2 типи визначення днк типування. Які типи ВПЛ існують: особливості, симптоми та діагностика. Які технології застосовуються

Сьогодні вивчено понад сто різновидів вірусу ВПЛ, половина з них викликає розвиток утворень на шкірних покривах та слизових оболонках інтимних органів людини. Статистика свідчить, що 80% населення Землі інфіковано. Це означає, що у клітинах організму міститься ВПЛ різного ступеня онкогенності.

Наявність папіломавірусу у пацієнта може призвести до розвитку серйозних ускладнень, складно передбачити, як поведеться той чи інший тип збудника.

Ось чому так важливо знати особливості кожного генотипу, щоб ефективно боротися з цією інфекцією.

Багато типів вірусу папіломи людини є абсолютно безпечними для їхнього носія, виникають незначні папіломи та бородавки, які успішно усуваються косметологічними методами.

Інші типи папілом відносяться до онкогенної групи, що провокують активну видозміну клітин, що веде до діагностування раку у носія. Поділ ВПЛ за типами дозволяє розробити максимально правильну тактику лікування, з урахуванням аналізів виявлення мікроорганізмів.

Людина може бути носієм кількох ДНК ВПЛ, віруси можуть стабілізуватися, припинити своє розмноження чи навпаки – процес розвитку онкогенних клітин прогресуватиме, а це означає, що зупинити їхній негативний вплив на організм буде складно.

Онкогенна група

Генотипування ВПЛ – важлива процедура у діагностиці виявлення захворювання, це додаткова можливість прогнозувати перебіг порушення. Загалом у практичній медицині підрозділ папіломавірусу відбувається за трьома групами.
Безпечні віруси, що не викликають розвитку раку, а значить, панікувати не варто, головне, надалі не стати носієм інших інфекцій, регулярно здавати аналізи на виявлення інфекції та не запускати стан імунної системи.
Низький ступінь ймовірності розвитку ракових клітин при виявленні папіломавірусу 6,11,42-44. У поодиноких випадках може статися мутації клітин, видозмінюючись в онкогенні.

Підвищена увага до стану свого здоров'я повинні приділяти пацієнтам з папіломавірусами 66 та 56, найчастіше таке носійство інфекції протікає безсимптомно, а тому виявити захворювання проблематично. Для кожного типу вірусу важливо простежити за ознаками ВПЛ, провести спеціальне обстеження та за необхідності розпочати кваліфіковане лікування.

Особливості кожного типу вірусу

Класифікація вірусів допомагає визначити рівень складності захворювання, яке може спровокувати така інфекція. Звичайні бородавки викликаються вірусом 2 типу, що передається побутовим шляхом, при контакті з носієм, найчастіше страждають діти та підлітки.

Захисні сили організму дозволяють впоратися з імунною системою з інфекцією, утворення зникають безслідно, головне не травмувати шкіру в місці розвитку папілом, щоб не викликати вторинне зараження.

При інфікуванні ВПЛ 3 та 5 з'являються невеликі нарости на обличчі та долонях. Такі висипання ще називають юнацькими, а отже організм може самостійно впоратися з цією інфекцією без медикаментозного втручання.

При виявленні підошовних бородавок можна впевнено говорити про наявність в організмі папіломавірусу 1 та 2 типів. Найчастіше страждають жінки через носіння вузького взуття на високих підборах. Шкіра на бородавці з часом товщає, нарости розмножуються по тілу.

Утворення ВПЛ типу 1 проростають всередину, доставляють дискомфорт при ходьбі, ниють і болять, особливо нічний час. Папіломавірус другого генотипу проявляється мозаїчними наростами, які не викликають больових відчуттів, лише естетичний дискомфорт.

Гострокінцеві кондиломи у жінок розташовуються на слизових оболонках статевих органах та геніталіях, а у чоловіків – на головці пеніса та крайньої плоті. Це небезпечні віруси 6 та 11 типу.

Якщо виявлено папіломавірус з малим онкогенним ризиком, це означає, що йдеться про приєднання інфекції 20, 21, 14, 25, 27 типу. Найчастіше це доброякісні освіти, які мають рецидивного характеру.

Під час родової діяльності матері дитина може заразитися ларингеальним папіломатозом, ВПЛ типу 11. Така форма захворювання спостерігається у дітей віком до п'яти років, при рясному виявленні утворень може виникнути ризик задухи.

Визначення небезпеки 16 та 18 типу ВПЛ

За допомогою аналізу гемотест можна зробити найбільш точний прогноз перебігу хвороби, отже виявити відразу кілька генотипів вірусу, поставити правильний діагноз та розпочати своєчасне лікування.

Якщо виявлено поєднання 16 та 18 типів, то це буде свідчити про наявність високого ступеня онкогенності – знадобиться кольпоскопічне обстеження.

Завдяки гемотесту ВПЛ можна виключити можливість рецидиву з летальним кінцем.

При діагностуванні жінок із раком шийки матки можна сказати, що причиною мутації є вірус 16 типу. Під вплив сприятливих факторів (ослаблення імунної системи, наявності інших інфекцій статевих органів) папіломавірус починає свій згубний вплив на клітини, змінюючи їх ДНК.

Це означає, що вірус генотипу 16 впливає на розвиток передракового стану, викликає дисплазію шийки матки, рясно формуються папіломи та кондиломи по всьому тілу пацієнтки. У чоловіків ці небезпечні штами вірусу здатні викликати хворобу Боуена, ушкодження слизової оболонки статевого органу.

