайно доставляти в лабораторію і відразу використовувати для зараження культури клітин. Якщо зробити це неможливо, потрібно заморозити матеріал у суміші сухого льоду та спирту та зберігати при - 20-60°С до дослідження.

ВПГ-3 виділяють у первинних субкультурах клітин ПЕК, ЛЕК, ПТ, ТБ та ін, які готують за загальноприйнятою методикою. Для парагрипозних вірусів характерним є дифузний характер РГАд, яка проявляється раніше, ніж ЦПД вірусу.

Перші ЦПІ зараженої культури можна спостерігати іноді через 48 годин після інокуляції. Вони складаються в появі клітин, що округляються, сильніше заломлюють світло, надалі утворюється синцитій і дегенерація клітин. При негативному результаті першому пасажі проводять другий пасаж у тому виді культури клітин. Паралельно з пробірковими культурами її вирощують і на покривному склі для ІФ. Усього рекомендується не менше 4-х "сліпих" пасажів. Ізолят вважають виділеним, якщо він викликає стабільне однотипне ЦПД та позитивну ДАД. У цьому випадку можлива його ідентифікація у РТГАд, РН, РТГА та інших реакціях. Метод виділення вірусу на ембріонах менш чутливий, ніж зараження культур клітин та застосовується порівняно рідко.

Зараження природно-сприйнятливих тварин.Застосовують рідко внаслідок; дорожнечі та великі труднощі у підборі телят, сприйнятливих до ПГ-3, що не мають специфічних АТ. Заражати сприйнятливих тварин вірусом ПГ-3 краще нанесенням на слизову оболонку носової порожнини та трахеї. Від експериментально заражених телят вірус вдається виділити з ексудату носової порожнини під час підйому температури або з крові на 4-6-й день після інтраназального і на 2-й день після внутрішньовенного зараження. З носовим закінченням вірус зазвичай виділяється з 2-го до 10-го дня.

Індикація та вірусу. У клітинах НеLа та КВ вірус розмножується менш активно, ніж у клітинах нирки теляти. У культурі цих клітин, а також клітини нирки мавпи, крім синцитію, вірус викликає утворення цитоплазматичних, а іноді внутрішньоядерних включень. Їх знаходять і в епітеліальних клітинах бронхів та бронхіол.

Для прискореної індикації вірусів ІРТ, ПГ-3 стафілококи обробляють імунною сироваткою. Готують мазок, на який наносять досліджуваний матеріал, що містить вірус, обробляють його імунною противірусною сироваткою і вірусспецифічним імуноглобуліном, міченим ФИТЦем. По специфічному світінню поверхні стафілокока здійснюють індикацію вірусу. З використанням прискореного методу індикації час індикації скорочується до 3-4 год.

Серологічна ідентифікація

РІФ.В основному артеріальна гіпертензія локалізується в цитоплазмі клітин, проте в ранні терміни інфікування одночасно спостерігається свічення ядерців. Парагрипозний АГ виявляють у перші дні хвороби і до 10-14 днів. При ускладнених формах хвороби АГ виявляють триваліший час. У деяких випадках його вдається виявити навіть під час інкубаційного періоду за 1-2 дні до появи клінічних симптомів. Специфіка ІФ становить 94% у порівнянні з результатами серологічного дослідження. Існує однозначна думка про більшу чутливість ІФ порівняно з РДАд при індикації парагрипозних вірусів, що робить її перспективною для швидкої діагностики.

РТГАд.Є швидким методом ідентифікації виділеного вірусу. Для цього використовують імунні сироватки кроликів чи морських свинок. РТГАд ставлять загальноприйнятим способом з еритроцитами морської свинки. Досліджуваний вірус вважають ідентифікованим, якщо імунна сироватка ПГ-3 блокує гемадсорбцію.

РНГАд.Використовують 100 ГАд одиниць вірусу. За реакцією гемадсорбції вірус ПГ-3 можна титрувати в культурі тканини, використовуючи для зараження культури послідовні 10-кратні розведення. Після 3 днів інкубації ставлять РГАд із вмістом усіх пробірок і реєструють наявність гемадсорбції. За одну ГАд одиницю приймають кінцеве розведення вірусу, що спричинив гемадсорбцію. Позитивна РГАд у контрольних пробірках, відсутність реакції у пробірках із сумішшю вірусу та сироватки свідчить про ідентичність виділеного вірусу даного типу сироватки.

РТГА.Застосовується для типування виділеного вірусу за наявності в рідкій фракції заражених культур клітин гемаглютиніну в титрі, достатньому для вибору 4 ГАЄ. Слід мати на увазі, що вірус парагрипу, вирощений у культурі клітин нирки ВРХ, аглютинує еритроцити гусей, індиків та морських свинок, на відміну від еритроцитів курей та качок. Аглютинація розвивається в наступні терміни: еритроцити гусей за - 1-3 хв, індика - за 2-5, морської свинки - за 60-90 хв. Найбільш високі та стабільні титри виявляються з еритроцитами індика та при значеннях рН: еритроцити гусей при 5,7; індика 5,7-7,2; морської свинки 6,8-7,2. Імунні сироватки, які використовуються в РТГА, повинні бути звільнені від термолабільних та термостабільних інгібіторів, для цього сироватки прогрівають при 56°С 30 хв і обробляють каоліном або фільтратом вібріона холерного. РТГА ставлять загальноприйнятим способом.

Імуноферментна ідентифікація.Співробітниками ВНІТІБП розроблено методику ідентифікації вірусу ПГ-3 в ЕLISА.

