На відміну від цитогенетичного методу, який дозволяє вивчати структуру хромосом та каріотипу в нормі та діагностувати спадкові хвороби, пов'язані зі зміною їх числа та порушенням організації, спадкові захворювання, зумовлені генними мутаціями, а також поліморфізм за нормальними первинними продуктами генів вивчають за допомогою біохімічних методів.

Вперше ці методи почали застосовувати для діагностики генних хвороб ще на початку XX ст. Останні 30 років їх широко використовують у пошуку нових форм мутантних алелів. З їхньою допомогою описано понад 1000 вроджених хвороб обміну речовин. Багатьом їх виявлено дефект первинного генного продукту. Найбільш поширеними серед таких захворювань є хвороби, пов'язані з дефектністю ферментів, структурних, транспортних чи інших білків.

Дефекти структурних і циркулюючих білків виявляються щодо їх будови. Так було в 60-х гг. XX ст. було завершено аналіз (3-глобінової ланцюга гемоглобіну, що складається з 146 амінокислотних залишків. Встановлено велику різноманітність гемоглобінів у людини, пов'язане зі зміною структури його пептидних ланцюгів, що нерідко є причиною розвитку захворювань (див. § 4.1).

Дефекти ферментів встановлюють шляхом визначення вмісту крові та сечі продуктів метаболізму, що є результатом функціонування даного білка. Дефіцит кінцевого продукту, що супроводжується накопиченням проміжних та побічних продуктів порушеного метаболізму, свідчить про дефект ферменту або його дефіцит в організмі (див. § 4.1).

Біохімічну діагностику спадкових порушень обміну проводять у два етапи. На першому етапі відбирають ймовірні випадки захворювань, на другому - більш точними і складними методами уточнюють діагноз захворювання. Застосування біохімічних досліджень для діагностики захворювань у пренатальному періоді або безпосередньо після народження дозволяє своєчасно виявити патологію та розпочати специфічні медичні заходи, як, наприклад, у разі фенілкетонурії.

Для визначення вмісту крові, сечі або амніотичної рідини проміжних, побічних і кінцевих продуктів обміну крім якісних реакцій зі специфічними реактивами на певні речовини використовують хроматографічні методи дослідження амінокислот та інших сполук.

Для визначення вродженого гіпотереозу крові дитини на 3 день життя визначають рівень тироксину. Просіююча програма масової діагностики спадкових хвороб застосовуються не тільки серед новонароджених. Вони можуть бути організовані виявлення тих хвороб які поширені у якихось групах населення. Наприклад зі США організована біохімічна програма, що просіює, з виявлення гетерозиготних носіїв ідіотії Тей-Сакса (вона частіше зустрічається серед євреїв-ашкеназі). На Кіпрі та в Італії організовано біохімічне дослідження гетерозиготних носіїв таласемії.

Селективні діагностичні програмипередбачають перевірку біохімічних аномалій обміну у пацієнтів із підозрою на генні спадкові хвороби.

У селективних програмах можуть використовуватися прості якісні реакції (наприклад, тест із хлоридом заліза для виявлення фенілкетонурії або тест з динітрофенілгідрозином для виявлення кетокислот у сечі) або точніші методи. Наприклад, за допомогою тонкошарової хроматографії сечі та крові можна діагностувати спадкові порушення обміну амінокислот та мукополісахаридів. За допомогою електрофорезу гемоглобінів діагностується вся група гемоглобінопатій.

На сьогоднішній день в нашій країні впроваджено програму обов'язкового селективного скринінгу на визначення спадкових хвороб обміну речовин, з проведенням 14 тестів аналізів сечі та крові: на білок, кетокислоти, цистин і т.д. На другому етапі, застосовуючи методи тонкошарової хроматографії сечі та крові, можна виявити понад 140 спадкових хвороб обміну речовин, такі як хвороби вуглеводного обміну, лізосомальні хвороби накопичення, хвороби обміну металів, аміноацидопатії тощо.

Широке застосування знайшов біохімічний метод у пренатальній діагностиці вроджених вад розвитку. Біохімічні методи включають визначення рівня альфа-фетопротеїну, хоріонічного ганадотропіну в сироватці крові вагітної. Ці методи просіюють для виявлення вроджених вад розвитку. Наприклад, при дефектах невральної трубки підвищується рівень альфа-фетопротеїну.