Завдяки високороздільному аналізу на ДНК ВПЛ (27 типів) можна виявити небезпечні патологічні видозміни в організмі, спричинені наявністю різних типів вірусу папіломи.

При дисплазії шийки матки крім 16 та 18 вірусу ще зустрічаються 32, 30, 57, 61 та інші онкогенні типи. Якщо під час обстеження аналізи підтвердили наявність лише одного типу ВПЛ високого ризику, а наростів у своїй немає, це, що можна говорити про самовидалення інфекції з організму.

Інші типи нашкірних наростів

ВПЛ 49 штаму проявляється розростаннями одиночних плоских утворень, які можна легко видалити лазерним апаратом. Цей генотип не є онкогенним, не виникає.

Виявлення вірусу 57 штаму у жінки свідчить про передраковий стан пацієнтки, якщо є нарости на обличчі, то вони видаляються за допомогою імпульсного потоку, після чого не залишається слідів та рубцевої тканини.

Нарости ВПЛ типу 27 у чоловіків і жінок можна прибрати рідким азотом, поява вторинної інфекції виключена. Штами з номерами 51, 52, 56 є онкогенними, а це означає, що подальші зміни в структурі ДНК можуть спричинити рак.

У чоловіків розвиток онкології статевого органу та анального отвору. Тільки своєчасна медикаментозна терапія може уповільнити ці процеси і залишити згубний поділ клітин ДНК.

ВПЛ 37 типу є однією з причин розвитку кератоакантоми, що свідчить про виникнення доброякісної пухлини на шкірі, місця локалізації – обличчя, відкриті ділянки тіла, у виняткових випадках – закриті зони.

Аналізи на виявлення ВПЛ 38 типу можуть свідчити про розвиток меланоми, це злоякісні нарости, які відрізняються агресивністю та стрімким фактором розвитку, а це означає, що ігнорувати симптоматику не можна, оскільки захворювання може вплинути на всі органи та системи людини.

Аналіз на ВПЛ різновиду

Існує кілька лабораторних методик, які з точністю зможуть визначити, скільки штамів вірусу присутні в організмі чоловіка та жінки. Для цього застосовують такі види діагностики як полімерна ланцюгова реакція, аналіз генотипування. ПЛР проводиться для визначення типу вірусу, а результати цього дослідження мають вигляд таблиці зі списком видів ВПЛ, позначками виявлених із них та зазначенням вірусного навантаження.

Матеріал для аналізу у жінок – мазок із цервікального каналу. При вагітності аналіз на папіломі проводити необов'язково, тому що немає загрози для матері та плода. Чоловікам при підозрілих утвореннях слід звернутися до уролога. Тільки така особлива увага до здоров'я допоможе уникнути серйозних наслідків для жінок після інфікування організму.

Коли потрібно робити діагностику ВПЛ для жінок?

Не варто допускати яскраво виражених симптомів захворювання, важливо регулярно проходити профілактичний огляд у гінеколога один-два рази на рік, обов'язково здавати аналізи на виявлення інфекції після першого року статевого життя.

Висновок

Усі класифікації виявлення ВПЛ в організмі зазнають змін, адже віруси мутують, викликають ускладнення, не піддаються лікуванню, повторно виникають після видалення, ускладнюється процес діагностування та розшифрування аналізів.

Специфіка подібних новоутворень ще досі точно не вивчена, скільки часу потрібно, щоб знизити ризик небезпеки після зараження онкогенними штамами і повністю видалити вірус з організму невідомо.

Для пацієнтів з будь-яким типом ВПЛ потрібен індивідуальний терапевтичний підхід, щоб успішно призупинити поширення вірусу в організмі, потрібно регулярно обстежуватися у профільних фахівців, дотримуватися зазначених рекомендацій, вести здоровий спосіб життя.

Головна небезпека ВПЛ для жінок і чоловіків – це утворення злоякісної пухлини, тому така класифікація вірусу проводиться з урахуванням його онкологічної небезпеки.

Бережіть себе та будьте здорові!

Результати, отримані для дослідження структури та організації геномної ДНК тварин, рослин та мікроорганізмів, наклали глибокий відбиток на методологію їх систематизації. Проблема адекватного віднесення конкретного організму до тієї чи іншої групи не є суто академічною. Заснована на точних умовах систематика живих організмів, що визначає еволюційну спорідненість між ними, крім суто теоретичного, представляє і великий практичний інтерес. Зокрема, знання джерела різних штамів патогенних мікроорганізмів, що викликають лікарняні інфекції, дало б змогу виробити ефективні заходи захисту проти їх поширення.

Нещодавно були виявлені генетичні маркери у вигляді специфічних послідовностей ДНК, які дають можливість виявляти споріднені відносини між особами одного і того ж виду шляхом внутрішньо- та міжпопуляційних досліджень. Такі дослідження популяцій людини особливо важливі з практичної точки зору. Нині молекулярно-генетичні методи дозволяють здійснювати ідентифікацію особистості судово-медичних дослідженнях, і навіть вирішувати у спірних випадках проблему визначення батьківства.