Імунодифузія (ІД) може бути успішно використана для діагностики ПГ-3 інфекції. В ВД виявлено 2 лінії преципітації, що відповідає 2-му АГ ПГ-3.

Серодіагностика та ретроспективна діагностика.При серологічній діагностиці ПГ-3 ВРХ досліджують парні сироватки телят чи дорослих тварин виявлення приросту АТ. Інтервал між взяттям проб 2-3 тижні. РДА, РН, РЗГАд та РСК дають загалом ідентичні результати при дослідженні АТ у період розвитку хвороби та реконвалесценції. Однак РТГА найчутливіша і найпростіша. Крім дослідження парних сироваток крові, при серодіагностиці ПГ-3 рекомендується метод виявлення секреторних АТ у РТГА. Для цього беруть парні проби носових секретів від 8-10 тварин, що виявили клінічні ознаки хвороби (підвищення температури, витікання з носової порожнини та ін), і повторюють дослідження через 6-8 днів.

Перед постановкою РТГА проби розморожують, центрифугують 10 хв при 2 000 хв- 1 потім обробляють наступним чином: до 0,2 мл надосадової рідини додають 0,2 мл 20%-ної суспензії еритроцитів морської свинки, струшують, витримують 30 хв З 10 хв центрифугують при 1500 хв- 1 ; надосадову рідину в об'ємі 0,3 мл змішують з 25%-ною суспензією каоліну на фізіологічному розчині, струшують 25 хв, центрифугують 15 хв при 2000 хв- 1 . Після цього надосадову рідину використовують у РТГА.

Позитивний результат дослідження на ПГ-3 вважають у разі виявлення АТ у 2-й пробі носових секретів у титрі 1:16 і вище (за відсутності титрів АТ у 1-й пробі) або встановлення 4-кратного та більше збільшення титру АТ у 2- й пробі носових секретів порівняно з 1-ою.

При позитивній РНГАд у контролю вірусу (пробірки з культурою клітин, куди було внесено вірус у робочому розведенні з рівним обсягом живильного середовища), враховують її відсутність у пробірках, куди була залита суміш того чи іншого розведення сироватки та вірусу. Діагностичним є не менш ніж 4-кратний приріст нейтралізуючих гемадсорбцію АТ у реконвалесцентній сироватці порівняно із сироваткою, взятою на початку хвороби. РСК не знайшла широкого застосування у ветеринарній діагностичній практиці.

Максимального терміну виявлення АТ у сироватках крові телят після інфікування вірусом ПГ-3 точно не встановлено. Ряд дослідників вважають, що АТ зберігаються протягом 4-6 місяців. Рівень освіти ВНА та анти-ГА досягав піку 1:320 та вище до 14-21 дня після зараження. ЕLISА широко використовується за кордоном для індикації та титрування АТ. Він у 4 – 64 рази чутливіший, ніж РТГА.

Диференційна діагностика.При постановці діагнозу на ПГ-3 необхідно виключити ІРТ, ВД-БС, адено- та РС-інфекції, що мають дуже подібні епізоотологічні, клінічні та патологоанатомічні дані. Тому матеріал, що надійшов з підозрою на ПГ-3, в лабораторії досліджують паралельно на вищевказані інфекції.

Лабораторна діагностика лейкозу

Лейкоз ВРХ - хронічна інфекційна хвороба пухлинної природи, основна ознака якої - злоякісне розростання клітин кровотворних органів з порушенням їхнього дозрівання, внаслідок чого відбувається дифузна інфільтрація органів цими клітинами або з'являються пухлини.

Лейкози тварин діагностують майже у всіх країнах світу. Найбільш широко вони поширені у США, низці країн центральної Європи, Данії, Швеції та країнах Близького Сходу.

У нашій країні виникнення лейкозу пов'язані з завезенням племінної худоби 1940, 1945 – 1947 гг. з Німеччини до господарств Західного Сибіру, ​​Московської, Ленінградської, Калінінградської областей, а також України, Латвії та Литви. Надалі лейкоз поширився на Таджикистан, Псковську, Новгородську області.

У природних умовах ВЛКРС поширений серед ВРХ, овець, зебу та буйволів.

Вірус лейкозу ВРХ (ВЛКРС) відноситься до сімейства Retroviridae, роду ретровірусів лейкозу ВРХ та Т-клітинного лейкозу людини. ВЛКРС має виражену антигенну активність і індукує синтез ВНА і КСА. ГА якості. ВЛКРС аглютинує тільки еритроцити мишей

Діагноз на лейкоз ставлять на підставі епізоотологічних даних, клінічних ознак, патологоанатомічних змін та результатів лабораторних досліджень, які включають гематологічні та гістологічні та серологічні дослідження.

Основні характеристики деяких ретровірусів

Усі форми лейкозу характеризуються збільшенням різною мірою лімфовузлів. При лімфолейкозі вони збільшені рівномірно, не зрощені з навколишніми тканинами, капсула знімається легко, на розрізі вузли сіро-білого кольору, соковиті та салоподібні. Лімфовузли при лімфогранулематозі, лімфосаркомі та гістіоцитарній саркомі бугристі, капсула зрощена з паренхімою, на розрізі часто виявляють крововиливи та некрози; в органах черевної, тазової порожнин, на серозних оболонках відзначають пухлинні розростання вузлів у вигляді конгломератів сіро-білого, жовто-сірого кольору. Селезінка при лімфоїдному та мієлоїдному лейкозах збільшена. За перших 2-х форм вона буро-червоного кольору з чітко вираженою червоною і білою пульпою за рахунок гіперплазії фолікулів. У пізнішій стадії хвороби межа між білою та червоною пульпою стерта. При мієлоїдному лейкозі селезінка червоно-малинового кольору фолікули погано помітні, а в окремих ділянках відсутні тканина пухкої консистенції з крововиливами. При лімфоретикулосаркомі селезінка не збільшена. При всіх формах лейкозу відзначають осередкові або дифузні розростання сіро-білого або сіро-рожевого кольору в печінці, нирках, товщі серцевого м'яза, органах травлення, матці, скелетних м'язах, діафрагмі та інших органах.