Цитогенетичний метод.

Цитогенетичний метод, заснований на вивченні кількості та структури хромосом у нормі та при патології.

Основними свідченнями для цитогенетичного дослідження є:

1) пренатальна діагностика статі плода у сім'ях, обтяжених захворюваннями, зчепленими з Х-хромосомою;

2) недиференційована олігофренія (недоумство);

3) звичні викидні та мертвонародження;

4) множинні вроджені вади розвитку у дитини;

5) безпліддя у чоловіків;

6) порушення менструального циклу (первинна аменорея);

7) пренатальна діагностика при віці матері старше 35 років.

Цей метод став широко застосовуватися в медичній практиці з 1956 року, коли Тіо та Леван визначили, що у людини 46 хромосом. Перша класифікація хромосом людини, запропонована Денвері заклала основу наступних номенклатур хромосом.

Найбільш сучасною вважається Міжнародна система цитогенетичної номенклатури хромосом людини скорочено ISCN, прийнята у Вашингтоні 1995 року.

Відповідно до останньої номенклатури в хромосомі довге плече позначають q, а коротке p. У кожному районі хромосоми смуги та сегменти послідовно пронумеровані від центроміри до теломери. Використання методу диференціального фарбування хромосом дозволяє виділяти індивідуальний малюнок кожної хромосоми внаслідок того, що в хромосомі ділянки еу-і гетерохроматину по-різному фарбуються барвниками.

Об'єктами для цитогенетичного дослідження є метафазні хромосоми, які можна вивчати за допомогою прямих і непрямих методів.

Прямі - це методи отримання препаратів клітин, що діляться без культивування, їх використовують для вивчення клітин кісткового мозку і клітин пухлин. Непрямі методи - це методи одержання препаратів хромосом із культивованих у штучних живильних середовищах, наприклад, при культивуванні лімфоцитів периферичної крові людини.

За допомогою непрямих методів можна проводити: каріотипування - визначення кількості та якості хромосом; генетична стать організму; діагностику геномних мутацій та хромосомних аберацій. Наприклад, синдром Дауна (трисомія по 21-й хромосомі), синдром Патау (трисомія по 13-й хромосомі), синдром Едвардса (трисомія по 18-й хромосомі), синдром «котячого крику» (делеція 5-ї хромосоми), синдром Вольфа -Хіршхорна (часткова моносомія 4-ї хромосоми).

Для вивчення статевих хромосом, зокрема Y-хромосоми, використовують спеціальне забарвлення акрихініприт (флюоресціююча) і дослідження проводять в ультрафіолетовому світлі. Y-хроматин - це крапка, що сильно світиться, виявляється в ядрах клітин чоловічого організму, і число Y-телець відповідає числу Y-хромосом в каріотипі. Остаточний діагноз хромосомної хвороби виставляється лише після дослідження каріотипу.

Щоб швидко визначити зміни статевих хромосом застосовують експрес-метод визначення статевого хроматину. Підлоговий хроматин або тільце Барра є однією з двох X-хромосом, причому в інактивованому вигляді. Воно виявляється у вигляді потік трикутної або овальної форми біля внутрішньої мембрани ядерної оболонки. У нормі статевий хроматин виявляється лише в жінок. У разі збільшення числа Х-хромосом збільшується і кількість тілець Барра. При зменшенні числа Х-хромосом (синдром Шерешевського-Тернера, каріотип 45 ХО) тільце Барра відсутнє. У нормі у чоловіків статевий хроматин не виявляється, його наявність може свідчити про синдром Клайнфельтера (каріотип 47 ХХY).

Цитогенетичний метод застосовують для пренатальної діагностики спадкових захворювань. Для цього проводять амніоцентез, одержують амніотичну рідину з клітинами шкіри плода, потім клітинний матеріал досліджують для допологової діагностики хромосомних аберацій та геномних мутацій, а також статі плода. Виявлення зміни кількості та структури хромосом дає можливість своєчасного переривання вагітності з метою запобігання потомству з грубими аномаліями розвитку.

23. Біохімічний метод, його сутність, можливості застосування під час медико-генетичного консультування.

Біохімічні методи.