Генетичним, або ДНК-типіруванням,називають визначення особливостей генотипу організму шляхом аналізу ДНК його геному. Іншими словами, у процесі ДНК-типування визначають особливості первинної структури ДНК досліджуваного організму у конкретних генетичних локусах. Абсолютно консервативних генетичних локусів, мабуть, немає. Мутаційні зміни геному постійно накопичуються протягом філогенетичного (історичного, еволюційного) розвитку виду. Але такого ж зміни неухильно відбуваються в геномах окремих особин, що належать одній або різним популяціям. Природно, що найпростіше виявляються міжвидові відмінностіу послідовностях нуклеотидів досліджуваних ділянок геному, оскільки ці відмінності, як правило, значні, і саме вони визначають еволюційну відстань між видами (їх диверґованість).

Таким чином, у кожного виду організмів є велика кількість внутрішньовидових відмінностей у первинній структурі ДНК окремих генетичних локусів. Генетичні локуси, що виконують ту саму функцію (що містять один і той же ген або кілька генів), але розрізняються за первинною структурою ДНК, називають поліморфними, А саме існування в популяції поліморфних локусів отримало назву генетичного поліморфізму.

ДНК-типування мікроорганізмів

Найчастіше нині використовують два способи ДНК-типування патогенних мікроорганізмів, основу яких лежить метод ПЛР. У першому випадку використовують один або кілька коротких праймерів довільної первинної структури довжиною в 6-15 нуклеотидів, які через свої малі розміри мають низьку специфічність щодо конкретних генетичних локусів і здатні гібридизуватися з багатьма сайтами геномної ДНК. У другому випадку застосовують специфічні олігонуклеотидні праймери довжиною 20-27 нуклеотидів, послідовності яких фланкують досліджувану послідовність нуклеотидів у бактеріальному геномі.

Мал. ІІ.35. Схема ДНК-типування мікроорганізмів з використанням ПЛР та праймерів довільної структури

а- Штаммоспецифічні відмінності, обумовлені різною локалізацією ділянок ДНК, що взаємодіють з праймерами. У ДНК штамів 2 і 3 відсутня ділянка, яка є в ДНК штаму 1, що призводить до зникнення відповідної смуги продукту ПЛР на електрофореграмі; б– результати ампліфікації ДНК, яка містить сайти зв'язування праймерів постійної локалізації. ДНК штамів 2 та 3 містять делеції різної довжини між сайтами зв'язування праймерів. Альтернативно, ДНК штамів 1 і 2 можуть містити вставки, відсутні у ДНК штаму 3. Це знаходить відображення в довжинах продуктів ПЛР, що розділяються електрофорезом. А, Б – сайти зв'язування праймерів на ДНК

Генетичне типування мікроорганізмів із застосуванням праймерів довільної первинної структури. Використання коротких олигонуклеотидных праймерів довільної структури полягає в тому, що у великих геномах їм є множинні сайти посадки, отже, і ініціації ПЛР. Чим коротші такі праймери, тим більше сайтів посадки для них має існувати. Одним із обмежень подальшої участі таких праймерів у ПЛР буде відстань між двома сайтами посадки для протилежно спрямованих праймерів. Чим довше ПЛР-продукт, який має утворюватися внаслідок функціонування таких праймерів, тим менш надійно працює вся система типування. На практиці довжина продуктів ПЛР, що утворюються з довільними праймерами, знаходиться в межах 0,2–2,0 т.п.о.

Залежно від локалізації на ДНК місць посадки для пари коротких праймерів можуть утворюватися два типи продуктів ПЛР. У першому випадку відмінності в довжинах продуктів ПЛР обумовлені присутністю на ДНК типованих мікроорганізмів різної кількості сайтів зв'язування для одного або обох праймерів (рис. II.35, а). У другому випадку такі відмінності визначаються довжинами сегментів ДНК ( ампліконів), укладених між парами місць посадки праймерів при незмінному їх числі у конкретних генетичних локусах (див. рис. II.35, б). Насправді можуть одночасно реалізовуватися обидві ці можливості. Під час генетичного типування еукаріотів зазначеними методами іноді відразу функціонують до 100 ампліконів, тоді як у бактерій це число досягає лише 20.

Незважаючи на те, що при обговорюваному підході послідовності праймерів вибираються довільно, картина ампліфікації, що отримується, як правило, є видо-і штаммоспецифічної. При цьому кількість сайтів зв'язування на одній і тій же ДНК для праймерів однакової довжини, але з первинною різною структурою може істотно варіювати. На рис. II.35 показані такі властивості двадцяти 10-нуклеотидних праймерів, випробуваних на ДНК людини, бобів та S. aureus. Видно, що використання праймера AGGGGTCTTG, наприклад, призводить до ампліфікації 8 ампліконів у ДНК людини, 3 ампліконів у ДНК соєвих бобів і не виявляє жодного амплікону в ДНК S. aureus, тоді як при використанні праймера AATCGGGCTG вдається виявляти до 40 ампліконів у ДНК і соєвих бобів і до 20 ампліконів у бактеріальній ДНК. Таким чином, при використанні обговорюваного методу ДНК-типування найважливішим етапом є підбір праймерів або їх комбінацій для найбільш ефективного визначення приналежності організму до того чи іншого виду, штаму або лінії.