Взяття та підготовка матеріалу. Для гематологічного дослідження кров беруть з часової вени в пробірки з антикоагулянтом - 10% розчином динатрієвої солі етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА, трилон Б) з розрахунку 0,02 мл розчину на 1 мл крові. Не дозволяється брати кров від тварин за 15 днів до отелення та 15 днів після нього. Для серологічного дослідження кров беруть від тварин віком 6 місяців і старше. У лабораторію термосі з льодом направляють 5-6 мл сироватки. Для гістологічного дослідження шматочки уражених органів (селезінки, лімфовузлів, грудної кістки, печінки, нирок, легенів, серця та правого вушка серцевого м'яза, стінки сичуга, матки та скелетних м'язів) посилають у свіжому вигляді в термосі з льодом або в 10%-ному р. -Ре формаліну.

ЕКСПРЕС-ДІАГНОСТИКА ШАЛУ

Методи виявлення антигенів. При сказі для експрес-діагностики можна використовувати методи флуоресціюючих антитіл (МФА), реакції преципітації (РП) в агаровому гелі, методи імуноферментного аналізу (ІФА), полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Для прижиттєвої діагностики сказу в людини потрібно кілька тестів.

Визначення антитіл до антигенів вірусу сказу. Виявлення антитіл у сироватці крові або в цереброспінальній рідині – важливий метод діагностики. Серологічне дослідження рабієс-специфічних антитіл проводиться в сироватці крові для визначення перед- та постекспозиційної вакцинації та визначення часу бустерної імунізації з метою підвищення імунної відповіді.

Виділення вірусу. Для виділення та ідентифікації вірусу використовують метод біопроби на білих мишах. Досліджуваний матеріал суспендують у фізіологічному розчині, що містить антибіотики та ембріональну сироватку великої рогатої худоби. Суспензія вводиться інтрацеребрально білим мишам масою 5-6 г. Для доказу розвитку інфекції за мишами щодня спостерігають до 30-го дня після інокуляції. Миші, у яких цей період розвивається захворювання, негайно піддаються евтаназії, і тканини мозку досліджуються методом прямої МФА.

Перевага даного підходу полягає у можливості визначити малі кількості вірусу сказу у матеріалі. Недолік методу – необхідність багатоденного (7–18 діб) очікування між інокуляцією та проявом перших ознак захворювання. Для скорочення інкубаційного періоду застосовують мишей-сусунків. Для експрес-діагностики можна використовувати мишей у віці менше 3 днів: у мишей, забитих через 3 дні, виявляється антиген вірусу в мозку, який можна виявити методом МФА.

Такий метод виділення вірусу практикується в якості підтверджуючого діагностичного тесту при негативних результатах виявлення антигену і тілець Бабеша - Негрі і в разі укусу людини підозрілим на сказ тваринам. Він забезпечує належну чутливість та специфічність, тобто розцінюється на рівні діагностичної значущості методу прямої імунофлуоресценції. Крім того, цей метод є основним для ідентифікації варіантів вірусу і є перспективним для розробки діагностичних реагентів.

Виділення та ідентифікація вірусу на культурі клітин. Основним недоліком виділення вірусу під час інфікування лабораторних тварин є тривалість методу. Уникнути цього можна під час використання культур клітин. Зазвичай цих цілей використовують культуру клітин нейробластомы мишей, якщо потрібно досліджувати тканини мозку. Мозок суспендують в культуральному поживному середовищі, наносять суспензію на моношар культури клітин і інкубують від одного до декількох днів.

Чутливість даної культури до вірусу можна підвищити обробкою її ДЕАЕ декстраном. Моношар клітин потім відмивають, фіксують на холоді ацетоном або сумішшю формаліну з метанолом і досліджують методом імунофлюоресценції. Якщо тварина була інфікована вірусом сказу, то монослое культури клітин виявляються цитоплазматичні включення антигену вірусу сказу.

Показано, що на клітинах мишачої нейробластоми лінії Na C1 300 у поєднанні з МФА антиген вірусу сказу можна виявити через 2 дні. Чутливість методу можна порівняти з методом ізоляції вірусу на мишах.

Хоча вірус сказу має облігатну нейропатогенність in vivo, він здатний інфікувати широке коло клітин-господарів in vitro, що можна використовувати для дослідження інших тканин та органів на наявність вірусу сказу. Встановлено, що вірус сказу розмножується у клітинах ВНК-21 і Vero, у первинних клітинах курячих ембріонів чи нирок хом'яка. Показано, що адсорбція вірусу та впровадження його у клітину відбуваються протягом 7 годин. Через 24–48 годин усередині клітини утворюються нові вірусні частки, через 72 години відбувається брунькування їх із клітинної оболонки в міжклітинний простір.