Ці методи використовуються для діагностики хвороб обміну речовин, причиною яких є зміна активності певних ферментів. За допомогою біохімічних методів відкрито близько 500 молекулярних хвороб, які є наслідком мутантних проявів генів. При різних типах захворювань вдається визначити сам аномальний білок-фермент, або проміжні продукти обміну. Ці методи відрізняються великою трудомісткістю, вимагають спеціального обладнання і тому не можуть бути широко використані для популяційних масових досліджень з метою раннього виявлення хворих зі спадковою патологією обміну.

В останні два десятиліття у різних країнах розробляються та застосовуються для масових досліджень спеціальні програми.

Перший етаптакої програми полягає в тому, щоб серед великої кількості обстежуваних виділить імовірно хворих, які мають якесь спадкове відхилення від норми. Така програма називається просіювальною, або скринінг-програмою (англ. screening - просіювання). Для цього етапу зазвичай використовують невелику кількість простих, доступних методик (експрес-методів). Експрес-методи ґрунтуються на простих якісних реакціях виявлення продуктів обміну в сечі, крові.

На другому етапіпроводиться уточнення (підтвердження діагнозу чи відхилення при хибно-позитивної реакції першому етапі). Для цього використовуються точні хроматографічні методи визначення ферментів, амінокислот тощо.

Застосовують також мікробіологічні тести, вони засновані на тому,що деякі штами бактерій можуть зростати лише в середовищах, що містять певні амінокислоти, вуглеводи. Вдалося отримати штами за речовинами, що є субстратамі або проміжними метаболітами у хворих при порушенні обміну. Якщо в крові або сечі є необхідна для росту речовина, то в чашці Петрі навколо фільтрувального паперу, просоченої однієї з цих рідин, спостерігається активне розмноження мікробів, чого не буває у разі у здорової людини. Розробляються різноманітні варіанти мікробіологічних методів.

Біохімічні, імунологічні та інші параклінічні методи не специфічні для генетичної консультації, але застосовуються так само широко, як і при діагностиці неспадкових хвороб. При спадкових хворобах часто виникає необхідність застосовувати ті ж тести не тільки у пацієнта, але й інших членів сім'ї (складання біохімічного або імунологічного "родоводу")

24. Близнюків у людини, критерії визначення ідентичності близнюків. Близнюковий метод у генетичному аналізі.

Близнюки-діти однієї матері, що пустували протягом однієї вагітності і з'явилися на світ в результаті одних пологів практично одночасно. Близнюки можуть бути як одностатеві, так і різностатеві.

Виділяють два основні типи близнюків:

монозиготні (гомозиготні);

дизиготні (гетерозиготні).

Монозиготні (однояйцеві, гомозиготні або ідентичні) близнюкиутворюються з однієї зиготи (однієї яйцеклітини, заплідненої одним сперматозоїдом), що розділилася на стадії дроблення на дві (або більше) частини. Вони мають однакові генотипи. Монозиготні ідентичні близнюки завжди однієї статі і мають дуже велику портретну подібність.

Дизиготні близнюкирозвиваються у тому випадку, якщо дві яйцеклітини запліднені двома сперматозоїдами. Звичайно, дизиготні близнюки мають різні генотипи. Вони подібні між собою не більше, ніж брати та сестри, оскільки мають близько 50% ідентичних генів.

Загальна частота народження близнюків становить приблизно 1 %, їх близько 1/3 посідає монозиготных близнюків.

Для підтвердження монозиготності близнюків використовують низку підходів:

порівняння за багатьма, головним чином, морфологічними ознаками - пігментація очей, волосся та шкіри, особливості волосяного покриву на голові і тілі, а також форма волосся, форма вух, носа, губ та нігтів, пальцеві візерунки (полісимптомний підхід);

порівняння за еритроцитарними антигенами – групи крові АВО, резус, MN та ін., за білками та сироватки крові: всі перелічені маркери відносяться до категорії моногенних менделюючих ознак, а контролюючі їх гени відрізняються вузькою нормою реакції (імунологічний підхід);

порівняння даних ЕКГ та ЕГ- електрокардіографії та енцефалограм - близнюків (клініко-функціональний метод);

трансплантаційний тест, що полягає у перехресній пересадці шкіри у близнюків (варіант імунологічного підходу, успішна перехресна пересадка – найбільш достовірний критерій монозиготності).