Генетичне типування мікроорганізмів з використанням геномних фінгерпринтів. При іншому підході до генетичного типування з використанням ПЛР досліджують поліморфізм конкретних локусів, котрим хоча б частково відома первинна структура. Синтезують специфічні олігонуклеотидні праймери, сайти зв'язування яких фланкують досліджувану послідовність ДНК з довжиною 1,5-2,5 т.п. Після проведення ПЛР особливості первинної структури продуктів ПЛР визначають за допомогою рестрикційного аналізу. Положення сайтів рестрикції в послідовності нуклеотидів, що аналізується, може мати видо- або штаммоспецифічний характер і служити точним генетичним маркером того чи іншого мікроорганізму.

За допомогою цього методу, який за своєю суттю є різновидом розглянутого вище способу визначення ПДРФ, ідентифікують близькі споріднені, подібні за фенотипом штами збудників захворювань, досліджують генетичну структуру популяцій мікроорганізмів та механізми їх адаптивної мінливості.

Мал. ІІ.35. Схема ДНК-типування мікроорганізмів з використанням ПЛР та праймерів довільної структури

Генетичне типування мікроорганізмів із застосуванням праймерів довільної первинної структури.Використання коротких олигонуклеотидных праймерів довільної структури полягає в тому, що у великих геномах їм є множинні сайти посадки, отже, і ініціації ПЛР. Чим коротші такі праймери, тим більше сайтів посадки для них має існувати. Одним із обмежень подальшої участі таких праймерів у ПЛР буде відстань між двома сайтами посадки для протилежно спрямованих праймерів. Чим довше ПЛР-продукт, який має утворюватися внаслідок функціонування таких праймерів, тим менш надійно працює вся система типування. На практиці довжина продуктів ПЛР, що утворюються з довільними праймерами, знаходиться в межах 0,2–2,0 т.п.о.

Генетичне типування мікроорганізмів з використанням геномних фінгерпринтів.При іншому підході до генетичного типування з використанням ПЛР досліджують поліморфізм конкретних локусів, котрим хоча б частково відома первинна структура. Синтезують специфічні олігонуклеотидні праймери, сайти зв'язування яких фланкують досліджувану послідовність ДНК з довжиною 1,5-2,5 т.п. Після проведення ПЛР особливості первинної структури продуктів ПЛР визначають за допомогою рестрикційного аналізу. Положення сайтів рестрикції в послідовності нуклеотидів, що аналізується, може мати видо- або штаммоспецифічний характер і служити точним генетичним маркером того чи іншого мікроорганізму.

11.2.2. Ідентифікація особи на основі мінісателітної ДНК: визначення батьківства

Визначення батьківства є серйозною соціальною, юридичною та медичною проблемою. Вирішення цього завдання часто потрібне в судах, при вирішенні приватних спорів, для пренатальної (внутрішньоутробної) діагностики, генетичних консультацій та при пересадках органів. Наприклад, тільки в США в 1990 р. було проведено понад 120 000 тестів на визначення батьківства, і це число швидко зростає. Світовий ринок таких діагностичних тест-систем оцінювався у 1994 р. більш ніж у 1 млрд. доларів і зараз є найбільшим ринком серед молекулярно-генетичних діагностикумів.

З використанням діагностичних тест-систем на основі мінісателітних ДНК визначення батьківства отримало міцну наукову основу. З цією метою нині використовують два підходи. При одному з них застосовують олігонуклеотидні зонди, специфічні щодо багатьох мінісателітних локусів, при іншому – набори зондів (або праймерів), специфічних щодо окремих поліморфних локусів VNTR (докладніше про VNTR див. розділ 1.3.1).

Теоретичні аспекти можливості визначення батьківства.Можливість визначення батьківства, так само як і віднесення біологічних зразків, що містять ДНК, до тієї чи іншої людини, ґрунтується на наявності в геномі людини чітких генетичних маркерів у вигляді певних послідовностей ДНК, набір яких є унікальним для конкретного індивідуума. Теоретично такими маркерами могли бути будь-які послідовності нуклеотидів ДНК, котрим характерна велика мінливість у популяціях людини. Як було вже зазначено вище, послідовності мінісателітів (VNTR), що тандемно повторюються, є одними з найбільш поліморфних послідовностей нуклеотидів в геномі людини. Тому не дивно, що вони були використані для ідентифікації особистості. Наявність поєднання генетичних маркерів серед VNTR, загальних для чоловіка, жінки та спірної дитини, у ряді випадків може однозначно вказувати на родинні зв'язки між ними.

Відсутність загальних генетичних маркерів у обстежуваних дитини та чоловіка однозначно виключає останнього як батька дитини. Проте виявлення у них загальних маркерів ще може бути доказом того, що підозрюваний чоловік є батьком. Докази батьківства ґрунтуються на простих статистичних розрахунках, у яких враховуються частоти народження в популяції загальних алелей досліджуваних VNTR-локусів. Розраховується відношення (X/Y) ймовірності (X) отримання спостерігається набору маркерів можливого справжнього батька до ймовірності (Y) виявлення цього набору маркерів у будь-якої, обраної навмання людини, що належить цій популяції. Таке ставлення ймовірностей отримало назву індексу батьківства(Paternity index - PI).

При розрахунках PI виникає ще одна проблема, пов'язана з визначенням ймовірності (X) того, що чоловік, що обстежується, є батьком. Значення такої ймовірності необхідно мати до будь-яких діагностичних тестів. Зазвичай значення 0,5 не можна вважати досить обґрунтованим у всіх конкретних випадках. На щастя, при дуже великих значеннях PI (> 104), які зазвичай виходять при таких дослідженнях ДНК, вибір цієї вихідної ймовірності виявляється практично несуттєвим. Як правило, це виходить через низькі значення ймовірності Y.