Методи дослідження

Для експрес-діагностики сказуможуть бути використані:

а) метод БФА- для виявлення антигену вірусу сказу у відбитках рогівки або заднього відділу шиї хворого, що містить цибулини волосся;
б) метод ПЛР- для виявлення РНК вірусу в біоптатах тканин, слині, спинномозкової або слізної рідини;
в) метод ІФА- для виявлення специфічних антитіл (антигену) у хворих з типовим або атиповим перебігом.
г) метод біопроби- для виділення вірусу на ранніх етапах захворювання або виявлення антитіл у крові або спинномозкової рідини на пізніх стадіях захворювання. Для експрес-діагностики використовується комплексний метод (біопробу + МФА), що полягає в зараженні досліджуваним матеріалом 2-денних новонароджених мишей та дослідження їх мозку на 3-4 добу в МФА.

Вибір методів прижиттєвої діагностики значною мірою залежить від стадії хвороби: метод, заснований на виявленні антигенів, як правило, має високу чутливість наприкінці інкубаційного періоду, протягом перших кількох днів захворювання, тоді як віруснейтралізуючі антитіла зазвичай з'являються у спинномозковій рідині та сироватці. крові після 7-10 днів з початку хвороби.

Реакція імунофлюоресценції. Метод заснований на використанні антитіл, пов'язаних з барвником, наприклад, флюоресцеїнізотіоціанатом. РІФ широко застосовується для виявлення вірусних антигенів у матеріалі хворих та для швидкої діагностики.

Метод має найбільш високий ступінь чутливості, він покладено в основу експрес-діагностики і дозволяє виявляти вірусні антигени протягом декількох годин.

Основні переваги МФА: швидкість виконання, висока специфічність (100%). Витрачений час на діагностику захворювання за його допомогою – менше одного дня. Застосовуються прямий та непрямий варіанти МФА.

Пряма імунофлуоресценціязалишається найбільш відданим методом діагностики сказу. Предметне скло, що містить мазки-відбитки тканин мозку, або скла з моношаром культури тканин фіксують в ацетоні протягом 1-4 годин. Потім препарати висушують і обробляють поліклональними флуоресцирующими антинуклеокапсидними антитілами (імунофлуоресцентний реагент).

Цей реагент являє собою кон'югат, виготовлений із специфічних поліклональних антитіл IgG класу до нуклеокапсидного антигену вірусу та флуоресцеїну ізоціанату (ФІТЦ). Специфічні антитіла одержують шляхом гіперімунізації тварин (кролів, хом'яків або коней) сумішшю епітопів нуклеокапсиду вірусу.

В даний час для цих цілей все ширше використовують мишачі моноклональні антитіла до нуклеокапсиду вірусу сказу. Після 30-хвилинної інкубації при 37 С діагностичні препарати багаторазово відмивають фізіологічним розчином і дистильованою водою.

Антитіла, мічені ФІТЦ, фіксуються лише у місцях локалізації вірусних нуклеопротеїдних антигенів. Потім препарати висушують на повітрі та досліджують методом світлової мікроскопії, використовуючи як джерело світла ксенонову лампу та відповідний фільтр.

При непрямому варіантіантиген спочатку з'єднують з незабарвленою специфічною імунною сироваткою. Потім на утворені нефлуоресціюючі комплекси антиген-антитіло впливають міченою флуорохромом імунною сироваткою, що містить антитіла до білків специфічної сироватки. Непрямий варіант МФА поряд з виявленням антигену дозволяє кількісно визначати антитіла в сироватці, що досліджується, шляхом відповідного її розведення.

Мічені ФІТЦ утворення у клітинах різних тканин виявляються у вигляді жовто-зеленого флуоресцентного фарбування на темному тлі (у вигляді округлої або овальної форми внутрішньоцитоплазматичних включень).

Імуноферментний аналіз. Метод заснований на принципі сорбції білків на твердій фазі з подальшим утворенням комплексів антиген-антитіло, що виявляються субстрат-індикаторним розчином. Антиген, що додається в лунки, специфічно зв'язується з антитілами. На шар антигену наносять досліджувані сироватки у потрібних розведеннях. За наявності специфічних антитіл у них зв'язуються з антигеном. Для виявлення зв'язування на шар антитіл наносять імуноглобулін проти глобулінів сироватки людей, кон'югований з пероксидазою хрону. Кількість сорбуючого кон'югату пропорційно кількості людей, що зв'язалися з антигеном антитіл сироваток. Це можна визначити, використовуючи індикаторний розчин (ортофенілілендіамін + перекис водню), компоненти якого в результаті дії пероксидази кон'югату забарвлюють рідину коричнево-жовтий колір. При обстеженні неясних випадків застосування ІФА додатково до методів РП або РЗК дозволяє збільшити достовірність лабораторної діагностики сказу завдяки великій чутливості цього методу. Метод дозволяє виявляти інфекційні та дефектні частки.

Для визначення антирабічних антитіл у процесі вакцинації можна застосовувати непрямий метод ІФА, використовуючи як антиген очищений вірус, а для визначення антитіл класу IgG в людській сироватці - А-білок стафілококу, пов'язаний з пероксидазою хрону. Результати ІФА можна порівняти з отриманими в тестах вірусної нейтралізації на мишах. Метод дозволяє виявляти присутність IgМ на початку процесу імунізації.

Імуноферментні методи - дуже перспективні виявлення нуклеокапсидного антигену вірусу при посмертної діагностиці в тканинах мозку. Серед них, наприклад, швидкий імуноферментний метод діагностики сказу, заснований на приготуванні плашок сенсибілізованих антитілами IgG ізотипу до нуклеокапсиду першого серотипу, розведених у карбонатному буфері.

