Класифікація культуральних клітин. Технології біотехнології: клітинні культури. Лінія клітин «Гібридому»

Зачатків органів, вирощених поза організмом (in vitro). В основі вирощування клітин і тканин лежить суворе дотримання стерильності та використання спеціальних поживних середовищ, що забезпечують підтримку життєдіяльності клітин, що культивуються, і максимально подібних до середовища, з яким клітини взаємодіють в організмі. Метод отримання культури клітин та тканин є одним із найважливіших в експериментальній біології. Культури клітин та тканин можуть бути заморожені та зберігатися тривалий час при температурі рідкого азоту (-196°С). Основний експеримент із культивування клітин тварин провів американський учений Р. Гаррісон в 1907 році, помістивши шматочок зачатка нервової системи зародка жаби в потік лімфи. Клітини зачатку залишалися живими кілька тижнів, їх виростали нервові волокна. Згодом метод був удосконалений А. Каррелем (Франція), М. Берроузом (США), А. А. Максимовим (Росія) та іншими вченими, які використовували як живильне середовище плазму крові та витяжку з тканин зародка. Надалі успіхи в отриманні культури клітин та тканин були пов'язані з розробкою середовищ певного хімічного складу для культивування різних типів клітин. Зазвичай вони містять солі, амінокислоти, вітаміни, глюкозу, фактори росту, антибіотики, що запобігають зараженню культури бактеріями та мікроскопічними грибами. Початок створення методу культури клітин і тканин у рослин (на шматочку флоеми моркви) покладено Ф. Стюардом (США) у 1958 році.

Для культивування клітин тварин і людини можуть бути використані клітини різного походження: епітеліальні (печінка, легені, молочна залоза, шкіра, сечовий міхур, нирка), сполучнотканинні (фібробласти), скелетні (кістка та хрящі), м'язові (скелетні, серцеві та гладкі м'язи) ), нервової системи (гліальні клітини та нейрони), залізисті клітини, секретуючі гормони (надниркові залози, гіпофіз, клітини острівців Лангерганса), меланоцити та різні типи пухлинних клітин. Виділяють 2 напрями їх культивування: культура клітин та органна культура (культура органів та тканин). Для отримання культури клітин - генетично однорідної швидко проліферуючої популяції - шматочки тканини (зазвичай близько 1 мм 3) вилучають з організму, обробляють відповідними ферментами (для руйнування міжклітинних контактів) і суспензію, що утворюється, поміщають в живильне середовище. Культури, отримані з ембріональних тканин, характеризуються кращим виживанням і активнішим зростанням (через низький рівень диференціювання та наявності стовбурових клітин-попередників в ембріонах) порівняно з відповідними тканинами, взятими з дорослого організму. Нормальні тканини дають початок культурам з обмеженим часом життя (так звана межа Хейфліка), тоді як культури, одержані з пухлин, здатні проліферувати необмежено довгий час. Однак навіть у культурі нормальних клітин деякі клітини спонтанно імморталізуються, тобто стають безсмертними. Вони виживають і дають початок клітинним лініям із необмеженим терміном життя. Вихідно клітинна лінія може бути отримана з популяції клітин або окремої клітини. У разі лінію називають клонової, чи клоном. При тривалому культивуванні під впливом різних факторів властивості нормальних клітин змінюються, відбувається трансформація, основними ознаками якої є порушення морфології клітин, зміна числа хромосом (анеуплоїдія). При високому ступені трансформації введення таких клітин тварин може викликати утворення пухлини. В органній культурі зберігаються структурна організація тканини, міжклітинні взаємодії, підтримується гістологічна та біохімічна диференціювання. Тканини, залежні від гормонів, зберігають чутливість до них та характерні відповіді, залізисті клітини продовжують секретувати специфічні гормони тощо. Такі культури вирощують у культуральній посудині на плотиках (паперових, міліпорових) або на металевій сітці, що плавають на поверхні живильного середовища.

