Бактерии фаги. Не антибиотиками едиными. Где живут бактериофаги «на воле»

Единственной эффективной альтернативой применению антибиотиков от болезнетворных бактерий на сегодняшний день являются фаги или бактериофаги. Они представляют собой специфические вирусы, которые избирательно поражают различные типы микробов. Медицине известно несколько групп, на которые подразделяются бактериофаги – виды и назначение данных микроорганизмов служат основанием для общепринятой классификации.

Какие бывают бактериофаги?

Существует 19 семейств рассматриваемых вирусов. Они различаются по типу нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК), строения генома и форме.

В медицинской практике бактериофаги классифицируют в соответствии со скоростью поражения патогенных бактерий:

1. Вирулентные. Вирус, попадая в клетки микробов, начинает быстро и активно размножаться, почти мгновенно приводит к гибели бактерий (литический эффект).
2. Умеренные. Бактериофаги медленно и лишь частично разрушают строение болезнетворных микроорганизмов, но вызывают в них необратимые изменения, которые передаются следующим поколениям микробов (лизогенный эффект).

Сегодня описываемые виды вирусов применяются в качестве альтернативы антибиотикам для лечения разнообразных бактериальных инфекций. Среди их преимуществ стоит отметить следующие достоинства:

1. Удобная форма выпуска. Бактериофаги производятся в таблетках и в виде раствора для перорального приема.
2. Меньшее количество побочных действий. В отличие от антибиотиков, бактериофаги реже вызывают аллергические проявления, не производят вторичных негативных эффектов на организм.
3. Отсутствие резистентности микробов. Бактериям сложнее адаптироваться к вирусам, а к комплексному воздействию почти невозможно.

При этом имеются и некоторые недостатки:

Виды бактериофагов и их использование

Учитывая специфичность описываемых вирусов, в медицине предпочитают применять поливалентные и комплексные бактериофаги, содержащие несколько разновидностей данных микроорганизмов.

Бактериофаги (вирусы бактерий)

Строение бактериофагов изучают с помощью электронной микроскопии образцов, контрастированных напылением металлов или фосфорно-вольфрамовой кислотой.

В зависимости от формы и структурной организации фаги подразделяют на несколько морфологических типов :

нитевид­ные;

Если, с другой стороны, предусматривается количественный анализ количества вирусного генома, присутствующего в образце, можно было бы предусмотреть в будущем близких к порогам настройки, выше которых была бы корреляция между наличием генома и наличием инфекционных кишечных вирусов.

Наконец, третья возможность, позволяющая учитывать вирусологический параметр, основана на идентификации индикаторов, которые действительно специфичны для вирусного заражения. Признано, что фекальные колиформы и стрептококки не приспособлены для оценки вирусологического риска, хотя некоторые английские авторы сообщали в последние годы, что в купальных водах скорость фекальных стрептококков коррелирует с частотой гастроэнтерита у пловцов.

мелкие кубические (некоторые из них име­ют аналоги отростков), без отростка, с коротким отростком, с длинным отростком;

фаги сперматозоидной формы, т. е. с кубической головкой и хвостовым отростком, имеющие сокращающийся или не сокращающийся чехол отростка.

Размеры фагов колеблются от 20 до 800 нм (нитевидный тип).

Наиболее изучены крупные бактериофаги, имеющие форму сперматозоида и сокраща­ющийся чехол отростка, например, колифаги Т2, Т4, Т6. Они состоят из головки икосаэд рического типа размером 65-100 нм и хвосто­ вого отростка длиной более 100 нм (рис. 3.14).

Хвостовой отросток имеет внутри полый ци­ линдрический стержень , сообщающийся с головкой, а снаружи - чехол , способный к сокращению, наподобие мышцы. Чехол присоединен к воротничку, окружающему стер­жень около головки. На дистальном конце отростка имеется шестиугольная базальная ,пластинка с шипами , от которых отходят нитевидные структуры - фибриллы.

Бактериофаги содержат или ДНК, или РНК. Нуклеиновые кислоты фагов могут быть двунитевыми, однонитевыми, линейными, коль­цевыми. Большинство фагов содержит двунитевую ДНК, замкнутую в кольцо.