Матеріал для дослідження гомогенезують у буфері або культуральному середовищі, освітлюють центрифугуванням, вносять у лунки та інкубують у плашках. Фіксований специфічними антитілами нуклеокапсидний антиген ідентифікують додаванням пероксидазного кон'югату з антинуклеокапсидними протирабічними антитілами іншої видоспецифічності та хромогенного субстрату. Чутливість методу становить 0,8-1,0 нг/мл.

Цим методом можна виявляти антигени вірусів різних серотипів. Застосування кон'югатів нуклеокапсидспецифічних антитіл, мічених біотином, підвищує чутливість до 0,1–0,2 нг/мл.

Методом ІФА успішно виявляється антиген нуклеокапсиду, але матеріал, що навіть розклався, не повинен фіксуватися формаліном.

Метод полімеразної ланцюгової реакції. Для експрес-діагностики вірусу сказу та ідентифікації лісовірусів найбільш зручний метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Метод ПЛР - найнадійніший і найшвидший для виділення віріонної РНК з будь-яких проб, що містять вірус у низькій концентрації. З його допомогою можна створити багато копій РНК вірусу. Цей метод використовується для підтвердження результатів МФА та для визначення вірусу в слині, цибулинах волосся заднього відділу шиї та голови.

ПЛР заснована на принципі природної реплікації ДНК. Суть методу полягає у багаторазовому повторенні циклів синтезу (ампліфікації) вірусоспецифічної послідовності ДНК за допомогою термостабільної Taq ДНК-полімерази та двох специфічних затравок, так званих праймерів.

Кожен цикл складається з трьох стадій із різним температурним режимом. У кожному циклі подвоюється кількість копій ділянки, що синтезується. Знову синтезовані фрагменти ДНК служать як матриця для синтезу нових ниток у наступному циклі ампліфікації, що дозволяє за 25-35 циклів напрацювати достатню кількість копій обраної ділянки ДНК для її визначення, як правило, за допомогою електрофорезу в агарозному гелі.

Особливо висока чутливість ПЛР при використанні праймерів комплементарних N-гену, коли вдається виявляти РНК вірусу в пробах, що містять вірус в титрі 10 МЛД50. Методом ПЛР можна виявляти РНК вірусу навіть у патологічному матеріалі, що розклався.

В даний час розроблені та широко використовуються на практиці підтверджуючі (конфірматорні) тести, такі як ПЛР у зворотно-транскриптазному виконанні (ВІД-ПЛР). Метод ОТ-ПЛР – високочутливий та найбільш ефективний. РНК екстрагується з тканин інфікованого вірусом органу, транскрибується в кДНК, яка потім ампліфікується методом ПЛР. Для постановки ОТ-ПЛР необхідні праймери, отримані до консервативних областей геному вірусу сказу. Зазвичай використовуються гени, що кодують нуклеопротеїн або N-білок.

Метод ПЛР високоспецифічний і дуже чутливий. Є одним із найбільш точних тестів детекції рабічного антигену, що дозволяє діагностувати сказ навіть за наявності в матеріалі хоча б одного віріону. В основі тесту лежить комплементарне добудовування РНК-матриці, яке здійснюється in vitro за допомогою ферменту РНК-полімерази. В останні роки ПЛР знаходить дедалі ширше застосування для діагностики та моніторингу вірусних інфекцій. Однак методика проведення складна, дорога і поки що недостатньо уніфікована для рутинного застосування.

Цитологічні методи в даний час мають обмежене діагностичне значення, але при ряді інфекцій, як і раніше, повинні застосовуватися. Досліджуються матеріали аутопсії, біопсії, мазки, які після відповідної обробки фарбуються та аналізуються під мікроскопом. При сказі – це виявлення включень у цитоплазмі клітин (тільця Бабеша – Негрі).

Виділення вірусу. Виділення вірусу може бути необхідним для підтвердження результатів тестів визначення антигену і для більш детальної характеристики ізолятів. І хоча цей метод є одним із найстаріших і трудомістких методів діагностики, сьогодні виділення вірусу з подальшою ідентифікацією за допомогою одного із сучасних методів (ІФА з моноклональними антитілами або ПЛР) є найбільш достовірним методом діагностики, т.з. "золотий стандарт".

Результативність методів діагностики сказу може варіювати в залежності від ряду факторів (стадії хвороби, термінів забору матеріалу, якості отриманих проб, умов їх зберігання, досвідченості персоналу, якості реактивів та ін.). Якщо позитивний результат підтверджує сказ, то негативний який завжди свідчить про відсутність хвороби. Тому за сказу експерти ВООЗ рекомендують використовувати кілька тестів, особливо МФА у поєднанні з біопробою на новонароджених (2–3 денних) білих мишах.

Заходи особистої профілактики

Усі роботи з матеріалом, що, ймовірно, містить вірус сказу, так само як і з тваринами, підозрілими на сказ, повинні проводитися з дотриманням заходів особистої безпеки. Медичні працівники та ветеринарні лікарі повинні працювати у халатах, рукавичках, масках.

Після закінчення роботи бокси обробляють 3% розчином перекису водню.

Флакони, ампули та інструменти, а також матеріали, що містять вірус сказу, і весь посуд після роботи знезаражують автоклавуванням протягом 1 години при 1,5 атм (режим «вбивки»).