Визначення батьківства з використанням олігонуклеотидних зондів, специфічних щодо кількох VNTR-локусів. У 1985 р. І.О. Джефрісом і співавторами вперше було показано, що олігонуклеотидні зонди, комплементарні послідовностям міоглобінового гена людини, одночасно мають здатність гібридизуватися по Саузерну з множинними локусами мінісателітної ДНК. Профілі гібридизації виявилися специфічними окремих індивідуумів. Сукупність електрофоретично поділяються рестрикційних фрагментів аналізованої ДНК, що виявляються після проведення гібридизації з міченими зондами, які специфічні щодо поліморфних мінісателітних локусів, отримала назву ДНК-фінгерпринтів, або генетичних відбитків пальців. За допомогою таких та інших аналогічних олігонуклеотидних зондів вдається виявляти на одній електрофореграмі до 15–20 різних фрагментів ДНК одного індивідуума, молекулярна маса яких перевищує 3,5 т.п.о., а також багато дрібніших фрагментів, які не враховуються при визначенні батьківства цим методом.

Мал. ІІ.36. Приклади виключення та докази батьківства за допомогою ДНК-типування

Результати гібридизації по Саузерну з зондом F10 показують повну ідентичність фрагментів ДНК у дитини та батька (доріжки 2 і 3), що розглядається як доказ батьківства, або виявляють принаймні 6 додаткових фрагментів ДНК у дитини, позначених стрілками, які відсутні у батька (доріжки 5 та 6 – виключення батьківства)

На рис. II.36 показані результати одного з таких дослідів. Інтерпретація ДНК-фінгерпринтів, отриманих при аналізі множинних локусів, заснована на трьох постулатах. Насамперед передбачається, що фрагменти ДНК, видимі на фінгерпринтах, є алельними продуктами окремих генетичних локусів людини і передаються потомству незалежно один від одного. По-друге, вважається, що для кожного генетичного локусу частоти народження в популяції окремих алелів слідують нормальному розподілу Пуассона. І, нарешті, приймається, що фрагменти ДНК, електрофоретична рухливість яких збігається, представляють той самий аллель конкретного локусу. Накопичений досвід роботи з ДНК-фінгерпринтами показує, що перше припущення дотримується досить добре: алелізм(парність гомологічних генів, що визначають різні фенотипічні ознаки у диплоїдних організмів) та генетичне зчеплення між досліджуваними локусами спостерігаються рідко. Невиконання другого припущення не позначається серйозно на результатах тестування, оскільки висновки робляться без урахування частоти окремого алелю на основі збігу структури (фрагментів ДНК) багатьох локусів. Третій постулат є спірнішим, проте його застосування надає значенням індексу батьківства стабільність.

З цими вихідними умовами статистична оцінка ДНК-фінгерпринтів множинних локусів ґрунтується лише на одному параметрі: середній частці фрагментів ДНК ( x), які збігаються у людей без родинних зв'язків. Такий параметр більшою мірою залежить від техніки лабораторних досліджень, ніж від властивостей популяції, що обстежується. Це насамперед здатність використовуваної системи до електрофоретичного поділу індивідуальних фрагментів ДНК (тобто роздільна здатність використовуваного методу), принципи вибору конкретних фрагментів ДНК для аналізу, а також критерії прийняття рішення про ідентичність порівнюваних фрагментів ДНК. Отже, параметр x може варіювати при порівнянні результатів, одержуваних у різних лабораторіях, але ці відмінності постійно зберігатимуться для різних популяцій і субпопуляцій. Справді, при використанні, наприклад, зондів 33.6 і 33.15, виявилося, що xтой самий у неспоріднених індивідуумів, у парах муж–жена й у різних етнічних групах.

Мал. ІІ.37. Порівняння інформативності двох мінісателітних зондів під час ідентифікації особистості

Частоти народження мінісателітних локусів D1S7 ( а) та D1S80 ( б) певного розміру в популяції оцінювали гібридизацією за Саузерном після розщеплення ДНК рестриктазою Hae III ( а) або ПЛР ( б). Для локусу D1S7 характерний квазі-безперервний унімодальний розподіл, тоді як локус D1S80 характеризується меншою гетерозиготністю (84%) з невеликим числом дискретних алелів, для яких характерний мультимодальний розподіл

Визначення батьківства з використанням ДНК-зондів, специфічних щодо лише одного локусу.ДНК-фингерпринты, одержувані під час одночасного дослідженні багатьох локусів, відбивають швидше фенотип індивідуума, ніж його генотип. Дійсно, одержувана в результаті картина містить у собі безліч смуг ДНК, у тому числі і фракції, що не розділилися, а також слабо розділилися. Така електрофореграма нагадує складну фенотипову ознаку, наприклад форму обличчя людини, яка є результатом експресії величезної кількості генів. На відміну від цього за допомогою ДНК-зондів, що є клонованими послідовностями мінісателітів і взаємодіють тільки з одним локусом, можна отримувати справжню інформацію про генотип організму, що вивчається. Таким чином, маючи справу з окремими поліморфними локусами людини, дослідники отримують у свої руки систему кодомінантних алелів(тобто алелів, спільнощо беруть участь у формуванні фенотипічних ознак), які успадковуються за законами Менделя. Саме розуміння успадкування таких мінісателітних локусів і призвело до поширення однолокусного методу визначення батьківства.