Близнюковий метод використовується дляз'ясування спадкової обумовленості ознак і добре демонструє взаємовідносини між генотипом та зовнішнім середовищем. За допомогою цього методу вдалося оцінити значущість генетичної схильності до багатьох захворювань, пенетрантність, експресивність та умови прояву тих чи інших видів патології. Близнюкові дані виявляються корисними для кількісної оцінки ступеня генетичної детермінованості окремих ознак, у зв'язку з чим близнюковий метод можна вважати одним із важливих методів кількісної генетики.

Таким чином, близнюковий метод дозволяє кількісно оцінити внесок спадковості (генотипу) і внесок навколишнього середовища в розвиток ознаки, що вивчається (хвороби).

Близнюковий метод включає наступні етапи:

Етап 1. Підбір пар монозиготних та дизиготних близнюків.

Підбирають по 100 пар близнюків, у яких хоча б у одного з двох близнюків є ознака, що вивчається

Етап 2. Обчислення ступеня подібності всередині кожної групи близнюків.

Визначаються окремо для кожної групи

Конкордантність (К) – наявність ознаки одночасно в обох близнюків.

Дискордантність (Д) - наявність ознаки тільки в одного близнюка з пари.

Коефіцієнт успадкованості H

Мз-монозиготні

Дз-дизиготні

Формула Хольцінгера

Н-коефіцієнт успадкованості

Е- частка середовища у формуванні досліджуваної ознаки

Етап 3 Обчислення частки генотипу та частки середовища у розвитку досліджуваної ознаки

Якщо НЕ переважає вплив спадковості

Якщо НЕ визначальним фактором є середовищем.