Кошти індивідуального захисту знезаражують кип'ятінням або автоклавуванням. Робочу поверхню столу та руки знезаражують дезрозчином (0,5% розчин хлораміну).

Викликане вірусом сказу. При цьому як для самого вихованця, але його оточення (власника та інших членів сім'ї). Вірус викликає запалення головного мозку у людини та тварин. Особливо сприйнятливі до захворювання лисиці, вовки, кішки, велика і дрібна рогата худоба, собаки, вівці, кози, коні та ін. Домашні тварини та людина заражаються при укусі хворої на сказ твариниабо від попадання слини на пошкоджену ділянку шкіри, слизові оболонки чи очі. Слина може стати заразною за 10 діб до появи ознак сказу.
В даний час існують описи інших шляхів передачі: повітряно-краплинний спосіб (аліментарний - через їжу та воду) та трансплацентарний спосіб (через плаценту в період вагітності).
Вірус, поширюючись нервовими шляхами, досягає слинних залоз і нервових клітин кори головного мозку і, вражаючи їх, викликає важкі незворотні порушення.

Захворювання на сказ тваринреєструють на всій земній кулі (винятком є ​​лише Японія, Австралія та Великобританія).

На жаль, Росія не входить до списку винятків. Москва та Московська область також є сприятливим середовищем для виникнення захворювань на сказ у домашніх та диких тварин.
Вірус нестійкий у зовнішньому середовищі – гине при нагріванні до 56 градусів за 15 хвилин, а при кип'ятінні за 2 хвилини. Вірус сказу також чутливий до ультрафіолетового та прямого сонячного проміння. Однак, вірус сказу стійкий до низьких температур та антибіотиків.

Інкубаційний період під час зараження на сказ може тривати від кількох діб до кількох місяців (в середньому 3-6 тижнів). Сказ у людини може протікати навіть до року. Прояву клінічної картини передує прихований (інкубаційний) період. Тварина тим часом також небезпечна.

Симптоми та ознаки сказу у тварин

Ознаки захворювання на сказможуть з'явитися у тварин через кілька тижнів після укусу скаженої тварини або контакту з вірусом. Звертайте увагу на поведінку вихованця. Будь-яка неадекватна та неприродна поведінка тварини повинна вас насторожити і бути більш спостережливими. У деяких випадках може збільшитися температура.
Як відомо, дикі тварини бояться людини. У разі захворювання дикі звірі можуть наближатися до будинку і навіть нападати на худобу та людей. Тому, якщо ваш вихованець почав поводитися агресивно або надмірно ласкаво, то це серйозний дзвіночок, щоб не ризикувати і викликати ветеринарного фахівця для обстеження та діагностики на ймовірність захворювання на сказ.

Часто неспецифічна симптоматика і ненадійна прижиттєва діагностика повинні унеможливлювати варіанти «на авось», т.к. мова йде про летальні наслідки не тільки для вихованця, але і з великою ймовірністю для власника.

Діагностика сказу у тварин

Діагноз ставиться на основі комплексних даних та лабораторних аналізів. 100% надійного способу прижиттєвої діагностики сказу у тварин, що застосовуються у ветеринарній практиці, на сьогоднішній день не існує.
Прижиттєво вірусний антиген може бути виявлений за допомогою МФА у відбитках рогівки хворих на сказ тварин. А також вірус може бути виділений з деяких тканин і рідин організму. Але все ж таки негативний результат даного методу не виключає все ж таки можливість зараження сказом.
При посмертної діагностики сказу тварин результати точніше, т.к. використовуються інші методи. Наприклад, одним із точних патологоанатомічних діагнозів при дослідженні головного мозку є виявлення специфічних включень (телець Бабеша-Негрі). Також найважливішим методом залишається біопроб - інтрацеребральне зараження.
Перешкодою для діагностування сказу у тварин є наявність різних форм перебігу захворювання. Ветеринарні лікарі умовно поділили прояв сказу на три форми (деякі форми мають різні стадії).

Форми розвитку та перебігу сказу у тварин (клінічна картина):

Буйна форма сказу:
1 Стадія. Тварина уникає людей, ховається у темному та затишному місці. Може проявлятися атипова поведінка – підвищена лагідність чи пасивна агресія. При цьому можливий прояв сверблячки на місці укусу. Тварина може розлизувати чи викушувати місце проникнення вірусу (завданої травми). Апетит знижується. З'являються блювання, слинотеча та галюцинації. Важко акт ковтання.
2 Стадія. З'являється яскраво виражена агресія. Наростає занепокоєння, з'являється схильність до поїдання неїстівних предметів. Неусвідомлене прагнення руху. Тварина може кусати своє тіло (самотравматизм), є навколишні предмети, амуніцію, землю. Напад інших тварин і навіть господаря. Вихованець не може ковтати воду. Через це рясне та неконтрольоване слиновиділення. Прийом їжі неможливий. Прояв судомних нападів. Настає часткова паралізація м'язів особи та груп кінцівок. Внаслідок чого розвивається косоокість, нижня щелепа відвисає, мова випадає з пащі.
3 Стадія (Термінальна - паралітична). Депресивний стан. Сильне виснаження організму, розвиток паралічу. Вихованець майже постійно лежить і впадає в коматозний стан і кому. Смерть настає внаслідок зупинки дихання і натомість паралічу дихальної мускулатури.

Тиха форма сказу:
Тиха форма характеризується розвитком паралічу, слинотечею, нездатністю приймати їжу. Через 2 - 4 дні вихованець гине. Фаза збудження (шаленства) короткочасна або відсутня.