У рослин культивування клітин засноване, загалом, на тих самих принципах, що й у тварин. Відмінності ж у способах культивування визначаються структурними та біологічними особливостями клітин рослин. Більшість клітин рослинних тканин мають тотипотентність: з однієї такої клітини за певних умов може розвинутись повноцінна рослина. Для отримання культури рослинних клітин використовується шматочок будь-якої тканини (наприклад, калюсу) або органу (кореня, стебла, листа), в якому присутні живі клітини. Його поміщають на живильне середовище, що містить мінеральні солі, вітаміни, вуглеводи та фітогормони (найчастіше цитокіни та ауксини). Рослинні культури підтримують при температурі від 22 до 27°С, у темряві або при освітленні.

Культури клітин та тканин знаходять широке застосування у різних галузях біології та медицини. Культивування соматичних клітин (всі клітини органів прокуратури та тканин крім статевих) поза організму визначило можливість розвитку нових способів вивчення генетики вищих організмів з використанням, поруч із методами класичної генетики, методів молекулярної біології. Найбільший розвиток отримала молекулярна генетика соматичних клітин ссавців, що пов'язано з можливістю, що з'явилася, постановки прямих експериментів з клітинами людини. Культуру клітин та тканин використовують при вирішенні таких загальнобіологічних проблем, як з'ясування механізмів експресії генів, раннього ембріонального розвитку, диференціювання та проліферації, взаємодії ядра та цитоплазми, клітин із середовищем, адаптації до різних хімічних та фізичних впливів, старіння, злоякісної трансформації та ін. її застосовують для діагностики та лікування спадкових захворювань. Як тест-об'єкти клітинні культури є альтернативою використанню тварин при випробуванні нових фармакологічних засобів. Вони необхідні для отримання трансгенних рослин, клонального розмноження. Важливу роль клітинні культури грають у біотехнології при створенні гібридів, виробництві вакцин та біологічно активних речовин.

Дивись також Клітинна інженерія.

Методи культивування клітин. Л., 1988; Культура тваринних клітин. Методи / За редакцією Р. Фрешні. М., 1989; Біологія культивованих клітин та біотехнологія рослин. М., 1991; Freshney R. I. Культура animal cells: а manual of basic technique. 5th ed. Hoboken, 2005.

О. П. Кісуріна-Євгеньева.

Клітинні культурице генетично однорідні популяції клітин, що ростуть у постійних умовах довкілля. Це можуть бути штами нормальних клітин людини, тварин, рослин чи тканин злоякісних пухлин.

Умови культивування

Клітини зазвичай поміщають у скляні судини, звідси й дослідження одержали назву вивчення in vitro (від латів. In - в, vitro - скло), хоча тепер частіше культури вирощують у пластмасових судинах. Виділені з тканин клітини інкубують при температурі 38 ° C 39 ° C (для клітин тваринного та людського організмів) та при 22 ° C 28 ° C (для рослинних клітин) у живильному середовищі відповідного складу. Клітини тоді ростуть у вигляді суспензії чи моношару. Суспензійна культура - це вирощування окремих клітин або невеликих їх груп у зваженому стані в рідкому живильному середовищі з використанням апаратури, що забезпечує їхню аерацію та перемішування. Характерною особливістю суспензійних культур є їхня морфологічна та біохімічна гетерогенність. Клітинна популяція містить клітини, які відрізняються за розміром та формою.

Застосування

Застосування у цитології

У цитології цей спосіб зручний тим, що клітини в культурі легко доступні для різних біохімічних маніпуляцій. Працюючи з ними радіоактивні речовини, отрути, гормони та інших. можуть бути введені у потрібній концентрації протягом необхідного часу. Кількість цих речовин може бути значно меншою, ніж при експерименті на тваринах. Зникає загроза того, що речовина буде метаболізована печінкою, екскретуватиметься нирками або відкладеться в м'язах. Це забезпечує отримання реальних значень швидкості дії речовини на клітину або засвоєння її клітиною.

