Сказ - це вкрай небезпечне вірусне захворювання, що характеризується важким ураженням головного та спинного мозку. Воно часто закінчується летальним кінцем.

Сказ зустрічається у всіх ссавців і передається з біологічними рідинами, в основному зі слиною. Людина, як правило, заражається нею в результаті укусу інфікованої тварини, найчастіше собаки, кішки, кролика, тхора, лисиці, вовка, єнота, кажана та ін.

На початковому етапі захворювання проявляється посиленим слиновиділенням і острахом води, а також пригніченим станом, який змінюється нападами агресії та збудження.

Людям, які входять до групи ризику розвитку сказу, необхідно проходити вакцинацію.

На жаль, поява симптомів захворювання неминуче закінчується летальним кінцем, отже лікування передбачає лише полегшення стану хворого.

Синоніми росіяни

Рабієс, гідрофобія, водобоязнь.

Синоніми англійські

Rabies, Hydrophobia, Canine madness, Lyssa, Madnessan.

Симптоми

Зазвичай сказ не викликає жодних симптомів аж до останньої стадії захворювання, коли лікування вже неможливе. Інкубаційний період (від зараження до появи симптомів) становить від 7 днів до 1 року, середньому 20-90 днів. Ознаки захворювання часто з'являються за кілька днів до смерті хворого:

• перед появою основних симптомів на місці укусу може виникати припухлість, почервоніння, свербіж,
• лихоманка,
• головний біль, нездужання,
• втрата апетиту, нудота, блювання, пронос,
• занепокоєння, порушення сну,
• депресія,
• підвищена чутливість до слухових, зорових подразників,
• пригнічений стан свідомості, тривожність, апатія змінюються нападами збудження, занепокоєння, агресії. Приступи збудження при цьому супроводжуються почастішанням дихання та серцебиття,
• розлади дихання та ковтання,
• гідрофобія - страх води (при розмові про неї або при спробі попити хворий відчуває жах, у нього виникають хворобливі спазми глотки і гортані),
• надмірне слиновиділення,
• галюцинації,
• судоми,
• частковий параліч.

Загальна інформація про захворювання

Сказ – це небезпечне вірусне захворювання, яке характеризується важким ураженням центральної нервової системи (головного та спинного мозку). На початковому етапі воно протікає безсимптомно, симптоми з'являються на пізній стадії, коли лікування вже неможливе.

Поширеність сказу залежить від ступеня вакцинованості свійських тварин. Найбільш поширене воно у сільській місцевості і частіше виникає у літній період.

Сказ може вражати всіх ссавців і передається з біологічними рідинами, переважно зі слиною. У людини зараження сказом, як правило, відбувається в результаті укусу зараженим тваринам, попадання слини зараженої тварини на пошкоджену шкіру, слизову оболонку рота, носа, очей. Значно рідше сказ передається при вживанні інфікованого м'яса. Від людини до людини захворювання не переходить, дуже рідко може траплятися зараження через пересадку органів від інфікованих донорів.

Найчастіше людина заражається від свійських тварин - від собак, кішок, кроликів, коней, тхорів, рідше - від диких - лисиць, єнотовидних собак, вовків, єнотів, кажанів та ін. Дикі тварини, у свою чергу, заражають сказом домашніх.

Після того як вірус потрапляє в організм через шкіру або слизову оболонку, він по нервових волокнах досягає спинного та головного мозку, де фіксується та починає ділитися. Виникає енцефаліт – запалення мозку. Це призводить до підвищення рефлекторної збудливості та розвитку паралічів. Потім вірус поширюється нервовими волокнами у зворотному напрямку, потрапляючи в печінку, нирки, надниркові залози, шкіру, серце, слинні залози, скелет, викликаючи порушення діяльності нервової системи та порушення функцій різних органів.

Швидкість поширення вірусу залежить від розташування укусу (при укусах голови, рук вона буде високою), його глибини, кількості збудників, що потрапили в рану, від активності мікроорганізмів, від імунного статусу інфікованої людини.

Інкубаційний період захворювання в середньому становить 20-90 днів, проте може змінюватись від тижня до одного року. З появою симптомів летальний кінець, зазвичай, неминучий.

Смерть зазвичай настає внаслідок ураження дихального центру, що спричиняє зупинку дихання.

Хто у групі ризику?

• Які зазнали укусів домашніх чи диких тварин.
• Жителі сільської місцевості, що тримають будинки тварин, не вакцинованих від сказу.
• Мандрівні країнами, що розвиваються (по Африці, Південно-Східній Азії).
• Виїжджають на природу і контактують з дикими тваринами (лисицями, єнотами, кажанами та ін.)
• Мисливці, звіролови.
• Службовці зоопарків, розплідників, притулків для тварин.
• Ветеринари.
• Які працюють з вірусом сказу в лабораторії.

Діагностика

Діагноз "сказ" передбачається за наявності симптомів захворювання після укусу тварини і підтверджується дослідженням зразка шкіри із потилиці, виділенням вірусу зі слини, слізної та спинномозкової рідини.

Лабораторні дослідження

• Загальний аналіз крові (без лейкоцитарної формули та ШОЕ). Рівень лейкоцитів може бути підвищений.
• Загальний аналіз сечі . При сказі може спостерігатися значне збільшення числа лейкоцитів у сечі за відсутності бактеріального запалення.
• Дослідження крові, спрямоване визначення антитіл до збудника сказу. У ході аналізу за допомогою спеціального імунофлюоресцентного фарбування виявляється наявність у крові молекул, що виробляються імунною системою у відповідь на потрапляння в організм вірусу сказу. Діагноз підтверджується при значному (4 та більше разів) підвищенні кількості (титру) антитіл до вірусу сказу у хворих, які не піддавалися вакцинації.

• Визначення збудника сказу в біологічних рідинах та тканинах організму.
  • Дослідження біоптатів (фрагментів тканин) шкіри потилиці, відбитків рогівки. В отриманий матеріал додаються мічені антитіла (молекули, що специфічно зв'язуються з молекулою вірусу сказу). Під впливом ультрафіолетового випромінювання комплекс з вірусів, "склеєних" з антитілами, дає характерне зелене свічення, що говорить про присутність вірусу сказу у взятому матеріалі. Цей аналіз є найбільш достовірним протягом першого тижня захворювання.
  • Дослідження генетичного матеріалу вірусу методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Може використовуватися слина, кров, спинномозкова рідина, також уражені тканини. Достовірність результатів наближається до 100%.
  • Дослідження тканин мозку під час електронної мікроскопії. Проводиться взяття ділянки тканини мозку (біопсія), яка потім піддається спеціальному фарбуванню та вивчається під електронним мікроскопом, який дозволяє досягти дуже високого ступеня збільшення. При цьому в уражених вірусом сказу клітинах нервової тканини виділяються спеціальні включення або виявляється сам вірус.

Інші методи дослідження

• Електроенцефалографія (ЕЕГ) – це метод, який оцінює електричні потенціали головного мозку.

Лікування

Специфічного лікування сказу немає. Як правило, захворювання невиліковне і призводить до летального результату.

При укусі дикої тварини проводиться промивання, ретельний огляд предметів сторонніх тіл (наприклад, зламаних зубів) та хірургічна обробка рани. Потім терміново вводять імуноглобуліни – спеціальні клітини імунної системи. Далі протягом двох тижнів проводиться вакцинація пацієнта (загалом застосовується 5 вакцин). Тільки цей спосіб дозволяє запобігти захворюванню.

Після укусу за твариною необхідно спостерігати протягом приблизно 10 днів і при появі симптомів сказу терміново звернутися до лікаря для вжиття заходів щодо імунізації пацієнта. Джерело сказу – хвора тварина – необхідно ізолювати.

Лікування сказу спрямовано полегшення його симптомів – зняття судом, зменшення болю. Для цього застосовуються, відповідно, протисудомні, знеболювальні, заспокійливі лікарські препарати.

Для зменшення контакту з потенційними подразниками хворий поміщається до спеціальної палати.

Заповнюються втрати рідини, мінеральних речовин; проводиться штучна вентиляція легень.

Профілактика

• Людям, які входять до групи ризику розвитку сказу, слід обов'язково пройти вакцинацію.
• Після укусу дикої тварини необхідно ретельно промити рану водою з милом і терміново звернутися до лікаря, щоб пройти курс імунізації та вакцинації проти сказу.
• Профілактична вакцинація свійських тварин.
• Домашніх тварин слід тримати вдома та контролювати їх під час перебування на вулиці. Для цього можуть застосовуватися клітини та закриті загони. Це допоможе уникнути зараження свійських тварин від диких. Слід приділити особливу увагу кроликам, морським свинкам, хом'якам та іншим дрібним вихованцям, оскільки вони не можуть бути вакциновані проти сказу. Нерідко домашня тварина заражається за містом, де має можливість контактувати з дикими, наприклад коти, собаки можуть тікати в ліс і контактувати там з інфікованими гризунами, лисицями.
• Слід дотримуватись правил спілкування при зустрічі з бродячими тваринами – не чіпати їх, не гладити, щоб уникнути укусу.
• Необхідно уникати контакту з дикими тваринами (наприклад, лисицями, єнотами). Здорові дикі тварини самі уникають людей, тому звір, який не боїться людей і не намагається втекти, має викликати підозру.
• Приводом для звернення до лікаря може стати і укус домашньої тварини, наприклад, якщо ви не знаєте, чи може бути вона заражена сказом, і тим більше якщо тварина протягом декількох днів після укусу загинула.

• Загальний аналіз крові
• Загальний аналіз сечі

Література

• Dan L. Longo, Dennis L. Kasper, J. Larry Jameson, Anthony S. Fauci, Harrison's principles of internal medicine (18th ed.).
• Manning SE, Rupprecht CE, Fishbein D, et al. Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of Advisory Committee on Immunization Practices. MMWR Recomm Rep. May 23 2008;57:1-28.
• Hemachudha T. Human rabies: клінічні аспекти, pathogenesis, і потенційна терапія. Curr Top Microbiol Immunol. 1994; 187: 121-43.
• Gerald L. Mandell. Mandell, Douglas, і Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases: Експерт Consult Premium Edition. Churchill Livingstone, 2009.

Аналіз на сказ у собак має на увазі проведення спеціальних експрес-тестів на наявність у крові специфічних антирабічних антитіл. Іноді його застосовують у комплексній діагностиці при підозрі на зараження домашніх вихованців вірусом сказу. Дане захворювання становить загрозу для життя тварин, людини, тому заводчики собак повинні мати поняття про те, як проявляється ця недуга. Якщо є підозра на зараження, якщо вихованець мав контакт із можливим бактеріоносієм, потрібно відразу відвезти вихованця до ветлікарні, для проведення лабораторної діагностики, без якої неможливо встановити точний діагноз.