У самостійну науку біологічна хімія виділилася майже 100 років тому, але багато біохімічних процесів відомі людям з давніх-давен і використовувалися в різних галузях виробництва, спочатку кустарного, а згодом і промислового масштабу. Наприклад, на біохімічних реакціях засновано хлібопечення, сироваріння, виготовлення вин, вироблення шкіри.
Сироваренням та виготовленням кисломолочних продуктів люди займалися ще до нашої ери, про це згадується навіть у поемах Пемера. У процесі виготовлення кисломолочних продуктів велику роль грають молочнокислі бактерії.
Використання лікарських рослин для лікування хвороб призвело до пошуку діючої речовини і змусило задуматися про те, що з нею відбувається в організмі людини. Вживання плодів, зелені, виготовлення рослинних фарб також зацікавило хімічний склад рослин. Багато лікарських речовин різного походження описані у праці великого арабського лікаря Авіценни «Канон лікарської науки».
Відомий італійський художник Леонардо да Вінчі проводив різні досліди та зробив висновок про те, що живі організми можуть існувати лише в тій атмосфері, в якій може виникнути полум'я. Тепер уже всім відомо, що майже всім жи4
вим організмам необхідний кисень, що міститься в атмосферному повітрі і забезпечує процес горіння. Наприкінці XVIII ст. було відкрито значення дихання та пояснено роль кисню для живого організму.
Вивчення хімічного складу живих організмів дозволило англійському лікарю та хіміку У. Прауту у 1827 р. розділити молекули на білки, жири та вуглеводи.
Хімічний склад організму людини викликав великий інтерес у науковому світі. Німецький хімік Ф. Велер у 1828 р. вперше отримав таку органічну речовину, як сечовина, спочатку з аміаку та ціанової кислоти, а потім з аміаку та вуглекислого газу. У 1882 р. вчений І.Я. Горбачевський (Україна) отримав сечову кислоту з гліцину, а в подальших роботах виявив процес утворення сечової кислоти в живих організмах: сечовина та сечова кислота утворюються внаслідок перетворення білків в організмі, та їх рівень у крові є важливим показником стану білкового обміну. І. Я. Горбачевський відомий та іншими дослідженнями в галузі біохімії (отримання метилмочової кислоти, креатину, відкриття ксантиноксидази). Саме він довів те, що білки складаються з амінокислот, розробив спосіб визначення азоту у сечі та інших біологічних матеріалах.
У 1854 р. французький хімік П. Бертло отримав під час лабораторних дослідів жири, а 1861 р. російський хімік А. М. Бутлеров висловив теорію будови органічних сполук. Вивченням мікроорганізмів та викликаного ними бродіння займався французький мікробіолог Л. Пастер. Бродіння - це розщеплення вуглеводів під впливом ферментів, що відбувається за участю кисню або без нього, що призводить до утворення енергії, яку мікроорганізми використовують для своєї життєдіяльності.
В організмі людини бродіння здійснюється в кишечнику населяють його мікроорганізмами, під впливом виділених ними ферментів. Вивченням бродіння займався і німецький хімік Еге. Бухнер, який довів, що процес розщеплення цукру має більш хімічну природу, ніж біологічну, оскільки відбувається з участю як дріжджів (живих грибків), а й екстракту їх.
Великий внесок у вивчення білків зробив німецький хімік Е. Фішер, який визначив будову та властивості більшості амінокислот. Також він встановив хімічний зв'язок між амінокислотами в білках, що стало основою пептидної теорії будови білків. У 1926 р. американський біохімік Д. Самнер отримав уреазу (фермент) і довів, що є білком. Подальше вивчення ферментів призвело до відкриття будови вітамінів і визначило перетворення в організмі. Було вивчено гліколіз (безкисневе розщеплення вуглеводів) та цикл трикарбонових кислот (циклічні реакції, в ході яких утворюються речовини з великим запасом енергії). Відкриття нуклеїнових кислот у складі білків та моделі будови ДНК стало проривом для біології та медицини (біохімії, генетики). За це в 1953 р. англійський лікар і біолог Ф. Крик та американський біолог Д. Вотсон були удостоєні Нобелівської премії.
Всі ці відкриття та досягнення, а також подальші біохімічні дослідження дозволили описати обмін речовин в організмі людини. При різних патологічних станах відбуваються зміни хімічного складу у клітинах, тканинах, біологічних рідинах та виділеннях. Найчастіше біохімічному аналізу піддають кров, сечу, кал, слину, ліквор, жовч та шлунковий сік. Рідше досліджують хімічний склад червоного кісткового мозку, навколоплідної рідини, поту, блювотних мас, волосся, нігтів та сперми.
Хімічний склад біологічного матеріалу може змінюватися як кількісно (збільшення чи зниження вмісту будь-яких речовин, порушення співвідношення з-поміж них), і якісно (виявлення відсутніх чи які визначаються нормі речовин). У зв'язку з цим біохімічний аналіз у деяких випадках проводять прицільно, визначаючи рівень речовини у досліджуваному матеріалі або виявляючи лише його присутність.
Багато спадкових захворювань пов'язані з порушенням обміну речовин. Часто це викликано генетично обумовленим дефіцитом будь-яких ферментів, у разі біохімічні дослідження допомагають поставити точний діагноз. Іноді для цього аналізують і шматочки тканин внутрішніх органів.
Біохімічні дослідження дозволяють виявити деякі порушення обміну речовин вже в період внутрішньоутробного розвитку або відразу після народження дитини, при цьому можливий ранній початок лікування спадкових захворювань, що дає змогу нормалізувати стан плода або дитини, якнайкраще забезпечити умови для її розвитку відповідно до віку.
За допомогою поширених біохімічних аналізів можна виявити наявність порушень обміну речовин, а для встановлення точного діагнозу проводять більш детальні дослідження. Багато біохімічних аналізів, що дозволяють виявити спадкові порушення обміну речовин, що загрожують життю чи розвитку дітей, нині проводять масово у формі скринінг-тестів. Наприклад, всіх новонароджених у пологовому будинку обстежують на фенілкетонурію. Крім того, за допомогою біохімічних тестів виявляють такі
захворювання, як ензімопатії, глікогенози, муковісцидоз, адреногенітальний синдром. Дослідженню в таких випадках піддають найбільш доступний матеріал від хворого (кров та сечу).
Після скринінгового обстеження роблять уточнюючі біохімічні аналізи, визначають кількість речовини, що свідчить про захворювання, в одиниці досліджуваного матеріалу та стежать за його рівнем в організмі надалі.
Сучасні біохімічні лабораторії оснащені комп'ютерами та аналізаторами, які уможливлюють одночасно проводити велику кількість досліджень з високою точністю результатів та їх розшифровкою. Біохімічні аналізи виконують на основі таких методів, як хроматографія, електрофорез та центрифугування.

Хроматографія

Електрофорез

Центрифугування

Біохімічний аналіз крові - це лабораторний метод дослідження, що використовується в медицині, який відображає функціональний стан органів та систем організму людини. Він дозволяє визначити функцію печінки, нирок, активний запальний процес.