Для дослідження живих рослинних клітин використовують культуру ізольованих протопластів. Ізольовані протопласти можна визначити як «голі» клітини рослин, оскільки клітинна стінка видаляється механічним чи ферментативним способом. Система ізольованих протопластів дає можливість вести селекцію на клітинному рівні, працювати в малому обсязі з великою кількістю індивідуальних клітин, одержувати нові форми рослин шляхом прямого перенесення генів, одержувати соматичні гібриди між віддаленими у систематичному відношенні видами. Оскільки в ізольованих протопластах відразу починається регенерація клітинної оболонки, то є зручним об'єктом для вивчення формування целюлозних мікрофібрил.

Застосування у вірусології

У вірусології культури клітин використовують дуже широко, оскільки із нею порівняно легко працювати у лабораторії, на відміну інших методів — вирощування вірусів на курячих ембріонах чи організмі живих тварин. Крім того, на моношарі клітинної культури можна добре вивчити цитопатичну дію вірусів, за утворенням внутрішньоклітинних включень, бляшок, у реакціях гемадсорбції та гемагглютинації та за колірною пробою. p align="justify"> При роботі з культурами клітин істотні результати можуть бути отримані при роботі з невеликою кількістю культур. Експерименти, які вимагають для підтвердження того чи іншого факту, сотні або тисячі лабораторних тварин можуть бути з рівною статистичною достовірністю поставлені на такій же кількості культур клітин. Таким чином, при лабораторії не треба тримати віварій і відсутні етичні аспекти поводження з хворими тваринами.

Також вивчається трансформація клітин вірусами, механізм якої подібний до механізму виникнення злоякісних пухлин.

Застосування у фармакології

Культури клітин широко застосовуються для тестування дії речовин, які можуть бути використані як лікарські препарати. Незважаючи на те, що результати, отримані на культурах клітин не можна екстраполювати на весь організм, не викликає сумніву, що якщо та чи інша речовина порушує діяльність клітин з кількох різних ліній культур, то слід очікувати негативного ефекту і при введенні цієї речовини в організм.

Застосування у біотехнології

Специфічні культури клітин є цінним джерелом гормонів та інших біологічно активних речовин. Вже зараз вони застосовуються для противірусного білка інтерферону.

Застосування у генетиці

У генетиці здатність клітин до зростання культури використовується в наступних напрямках:

• Клонування
• Зберігання клітин
• Отримання мутантних клітин та робота з ними

Типи культур клітин

1. Первинно-трипсинізовані - отримують із подрібнених тканин людини та тварин шляхом їх обробки трипсином або іншими ферментами. Витримують лише 5-10 поділів (пасажів).

2. перевиваються - клітини, які набули здатності до безмежного розмноження, оскільки є похідними пухлин людини та тварин.

3. Напівперещеплювані (диплоїдні) - можуть витримувати до 100 пасажів, зберігаючи при цьому вихідний диплоїдний набір хромосом.