(rabies) – гостропротекає захворювання теплокровних тварин інфекційної етіології, що викликається вірусом, який вражає ЦНС, провокуючи серйозні порушення в організмі. На жаль, ефективного лікування на даний момент не розроблено, тому інфекція завжди закінчується летальним кінцем.

Збудник інфекційної недуги – РНК-вірус (рабдовірус). Вражає свійських та диких тварин. Існує так званий «природний» вірус та «лабораторний».

ВАЖЛИВО! Сказ відносяться до зооантропозоонозних ХВОРОБ, ТО Є ІНФЕКЦІЯ ПЕРЕДАЄТЬСЯ ЛЮДИНІ. СПАЛАХ ІНФЕКЦІЇ ВІДЗНАЧАЮТЬ СКРІЗІ. ХВОРОБА МАЄ ПРИРОДНО-ВОСЕРЕДНИЙ ХАРАКТЕР.

Природним резервуаром рабдовірусу є інфіковані м'ясоїдні хижаки.Смертельно небезпечний вірус міститься у слині інфікованих особин. Інфікування відбувається контактним шляхом, при укусах, проникненні слини в садна, ранки на дермі.

Проникнувши в організм, вірус нервовими шляхами миттєво переміщається в головний, спинний мозок, слинні залози, де надалі він розмножується.

У слині інфікованих тварин рабдовірус утворюється приблизно за три-сім днів до моменту прояву перших симптомів. При цьому інфікована особина є вірусуносієм, представляючи реальну загрозу для людини, інших домашніх тварин. Тому зараження на сказ може статися навіть у тому випадку, якщо вас чи вашого вихованця вкусила зовні здорова тварина.

Форми, стадії сказу

Інкубаційний період триває від 2-7 доби до декількох тижнів. Інтенсивність прояву симптоматики залежить від віку, резистентності, імунного захисту, вірулентності, концентрації рабдовірусу в організмі. Смертельно небезпечна недуга у тварин протікає у тихій, буйній, рідше в атиповій формах.

У собак відзначають переважно буйну форму інфекції, тривалість якої становить від шести до десяти діб. Має три стадії прояви:

• Продромальну.Термін протікання меланхолійної стадії – не більше двох діб. На цьому етапі розвитку інфекції відзначають зміну поведінкових манер собаки. Тварини сильно пригнічені, виглядають пригніченими, ховаються у темних затишних місцях, неохоче йдуть на контакт, неадекватно реагують на подразники.
• Маніакальну(Стадія збудження). Тривалість перебігу не більше трьох-чотирьох діб. Хворі тварини виявляють безпричинну агресію до своїх побратимів, інших домашніх вихованців, людини, включаючи господаря. Агресія змінюється лагідною поведінкою. Вихованець вимагає уваги, лиже руки, обличчя людини. Хворі вихованці поїдають неїстівні предмети. Нерідко собаки тікають із дому і можуть пробігти невтомно 20-30 км.
• Паралітичну(Депресивну). Для даної стадії, тривалість якої не більше шести діб, характерні важкі збої у функціонуванні ЦНС. Зазначають параліч глотки, гортані, м'язові судоми, спазми. Нижня щелепа відвисає. Відсутня ковтальний рефлекс. З пащі постійно тече слина. Гучні звуки, шум води викликає найсильнішу паніку. Координацію руху порушено. Вихованець впадає в кому, гине від виснаження, порушення дихальної, серцевої функції.

Варто відзначити, що скажений собака, незалежно від форми та стадії захворювання кусає людину, тварин не попереджаючи про напад гавканням.

Тиха, атипова форми

Для тихої форми хвороби характерно відсутність стадії збудження. Тривалість – від двох до п'яти діб. Характеризується загальним пригніченням, меланхолічністю, відсутністю реакцію зовнішні подразники. Тварини гинуть через параліч м'язових структур тіла, глотки. Хвороба завжди закінчується летальним кінцем.

Рідше у собак відзначають атипову форму хвороби, яка проявляється нетиповими, нехарактерними для інфекції проявами. Протікає гостро, підгостро, рідше хронічно (два-три місяці). У тварин відзначають зміну поведінки, збої у роботі ЦНС, ШКТ.

Помітивши нехарактерну поведінку свого домашнього улюбленця, зміну звичок, прояв агресії, а також якщо собака мала контакт або була укушена бездомними, дикими тваринами, обов'язково потрібно відвезти вихованця до ветлікарні, перевірити собаку на сказ. Не слід забувати, що симптоматика наростає спонтанно у певній послідовності.

Діагностичні методики

При постановці попереднього діагнозу мають бути враховані дані анамнезу, паталагоанатомічні результати, епізоотологічна ситуація, симптоми. Проводиться серія лабораторних, гістологічних, мікроскопічних, бактреріологічних досліджень, експрес-тести.

З огляду на схожість симптоматики з іншими інфекціями проводиться диференціальна діагностика (ІФА, ПЛР). Необхідно виключити хворобу Ауески, чуму м'ясоїдних, енцефаломієліт.

Важливо! Якщо є підозра на інфекцію, тварина покусала людину, собаку поміщають у спеціальні ізольовані бокси і протягом десяти днів, доки не будуть готові результати аналізів, спостерігають за її станом. Якщо діагноз підтвердився, на жаль, проводиться евтаназія. Тварин присипляють, оскільки лікування цієї інфекції немає.

Точний діагноз вдається встановити лише після смерті тварин. Отриманий патматеріал досліджують різними методами.

Основні діагностичні дослідження

Найбільш достовірний метод, який завжди підтверджує хворобу – мікроскопічні дослідження біоматеріалу на наявність специфічних включень у мозку – тілець Бабеша-Негрі. Розташовані в рогах амонових.

Для виявлення специфічного антигену у мозку застосовують реакцію дифузної преципітації; імунофлуоресцентний аналіз відбитка рогівки.

Імунофлуоресцентний метод дозволяє максимально швидко діагностувати наявність вірусу в організмі собак. Метод визначає вірусний антиген у 93-97% випадках.

Аналіз крові на антитіла

Враховуючи те, що вірус переміщається нервовими стовбурами, його вкрай рідко вдається визначити в кровоносному руслі. Як правило, при підозрі на зараження для аналізів досліджують спинномозкову рідину.

Серологічні дослідження полягають у проведенні загального, біохімічного аналізу крові. Відзначають зміну лейкоцитарної формули (лейкоцитоз), олігурію, альбумінурію, глюкозурію, збільшення концентрації моноцитів.

Протестувати свого вихованця на сказ, визначити напруженість поствакцинального імунітету дозволить тест на наявність специфічних антирабічних антитіл у крові. Проводиться ця процедура лише в акредитованих лабораторіях, деяких ветклініках. Вартість даного аналізу досить висока. Результати після проведення процедури будуть готові за 10-20 діб.

Сьогодні проводиться два види тестів на антирабічні антитіла – RFFIT (тест швидкого гальмування фокусу флюоресценції) та FAVN – тест флуоресцентних віруснейтралізуючих антитіл, який визначає титр антитіл у МО/мл. Дані методики виконують на живих культурах клітинних структур з додаванням реакцію збудника інфекції. У собак береться 0.5-1 мл сироватки крові.

Тест проводять переважно в тому випадку, якщо ви хочете вивезти свого вихованця закордон. Багато країн ЄС забороняють ввозити на свою територію тварин, які не щеплені від сказу, а також собак, котів, які не мають результатів щодо даного аналізу.

Здавати тест на антитіла потрібно тоді, коли у крові собаки виробляться антитіла до цієї інфекції. Специфічний імунітет після імунізації формується через місяць після щеплення. З цього моменту можна везти вихованця до лабораторії для проходження тесту на антитіла до сказу. При цьому після імунізації, якщо виникає потреба у проведенні тесту, від дати щеплення не повинно пройти більше року. Тест потрібно здати пізніше місяця до терміну проведення ревакцинації.

Якщо титр антирабічних антитіл становить менше 0,50 МО/мл – собаку ревакцинують. За місяць здається повторний аналіз. Продукування захисних антитіл після імунізації впливають деякі чинники: порода, вік, індивідуальні особливості організму, кратність антирабічної імунізації. Ветлікарі рекомендують проводити моніторинг титру антитіл у собак, котів після вакцинації, навіть якщо не планується виїзд за кордон.

Багато власників вивозять своїх вихованців на дачу, на природу, у ліс, на полювання. Не слід забувати, що собаку можуть покусати дикі звірі, які можуть бути інфіковані або є вірусоносіями.

Єдиний спосіб захистити собаку від смертельно небезпечної інфекції – вчасно проведена вакцинація.

Надалі, залежно від вибраного препарату, щорічно проводиться ревакцинація. Деякі вакцини формують імунний захист терміном три роки. Оптимальну схему вакцинацій, ревакцинацій підбере ветлікар.

304.00 ₽

Розповсюджуємо нормативну документацію з 1999 року. Пробиваємо чеки, сплачуємо податки, приймаємо до оплати всі законні форми платежів без додаткових процентів. Наші клієнти захищені Законом. ТОВ "ЦНТІ Нормоконтроль".

Наші ціни є нижчими, ніж в інших місцях, тому що ми працюємо безпосередньо з постачальниками документів.

способи доставки

• Термінова кур'єрська доставка (1-3 дні)
• Кур'єрська доставка (7 днів)
• Самовивіз із московського офісу
• Пошта РФ

Поширюється на всі види ссавців і встановлює наступні методи лабораторної діагностики сказу: - метод флуоресціюючих антитіл (МФА); - метод виділення вірусу сказу у культурі клітин мишачої нейробластоми CCL-131 (або невриноми Гассерова вузла щура – ​​НГУК-1); - біопроба на білих мишах; - метод імуноферментного аналізу (ІФА); - Реакція дифузійної преципітації (РДП).