Визначення біохімічних показників крові

Визначення біологічних показників крові дозволяє оцінити роботу гепатобіліарної та серцево-судинної систем. Отруєння хімічними речовинами позначається, перш за все, на таких органах, як печінка, нирки та серце.

· Визначення аланінамінотрансферази (АЛТ)

Клітинний фермент, що у обміні амінокислот. АЛТ міститься у тканинах серця, печінки, нирок, нервової тканини, скелетної мускулатури та інших органів. Завдяки високому вмісту в тканинах цих органів, аналіз крові. Підвищений вміст: при застійній жовтяниці, гострому гепатиті, цирозі, серцевому нападі, раку печінки, гемолітичній жовтяниці, травмі.

Принцип методу: Визначення проводиться на біохімічному аналізаторі фірми Stat-fax 1300. Використовується кінетичний метод згідно з рекомендаціями IFCC (Міжнародна Федерація Клінічної Хімії). Як субстрат застосовується 2-оксоглутарат у присутності ТРІС буфера (рН 7,5).

· Визначення аспартатамінотрансферази (ACT)

АСТ-фермент, який використовується для оцінки функції печінки. Норма АСТ у крові: для жінок – до 31 Од/л; для чоловіків норма АСТ – до 37 Од/л. Підвищується рівень АлАт при інфаркті міокарда, ураження серцевої та соматичної мускулатури.

Принцип методу: Визначення проводиться біохімічному аналізаторі фірми Human Autohumalyzer - 900 plus. Використовується кінетичний метод згідно з рекомендаціями IFCC (Міжнародна Федерація з Клінічної Хімії). Як субстрат застосовується 2-оксоглутарат у присутності ТРІС буфера (рН 7,8).

· Визначення глутамілтранспептидази (ГГТ)

Активність ГГТ змінюється раніше решти ферментів у разі розвитку патології печінки. Найбільш високі значення фермент набуває при розвитку синдрому холестазу, коли порушується нормальний пасаж жовчі по жовчних протоках внаслідок перешкод, спричинених конкрементом, запаленням, стриктурою, пухлиною. Гострий вірусний гепатит, токсична, радіаційна поразка печінки (ГГТ дає можливість ранньої діагностики).

Принцип методу: Визначення проводиться біохімічному аналізаторі фірми Human Autohumalyzer - 900 plus. Використовується кінетичний колориметричний метод Persijn & van der Slik. Як субстрат застосовується L-гамма-глутаміл-З-карбокси-4-нітроанілід у присутності ТРІС буфера (рН 8,25).

· Визначення лужної фосфатази (ЛФ)

ЛФ каталізує відщеплення фосфорної кислоти від її органічних сполук; назву отримала у зв'язку з тим, що оптимум рН лужної фосфатази лежить у лужному середовищі (рН 86-101). Швидко зростає активність ферменту при остеогенній саркомі, метастазах раку в кістці, мієломній хворобі, лімфогранулематозі з ураженням кісток. У дітей лужна фосфатаза підвищена до статевого дозрівання. Значне збільшення активності лужної фосфатази спостерігається при холестазі. Лужна фосфатаза на противагу амінотрансфераз залишається нормальною або незначно збільшується при вірусному гепатиті. Різко зростає її активність при отруєннях алкоголем і натомість хронічного алкоголізму. Вона може підвищуватись при лікарських призначеннях, що виявляють гепатотоксичний ефект.

Принцип методу: Лужна фосфатаза (лужна фосфогідроліпаза моноестерів ортофосфорної кислоти) розщеплює в N-метил-D-глюкаміновому буфері 4-нітрофенілфосфат з утворенням 4-нітрофенолу та фосфату. Лужна фосфатаза (ЛФ) активована хлоридом натрію. Мірою каталітичної концентрації ферменту є кількість звільненого 4-нітрофенолу, який визначають фотометрично, або кінетичним методом або методом постійного часу після зупинки ферментативної реакції інгібітором ЛФ, який блокує активний центр ферменту.

Визначення білірубіну.