Найбільш поширені лінії клітин

Вилученим з організму клітинам можна створити такі умови, за яких вони житимуть і розмножуватимуться в штучному середовищі (in vitro - поза організмом, на відміну від in vivo - в організмі), утворюючи культуру клітин. Клітинні культури можна отримувати з таких клітин, які у складі організму втратили здатність до поділу, наприклад, з лейкоцитів периферичної крові. Вивчення поведінки клітин у культурі допомагає зрозуміти механізми контролю розподілу клітин. Встановлено, що у цьому контролі головну роль грають клітинні взаємодії. Спостереження за клітинними культурами показало, що клітини активно діляться і розповзаються по склу судини, де їх культивують до того часу, поки вони почнуть стикатися друг з одним. Контакт поверхонь сусідніх клітин призводить до зупинки руху і одночасно вимикає клітини з розмноження. Коли клітини щільним шаром покриють всю доступну їм поверхню судини, поділ припиниться. Деякий час клітини житимуть, потім у них почнуть виникати різні порушення, і якщо частина клітин не пересадити в іншу посудину, на нове середовище, то культура загине. Цікаво, що пересівання клітин на нове середовище не завжди стимулює розмноження клітин. Клітини, які зазнали кількох пересівань, з часом не приступають до поділу навіть на новому середовищі. Спеціальні експерименти показали, що клітини, взяті з тканин дорослих організмів, здатні ділитися in vitro менше разів, ніж клітини, отримані з ембріонів. Причину цього явища, названого на ім'я вченого, що його відкрив феноменом Хейфліка, багато дослідників бачать у старінні клітин, і в даний час клітинні культури служать об'єктом вивчення механізмів старіння на клітинному рівні. Клітини, взяті з ракових пухлин, поводяться у культурі трохи інакше. Контакт поверхонь клітин не зупиняє їхні поділи, вони продовжують розмножуватися і культура стає багатошаровою. Не підкоряються пухлинні клітини і правилу Хейфліка: вони можуть зазнавати необмежену кількість поділів. Деякі клітини в культурі залишаються диференційованими: синтезують специфічні білки, зберігають морфологічні особливості, наприклад, пухлинні клітини лімфоїдного походження. Інші клітини при перенесенні в штучні умови стають недиференційованими. Зміна умов вирощування іноді призводить до втрати, іноді придбання властивостей диференційованих клітин. Це дозволяє використовувати клітини у культурі вивчення механізмів клітинної диференціювання. Збереження деякими клітинами in vitro диференційованого стану послужило поштовхом до створення клітинних культур із практичними цілями щоб одержати їх речовин, які синтезуються цими клітинами. Так отримують антитіла до різних білків. Можна отримувати і лікарські речовини із клітин тих рослин, які погано вирощуються на плантаціях. Клітинні культури знайшли застосування й у медицині. Для діагностики спадкових захворювань іноді потрібна досить велика кількість клітин організму для того, щоб можна було провести біохімічний аналіз. Якщо діагноз потрібно встановити в ембріона людини, взяття матеріалу на аналіз становить велику проблему. У цьому випадку на допомогу приходить техніка клітинних культур: кілька сотень клітин, взятих з ворсинок оболонки зародка без шкоди йому, достатньо, щоб виростити велику клітинну масу. Клітинні культури використовують і у вірусології - для вирощування вірусів та вивчення їх властивостей, а також у фармацевтичній та хімічній промисловостях для дослідження ушкоджувальної дії на ДНК та хромосоми новостворених синтезованих хімічних речовин.

1966 р.).

Методи культивування клітин отримали значний розвиток у 1940-х 1950-х роках у зв'язку з дослідженнями у галузі вірусології. Вирощування вірусів у культурах клітин дало можливість отримання чистого вірусного матеріалу для вакцин. Вакцина проти поліомієліту стала одним із перших препаратів, масово вироблених з використанням технології культивування клітин. У 1954 р. Ендерс, Уеллер і Роббінс отримали Нобелівську премію "За відкриття здатності вірусу поліомієліту рости в культурах різних тканин". У 1952 р. була отримана широко відома лінія ракових клітин людини HeLa.

Основні засади культивування

Виділення клітин

Для культивування поза організмом живі клітини можна отримати кількома способами. Клітини можуть бути виділені з крові, але зростання в культурі здатні тільки лейкоцити. Моноядерні клітини можуть бути виділені з м'яких тканин за допомогою таких ферментів, як колагеназа, трипсин, проназа, що руйнують позаклітинний матрикс. Крім того, в живильне середовище можна помістити шматочки тканин та матеріалів.

Культури клітин, взятих безпосередньо від об'єкта (ex vivo), називаються первинними. Більшість первинних клітин, крім пухлинних, мають обмежений термін використання. Після певної кількості поділок такі клітини старіють і припиняють ділитися, хоча можуть при цьому зберегти життєздатність.