В даний час отримані сотні клонів мінісателітної ДНК та на їх основі розроблені комбінації зондів, придатні для визначення батьківства. При виборі зондів для таких мінісателітних локусів зазвичай керуються такими критеріями: зонди повинні мати сувору локус-специфічність, а тестовані локуси бути незчепленими (передатися потомству незалежно один від одного) і мати достатню, але не надмірну генетичну стабільність. Зокрема, серед найбільш широко використовуваних зондів MS1 (D1S7) відповідає генетичному локусу, гетерозиготному в 99% випадків, проте він мутує з дуже високою частотою (0,05 на гамету) і тому, незважаючи на високу інформативність, не використовується при визначенні батьківства ( рис. а). У той же час для локусу D1S80 із значно меншою варіабельністю (84% гетерозигот) характерне утворення кластерів у частотах розподілу фрагмента ДНК за довжиною (див. рис. II.37, б). Тому невеликі помилки у визначенні довжини алелів можуть призвести до значних помилок в оцінці частоти їхнього народження. Такі локуси досить легко змінюються внаслідок генетичного дрейфу та інбридингу.

В даний час розроблено теорію, що вказує на те, скільки локусів має бути типовано для отримання правильної відповіді про батьківство при відомих значеннях гетерозиготності цих локусів у популяції. Наприклад, якщо використовуються локуси, гетерозиготність яких становить 90%, для встановлення батьківства необхідно проаналізувати шість таких локусів. У наш час для цих цілей зазвичай використовується набір із трьох-п'яти однолокусних зондів. Однолокусні зонди мають низьку роздільну здатність щодо братів і сестер ( сібсів). Зокрема, за допомогою одного такого зонда можна лише з ймовірністю 75% виявити генетичні різницю між сибсами, і ця ймовірність збільшується до 99,6% при використанні чотирьох зондів. Цей факт набуває особливої важливості, коли при визначенні батьківства необхідно зробити вибір між братами.

Особливості визначення батьківства з окремих локусів з використанням ПЛР.Як альтернативу однолокусним зондам останнім часом визначення батьківства часто використовують ПЛР. Окремі міні- та мікросателітні локуси можуть бути ампліфіковані за допомогою праймерів, комплементарних унікальним послідовностям ДНК, що фланкують ці послідовності, що повторюються. При ідентифікації особистості метод ПЛР, який за своєю суттю є одним з різновидів однолокусної методики, оскільки має справу з окремими локусами, має принаймні дві переваги перед однолокусними зондами. По-перше, популяційний поліморфізм довжин ДНК алелей, що досліджуються з використанням цього методу, носить більш дискретний характер, ніж у алелей, що вивчаються за допомогою однолокусних зондів (див. рис. II.37, а,б). Ця обставина полегшує подальше обчислення індексу батьківства. По-друге, метод ПЛР має набагато більшу чутливість і може бути використаний при аналізі зразків, що містять<1 нг геномной ДНК и полученных из разных источников (см. раздел 11.1.1).

До недоліків ПЛР у застосуванні до визначення батьківства слід віднести низьку інформативність поліморфних мікросателітів та коротких мінісателітів. Це пов'язано з тим, що вони мають<90% гетерозиготности, небольшим числом аллелей и имеют тенденцию к образованию кластеров по размерам (см. рис. II.37,б). Крім того, на розподіл таких послідовностей у геномі впливають інбридинг та належність індивідуумів до певних етнічних груп. Кількість локусів мінісателітів, які необхідно досліджувати методом ПЛР для визначення батьківства, наближається до 11, а мікросателітів – до 18.

Для типування за допомогою ПЛР найчастіше використовуються три мінісателітні локуси людини: в гені аполіпопротеїну B (APOB), D17S5 (відомий також як локус D17S30) і D1S80. Усі три локуси легко ампліфікуються (максимальний розмір їх алельних варіантів не перевищує 1 т.п.о.) і легко виявляються за допомогою електрофорезу. Однак для них характерні низький рівень гетерозиготності та мала мінливість (що виражається в невеликій кількості відомих алелів). Мутації у цих мікросателітах виникають дуже рідко.

Одним із шляхів підвищення інформативності поліморфізмів мікросателітів при ДНК-типуванні є одночасна ампліфікація двох тісно зчеплених мікросателітних локусів, поєднання яких формують безліч гаплотипів. Наприклад, одночасна ампліфікація двох GATA-повторів, локалізованих в інтроні 40 гена фактора фон Віллебранда, які розділені послідовністю довжиною 212 п.о., виявила сумарний рівень гетерозиготності об'єднаного локусу ~93%. При цьому рівні гетерозиготності індивідуальних локусів становили лише 72 та 78% відповідно.

Насамкінець необхідно ще раз відзначити, що за своєю логікою сучасні методи визначення батьківства, засновані на ДНК-типуванні, дещо суперечливі. Якщо негативний висновок про батьківство, заснований на розбіжності алелей аналізованих міні- або мікросателітних локусів, абсолютно і не підлягає сумніву, то позитивний висновок може бути зроблений лише з деякою часткою ймовірності, яка заснована на частоті конкретних алелей аналізованих локусів в популяції. З іншого боку, в результаті методичних помилок легко можуть бути зроблені помилково-негативні висновки, проте позитивний висновок про батьківство в результаті методичної лабораторної помилки практично виключено.