3 Терміни, визначення та скорочення

4 Умови виконання досліджень та вимоги безпеки

5 Засоби вимірювань, обладнання, матеріали, реактиви та тварини

6 Відбір проб

7 Метод флуоресціюючих антитіл (МФА)

8 Метод виділення вірусу сказу в культурі клітин мишачої нейроблатоми CCL-131 (або невриноми Гассерова вузла щура - НГУК-1)

9 Біопроба на білих мишах

10 Метод імуноферментного аналізу (ІФА)

11 Реакція дифузійної преципітації (РДП)

Цей ГОСТ знаходиться в:

Організації:

Animals. Methods of laboratory diagnostic of rabies

нормативні посилання

• ГОСТ 12.0.004-90 Система стандартів безпеки праці. Організація навчання безпеки праці. Загальні положення . Замінено на ГОСТ 12.0.004-2015.
• ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартів безпеки праці. Загальні санітарно-гігієнічні вимоги до повітря робочої зони
• ГОСТ 12.1.008-76 Система стандартів безпеки праці. Біологічна безпека. Загальні вимоги
• ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартів безпеки праці. Засоби захисту працюючих. Загальні вимоги та класифікація
• ГОСТ 17.0.0.01-76 Система стандартів у галузі охорони природи та покращення використання природних ресурсів. Основні положення
• ГОСТ 6709-72 Вода дистильована. Технічні умови
• ГОСТ 12026-76 Папір фільтрувальний лабораторний. Технічні умови
• ГОСТ 13739-78 Олія імерсійна для мікроскопії. Технічні вимоги. Методи випробувань
• ГОСТ 16317-87 Холодильні прилади електричні побутові. Загальні технічні умови
• ГОСТ 177-88 Водню перекис. Технічні умови
• ГОСТ 21241-89 Медичні пінцети. Загальні технічні вимоги та методи випробувань
• ГОСТ 22967-90 Шприци медичні ін'єкційні багаторазового застосування. Загальні технічні вимоги та методи випробувань
• ГОСТ 24861-91 Шприци ін'єкційні одноразового застосування.
• ГОСТ 25046-81 Голки ін'єкційні одноразового застосування. Основні розміри. Технічні вимоги. Методи випробувань
• ГОСТ 25336-82 Посуд та обладнання лабораторні скляні. Типи, основні параметри та розміри
• ГОСТ 2603-79 Реактиви. Ацетон. Технічні умови
• ГОСТ 2768-84 Ацетон технічний. Технічні умови
• ГОСТ 29230-91 Посуд лабораторний скляний. Піпетки градуйовані. Частина 4. Піпетки видувні
• ГОСТ 4204-77 Реактиви. Кислота сірчана. Технічні умови
• ГОСТ 8074-82 Мікроскопи інструментальні. Типи, основні параметри та розміри. Технічні вимоги
• ГОСТ 9147-80 Посуд та обладнання лабораторні фарфорові. Технічні умови
• ГОСТ 9284-75 Скло предметне для мікропрепаратів. Технічні умови
• ГОСТ ІСО/МЕК 17025-2009 Загальні вимоги до компетентності випробувальних та калібрувальних лабораторій
• ГОСТ ISO 7218-2011 Мікробіологія харчових продуктів та кормів для тварин. Загальні вимоги та рекомендації щодо мікробіологічних досліджень. Замінено на ГОСТ ISO 7218-2015.

стор 1

стор 2

стор 3

стор 4

стор 5

стор 6

стор 7

стор 8

стор 9

стор. 10

стор. 11

стор. 12

ТЕРТР 81-07-14-2001

ТЕРТР-2001

ЯМАЛО-НЕНЕЦЬКИЙ АВТОНОМНИЙ ОКРУГ

Частина 14

КАНАЛІЗАЦІЙНІ КОЛЕКТОРИ

ВИДАННЯ ОФІЦІЙНЕ

Салехард 2011

ТЕРИТОРІАЛЬНІ ЄДИНІ РОЗЦЕНКИ НА РОБОТИ З ТЕХНІЧНОГО ОБСЛУГОВУВАННЯ ТА РЕМОНТУ УСТАТКУВАННЯ МІСЬКОГО ГОСПОДАРСТВА

ТЕРтр 81-07-14-2001 ЯМАЛО-НЕНЕЦЬКИЙ АВТОНОМНИЙ ОКРУГ Частина 14

КАНАЛІЗАЦІЙНІ КОЛЕКТОРИ

Видання офіційне

Салехард 2011

ББК 65.31 УДК 338.5:69 (083)

Територіальні кошторисні нормативи.

Територіальні одиничні розцінки на роботи з технічного обслуговування та ремонту обладнання міського господарства. Ямало-Ненецький автономний округ.

ТЕРТР 81-07-14-2001 Частина 14. Каналізаційні колектори

Салехард, 2011 - 9 стор.

Територіальні одиничні розцінки на роботи з технічного обслуговування та ремонту обладнання міського господарства (далі - ТЕРтр) призначені для визначення витрат при виконанні на роботи з технічного обслуговування та ремонту обладнання міського господарства та складання на їх основі кошторисних розрахунків (кошторисів) на виконання зазначених робіт.

РОЗРОБЛЕНІ Сибірським центром ціноутворення у будівництві, промисловості та

енергетиці (ЗАТ)

ЗАТВЕРДЖЕНО І ВВЕДЕНО В ДІЮ Постановою Уряду Ямало-Ненецького автономного округу від 13.10.2011 № 755-п.

ПРО ЯНАО 2011р.

Ці територіальні кошторисні нормативи не можуть бути повністю або частково відтворені, тиражовані та поширені як офіційне видання без дозволу Департаменту будівництва та житлової політики Ямало-Ненецького автономного округу.

ТЕРИТОРІАЛЬНІ ЄДИНИЧНІ РОЗЦЕНКИ НА РОБОТИ З ТЕХНІЧНОГО ОБСЛУГОВУВАННЯ І РЕМОНТУ УСТАТКУВАННЯ МІСЬКОГО ГОСПОДАРСТВА ЯМАЛО-НЕНЕЦЬКИЙ АВТОНОМНИЙ ОКРУГ

ТЕРТР-14-2001

Частина 14. Каналізаційні колектори

РОЗДІЛ 1. СНІГОСПЛАВНІ СПОРУДИ

КОШТОВНІ РОЗЦЕНКИ НА ЕКСПЛУАТАЦІЮ БУДІВЕЛЬНИХ МАШИН, КОШТОВНІ ЦІНИ НА МАТЕРІАЛИ, ВИРОБИ, КОНСТРУКЦІЇ ТА ГОДИННИКА ОПЛАТА ПРАЦІ РОБОЧИХ-БУДІВЕЛЬНИКІВ

ДО БЛ ЗИСНИХЦІНАХ З СТАНУ НА 01.01.2000 р.

Додаток 2.

Кошторисні розцінки на експлуатацію будівельних машин

ТЕРТР-2001. Ямало-Ненецький автономний округ. Частина 14. Каналізаційні колектори

ЧАСТИНА 14. КАНАЛІЗАЦІЙНІ КОЛЕКТОРИ............................................. ......................3

РОЗДІЛ 1. СНІГОСПЛАВНІ СПОРУДИ.............................................. .................................................. .........3

Таблиця ТЕРтр 14-01-001 Очищення від сміття камер відстоювання снігосплавних пунктів. ....................3

Таблиця ТЕРтр 14-01-002 Очищення від сміття снігосплавних пунктів із майданчиком відстоювання................................... ..........3

Таблиця ТЕРтр 14-01-003 Консервація на літній період споруд снігосплавних камер і пісколок................4

Кошторисні розцінки на експлуатацію будівельних машин, кошторисні ціни на матеріали, вироби, конструкції та годинна

ОПЛАТА ПРАЦІ Р А КОЧИХ-З ТРІЙТЕ Л ЕЙ........................................ .......................................5

Додаток 1. РОЗМІР ГОДИННИКОЇ ОПЛАТИ ПРАЦІ РОБОЧИХ-БУДІВЕЛЬНИКІВ........................................ ...5

Додаток 2. Кошторисні розцінки на ЕКСПЛУАТАЦІЮ БУДІВЕЛЬНИХ МАШИН.....................6

Додаток 3. КОРИСТУВАЛЬНІ ЦІНИ НА МАТЕРІАЛЬНІ РЕСУРСИ .......................................... ........................8

МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ
ПО ЛАБОРАТОРНІЙ ДІАГНОСТИЦІ Скази

1. Діагноз на сказ ставлять на підставі комплексу епізоотологічних, клінічних, патологоанатомічних даних та головним чином – на підставі лабораторних досліджень.

2. Для дослідження направляють до лабораторії з навмисним: свіжий труп або голову від собаки (кішки, лисиці, песця, вівці, теляти та ін.), від великих тварин - голову або головний мозок (свіжий або консервований у 30 - 50%-ному розчині гліцерину). Для серологічних досліджень придатний лише неконсервований мозок.

3. Лабораторна діагностика сказу полягає в мікроскопічному дослідженні головного мозку (з метою виявлення тілець Бабеша-Негрі), серологічному (виявлення специфічного рабічного антигену), а також постановці біологічної проби на білих мишах або кроликах.

Порядок досліджень.

4. З головного мозку, що надійшов для дослідження, роблять спочатку засів на живильні середовища. Частину мозку відразу ж поміщають у холодильник і зберігають у разі необхідності повторного дослідження. З частини мозку беруть матеріал для мікроскопічного дослідження, серологічних реакцій і біологічної проби.

Примітка. Розтин трупа, вилучення мозку та інші роботи проводять у стерильних умовах за суворого дотримання заходів особистої профілактики (міцна фіксація голови тварини, захист рук двома парами рукавичок: хірургічними та анатомічними; для захисту очей надягають окуляри, а ніс і рот закривають марлевою пов'язкою).

I. МІКРОСКОПІЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ

5. Для мікроскопічного дослідження роблять відбитки та мазки з різних ділянок головного мозку.

6. Для приготування відбитка шматочки головного мозку (аммонів ріг, кора півкуль, мозок, довгастий мозок) кладуть на фільтрувальний папір, складений у 4 - 6 шарів. До поверхні зрізу кілька разів (3 - 4) поспіль торкаються чистого предметного скла, злегка натискаючи, щоб на склі вийшов тонкий відбиток.

7. Мазки роблять із тих же ділянок головного мозку. Для цього шматочки мозку розтирають у фарфоровій ступці маточкою або в пробірці скляною паличкою до утворення гомогенної маси, з якої роблять грубі мазки на знежиреному предметному склі.

Можна робити мазки та іншим способом. Для цього невеликий шматочок мозку кладуть на край предметного скла, а іншим склом роздавлюють його і розмазують від краю до іншого, в результаті чого на поверхні скла виходить тонкий рівномірний мазок.