Існують иммортализованные («безсмертні») лінії клітин, здатні розмножуватися нескінченно. У більшості пухлинних клітин ця здатність є результатом випадкової мутації, але в деяких лабораторних клітинних ліній вона придбана штучно шляхом активації гена теломерази.

Культивування клітин

Клітини вирощують у спеціальних живильних середовищах, при постійній температурі. Для культур рослинних клітин використовується регульоване освітлення, а клітин ссавців зазвичай необхідна також спеціальна газове середовище, підтримувана в інкубаторі клітинних культур . Як правило, регулюється концентрація в повітрі вуглекислого газу та пари води, але іноді також і кисню. Поживні середовища для різних культур клітин розрізняються за складом, концентрації глюкози, складом факторів росту та ін. Фактори росту, що використовуються в живильних середовищах для клітин ссавців, найчастіше додають разом із сироваткою крові. Одним із факторів ризику при цьому є можливість зараження культури клітин пріонами чи вірусами. При культивуванні однією з важливих завдань є виключення або мінімізація використання заражених інгредієнтів. Однак на практиці це буває досягнуто не завжди. Найкращим, але й найдорожчим способом є додавання замість сироватки очищених факторів зростання.

Перехресне забруднення клітинних ліній

Працюючи з клітинними культурами вчені можуть зіштовхнутися з проблемою перехресного забруднення.

Особливості вирощування клітин

При вирощуванні клітин, через постійне поділу може виникнути їх надлишок у культурі, і, як наслідок, виникають такі проблеми:

• Накопичення у живильному середовищі продуктів виділення, у тому числі токсичних.
• Нагромадження у культурі відмерлих клітин, які припинили життєдіяльність.
• Скупчення великої кількості клітин негативно впливає на клітинний цикл, зростання і поділ уповільнюються, а клітини починають старіти і відмирати (контактне інгібування росту).
• З тієї ж причини може розпочатись клітинне диференціювання.

Для підтримки нормального функціонування культур клітин а також для запобігання негативним явищам періодично проводять заміну живильного середовища, пасерування та трансфекція клітин. Щоб уникнути забруднення культур бактеріями, дріжджами або іншими лініями клітин, всі маніпуляції зазвичай проводять з дотриманням правил асептики в стерильному боксі. Для придушення мікрофлори в живильне середовище можуть бути додані антибіотики (пеніцилін, стрептоміцин) та протигрибкові препарати (амфотерицин B).

Культивування людських клітин дещо суперечить правилам біоетики, оскільки клітини, що ізольовано вирощуються, можуть пережити батьківський організм, а потім використовуватися для проведення експериментів або для розробки нових методів лікування та вилучення з цього прибутку. Перше судове рішення у цій галузі було винесено у Верховному суді штату Каліфорнія у справі «Джон Мур проти представників Каліфорнійського університету», згідно з яким пацієнти не мають жодних прав власності на лінії клітин, отриманих з органів, видалених за їх згодою.

Гібридому

Використання клітинних культур

Масове культивування клітин є основою для промислового виробництва вірусних вакцин та різноманітних продуктів біотехнології.

Продукти біотехнології

Промисловим методом з культур клітин отримують такі продукти, як ферменти, синтетичні гормони, моноклональні антитіла, інтерлейкіни, лімфокіни, протипухлинні препарати. Хоча багато простих білків відносно просто можуть бути отримані з використанням рДНК у бактеріальних культурах, більш складні білки, такі як глікопротеїни, в даний час можуть бути отримані тільки з тварин клітин. Одним з таких найважливіших білків є гормон еритропоетин. Вартість вирощування культур клітин ссавців є досить високою, тому в даний час проводяться дослідження щодо можливості виробництва складних білків у культурах клітин комах або вищих рослин.