Білірубін - жовто-червоний пігмент, продукт розпаду гемоглобіну, що відбувається в макрофагах селезінки, печінки та кістковому мозку. Аналіз білірубіну показує, як працює печінка людини, визначення білірубіну входить до комплексу діагностичних процедур при багатьох захворюваннях шлунково-кишкового тракту. У сироватці крові зустрічається білірубін у таких формах: прямий білірубін та непрямий білірубін. Разом ці форми утворюють загальний білірубін крові. Метод визначення білірубіну у сироватці крові: білірубін реагує з діазотованою сульфаніловою кислотою (ДСК). У результаті реакції утворюється продукт, пофарбований у червоний колір. Оптична густина продукту при 546 нм прямо пропорційна концентрації білірубіну в пробі. Глюкоуроніди білірубіну (прямий білірубін), що розчиняються у воді, відразу ж реагують з ДСК, у той час як пов'язаний з альбуміном непрямий білірубін реагує з ДСК тільки в присутності акселератора. Загальний білірубін = Прямий + Непрямий.

2. Метод визначення білірубіну за Йендрашиком

Принцип: При взаємодії сульфанілової кислоти з азотистокислим натрієм утворюється діазофенілсульфонова кислота. Реагуючи зі зв'язаним білірубіном сироватки дає рожево-фіолетове забарвлення. За інтенсивністю його судять про концентрацію білірубіну, що входить у пряму реакцію. При додаванні до сироватки крові кофеїнового реактиву незв'язаний білірубін переходить у розчинний дисоційований стан, завдяки чому він також викликає рожево-фіолетове фарбування розчину з сумішшю діазореактивів. За інтенсивністю останнього фотоколориметрично визначають концентрацію загального білірубіну. По різниці між загальним та пов'язаним білірубіном знаходять вміст незв'язаного білірубіну, що дає непряму реакцію.

· Визначення холестерину

Визначення холестерину крові - обов'язковий етап діагностики захворювань серцево-судинної системи (ішемічна хвороба серця, інфаркт міокарда), атеросклерозу та захворювань печінки.

Зниження холестерину може бути симптомом наступних захворювань: Гіпертиреоз, хронічна серцева недостатність, мегалобластична анемія, гострі інфекційні захворювання, термінальна стадія цирозу печінки, рак печінки, хронічні захворювання легень, туберкульоз легень.

Принцип методу: Визначення проводиться біохімічному аналізаторі фірми Human Autohumalyzer - 900 plus. Холестерин визначається після ферментативного гідролізу та окислення. Перекис водню, що утворюється в результаті цих реакцій, взаємодіє під дією пероксидази з 4-амінофеназолом і фенолом з утворенням забарвленого продукту - хіноніміну. Норма холестерину до 5,2 ммоль/л.

· Холестерин ЛПВЩ

Холестерин ліпопротеїдів високої щільності або б-холестерин - єдина фракція ліпідів, що перешкоджає утворенню атеросклеротичних бляшок у судинах (тому ліпопротеїди високої щільності ще називають хорошим холестериномами та обчислюється за спеціальною формулою).

Антиатерогенна дія ЛПВЩ обумовлена ​​їх здатністю транспортувати холестерин від клітин. Визначення холестерину ліпопротеїдів високої щільності (б-холестерин)

Принцип: Визначення проводиться біохімічному аналізаторі фірми Human Autohumalyzer - 900 plus. Використовується осаджуючий реагент преципітант, під впливом якого ліпопротеїди низької та дуже низької щільності осаджуються фосфовольфрамової кислоти та магнію хлоридом.

ЛПВЩ - У складі ліпопротеїнів Високої Щільності (ЛПЗЩ), холестерин видаляється зі стінок судин та ЛПНЩ. Після ЛПВЩ, утилізуються в печінці. ЛПВЩ виконують захисну функцію та перешкоджають розвитку атеросклерозу.

· Визначення Холестерину Ліпопротеїнів Низької Щільності

ЛПНЩ (холестерин) - У складі ліпопротеїнів Низької Щільності (ЛПНЩ), холестерин довго циркулює в кровотоку, якщо він, в результаті порушень, своєчасно не споживається органами і тканинами, то ЛПНЩ, багаті холестерином, починають відкладатися в стінки судин, приводячи бляшок. Чим більше ЛПНГ у крові, тим швидше розвивається атеросклеротичний процес.