8. Отримані мазки або відбитки фарбують одним із наступних способів:

а) забарвлення за Муромцевим. Виготовлені, ще вологі мазки або відбитки відразу ж фіксують в етиловому або метиловому спирті або суміші спирту навпіл з ефіром або ацетоном (хімічно чистим) протягом 1 - 2 год і після цього промивають водою. Посудина з фіксатором повинна бути добре закрита, щоб попередити випаровування фіксуючої рідини. Після промивання водою вологі мазки поміщають на 5 - 10 хв розчин фарби Мансона, розведеної водою 1:40. Потім фарбу зливають і відразу мазки занурюють в 10%-ний водний розчин таніну на 8 - 10 хв до появи блакитного забарвлення. Після цього мазки промивають водою, висушують фільтрувальним папером, проводять через суміш з рівних частин спирту з ацетоном (хімічно чистим) або спирту з ксилолом і знову висушують фільтрувальним папером. Забарвлений мазок повинен мати світло-блакитний фон, при цьому ядра нервових клітин забарвлюються у синій колір, а тільця Бабеша-Негрі – у блідо-фіолетовий з темними включеннями;

б) забарвлення за Селлерсом. На приготовлений вологий відбиток або мазок наносять на 4 - суміш реактиву «А» (метиленовий синій - 2 г, метиловий спирт без ацетону - 100 мл) і реактиву «Б» (основний фуксин - 0,5 г, етиловий спирт без слідів ацетону - 100мл). Робочий розчин барвника складається з 15 мл реактиву А, 2 - 4 мл реактиву Б і 25 мл метилового спирту. Після фарбування препарат промивають проточною водою та висушують. У пофарбованому мазку цитоплазма нейронів яскраво-синя, ядерця темно-сині, еритроцити цегляно-червоні, тільця Бабеша-Негрі пурпурно-червоні з чітко видною базофільною структурою тілець;

в) забарвлення по Міхіну. Мазки або відбитки фіксують у суміші спирту та ефіру (порівну) протягом 5 - 10 хв, після чого їх просушують фільтрувальним папером і забарвлюють протягом 30 - 40 хв фарбою Гімза (1 - 2 краплі на 1 мл дистильованої води), швидко промивають підкисленим спиртом (1 крапля крижаної оцтової кислоти на 30 мл 96°-ного спирту), а потім водою, просушують фільтрувальним папером і піддають дослідженню. Якщо матеріал був у гліцерині, його попередньо добре прополіскують у воді і просушують фільтрувальним папером.

У забарвленому препараті при мікроскопічному дослідженні основне тло має бути червоним з фіолетовим відтінком. При переважанні синього тону мазок знову обмивають підкисленим спиртом та промивають водою. Пірамідальні нервові клітини мають синюватий колір з інтенсивно чорним ядром, а тільця Бабеша-Негрі – рожево-червоний із точковими включеннями темно-синього кольору;

г) забарвлення за Борманом-Гайнулліною. Тонкі мазки або відбитки протягом 5 хв фіксують у суміші наступного складу: спирту та ефіру (порівну) - 98 мл, крижаної оцтової кислоти - 2 мл; після фіксації їх занурюють на 5 хв в 10% розчин кристалічної соди, а потім промивають водою і просушують на повітрі. Зафіксовані мазки протягом 2 хв забарвлюють фарбою, приготованою перед її вживанням (насиченого водного розчину метиленової сині – 3 краплі, насиченого основного розчину фуксину – 2 краплі, водопровідної води – 20 мл). Розчин фарби наливають на мазок, фіксують над полум'ям пальника, потім залишають фарбу ще на одну хвилину, після чого промивають водою і просушують фільтрувальним папером. У пофарбованому мазку основне тло має бути яскраво-червоним, протоплазма нервових клітин забарвлюється в червонувато-синій колір, які ядра - в темно-синій, тільця Бабеша-Негри забарвлюються в сунично-червоний колір із типово гранулярної структурою. Еритроцити мають вигляд незабарвлених кружальців.

ІІ. СЕРОЛОГІЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ

9. Реакція дифузної преципітації в агаровому гелі. Реакція застосовується для виявлення специфічного рабічного антигену в неконсервованому головному мозку тварин, що загинули від вуличного сказу, а також у тварин, на яких ставилася біопроба. Для реакції можна використовувати несвіжий (до 1 місяця) головний мозок.

Реакцію виконують на предметних знежирених стеклах, на які наносять 2,5 мл розплавленого та охолодженого до 60 °С агарового гелю, приготованого за прописом: сухий агар-агар - 12 - 15 г; хімічно чистий хлористий натрій – 8,6 г; 1% розчин (фільтрований) метилоранжу на 50°-ному спирті - 5 - 10 мл; мертіолят – 0,01 г; вода дистильована – 1 л.

Примітка. Для постановки реакції краще використовувати агар-агар компанії «Діфко», він повністю розчиняється, фільтрування середовища не потрібно. Інші сорти агар-агару потребують ретельної фільтрації.

Після застигання агару в ньому роблять лунки за допомогою тонкостінної металевої або скляної трубочки з внутрішнім діаметром 4 - 5 мм, розташовуючи їх згідно з трафаретом (див. рис. - ).

Для реакції у великих тварин використовують шматочки головного мозку - амонів ріг, кору півкуль, мозок, довгастий мозок; у щурів, ховрахів, морських свинок, хом'яків та ін. - три будь-які відділи мозку; у мишей – весь головний мозок.

Схема постановки мікропреципітації:
А - кора (ліва півкуля); У- кора (права півкуля); З- Амонів ріг (лівий);
Д- амонів ріг (правий); Е- мозок; Ж- продовгуватий мозок;
1 , 2 , 3 , 4 - розведень глобуліну відповідно 1:2, 1:4, 1:8, 1:16.

Позитивна РП з усіма розведеннями глобуліну
(кора головного мозку вівці, вуличне сказ)

Позитивна РП із розведеннями глобуліну 1:4; 1:8, 1:16
(Аммонів ріг собаки, вуличне сказ)

Позитивна РП з розведеннями глобуліну 1:16,
відсутні лінії преципітації з розведеннями 1:2, 1:4,
(довгастий мозок собаки, вуличне сказ)

Мозок розтирають у фарфоровій ступці маточкою або в самій черепній коробці в «пасту», якою заповнюють ямочки для антигену. Інші луночки заповнюють преципітуючим антирабічним глобуліном у розведенні 1:2, 1:4, 1:8, 1:16. Об'єм інгредієнтів становить 0,02 мл.

Контролі з позитивними та негативними антигенами ставлять одночасно на окремому склі з використанням того ж агару за тим самим трафаретом.

Після того, як інгредієнти реакції поміщені у відповідні ямочки, предметні скла переносять у вологу камеру (чашки Петрі з вологим фільтрувальним папером або ватою) і ставлять у термостат на 6 год при температурі 37 - 38 °С. Потім чашки залишають за кімнатної температури ще на 18 год.

Облік реакції проводять через 3, 6 та 24 год після її постановки. Щоб уникнути висихання агару скла з реакцією після кожного перегляду поміщають у ті самі чашки Петрі, що містять зволожену вату.

При позитивній реакції преципітації в агарі між лунками з глобуліном і антигеном можуть утворюватися одна, дві та дуже рідко три паралельно розташовані лінії преципітації. Лінії преципітації, що утворилися, видимі візуально при просвічуванні скла освітлювачем знизу вгору під кутом приблизно 45°.

За негативних показань реакції преципітації ставлять біопробу.

10. Реакція імунофлуоресценції. Заснована на виявленні спеціальними мікроскопами (МЛ-1, МЛ-2, МЛ-3 та ін) вірусного антигену, що вступив у реакцію зі специфічною антирабічною сироваткою, міченою флуоресцентним барвником.

Для реакції роблять тонкі та рівношарові відбитки на ретельно знежиреному склі зі свіжого або свіжомороженого головного мозку. Відбитки готують зі шматочків головного мозку (аммонів ріг, кора півкуль, мозочок, довгастий мозок) так само, як і для мікроскопічного дослідження. Від кожного шматочка мозку готують щонайменше 4 препаратів. Для контролю аналогічно роблять препарати з мозку здорової тварини.

Після висушування на повітрі препарати фіксують в ацетоні протягом 4 год. при температурі не вище 4 °С. Посудина з фіксатором повинна бути добре закрита, щоб попередити випаровування фіксуючої рідини. Після фіксації ацетоном наносять на препарати кілька крапель кон'югату (флуоресціюючий антирабічний гамма-глобулін) у робочому розведенні. Потім їх поміщають у вологу камеру (кухоль Петрі або закритий емальований кювет з зволоженим дном) на 20 - 30 хв при температурі 25 °С.

Після цього препарати промивають водою або буферним фосфатним розчином (pH 7,2 - 7,4) протягом 1 год, потім обполіскують дистильованою водою, висушують на повітрі і піддають дослідженню. Препарати проглядають під імерсійною системою. Для імерсії використовують нелюмінесцентну олію.

У забарвленому препараті при люмінесцентній мікроскопії мозкова тканина флуоресціює (світиться) тьмяним сірувато-жовтим кольором. Антиген вірусу сказу виявляється у препаратах у вигляді яскравих жовтувато-зелених або зелених гранул різної форми та величини – від ледь помітних до тих, що мають 15 – 20 мкм у діаметрі.

У контрольному препараті жовто-зелених гранул, що інтенсивно світяться, не відзначається.

При дослідженні за допомогою методу флуоресціюючих антитіл діагноз сказу вважається встановленим, якщо в кількох полях зору мікроскопа виявляють достатню кількість (не менше 10) типових гранул з яскравим зеленим свіченням різної величини. У контролі таких утворень не повинно бути.

За відсутності позитивної флуоресценції ставлять біологічну пробу.

ІІІ. БІОЛОГІЧНА ПРОБА

11. Біологічну пробу на сказ ставлять, якщо отримано негативний результат при мікроскопічному дослідженні (тільця Бабеша-Негри не виявлено), при серологічних реакціях (специфічного рабічного антигену не виявлено), а також при виявленні атипових включень. Біологічну пробу проводять на білих мишах чи кроликах.

12. Досвідчених мишей або кроликів заражають 10% суспензією з досліджуваного мозку на фізіологічному розчині або м'ясопептонному бульйоні з pH 7,2 - 7,4. Для приготування суспензії використовуються самі ділянки головного мозку, з яких брали матеріал для мікроскопічного та серологічного досліджень.

Вирізані ділянки головного мозку збирають у стерильну пробірку і зважують, а потім ретельно розтирають у ступці маточкою, після чого додають фізіологічний розчин або м'ясопептонний бульйон з розрахунку отримання 10% суспензії. Отриману суспензію відстоюють протягом 10 хв і для зараження використовують надосадову рідину.

Якщо патологічний матеріал був забруднений, то надосадову рідину зливають в іншу судину (пробірку) і до неї додають по 500 - 1000 ОД пеніциліну та стрептоміцину на 1 мл рідини, після чого відстоюють ще 30 хв при кімнатній температурі і потім використовують для зараження. Суспензію необхідно готувати в стерильних умовах і за суворого виконання правил особистої профілактики.