Тканинні культури

Культивування клітин є невід'ємною частиною технології культивування тканин та тканинної інженерії, оскільки саме воно визначає основи вирощування клітин та підтримки їх у життєздатному стані ex vivo.

Вакцини

Із застосуванням методики культивування клітин у цей час випускаються вакцини проти поліомієліту, кору, епідемічного паротиту, краснухи, вітрянки. Внаслідок загрози пандемії грипу, викликаного штамом вірусу H5N1, зараз уряд Сполучених Штатів фінансує дослідження з отримання вакцини проти пташиного грипу з використанням клітинних культур.

Культури клітин не ссавців

Культури клітин рослин

Культури клітин рослин, як правило, вирощуються або у вигляді суспензії в рідкому поживному середовищі, або у вигляді калюсної культури на твердій поживній основі. Культивування недиференційованих клітин та калюсу вимагає дотримання певного балансу гормонів росту рослин ауксинів та цитокінінів.

Бактеріальні, дріжджові культури

Основна стаття: Бактеріальна культура

Для культивування невеликої кількості клітин бактерій та дріжджів клітини висіють на тверде живильне середовище на основі желатину або агар-агару. Для масового виробництва застосовують вирощування в рідких живильних середовищах (бульйонах).

Вірусні культури

Клітинні культури

Технологія клітинних культур полягає у вирощуванні клітин поза живими організмами.

Культури рослинних клітин

Культури рослинних клітин не тільки є важливим етапом створення трансгенних рослин, але й екологічно прийнятним і економічно виправданимджерелом природних продуктів, що мають терапевтичні властивості, як, наприклад, паклітаксель (paclitaxel), що міститься в тисовій деревині і випускається як препарат для хіміотерапії під назвою Таксол (Taxol). Культури рослинних клітин також застосовуються для виробництва речовин, що використовуються харчовою промисловістю як ароматизатори та барвники.

Культури клітин комах

Вивчення та застосування культур клітин комах розширює можливості розробки та використання людиною біологічних агентів, що знищують комах-шкідників, але не впливають на життєздатність корисних комах, а також не накопичуються у навколишньому середовищі. Незважаючи на те, що переваги біологічних методів боротьби зі шкідниками були відомі вже давно, виробництво таких біологічно активних речовин і патогенних комах і мікроорганізмів у промислових кількостях дуже утруднено. Використання культур клітин комах здатне повністю вирішити цю проблему. Крім того, як і рослинні клітини, клітини комах можуть бути використані для синтезу лікарських препаратів. Ця перспектива нині активно вивчається. Крім того, вивчається можливість використання клітин комах для виробництва VLP-вакцин (VLP – virus-like particle – вірусоподібні частинки) для лікування інфекційних захворювань, таких як атипова пневмонія та грип. Ця методика могла б сильно знизити витрати та виключити проблеми безпеки, пов'язані з традиційним методом, який використовує курячі яйця.

Культури клітин ссавців

Клітинні культури ссавців є одним із головних інструментів, які використовуються фахівцями племінного тваринництва протягом уже не одного десятиліття. У лабораторних умовах яйцеклітини, отримані від корів, що володіють визначними якостями, запліднюються сперматозоїдами відповідних бугаїв. Ембріони, що утворюються при цьому, протягом декількох днів вирощуються в пробірці, після чого імплантуються в матки сурогатних корів-матерів. Цей прийом є основою екстракорпорального запліднення людини.

В даний час використання культур клітин ссавців виходить далеко за рамки штучного запліднення. Клітини ссавців можуть доповнювати, а можливо, колись і замінять використання тварин для тестування безпеки та ефективності нових лікарських препаратів. Крім того, як клітини рослин і комах, клітини ссавців можуть бути використані для синтезу лікарських речовин, особливо деяких тварин білків, занадто складних для того, щоб синтезувати їх за допомогою генетично модифікованих мікроорганізмів. Наприклад, моноклональні антитіла синтезуються саме культурами клітин ссавців.