Атипова форма сказу:
Атипова форма (складна діагностується). Можлива поява діареї чи атонії кишечника. Можливе короткочасне покращення стану з наступними прогресуючими неврологічними симптомами. В результаті вихованець гине. Ця стадія перебігу сказу може тривати до 3-х місяців і більше.

У великої рогатої худобипревалює тиха форма. Порушення у разі виражено слабко, відзначають хрипке мукання, слинотеча, хитка хода, швидко розвиваються паралічі кінцівок. Нерідко атипова течія – відмова від корму, атонія передшлунків, часті позиви на дефекацію, напади судом, потім розвиваються паралічі. При буйній формі в момент нападу тварини рвуться з прив'язі, ревуть, риють землю, кидаються на стіни, нападають на інших тварин свого вигляду, особливо агресивні щодо собак.
У овець та кізхвороба протікає майже так само, як у великої рогатої худоби, але паралічі розвиваються швидше (на другу добу).
У коней та свинейпереважає буйна форма.

Профілактика сказу у тварин

Найдієвішим та найефективнішим способом профілактики сказу тваринє вакцинація. За законом РФ щорічна вакцинація обов'язкова всім домашніх і сільськогосподарських тварин. Сьогодні є великий вибір вакцин від сказу у тварин як імпортних, так і вітчизняних виробників. Сучасні вакцини забезпечують формування імунітету протягом трьох років. Щорічна вакцинація від сказу тварин не становить небезпеки для здорового вихованця.

304.00 ₽

Розповсюджуємо нормативну документацію з 1999 року. Пробиваємо чеки, сплачуємо податки, приймаємо до оплати всі законні форми платежів без додаткових процентів. Наші клієнти захищені Законом. ТОВ "ЦНТІ Нормоконтроль".

Наші ціни є нижчими, ніж в інших місцях, тому що ми працюємо безпосередньо з постачальниками документів.

способи доставки

• Термінова кур'єрська доставка (1-3 дні)
• Кур'єрська доставка (7 днів)
• Самовивіз із московського офісу
• Пошта РФ

Поширюється на всі види ссавців і встановлює наступні методи лабораторної діагностики сказу: - метод флуоресціюючих антитіл (МФА); - метод виділення вірусу сказу у культурі клітин мишачої нейробластоми CCL-131 (або невриноми Гассерова вузла щура – ​​НГУК-1); - біопроба на білих мишах; - метод імуноферментного аналізу (ІФА); - Реакція дифузійної преципітації (РДП).

3 Терміни, визначення та скорочення

4 Умови виконання досліджень та вимоги безпеки

5 Засоби вимірювань, обладнання, матеріали, реактиви та тварини

6 Відбір проб

7 Метод флуоресціюючих антитіл (МФА)

8 Метод виділення вірусу сказу в культурі клітин мишачої нейроблатоми CCL-131 (або невриноми Гассерова вузла щура - НГУК-1)

9 Біопроба на білих мишах

10 Метод імуноферментного аналізу (ІФА)

11 Реакція дифузійної преципітації (РДП)

Цей ГОСТ знаходиться в:

Організації:

Animals. Methods of laboratory diagnostic of rabies

нормативні посилання

• ГОСТ 12.0.004-90 Система стандартів безпеки праці. Організація навчання безпеки праці. Загальні положення . Замінено на ГОСТ 12.0.004-2015.
• ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартів безпеки праці. Загальні санітарно-гігієнічні вимоги до повітря робочої зони
• ГОСТ 12.1.008-76 Система стандартів безпеки праці. Біологічна безпека. Загальні вимоги
• ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартів безпеки праці. Засоби захисту працюючих. Загальні вимоги та класифікація
• ГОСТ 17.0.0.01-76 Система стандартів у галузі охорони природи та покращення використання природних ресурсів. Основні положення
• ГОСТ 6709-72 Вода дистильована. Технічні умови
• ГОСТ 12026-76 Папір фільтрувальний лабораторний. Технічні умови
• ГОСТ 13739-78 Олія імерсійна для мікроскопії. Технічні вимоги. Методи випробувань
• ГОСТ 16317-87 Холодильні прилади електричні побутові. Загальні технічні умови
• ГОСТ 177-88 Водню перекис. Технічні умови
• ГОСТ 21241-89 Медичні пінцети. Загальні технічні вимоги та методи випробувань
• ГОСТ 22967-90 Шприци медичні ін'єкційні багаторазового застосування. Загальні технічні вимоги та методи випробувань
• ГОСТ 24861-91 Шприци ін'єкційні одноразового застосування.
• ГОСТ 25046-81 Голки ін'єкційні одноразового застосування. Основні розміри. Технічні вимоги. Методи випробувань
• ГОСТ 25336-82 Посуд та обладнання лабораторні скляні. Типи, основні параметри та розміри
• ГОСТ 2603-79 Реактиви. Ацетон. Технічні умови
• ГОСТ 2768-84 Ацетон технічний. Технічні умови
• ГОСТ 29230-91 Посуд лабораторний скляний. Піпетки градуйовані. Частина 4. Піпетки видувні
• ГОСТ 4204-77 Реактиви. Кислота сірчана. Технічні умови
• ГОСТ 8074-82 Мікроскопи інструментальні. Типи, основні параметри та розміри. Технічні вимоги
• ГОСТ 9147-80 Посуд та обладнання лабораторні фарфорові. Технічні умови
• ГОСТ 9284-75 Скло предметне для мікропрепаратів. Технічні умови
• ГОСТ ІСО/МЕК 17025-2009 Загальні вимоги до компетентності випробувальних та калібрувальних лабораторій
• ГОСТ ISO 7218-2011 Мікробіологія харчових продуктів та кормів для тварин. Загальні вимоги та рекомендації щодо мікробіологічних досліджень. Замінено на ГОСТ ISO 7218-2015.