Висока інформативність багатолокусних ДНК-фінгерпринтів підтверджена великою кількістю генетичних та популяційних досліджень. Емпіричні дані, отримані під час обстеження тисяч сімей, показали, що з допомогою багатолокусних зондів можна вирішувати всі спірні випадки батьківства. Використання однолокусних зондів утруднено неможливістю створення повної класифікації відповідних алелів у популяції через безперервного розподілу їх за розмірами. Однак і в цьому випадку на практиці проблема повністю вирішується за допомогою набору п'яти-шість однолокусних зондів. Застосування ПЛР обмежується великою еволюційною консервативністю міні- і мікросателітних локусів, що ампліфікуються і, як наслідок, малим сумарним числом алелів. Однак ПЛР буває дуже корисною на перших етапах дослідження через методичну простоту постановки дослідів, особливо в умовах малої доступності вихідного біологічного матеріалу. Усі групи методів добре доповнюють одне одного й у різних поєднаннях у спірних випадках дозволяють однозначно ідентифікувати особистість людини.

Навіть якщо дві ракові клітини виглядають під мікроскопом однаково, вони можуть бути різними, тому що в них відбулися різні мутації, у них відрізняється молекулярно-генетичний профіль. За рахунок цього вони будуть по-різному поводитися і неоднаково реагувати на те саме ліки.

Генетичне типування допомагає скласти «молекулярний портрет» пухлини, підібрати найефективніші препарати, призначити оптимальну схему лікування конкретного випадку. Такий підхід не просто дозволяє виграти дорогоцінний час, він допомагає зробити лікування персоналізованим, підвищує шанси на успіх при різних видах раку.

За допомогою сучасних технологій можна проаналізувати більшість лікарських препаратів та найпоширеніші онкозахворювання. У результаті лікар розуміє, яке лікування дасть найкращий ефект у конкретного пацієнта.

Тест OncoDEEP - це комплексне молекулярно-генетичне дослідження, в якому поєднуються найсучасніші технології: Секвенування Наступного Покоління (NGS) ІГХ, FISH, аналіз метилювання, транслокацій та багато іншого. Матеріал для дослідження одержують за допомогою класичної (зразок тканини пухлини) або рідинної (зразок крові) біопсії.
OncoDEEP дозволяє визначити чутливість пухлини до різних видів терапії та підібрати персоналізоване лікування, зіставивши результати з даними світової літератури та доказової бази.

В даний час генетичне типування успішно застосовують для підбору лікування при меланомі, раку молочної залози, товстої та прямої кишки, яєчників, легені, а також при низці інших онкозахворювань.

Ми допомагаємо онкологам та хіміотерапевтам скласти максимально ефективний план лікування за допомогою триетапної діагностики:

біопсія пухлини;
аналіз крові;
підключення до платформи обробки та аналізу даних, які отримують від лікарів та пацієнтів з усього світу.

Дана платформа дозволяє отримати персоніфікований висновок, в якому відображено взаємозв'язок терапії та генної відповіді як реакції на призначене лікування. Це дає лікарю можливість швидко отримувати зворотний зв'язок та змінювати протокол відповідно до отриманої інформації.

Молекулярно-генетичне типування допомагає:

підвищити ефективність хіміотерапії та таргетної терапії;
більш точно прогнозувати поведінку пухлини та процес метастазування;
заощадити час.

Для кого призначено генне типування?

Для дорослих пацієнтів із великим пухлинним процесом усіх типів. Метод допомагає підвищити ефективність терапії у таких випадках:

якщо лікування вже проводилось, але не дало результатів;
при метастатичних пухлинах;
при поодиноких, агресивних типах раку.

Які технології застосовуються?

Дослідження проводиться на одному з двох видів препаратів:

FFPE-блоки - фіксовані у формаліні та парафінізовані зразки тканин;
Мікропрепарати - предметне скло зі зразками тканини.

У медичному центрі «Медицина 24/7» є обладнання, яке дозволяє проводити всі необхідні дослідження з використанням новітніх технологій біосеквенування у поєднанні з імуногістохімічним дослідженням та аналізом біомаркерів, специфічних для даного виду пухлини.

ДНК-ТИПІРОВАНИЕ (молекулярно-генетична індивідуалізація організмів, ДНК-індивідуалізація), спосіб дослідження генетичного матеріалу, спрямований на виявлення та оцінку індивідуальних генетичних особливостей біологічного об'єкта. Мета такого дослідження - встановлення подібності (або відмінностей) різних організмів для визначення ступеня їхньої спорідненості.