Біологічна проба на білих мишах. Для зараження використовують білих мишей масою 8 – 10 г. Для кожного дослідження беруть 6 мишей, з яких 3 заражають у головний мозок, а 3 – підшкірно. При зараженні в мозок голку вводять у точці за лінією, що з'єднує задні кути і трохи осторонь лінії, що проходить посередині голови. Місце зараження протирають спиртом. Суспензію вводять у дозі 0,03мл. Для попередження глибокого проникнення голки в мозок на її кінчик одягають обмежувач – невеликий шматочок гумової трубки, який зміцнюють на відстані 2 – 3 мм від кінця голки. При підшкірному зараженні вводять суспензію в область кінчика носа (у верхню губу) в дозі 0,05 мл. На місці введення суспензії утворюється невелика припухлість. Заражених мишей поміщають у скляні банки та спостерігають за ними протягом 30 діб. При позитивному результаті біологічної проби мишей зазвичай на 7 - 15-й день після зараження розвивається клініка паралітичного сказу.

Спочатку відзначаються млявість, скуйовдженість вовни та своєрідна горбатість, а також порушення координації рухів. Потім настає параліч задніх кінцівок, а пізніше - передніх, що переходять у загальний параліч, що закінчується смертю. Тривалість хвороби 2 – 3 діб.

З розвитком загального паралічу мишей умертвляють за допомогою ефірного чи хлороформеного наркозу. У полеглих і вбитих мишей розкривають черепну порожнину, роблять засів із мозку на живильні середовища, після чого витягують головний мозок, з якого готують препарати для мікроскопічного та імунобіологічних досліджень.

За відсутності клінічних проявів сказу у заражених мишей протягом 30 діб їх знищують. Банки, де вони утримувалися, ретельно дезінфікують.

Біологічна проба на кроликах. Для постановки біологічної проби беруть 4 кролики масою не менше 1,5 кг кожен. 2 кроликів заражають у мозок і 2 внутрішньом'язово в ділянці стегна. Суспензію вводять інтрацеребрально у дозі 0,2 мл, а внутрішньом'язово – у дозі 2 мл.

При позитивному результаті біологічної проби кролики хворіють протягом 16 – 21 дня. Захворювання на сказ протікає у кроликів у тихій паралітичній формі зі смертельним результатом. У полеглих кроликів витягують головний мозок і подальше дослідження проводять так само, як і при зараженні мишей. Спостереження за кроликами ведуть протягом 45 – 50 діб. Після закінчення зазначеного терміну кроликів знищують. Клітини, у яких містилися піддослідні тварини, дезінфікують.

IV. ГІСТОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ 1

1 Гістологічне дослідження використовують як додатковий метод

Для гістологічного дослідження беруть шматочки амонового рогу, кори півкуль, мозочка, довгастого мозку і фіксують в одній або двох порціях ацетону так, щоб тривалість фіксації була в межах 6 - 18 год.

Найкраще фіксацію в ацетоні залишати на ніч. Потім патматеріал проводять через дві порції ксилолу, витримуючи по 30 хв у кожній і через дві порції парафіну - по 1 год в кожній. Готові зрізи депарафінують звичайним методом і забарвлюють за Ленцом або Туревичем:

Забарвлення по Ленц. Зрізи фарбують розчином еозину 1 - 3 хв (0,5 г еозину розчиняють у 100 мл 60°-ного етилового спирту). Еозин швидко змивають водою і протягом 1 хв забарвлюють метиленової синькою Лефлера, промивають водою, обережно підсушують фільтрувальним папером і диференціюють розчином од. кого натру в абсолютному спирті (5 крапель їдкого натру на 30 мл спирту) до блідо-рожевого кольору. На препарат наливають розчин оцтової кислоти (1 крапля крижаної оцтової кислоти на 60 мл абсолютного спирту) і тримають до появи слабо-синього забарвлення, швидко змивають спиртом і просвітлюють ксилолом протягом 4-5 хв. Тільці Бабеша-Негрі забарвлюються у яскраво-червоний колір із синіми включеннями, цитоплазма гангліозних клітин – у блідо-блакитний;

Забарвлення за Туревичем. Депарафіновані зрізи відразу після проведення через спирти та дистильовану воду забарвлюють гематоксиліном Вейгерта або Ерліха, промивають дистильованою водою. Потім фарбують 1%-ним водним розчином кислого фуксину протягом 1 хв і ретельно промивають дистильованою водою до появи блідо-рожевого відтінку. Після промивання обробляють сумішшю (у рівних частинах) насиченого водного розчину пікринової кислоти (на 1 л гарячої води, що дистилює 25 - 30 г пікринової кислоти) і 96°-ного спирту. При обробці спостерігають відходження хмаринок червоної фарби, і зрізи через 10 - 20 с набувають жовтого відтінку. Зрізи швидко прополіскують у воді і злегка обсушують фільтрувальним папером. Потім швидко проводять через абсолютний або 96°-ний спирт, карбол-ксилол, чистий ксилол і укладають в бальзам. Тільця Бабеша-Негрі – вишнево-червоного кольору, ядра клітин – чорні чи сині залежно від того, яким гематоксиліном вони пофарбовані. За формою та величиною тільця Бабеша-Негрі дуже різноманітні, знаходяться в цитоплазмі та відростках нервових клітин у вигляді численних чи одиночних екземплярів. Найчастіше тільця Бабеша-Негрі виявляють у великих гангліозних клітинах, причому клітини, що їх містять, не мають виражених ознак дегенерації.

Нерідко виявляють інші включення, які через низку подібних ознак іноді приймають за тільця Негрі. Слід пам'ятати, що у мозку здорових кішок і білих мишей іноді містяться неспецифічні ацидофільні тільця-включення. Ці тільця можна віддиференціювати від тілець Негри за відсутністю внутрішніх гранул та гомогенності основної субстанції.

Для сказу також характерні ознаки гострого енцефаломієліту: переважно навколо дрібних вен виявляють периваскулярні інфільтрати, що складаються в основному з лімфоїдних клітин, що мають вигляд клітинних муфт.

У гангліозних клітинах головного мозку можуть бути хроматоліз, вакуолізація та гостре набухання клітин, а також загибель окремих клітин. В області пошкоджених нервових клітин досить постійна проліферативна реакція глії, що набуває форми істинної нейронофагії з наступним заміщенням нервових клітин елементами глії, що розмножилася. Таке скупчення клітин проліферату дома розпалася нервової клітини зветься «вузлика сказу» - на зрізі іноді можна простежити процес розвитку вузлика (1).

МІЖДЕРЖАВНА РАДА З СТАНДАРТИЗАЦІЇ. МЕТРОЛОГІЇ І СЕРТИФІКАЦІЇ

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION. METROLOGY AND CERTIFICATION

МІЖДЕРЖАВНИЙ

СТАНДАРТ

ТВАРИННІ

Видання офіційне

Стандартнформ

Передмова

Цілі, основні засади та основний порядок проведення робіт з міждержавної стандартизації встановлено ГОСТ 1.0 – 92 «Міждержавна система стандартизації. Основні положення» та ГОСТ 1.2-2009 «Міждержавна система стандартизації. Стандарти міждержавні. правила та рекомендації щодо міждержавної стандартизації. Правила опрацювання. прийняття, застосування, оновлення та скасування»

Відомості про стандарт

1 РОЗРОБЛЕНО Федеральною державною бюджетною установою «Всеросійський державний Центр якості та стандартизації лікарських засобів для тварин та кормів» (ФДБУ «ВДНКІ»)

2 ВНЕСЕН Федеральним агентством з технічного регулювання та метрології Російської Федерації

3 ПРИЙНЯТЬ Міждержавною радою зі стандартизації, метрології та сертифікації (протокол від 27 червня 2013 р. № 57-П)

4 Наказом Федерального агентства з технічного регулювання та метрології від 30 вересня 2013 р. № 1127-ст міждержавний стандарт ГОСТ 26075-2013 введено в дію як національний стандарт Російської Федерації з 1 січня 2015 року

5 ВЗАМІН ГОСТ 26075-54

Інформація про зміни до цього стандарту публікується в інформаційному покажчику «Національні стандарти», що щорічно видається, а текст змін і поправок - у щомісячно видається інформаційному покажчику «Національні стандарти». У разі перегляду (заміни) або скасування цього стандарту відповідне повідомлення буде опубліковане у щомісячному інформаційному покажчику «Національні стандарти». Відповідна інформація, повідомлення та тексти розміщуються також в інформаційній системі загального користування - на офіційному сайті Федерального агентства з технічного регулювання та метрології в мережі Інтернет

© Стандартінформ, 2014

У Російській Федерації цей стандарт не може бути повністю або частково відтворено. тиражований і поширений як офіційне видання без дозволу Федерального агентства з технічного регулювання та метрології

МІЖДЕРЖАВНИЙ СТАНДАРТ

ТВАРИННІ

Методи лабораторної діагностики сказу

Methods of Laboratory Diagnostic of Rabies

Дата введення - 2015 - 01 - 01

1 Область застосування

Цей стандарт поширюється на всі види ссавців і встановлює такі методи лабораторної діагностики сказу:

Метод флуоресціюючих антитіл (МФА);

Метод виділення вірусу сказу в культурі клітин мишачої нейробластоми CCL-131 (або невриноми Гассерова вузла щура – ​​НГУК-1);

Біопроба на білих мишах:

Метод іммукоферментного аналізу (ІФА);

Реакція дифузійної преципітації (РДП).

Примітки

1 Дані методи застосовуються до всіх представників роду Lyssavwus.

2 Вуличний вірус сказу відноситься до мікроорганізмів 2 класу патогенності (представляє смертельну небезпеку для людини та тварин).

3 При необхідності генотипування вірусу сказу за допомогою готових тест-систем застосовують метод назад транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції (від ПЛР).

2 Нормативні посилання

У цьому стандарті використано нормативні посилання на такі стандарти:

ГОСТ ІСО/МЕК 17025 - 2009 Загальні вимоги до компетентності випробувальних та калібрувальних лабораторій

ГОСТ 12.0.004 – 90 Система стандартів безпеки праці. Організація навчання безпеки праці. загальні положення

ГОСТ 12.1.005-68 Система стандартів безпеки праці. Загальні санітарно-гігієнічні вимоги до повітря робочої зони

ГОСТ 12.1.008 – 76 Система стандартів безпеки праці. Біологічна безпека. Загальні вимоги

ГОСТ 12.4.011 – 89 Система стандартів безпеки праці. Засоби захисту працюючих. Загальні вимоги та класифікація

ГОСТ 17.0.0.01 - 76 Система стандартів у сфері охорони навколишнього середовища та поліпшення використання природних ресурсів. Основні положення

ГОСТ 177-88 Водню перекис. Технічні умови ГОСТ 2603 – 79 Реактиви. Ацетон. Технічні умови ГОСТ 2768 – 84 Ацетон технічний. Технічні умови ГОСТ 4204 – 77 Реактиви. Кислота сірчана. Технічні умови ГОСТ 6709 - 72 Вода дистильована. Технічні умови.