стор 1

стор 2

стор 3

стор 4

стор 5

стор 6

стор 7

стор 8

стор 9

стор. 10

стор. 11

стор. 12

ТЕРТР 81-07-14-2001

ТЕРТР-2001

ЯМАЛО-НЕНЕЦЬКИЙ АВТОНОМНИЙ ОКРУГ

Частина 14

КАНАЛІЗАЦІЙНІ КОЛЕКТОРИ

ВИДАННЯ ОФІЦІЙНЕ

Салехард 2011

ТЕРИТОРІАЛЬНІ ЄДИНІ РОЗЦЕНКИ НА РОБОТИ З ТЕХНІЧНОГО ОБСЛУГОВУВАННЯ ТА РЕМОНТУ УСТАТКУВАННЯ МІСЬКОГО ГОСПОДАРСТВА

ТЕРтр 81-07-14-2001 ЯМАЛО-НЕНЕЦЬКИЙ АВТОНОМНИЙ ОКРУГ Частина 14

КАНАЛІЗАЦІЙНІ КОЛЕКТОРИ

Видання офіційне

Салехард 2011

ББК 65.31 УДК 338.5:69 (083)

Територіальні кошторисні нормативи.

Територіальні одиничні розцінки на роботи з технічного обслуговування та ремонту обладнання міського господарства. Ямало-Ненецький автономний округ.

ТЕРТР 81-07-14-2001 Частина 14. Каналізаційні колектори

Салехард, 2011 - 9 стор.

Територіальні одиничні розцінки на роботи з технічного обслуговування та ремонту обладнання міського господарства (далі - ТЕРтр) призначені для визначення витрат при виконанні на роботи з технічного обслуговування та ремонту обладнання міського господарства та складання на їх основі кошторисних розрахунків (кошторисів) на виконання зазначених робіт.

РОЗРОБЛЕНІ Сибірським центром ціноутворення у будівництві, промисловості та

енергетиці (ЗАТ)

ЗАТВЕРДЖЕНО І ВВЕДЕНО В ДІЮ Постановою Уряду Ямало-Ненецького автономного округу від 13.10.2011 № 755-п.

ПРО ЯНАО 2011р.

Ці територіальні кошторисні нормативи не можуть бути повністю або частково відтворені, тиражовані та поширені як офіційне видання без дозволу Департаменту будівництва та житлової політики Ямало-Ненецького автономного округу.

ТЕРИТОРІАЛЬНІ ЄДИНИЧНІ РОЗЦЕНКИ НА РОБОТИ З ТЕХНІЧНОГО ОБСЛУГОВУВАННЯ І РЕМОНТУ УСТАТКУВАННЯ МІСЬКОГО ГОСПОДАРСТВА ЯМАЛО-НЕНЕЦЬКИЙ АВТОНОМНИЙ ОКРУГ

ТЕРТР-14-2001

Частина 14. Каналізаційні колектори

РОЗДІЛ 1. СНІГОСПЛАВНІ СПОРУДИ

КОШТОВНІ РОЗЦЕНКИ НА ЕКСПЛУАТАЦІЮ БУДІВЕЛЬНИХ МАШИН, КОШТОВНІ ЦІНИ НА МАТЕРІАЛИ, ВИРОБИ, КОНСТРУКЦІЇ ТА ГОДИННИКА ОПЛАТА ПРАЦІ РОБОЧИХ-БУДІВЕЛЬНИКІВ

ДО БЛ ЗИСНИХЦІНАХ З СТАНУ НА 01.01.2000 р.

Додаток 2.

Кошторисні розцінки на експлуатацію будівельних машин

ТЕРТР-2001. Ямало-Ненецький автономний округ. Частина 14. Каналізаційні колектори

ЧАСТИНА 14. КАНАЛІЗАЦІЙНІ КОЛЕКТОРИ............................................. ......................3

РОЗДІЛ 1. СНІГОСПЛАВНІ СПОРУДИ.............................................. .................................................. .........3

Таблиця ТЕРтр 14-01-001 Очищення від сміття камер відстоювання снігосплавних пунктів. ....................3

Таблиця ТЕРтр 14-01-002 Очищення від сміття снігосплавних пунктів із майданчиком відстоювання................................... ..........3

Таблиця ТЕРтр 14-01-003 Консервація на літній період споруд снігосплавних камер і пісколок................4

Кошторисні розцінки на експлуатацію будівельних машин, кошторисні ціни на матеріали, вироби, конструкції та годинна

ОПЛАТА ПРАЦІ Р А КОЧИХ-З ТРІЙТЕ Л ЕЙ........................................ .......................................5

Додаток 1. РОЗМІР ГОДИННИКОЇ ОПЛАТИ ПРАЦІ РОБОЧИХ-БУДІВЕЛЬНИКІВ........................................ ...5

Додаток 2. Кошторисні розцінки на ЕКСПЛУАТАЦІЮ БУДІВЕЛЬНИХ МАШИН.....................6

Додаток 3. КОРИСТУВАЛЬНІ ЦІНИ НА МАТЕРІАЛЬНІ РЕСУРСИ .......................................... ........................8