Вчені також розглядають можливість використання клітин ссавців для вакцин. 2005 року Міністерство охорони здоров'я та соціальних послуг США уклало з компанією Sanofi Pasteur контракт на 97 мільйонів доларів США. Завданням фахівців компанії є розробка методик культивування клітин ссавців з метою прискорення процесу розробки вакцин проти грипу та, відповідно, підвищення готовності людства до пандемії.

Методи терапії, що ґрунтуються на використанні культур дорослих стовбурових клітин, Виявлених в деяких тканинах організму (кістковому мозку, жировій тканині, мозку та ін), також незабаром займуть гідне місце в клінічній практиці. Дослідники встановили, що стволові клітини можуть бути використані організмом для відновлення пошкоджених тканин. Дорослі гемопоетичні стовбурові клітини вже давно використовуються як трансплантати кісткового мозку. Вони необхідні відновлення процесів дозрівання та формування всіх типів клітин крові. Такі клітини можуть бути у великих кількостях отримані з пуповинної крові, проте їх виділення є досить складним процесом.

В даний час дослідники працюють над методами виділення стовбурових клітин із плаценти та жирової тканини. Ряд фахівців зайнятий розробкою методів клітинного репрограмування - повернення в недиференційований стан зрілих клітин організму, наприклад, клітин шкіри, і подальшої стимуляції їх диференціювання в клітини необхідного типу тканини.

Ембріональні стовбурові клітини

Використання ембріональних стовбурових клітинтакож розглядається як потенційний метод терапії багатьох захворювань. Як відомо з назви, ембріональні клітини одержують з ембріонів, зокрема, тих, що розвиваються з яйцеклітин, запліднених in vitro (у клініках, що займаються екстракорпоральним заплідненням) та, за згодою донорів, переданих дослідникам для використання з науковою метою. Зазвичай використовуються бластоцисти - 4-5-денні ембріони, що виглядають під мікроскопом як кульки, що складаються з кількох сотень клітин.

Для виділення людських ембріональних стовбурових клітин внутрішня клітинна маса бластоцисти переноситься в багате на поживні речовини культуральне середовище, де клітини починають активно ділитися. Протягом кількох днів клітини покривають всю поверхню культуральної плашки. Після цього дослідники збирають клітини, що діляться, ділять їх на частини і поміщають у нові плашки. Процес переміщення клітин у нові плашки називається пересіваннямі може багаторазово повторюватися багато місяців. Цикл пересіву клітин називається пасаж. Ембріональні стовбурові клітини, що проіснували в культурі протягом шести і більше місяців без диференціювання (тобто залишаються плюрипотентними – здатними диференціюватися в клітини будь-якої тканини організму) і зберегли нормальний набір генів, називаються лінією ембріональних стовбурових клітин.

Внутрішня поверхня культуральної плашки найчастіше покривається клітинами шкіри мишачих зародків, генетично модифікованих на нездатність до поділу. Ці клітини утворюють шар фідера – «живильну підкладку», завдяки якій ембріональні клітини прикріплюються до поверхні. Вчені намагаються вдосконалити існуючий метод і виключити необхідність використання мишачих клітин, оскільки їхня присутність завжди привносить ризик потрапляння в культуру людських клітин вірусних частинок та мишачих білків, здатних викликати алергічну реакцію.

Максимальна цінність терапії з використанням стовбурових клітин та тканинної інженерії може бути досягнута в тому випадку, якщо терапевтичні стовбурові клітини та тканини, вирощені з них, є генетично ідентичними клітин реципієнта. Тому, якщо сам пацієнт не є їх джерелом, стовбурові клітини мають бути модифіковані методом заміщення їхнього генетичного матеріалу генами реципієнта і лише потім диференційовані клітини специфічного типу. На даний час процедура заміщення генетичного матеріалу та репрограмування може бути успішно виконана тільки з ембріональними стовбуровими клітинами.