ГОСТ ISO 7218 - 2011 Мікробіологія харчових продуктів та кормів для тварин. Загальні вимоги та рекомендації щодо мікробіологічних досліджень

ГОСТ 8074 – 82 Мікроскопи інструментальні. Типи, основні параметри та розміри. Технічні вимоги.

ГОСТ 9147 - 80 Посуд та обладнання лабораторні фарфорові. Технічні умови ГОСТ 9284-75 Скло предметне для мікропрезратне. Технічні умови ГОСТ 12026 - 76 Папір фільтрувальний лабораторний. Технічні умови ГОСТ 13739-78 Олія імерсійна для мікроскопії. Технічні вимоги. Методи випробувань

ГОСТ 16317-87 Холодильні прилади електричні побутові. Загальні технічні умови

ДЕРЖСТАНДАРТ 21241-69 Пінцети медичні. Загальні технічні умови

ДЕРЖСТАНДАРТ 22967 - 90 Шприци медичні ін'єкційні багаторазового застосування. Загальні технічні вимоги та методи випробувань

ГОСТ 24661 - 91 (ІСО 7866 84) Шприци ін'єкційні одноразового застосування

ГОСТ 25046 - 81 (ІСО 7864-81) Голки ін'єкційні одноразового застосування. Основні розміри. Технічні вимоги. Методи випробувань

ГОСТ 25336 - 82 Посуд та обладнання лабораторні скляні. Типи, основні параметри та розміри

ГОСТ 29230 - 91 (ІСО 835-4-81) Посуд лабораторний скляний. Піпетки градуйовані. Частина 4. Піпетки видувні

Примітка - При користуванні цим стандартом доцільно перевірити дію стандартів посилань в інформаційній системі загального користування - на офіційному сайті Федерального агентства з технічного регулювання та метрології в мережі Інтернет або за щорічним інформаційним покажчиком «Національні стандарти», який опублікований станом на 1 січня поточного року і ло випускам щомісячного інформаційного покажчика «Національні стандарти» за поточний рік. Якщо стандарт посилається (змінений), то при користуванні цим стандартом слід керуватися замінним (зміненим) стандартом. Якщо стандарт зв'язку скасовано без заміни, то положення, в якому дано посилання на нього, застосовується в частині, що не зачіпає це посилання.

3 Терміни, визначення та скорочення

3.1 У цьому стандарті застосовані такі терміни з відповідними визначеннями:

3.1.1 Сказ: Інфекційне захворювання людини та тварин, що викликається представниками сімейства Rhabdoviridae роду Lyssavirus (рабДовірус), і що призводить до летального результату в 100% випадків.

3.1.2 вірус сказу: Збудник інфекційного захворювання людини та тварин.

3.1.3 антиген вірусу сказу: Поверхневі білкові структури вірусу сказу, на які виробляються антитіла.

3.1.2 метод флуоресціюючих антитіл (МФА): Метод виявлення антигену вірусу сказу міченими флуоресценінеотіоціаціатом антирабічними антитілами, з утворенням характерних світящих комплексів-включень, що виявляються в полі зору люмінесцентного мікроскопа.

3.1.3 Метод виділення вірусу сказу в культурі клітин мишачої нейробластоми CCL-131 (або невриноми Гассерова вузла щура – ​​НГУК-1): Метод виділення антигену вірусу сказу. заснований на розмноженні вірусу в культурі клітин та його ідентифікації методом флуоресціюючих антитіл.

3.1.3 біопроба: Метод виділення вірусу сказу на білих мишах шляхом введення ним суспензії патологічного матеріалу з подальшою ідентифікацією вірусу методом флуоресціюючих антитіл.

3.1.4 Метод імуноферментного аналізу (ІФА): Метод виявлення антигену вірусу сказу. заснований на його специфічній взаємодії з антирабічним антитілом, іммобілізованому на твердому носії, з подальшим виявленням антигену, що зв'язався, за допомогою другого міченого ферментом антитіла шляхом фарбування продукту реакції хромогеном.

3.1.5 реакція дифузійної преципітації (РДП): Метод виявлення вірусу сказу, заснований на здатності антитіл та вірусного антигену сказу дифундувати в агаровому гелі та при специфічній взаємодії утворювати комплекс «антиген-антитіло», що спостерігається неозброєним оком у вигляді лінії.

3.1.6 метод зворотної транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції (від ПЛР): Метод виявлення геному вірусу сказу шляхом перекладу специфічної послідовності РНК вірусу в ДНК з подальшим багаторазовим копіюванням отриманої ДНК і виявленням продуктів реакції, що здійснюється in vitro.

3.2 У цьому стандарті застосовані такі скорочення:

ФАГ-флуоресцентний антирабічний імуноглобулін;

АнГ-антирабічний глобулін;

КФГ - контрольний флуоресцентний глобулін;

ФБР – фосфатно-буферний розчин;

НГУК-1-невринома Гассерова вузла щура;

ФІТЦ - флуоресцеїнізотіоцинат:

РНК - рибонуклеїнова кислота:

ДНК - дезоксирибонуклеїнова кислота:

ССИ31 - культура клітин мишачої нейробластоми:

ОФД-ортофенілдіамін;

ТМБ – тетраметилбензидин.

4 Умови виконання досліджень та вимоги безпеки

4.1 Умови виконання досліджень

4.1.1 Загальні вимоги проведення мікробіологічного аналізу та роботи з мікроорганізмами І – ІІ груп патогенності – ло ГОСТ ISO 7218.

4.1.2 Загальні вимоги до приміщень - згідно з ДСТУ ISO 7218.

4.1.3 Вимоги до персоналу - згідно з ГОСТ ISO 7218, ГОСТ ИСО/МЭК 17025. (1).

До проведення досліджень допускаються кваліфіковані співробітники, які мають досвід роботи з мікроорганізмами І – ІІ груп патогенності, що вивчили методики мікробіологічних робіт. вакциновані проти сказу.

4.2 Вимоги безпеки

4.2.1 Загальні вимоги безпеки під час проведення робіт згідно з ГОСТ 12.1.008.

4.2.2 Засоби захисту працюючих мають відповідати вимогам ГОСТ 12.4.011.

4.2.3 Повітря робочої зони повинне відповідати вимогам ГОСТ 12.1.005.

4.2.4 Навчання персоналу безпеки праці відповідно до ГОСТ 12.0.004.

4.2.5 Утилізацію отриманого для дослідження матеріалу, а також використаних індивідуальних засобів захисту, інструментів тощо. проводять шляхом кип'ятіння протягом 30 хв або автоклавування протягом 15 хв при тиску (0.11±0.20) МПа.

5 Засоби вимірювань, обладнання, матеріали, реактиви та тварини

5.1 Для проведення досліджень використовують:

Спектрофотометр скануючий із спектральним діапазоном вимірювання довжин хвиль від 190 до 1100 нм з похибкою не більше ± 0,5 нм та діапазоном вимірювання оптичної щільності (ОП) від 0.1 до 3.0;

Планшети для імунологічних реакцій 96-лункові:

Термостат, що забезпечує підтримання температури від 20 "-С до 50 °С:

Холодильник побутовий, що забезпечує підтримання температури від 0 °С до 10 °С за ГОСТ 16317:

Центрифугу лабораторну;

Лазню водяну;

Мікроскоп люмінесцентний інвертований за ГОСТ 8074:

Ступки фарфорові з маточкою за ГОСТ 9147 або гомогенізатор за ГОСТ ІСО/МЕК 17025;

Скло предметне за ГОСТ 9284:

Скляні пробірки за ГОСТ 25336;

Чашки Петрі за ГОСТ 25336;

Кювету за ГОСТ 25336;

Піпетки місткістю 1.0; 2,0 та 10.0 см 3 за ГОСТ 29230;

Автоматичні піпетки місткістю від 0,05 до 0,20 см 3 з наконечниками:

Пінцети медичні за ГОСТ 21241:

Шприци інсулінові місткістю 1,0 см 3 за ГОСТ 22967 чи ГОСТ 24861;

Голки ін'єкційні ло ГОСТ 25046:

Скло культуральне на вісім лунок;

Клітини для утримання мишей;

Ацетон за ГОСТ 2603 чи ГОСТ 2768;

Флуоресціюючий антирабічний імуноглобулін (ФАГ);

Антирабічний глобулін (АнГ);

Контрольний флуоресціюючий глобулін (КФГ);

Олія нефлуоресціююча імерсійна ло ГОСТ 13739;

Воду дистильовану за ГОСТ 6709;

Розчин фосфатно-буферної молярної концентрації 0,01 моль/дм 3 (ФБР). pH 7,2 – 7.4;

- розчин натрію хлориду стерильний 0.9%-ний ізотонічний:

Культуру клітин мишачої нейробластоми ССИ31 або неериноми Гассерова вузла щура -

Пеніцилін;

Стрептоміцин;

Середовище Голка МЕМ із подвійним набором амінокислот та вітамінів (ДМЕМ), pH 7,2;

Розчин трипсину 0,25%-ний;

Сироватку ембріональної крові великої рогатої худоби для культур клітин 10%-ву;

Глютамін 3%-ний;

Перекис водню 3%-ну за ГОСТ 177;

Набір препаратів для лабораторної діагностики сказу тварин методом ІФА;

Розчин сірчаної кислоти молярної концентрації 2 моль/дм 3 за ГОСТ 4204;

Папір фільтрувальний за ГОСТ 12026;

Штамп для приготування лунок;

Мертіолят;

Агар "Діфко" або аналогічний;

Розчин метилового помаранчевого 1%-ний в 50%-му етиловому спирті:

Антигени позитивний та негативний;

Сироватку антирабічну або імуноглобулін;

Мишей білих клінічно здорових масою 6 - 8 р.

5.2 Допускається застосування інших засобів вимірювань з метрологічними характеристиками та обладнання з технічними характеристиками не гірше, а також реактивів та матеріалів за якістю не нижче зазначених вище. Допускається використання одноразового посуду.

6 Відбір проб

6.1 Для проведення досліджень на наявність вірусу сказу в лабораторію направляють патологічний матеріал - свіжий труп або голову дрібних тварин, голову або мозок великих тварин.

6.2 Відібраний для досліджень патологічний матеріал упаковують у вологонепроникну тару та доставляють у лабораторію у металевих контейнерах. Заморожений матеріал поміщають у кріоконтейнер.

6.3 Патологічний матеріал супроводжують документом, що містить такі дані; найменування та адреса відправника, вид тварини, анамнестичні та клініко-еліеоотологічні дані.