Метод ДНК-типування заснований на існуванні відмінностей у структурі ДНК у різних індивідуумів. Це стосується так званих гіперваріабельних ділянок, які мають структурний поліморфізм (мають кілька алельних форм). У їх формуванні головну роль відіграють відносно короткі нуклеотидні послідовності, що отримали назву мінісателітних і мікросателітних ДНК, що складаються відповідно з 15-70 і 2-5 пар нуклеотидів. Ці послідовності розпорошені по геному у вигляді блоків (локусів) і мають тандемну організацію (багаторазово йдуть один за одним). Число тандемних повторів (і, отже, довжина самих локусів) варіює в межах від 2-4 до кількох тисяч. Наявність елементів, що повторюються, в таких гомологічних сателітних блоках і зумовлює структурний поліморфізм цих локусів, що проявляється, зокрема, як феномен поліморфізму довжини рестриктазних фрагментів (ПДРФ). Такі фрагменти утворюються після ферментативного розщеплення ДНК рестриктазами (всередині повторів розщеплення не відбувається через особливості їх нуклеотидного складу). У початкових варіантах ДНК-типування фрагменти ДНК розділяли електрофорезом в агарозному гелі, а потім отримували відбиток гелю на мембранному фільтрі. Останній інкубували у розчині, що містить спеціально підібрані зонди - фрагменти ДНК, мічені радіоізотопом. Ділянки досліджуваної ДНК, що містять комплементарні зонду, зв'язувалися (гібридизувалися) з ним і виявлялися за допомогою радіоавтографії. Таким чином, на радіочутливій плівці у вигляді набору смуг ідентифікувалися відразу всі мікро- і мінісателіти геномної ДНК, гомологічні зонду, що використовується. За аналогією з аналізом дактилоскопічного відбитка (рисунком папілярних ліній) з'явився термін «генетична, чи геномна, дактилоскопія». Кожен індивід має свій геномний «відбиток», який характеризується певним числом смуг (до кількох десятків), їх розташуванням на доріжці та інтенсивністю почорніння кожної зі смуг. Чим більша спорідненість, тим більше збігів. Вся картина виявляє навіть більш високу індивідуальну специфічність, ніж папілярні візерунки, і тому може бути «генетичним посвідченням» особистості. У кровних родичів кількість збігаються смуг помітно більше, у близнюків вони ідентичні.

Розробка методу (кінець 1980-х років) полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) дозволила розмножувати (ампліфікувати) будь-яку послідовність ДНК, отримувати десятки та сотні мільйонів її копій та використовувати для молекулярно-генетичного аналізу зникаюче малі кількості біологічного матеріалу. З'явилася можливість порівнювати довжину окремих цілих локусів мінісателітних ДНК, не піддаючи їх попередньому ферментативному розщепленню, тобто здійснювати аналіз поліморфізму довжини ампліфікованих фрагментів (ПДАФ). Після поділу продуктів ПЛР електрофорезом їх положення в гелі виявляють за допомогою спеціальних барвників, флуоресцентних міток та ін. У цьому випадку ампліфікаційний профіль ДНК, що створюється вже сумою локусів, виявляється надзвичайно поліморфним (є комбінацією декількох незалежних поліморфних елементів), але забезпечує дуже високу достовірність аналізу.

Варіабельність у структурі поліморфних генів міні- та мікросателітних ДНК може бути обумовлена також точковими нуклеотидними замінами. Такі локуси розрізняються лише за нуклеотидним складом. У цьому випадку визначають первинну структуру ампліфікованих фрагментів (дивись Секвенування). Найбільш розробленим методом ДНК-типування, заснованим на секвенуванні фрагментів, є аналіз мітохондріальної ДНК (мтДНК), яка характеризується високим рівнем поліморфізму, наявністю великої кількості копій, відсутністю рекомбінації та материнським характером спадкування (зародок одержує мітохондрії лише з яйцеклітини). Все це дозволило широко використовувати мтДНК у популяційних та філогенетичних дослідженнях, а в деяких випадках зробило її єдиним можливим інструментом для ДНК-типування; наприклад, коли ДНК, що міститься у зразку, сильно деградована, а хромосомна ДНК не може бути ампліфікована. Спадкування по материнській лінії та відсутність рекомбінації дозволяють використовувати мтДНК як так званий «трасуючий» родовід генетичного маркера. Це особливо важливо при встановленні спорідненості у тих випадках, коли генетична дистанція, що розділяє родичів, виявляється більшою, ніж одне покоління. Яскравим прикладом використання мтДНК для ДНК-типування стала робота російських, британських та американських вчених з ідентифікації останків російської імператорської сім'ї в 1992-98 роках. Пізніше аналіз мтДНК був багаторазово використаний для індивідуалізації кісткових та муміфікованих останків, вік яких обчислюється десятками, сотнями та навіть десятками тисяч років.

Методом ДНК-типування користуються в криміналістиці для ідентифікації особи та встановлення споріднених відносин, а також у медико-біологічному аналізі. У генетиці та селекції сільськогосподарських тварин і рослин цей метод використовують для паспортизації та відбору чистопородного потомства тварин, типування сортів рослин, визначення міжвидових та міжсортових відмінностей, а в практичній бактеріології та епідеміології – для ідентифікації бактеріальних штамів. ДНК-типування можна використовувати при вивченні структурно-функціональних особливостей генетичного апарату та явищ геномної нестабільності при нормальному функціонуванні клітин та патогенезі, у популяційній та еволюційній генетиці.

DNA Fingerprinting: State of the science. Ст а. о., 1993; Іванов П. Л. Молекулярно-генетична ідентифікація останків царської сім'ї// Вісник РАН. 1994. Т. 64. № 10; він же. Використання індивідуалізуючих систем на основі поліморфізму довжини ампліфікованих фрагментів (ПДАФ) ДНК у судово-медичній експертизі ідентифікації особи та встановлення спорідненості // Судово-медична експертиза. 1999. № 4; він же. Індивідуалізація людини та ідентифікація особистості: молекулярна біологія у судовій експертизі // Вісник РАН. 2003. Т. 73. № 12.