Принцип: При додаванні до зразка реагенту 1 захисний реагент з'єднується з ЛПНГ і захищає їх від реакцій ферментів. CHE (холестеролестераза) та CO (холестеролоксидаза) реагують з іншими фракціями ліпопротеїнів. Перекис водню, утворена в ході реакції ензиму з холестерином проміжної щільності розкладається під дією реагенту 1. При додаванні реагенту 2 захисний реагент вивільнення ЛПНЩ з комплексу і за допомогою азиду натрію активізується каталаза. У процесі другої реакції CHE та CO реагують тільки з ЛПНЩ. Під дією окислювача з HDAOS та 4-AA у присутності пероксидази (POD) перекис водню утворює кольоровий комплекс. Інтенсивність забарвлення блакитного комплексу прямо пропорційна змісту ЛПНЩ у зразку. Аналіз складається з двох етапів: видалення хіломікронів та ЛПНЩ та видалення ХС-ЛПЗЗ за допомогою холестеролестерази та ферментів оксидази.

Для достовірної діагностики порушень обміну холестерину достатньо визначення Загального холестерину (ОХС) та ЛПВЩ (Ліпопротеїнів Високої Щільності). На основі цих даних розраховується Індекс Атерогенності – Основний показник за яким можна достовірно судити про порушення та визначити прогноз.

· Визначення вмісту тригліцеридів (ТГ).

Тригліцериди – показник обміну ліпідів (жирів) в організмі. Основні показання до застосування: діагностика гіпертригліцеридемії, оцінка ризику атеросклеротичного ураження коронарних судин та ішемічної хвороби серця (ІХС), порушення жирового обміну. ТГ є головною формою накопичення жирних кислот в організмі і одним з основних джерел енергії у людини. Тригліцериди є основними жирами, які присутні в жировій тканині. Тригліцериди є альтернативним по відношенню до глюкози джерелом енергії, наприклад, при голодуванні, коли запаси глюкози виснажені.

Принцип: Визначення проводиться біохімічному аналізаторі фірми Human Autohumalyzer - 900 plus. Концентрація тригліцеридів визначається після ферментативного гідролізу під дією ліпази. В результаті реакції утворюється індикатор хінонімін з перекису водню, 4-аміноантипірину та 4-хлорфенолу при каталітичній дії пероксидази.

· Визначення індексу атерогенності.

Індекс атерогенності – є одним із показників порушення обміну холестерину, критерієм розвитку атеросклерозу. Він показує співвідношення «шкідливих» фракцій жирів і тих, які, навпаки, перешкоджають утворенню бляшок на стінках судин, про антиатерогенних фракцій ліпідів.

Розраховується за формулою:

де Хс загальний - загальний холестерин, бXC- холестерин Ліпопротеїнів Високу Щільність.

· Визначення креатиніну.

Вміст креатиніну в крові залежить від обсягу м'язової маси, тому для чоловіків норма креатиніну, як правило, вища, ніж у жінок. Так як обсяг м'язової тканини швидко не змінюється, рівень креатиніну в крові – величина досить постійна. Підвищення креатиніну - симптом гострої та хронічної ниркової недостатності, променевої хвороби, гіпертиреозу. Рівень креатиніну зростає при зневодненні організму після механічних, операційних уражень м'язів.

Концентрацію креатиніну в сироватці крові визначали за кольоровою реакцією Яффе, заснованої на принципі - у лужному середовищі пікринова кислота взаємодіє з креатиніном з утворенням оранжево-червоного забарвлення, яке вимірювають фотометрично на фотоелектроколориметрі ФЕК-2, визначення проводять після депротеї.

Розрахунок концентрації (С) креатину:

С = Е проби /Є калібр * 177 (мкмоль/л),

де З- Концентрація креатиніну, Е проби- оптична щільність проби, Е калібр- Оптична щільність калібрувальної проби.

Визначення сечовини

Підвищення норми говорить про погану видільну роботу нирок і порушення фільтрації. Наростання вмісту сечовини у крові до 16-20 ммоль/л (з розрахунку на азот сечовини) класифікується як порушення функції нирок середньої тяжкості, до 35 ммоль/л - як важке; понад 50 ммоль/л - дуже важке, з несприятливим прогнозом. При гострій нирковій недостатності концентрація сечовини в крові може досягати 50-83 ммоль/л.

Сечовина під дією урази розкладається на вуглекислий газ, аміак, останній у реакції з натрію саліцилатом та натрію гіпохлоритом у присутність натрію нітропрусиду утворює забарвлений продукт, інтенсивність забарвлення якого пропорційна концентрації сечовини у пробі. 1.