6.4 Пабораторні дослідження проводять одразу ж при отриманні патологічного матеріалу.

6.5 Для дослідження відбирають від великих тварин шматочки тканини з кожного відділу головного мозку (амонові роги, мозок, кору великих півкуль, довгастий мозок) розміром 0.5 - 1.0 см. мозок дрібних тварин, наприклад мишей, досліджують цілком.

Для дослідження МФА та методом виділення вірусу сказу в культурі клітин мишачої нейробластоми CCL-131 (або НГУК-1) придатні лише свіжі чи свіжозаморожені проби тканини головного мозку. Не допускаються для досліджень проби мозку тварин, що розкладаються (у стадії загнивання), консервовані гліцерином, фіксовані метиловим спиртом, формаліном або іншими засобами, що сприяють виникненню флуоресценції.

Для постановки біопроби допускається використовувати проби мозку, консервовані в 30% -50% *ному розчині гліцерину. Використання інших консервантів не допускається. Для збереження патологічний матеріал може бути заморожений при температурі не вище мінус 10°С.

7 Метод флуоресціюючих антитіл (МФА)

7.1 Сутність методу

Сутність методу флуоресціюючих антитіл полягає в специфічній взаємодії флуоресціюючих антирабічних антитіл з гомологічним антигеном вірусу сказу. Комплекс «антиген-антитіло», що утворюється при цьому, мічений ФІТЦ. виявляється візуально за характерним світінням у полі зору під час розгляду під люмінесцентним мікроскопом.

7.2 Підготовка до дослідження

7.2.1 Підготовка проб

7.2.1.1 З шматочків тканини, відібраних по 6.5, готують не менше трьох препаратів (відбитків або мазків) з кожного відділу мозку на ретельно знежирених предметних шибках. Якщо стан патолсгического матеріалу дозволяє, то готують відбитки, інших випадках роблять мазки.

7.2.1.2 Приготування відбитків

Шматочки тканини, відібрані за 6.5. кладуть на фільтрувальний папір, складений у чотири-шість шарів. Мозок дрібних тварин розрізають упоперек, захоплюючи всі його відділи, і кладуть його пінієтом зрізом вгору на фільтрувальний папір, складений у чотири - шість шарів. До поверхні зрізу торкаються предметного скла, злегка натискаючи його до отримання на склі тонкого відбитка.

7.2.1.3 Приготування мазків

Шматок тканини з кожного відділу мозку (у дрібних тварин весь мозок повністю), відібраний по 6.5. розтирають у фарфоровій ступці маточкою до утворення гомогенної маси, з якої роблять мазки на предметних стеклах.

7.2.1.4 Для контролю роблять мазки або відбитки з мозку здорових, не хворих на сказ і не вакцинованих проти сказу, білих мишей, як описано в 7.3.1.2 та 7.3.1.3.

7.2.1.5 Після приготування мазки або відбитки висушують у повітрі протягом 20-30 хв. фіксують в охолодженому ацетоні при температурі 4 С протягом 4 - 12 год або при температурі мінус 20 * С протягом 1 ч. після чого вилучають з ацетону і висушують на повітрі протягом 10 - 15 мж.

7.2.2 Підготовка реактивів

ФАГ. АнГ та КФГ розчиняють дистильованою водою до зазначеного на етикетці ампули початкового об'єму. Термін зберігання розчинених ФАГ. АнГ та КФГ при температурі (5±2) у С – не більше двох тижнів.

Безпосередньо для дослідження необхідна кількість розчинених ФАГ. АнГ та КФГ розводять ФБР до робочого розведення, вказаного на етикетці ампули. Робочі розведення розчинених ФАГ. АнГ та КФГ використовують у день приготування.

7.3 Проведення дослідження

Предметне скло з препаратами (мазками або відбитками) по 7.2.1 поміщають у вологу камеру (чашку Петрі або кювету з зволоженим дном). Потім на один із трьох приготовлених препаратів наносять ФАГ у робочому розведенні рівномірно на всю поверхню мазка або відбитка за допомогою піпетки. На другий препарат наносять робоче розведення КФГ. Закривають камеру із препаратами. поміщають у термостат при температурі (37 ± 1) *С та витримують протягом 30

хв. Паралельно фарбують контрольні препарати. Після закінчення фарбування препарати триразово промивають, занурюючи їх щоразу на 10 хв у посудину з ФБР. обполіскують дистильованою водою і висушують повітря протягом 20 - 30 хв.

На третій препарат завдають робоче розведення АнГ. поміщають у термостат при температурі (37 ± 1) С і витримують протягом 30 хв. Потім препарат триразово промивають, занурюючи щоразу на 10 хв у посудину з ФБР. обполіскують дистильованою водою, висушують повітря протягом 20 - 30 хв і забарвлюють робочим розведенням ФАГ. як описано вище.

7.4 Обробка результатів

8 пофарбованих препаратах не уражена вірусом сказу мозкова тканина світиться тьмяним. сірувато-жовтим кольором.

Антиген вірусу сказу виявляється в нейронах і поза клітинами у вигляді яскравих зелених гранул різної форми і величини - від ледь помітних до розмірів, що мають, в діаметрі 15 - 20 мкм. Іноді відзначається велика кількість дрібних яскравих зелених частинок (розміром до 1 мкм) округлої та овальної форми.

Діагноз сказ вважається встановленим, якщо в кількох полях зору мікроскопа в досліджуваному препараті виявляють типові жовтувато-зелені гранули. При цьому в контрольних препаратах (у мазках або відбитках з мозку здорових білих мишей, що не хворіли на сказ, пофарбованих ФАГ), а також у досліджуваних препаратах, пофарбованих КФГ і попередньо оброблених АнГ і пофарбованих ФАГ. подібних утворень не повинно бути.

Про результати дослідження повідомляють компетентні органи відповідно до порядку, що діє на території держави, яка прийняла стандарт.

8 у разі негативного результату проводять дослідження з 8 або 9.

8 Метод виділення вірусу сказу в культурі клітин мишачої нейробластоми CCL-131 (або невриноми Гассерова вузла щура - НГУК-1)

8.1 Сутність методу

Сутність методу полягає у виділенні вірусу сказу в культурі клітин мишачої

нейробластоми CCL-131 або НГУК-1 з подальшою його ідентифікацією методом флуоресціюючих антитіл.

Метод є альтернативним біопробі на білих мишах по 9.

8.2 Підготовка до дослідження

8.2.1 Підготовка проб

Рівні частини тканини, стерильно відібрані з кожної ділянки головного мозку дрібної тварини (амонові роги, мозок, кора великих півкуль, довгастий мозок), або шматочки тканини з кожного відділу головного мозку великої тварини, відібрані за 6.5. подрібнюють ножицями і розтирають у ступці або гомогенізаторі, поступово додаючи стерильний 0.9% ізотонічний розчин натрію хлориду до отримання 10% суспензії. У суспензію мозку додають пеніцилін та стрептоміцин по ЮС ОД/см 3 та 1 мг/см 3 відповідно.

Отриману суспензію ретельно перемішують та центрифугують протягом 5-10 хв при швидкості 2000 об/хв. Над осадову рідину переносять у стерильну пробірку та зберігають при температурі не вище 4 °С до використання.

8.2.2 Підготовка культурального скла

Добову культуру клітин мишачої нейробластоми CCL-131 (або НГУК-1) знімають з культурального флакона за допомогою 0,25%-ного розчину трипсину і розводять середовищем ДМЕМ з 10%-ною ембріональною сироваткою крові великої рогатої худоби і 3%-ним глютаміном концентрації 2*10 s клітин/см 3 . У лунки культурального скла вносять по 0.1 см 3 отриманої суспензії клітин, накривають кришкою і поміщають у вологий СО г -інкубатор із вмістом СО г 5 % при температурі (37±1)°С на 18-20год

8.3 Проведення дослідження

У дві лунки культурального скла 8.2.2 вносять по 0.05 см 3 суспензії з кожного відділу головного мозку. На кожному склі залишають дві лунки для позитивного та негативного контролю. Як позитивний контроль використовують суспензію мозку миші, зараженої вірусом сказу - штамом CVS. Як негативний контроль вносять суспензію мозку клінічно здорової миші. Культуральне скло поміщають у вологий СОг-інкубатор із вмістом СОг 5 % при температурі (37 ± 1) *С на 42 - 48 год.

Після закінчення інкубації за допомогою автоматичної піпетки з лунок культурального скла видаляють середовище, один раз промивають клітини ФБР (за допомогою автоматичної піпетки вносять по 0.2 см 3 розчину кожну лунку) і підсушують в ламінарному потоці повітря протягом 20 - 30 хв. Потім кожну лунку вносять по 0.1 см 3 охолодженого до температури мінус 20 С ацетону і залишають при кімнатній температурі на 30 хв.

Після фіксації клітин культуральне скло перевертають та струшують для видалення ацетону, а потім висушують у ламінарному потоці повітря протягом 20 - 30 хв. За допомогою скальпеля та пінцета видаляють пластикову насадку та підсушують скло ще протягом 5-10 хв. У кожну лунку додають по 0,05 - 0,10 см 3 ФАГ у робочому розведенні (підбирають дослідним шляхом), приготовленому у ФБР. поміщають у вологу чашку Петрі та інкубують при температурі (37 ± 1) С протягом 30 хв.

Після закінчення фарбування скла триразово промивають, занурюючи їх щоразу на 10 хв у посудину з ФБР. Потім препарати обполіскують дистильованою водою та висушують на повітрі протягом 20-30 хв.

На пофарбовані препарати наносять нефлуоресціюючу іммерсійну олію та переглядають у люмінесцентному мікроскопі.

8.4 Обробка результатів

У пофарбованих препаратах не уражена вірусом сказу культура клітин світиться тьмяним. сірувато-жовтим кольором (негативний контроль). Антиген вірусу сказу виявляється у цитоплазмі культури клітин у вигляді яскравих зелених гранул різної форми та величини з чіткими окресленими краями (позитивний контроль).

Діагноз на сказ вважається встановленим, якщо у кількох полях зору мікроскопа в досліджуваному препараті виявляють типові жовто-зелені гранули.

Якщо культурі клітин вірус сказу не виявлено, то ставиться негативний діагноз.

Результати виділення вірусу сказу у культурі клітин остаточні, подальші дослідження не проводять.

9 Біслроба на білих мишах

9.1 Сутність методу

Сутність методу полягає у виділенні вірусу сказу шляхом інтрацеребрального введення патологічного матеріалу білим мишам з подальшою ідентифікацією вірусу методом флуоресціюючих антитіл по 7.

9.2 Підготовка проб до дослідження – по 6.2.1.

9.3 Проведення дослідження

П'ять - шість білих мишей заражають 10% суспензією патологічного матеріалу ім-трацеребрально в обсязі 0.02 - 0,03 см 3 . Заражених мишей поміщають в окрему клітину, на яку наклеюють етикетку із зазначенням дати зараження, кількості мишей, способу зараження та номера експертизи патологічного матеріалу. Спостереження за тваринами проводять щонайменше 30 днів. Кількість здорових, хворих та загиблих мишей реєструють у журналі.

9.4 Обробка результатів

При оцінці результатів враховують наявність клінічних ознак у заражених мишей (оскаженність вовни, поїдання корму, порушення координації руху, паралічі, тремор, прострація). Загибель мишей у перші дві доби після зараження не враховують. Проби мозку від хворих та загиблих тварин, починаючи з третьої доби, досліджують МФА по 7.

Біопробу вважають позитивною, якщо, починаючи з третьої доби після зараження, захворіла і загинула хоча б одна миша і в пробі мозку за допомогою МФА виявлено специфічні включення вірусу сказу.

Негативний діагноз може бути дано тільки через 30 діб спостереження за умови, що всі заражені тварини залишаться живими і здоровими.

Результати біопроби вважаються остаточними, подальші дослідження не проводять.

10 Метод імуноферментного аналізу (ІФА)

10.1 Сутність методу

На основі ІФА лежить специфічна взаємодія антигену вірусу сказу з антиге* лом. іммобілізованим на твердому носії. Пов'язаний антиген виявляється за допомогою другого антирабічного антитіла, міченого пероксидазою. продукт реакції якої забарвлюється при додаванні хромогену. Інтенсивність фарбування продукту реакції прямо пропорційна кількості антигену.

10.2 Підготовка до дослідження

10.2.1 Як досліджуваний матеріал (антиген) використовують проби тканини головного мозку загиблих, вимушено вбитих, підозрюваних у захворюванні на сказ або експериментально заражених вірусом сказу тварин.

10.2.2 Приготування антигену, що досліджується.

Проби тканини головного мозку, отримані по 6.5, подрібнюють, розтирають у ступці і готують 10 % * суспензії в С.9 %-ном ізотонічному розчині хлористого натрію, прогрівають у водяній бані при температурі 60 * С протягом 15 хв і центрифугують протягом 5-10 хв при швидкості 2000 об/хв. Надосадову рідину використовують як досліджуваний антиген.

10.2.3 Підготовка реагентів

усі розчини та реагенти перед постановкою реакції необхідно витримати не менше 30 хв при температурі (22±1) *С.

Підготовку компонентів набору проводять згідно з інструкцією із застосування.

10.3 Проведення дослідження

10.3.1 ІФА проводять у сендвіч-варіанті з використанням компонентів, що входять до набору для виявлення антигену збудника сказу у патологічному матеріалі.

Для проведення ІФА використовують планшети для імунологічних реакцій із плоским дном.

Об'єм інгредієнтів, що вносяться поетапно в лунки планшета, дорівнює між собою і становить

10.3.2 Сенсибілізація планшета

6 лунки полістиролового планшета вносять АнГ у робочому розведенні, вказаному на етикетці. Планшет з АнГ накривають кришкою і інкубують у термостаті при температурі (37 ± 0.5) С протягом 3 год або при температурі 4 С протягом 18 год. Після закінчення інкубації лунки планшета триразово промивають буферним розчином, що відмиває. При кожному відмиванні вміст лунок витрушують. а залишки розчину видаляють постукуванням про фільтрувальний папір.

10.3.3 Внесення антигенів

8 ряди планшета А. 8 і З вносять буфер, що відмиває. У лунки планшета вносять контрольні позитивний (лунка А1) і негативний (лунка А2) антигени, що входять до складу набору, а також досліджувані проби (лунки АЗ. А4 і т.д.) і титрують по вертикалі, отримуючи розведення від 1: 2 до 1: 8. При великій кількості проб заповнюють інші ряди планшета. Планшет накривають кришкою і інкубують у гермостаті при температурі (37 ± 0.5) *С протягом 1 години.

10.3.4 Внесення антирабічного лероксидазного кон'югату

У лунки планшета вносять антирабічний пероксидазний кон'югат у робочому розведенні, після чого накривають кришкою і інкубують у термостаті при температурі (37 ± 0.5) С протягом 1 год. Потім лунки планшета триразово відмивають, як описано в 10.3.2.

10.3.5 Внесення субстратної суміші

Для прояву реакції в лунки планшета вносять готову субстратну суміш. Реакцію виявляють протягом 15 - 30 хв при температурі (22±0.5) *С у темряві. Реакцію зупиняють додаванням розчину сірчаної кислоти молярної концентрації 2 моль/дм 3 .

10.4 Обробка результатів

Облік реакції проводять візуально або на спектрофотометрі, що сканує, відповідно до інструкції із застосування набору.

Якщо в субстратній суміші як хромоген використовують ОФД. то вимір оптичної густини проводять при 490 нм. якщо використовують ТМБ. то за 450 км.

Реакцію враховують лише в тому випадку, якщо в лунках з контрольним негативним антигеном специфічне фарбування відсутнє при інтенсивному фарбуванні в лунках з позитивним контрольним антигеном. При візуальному обліку пробу вважають позитивною, якщо хоча б у одному (першому) розведенні спостерігається специфічне фарбування.

При спектрофотометричному обліку результату ІФА проводять розрахунок коефіцієнта специфічності До сп. який дорівнює відношенню оптичної щільності (ОП) продукту реакції в лунках з контрольним позитивним антигеном або досліджуваним матеріалом (ОП«) до оптичної щільності субстратної суміші в лунках з контрольним негативним антигеном (ОПг). Реакцію вважають позитивною. якщо коефіцієнт специфічності більше 2.1 та негативної, якщо менше 2.1.

ОП1 * 0,641, ОПг а 0,120, К сп = 5,34 - позитивна реакція або ОП1 = 0,180, ОПг в 0,120 До з " * 1,5 - реакція негативна.

У разі позитивної реакції діагноз вважають встановленим. Негативний результат може бути підтверджений іншими методами по 7 - 9.

11 Реакція дифузійної преципітації (РДП)

11.1 Сутність методу

Сутність методу РДП полягає в здатності антитіл і вірусного антигену дифундувати в агаровом гелі і при специфічній взаємодії утворювати комплекс антиген-антитіло, що спостерігається неозброєним оком у вигляді лінії преципітації.

11.2 Підготовка до дослідження

11.2.1 Підготовка проб

Підготовка проб до дослідження – по 8.2.1.

Дослідження допускаються несвіжі проби мозку тварин, контаміновані бактеріальною мікрофлорою.

11.2.2 Підготовка агару

Для приготування агару змішують 1.5 г агару «Діфко». 1 см 3 1%-ного розчину метилового помаранчевого в 50%-му етиловому спирті. 0.01 г мертіоляту. 100 см 3 ізотонічного розчину хлориду натрію. Отриману суміш кип'ятять до повного розплавлення агару, розливають пробірками, автоклавують при тиску 0.5 атм протягом 30 хв і зберігають в холодильнику при температурі 4 в С.

11.2.3 Підготовка предметного скла (чашок Петрі)

Реакцію ставлять або на предметних шибках, або на чашках Петрі. На знежирене скло наносять краплю розплавленого агару, рівномірно розподіляють по склу і залишають при кімнатній температурі на 20 - 30 хв для застигання агару. Потім наносять на скло 2.5 см 3 розплавленого агару, утворюючи шар завтовшки близько 2 мм. і залишають на 20 – 30 хв. 8 застиглий шар агару за допомогою спеціального штампу або металевої тонкостінної трубочки діаметром 4 - 5 мм роблять лунки. Стовпчики агару обережно виймають, не пошкоджуючи і не допускаючи відшаровування від скла тонкого шару агарового гелю, за допомогою пінцету очного або іншого інструменту.

Чашки Петрі готують аналогічно, вносячи до них 10 - 15 см 3 розплавленого агару отримання шару товщиною 2-3 мм.

11.3 Проведення дослідження

Безпосередньо перед постановкою реакції готують розведення антирабічної сироватки (імуноглобуліну), для чого чотири пробірки вносять по 1.0 см 3 ізотонічного розчину натрію хлориду. У першу пробірку додають 1.0 см 3 антирабічної сироватки, отримуючи розведення 1:2.

перемішують, і переносять 1.0 см 3 суміші у другу пробірку і т. д. Таким чином, одержують чотири пробірки з розведеннями 1: 2.1:4.1: 8 та 1:16.

8 приготовлені лунки вносять по 0.05 - 0,07 см 3 проби мозку (кожну пробу окрему лунку), отриманої по 8.2.1. та розведення антирабічної сироватки або імуноглобуліну (1: 2; 1: 4; 1: 8:1:16) згідно з малюнком 1.

Малюнок 1 - Схема внесення матеріалу

Ар - еммонів ріг; Пм - довгастий мозок; А+ – позитивний контрольний антиген; М-мозочок; К – кора великих півкуль; А - негативний контрольний антиген.

можливе застосування інших схем внесення матеріалу, але при цьому обов'язково використання позитивного та негативного антигенів.

Предметне скло з досліджуваним матеріалом поміщають у чашки Петрі з зволоженим дном або вологий ексікатор, а потім термостат при температурі (37 ± 1) *С на 48 год (чашки Петрі накривають кришкою і поміщають у термостат).

Реакцію враховують через 6. 24 та 48 год.

11.4 Обробка результатів

Реакцію вважають позитивною у разі навіть однієї лінії преципітації будь-якої інтенсивності між лунками, що містять досліджуваний матеріал і антирабічну сироватку (імуноглобулін).

При цьому між позитивним антигеном та антирабічною сироваткою (імуноглобуліном) повинна спостерігатися помітна лінія преципітації, а між негативним антигеном та антирабічною сироваткою (імуноглобуліном) лінії преципітації не повинно бути.

8 у разі позитивної реакції діагноз вважають встановленим. Негативний результат може бути підтверджений іншими методами по 7 -10.

бібліографія

ЄС Guide to Good Manufacturing Practice for Medicinal Products for Human and Veterinary Use

УДК 619:616.98:579.852.1:615371 МКС 11.220

Ключові слова: сказ, діагностика, метод флуоресціюючих антитіл, імуноферментний аналіз, біопроба, реакція дифузійної преципітації

Підписано до друку 01.04.2014. Формат 60x84V

Уел. пвч. л. 1,40. Тираж 31 еке. Зак. 1363.

Підготовлено на основі електронної версії, наданої розробником стандарту

ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ»

123995 Москва. Гранатний пров., 4.