У фагов, имеющих форму сперматозоида, одна молекула двунитевой суперспирализованной ДНК находится внутри головки и за­щищена капсидом. Капсид состоит из белко­вых молекул - идентичных полипептидных субъединиц, уложенных по икосаэдрическому (кубическому) типу симметрии. В состав головки также входит полипептид, состоя­щий из аспарагиновой, глутаминовой кислот и лизина. У некоторых фагов внутри головки находится внутренний гистоноподобный бе­лок, обеспечивающий суперспирализацию ДНК. Сокращающийся чехол хвостового от­ростка образован также белковыми субъеди­ницами, уложенными по спиральному типу симметрии, содержащими АТФ и ионы Са 2+ . У некоторых фагов (например, Т2) в дистальной части отростка содержится фермент лизоцим.

Антигенные свойства. Бактериофаги содер­жат группоспецифические и типоспецифические антигены, обладают иммуногенными свойствами, вызывая синтез специфических антител в организме. Антитела, взаимодейс­твуя с бактериофагами, могут нейтрализовать их литическую активность против бактерий. По типоспецифическим антигенам фаги де­лят на серотипы.

Резистентность. По сравнению с ви­русами человека бактериофаги более ус­тойчивы к факторам окружающей среды. Инактивируются под действием температуры 65-70 °С, УФ-облучения в высоких дозах, ио­низирующей радиации, формалина и кислот. Длительно сохраняются при низкой темпера­туре и высушивании.

Взаимодействие фагов с бактериальной клеткой. Бактериофаги инфицируют строго определенные бактерии, взаимодействуя со специфическими рецепторами клетки.

По специфичности взаимодействия различают следующие бактериофаги:

поливалентные, взаимодействующие с родственными видами бактерий;

моновалентные, взаимодействую­щие с бактериями определенного вида;

типо­вые, взаимодействующие с отдельными типа­ми (вариантами) бактерий данного вида.

К сожалению, это время великих сталинских чисток. Этот высокопоставленный ученый, который, тем не менее, поддерживает Сталина, будет исполняться по приказу отвратительного Лорана Берия, главы секретной полиции. Для желанной женщины или для повторных контактов с демонизированным иностранцем никто не знает, почему. Феликс д'Эрелл укрылся во Франции. В то время многие лаборатории производят фаги в мире. Успехи обнадеживают. Но во время войны рождается замечательный пенициллин, и антибиотики затмевают этот многообещающий путь.

Грузия останется единственной страной наряду с Польшей и Россией, чтобы разработать то, что теперь будет называться «фаготерапия». Фаг Николая Булгакова стал крупной звездой в исследовательских лабораториях. Общепринятой практикой является проверка пористости хирургических перчаток. Это 10 9 тонн, или 5% от общей биомассы. В одном мл морской воды от 10 4 до 10 8.

Взаимодействие фагов с бактериями может протекать, как и у других вирусов, по:

продук­тивному,

абортивному

интегративному ти­пам.

При продуктивном типе взаимодействия образуется фаговое потомство, бактерии лизируются; при абортивном типе - фаговое по­томство не образуется и бактерии сохраняют свою жизнедеятельность; при интегративном типе - геном фага встраивается в хромосому бактерии и сосуществует с ней.

В зависимости от типа взаимодействия различают вирулент­ ные и умеренные бактериофаги.

Вирулентные бактериофаги взаимодейс­твуют с бактерией по продуктивному типу. Проникнув в бактерию, они репродуцируются с образованием 200-300 новых фаговых частиц и вызывают лизис бактерий. Взаимодействие бактериофага с бактерией напоминает взаимо­действие вирусов человека с клеткой хозяина. Специфическая адсорбция фагов на бактери­альной клетке происходит при наличии ком­плементарных рецепторов липопротеиновой или липополисахаридной природы в ее кле­точной стенке. На бактериях, лишенных кле­точной стенки (протопласты, сферопласты), бактериофаги не адсорбируются. Некоторые фаги в качестве рецепторов используют поло­вые пили бактерий.

Зараженные лица, некоторые из которых уже не могут предлагать ампутации, ужасные, и у которых достаточно денег, чтобы заплатить за пребывание в Тбилиси. Они пользуются 80-летним опытом врачей, которые остались на краю западной истории болезни. В Европе его реабилитация продолжается.

Но это уже другая история. Дайте определение трансформации. Дайте определение сопряжения. Определите определение трансдукции. Можете ли вы указать их основные характеристики? Каковы были научные последствия этих переводов? Каковы медицинские последствия этих переводов?

Фаги, имеющие хвостовой отросток, при­крепляются к бактериальной клетке свобод­ным концом отростка (фибриллами, базальной пластинкой). Проникновение фаговой нуклеиновой кислоты в бактерию наиболее изучено у бактериофагов, имеющих отрос­ток с сокращающимся чехлом. В результате активации АТФ чехол хвостового отростка сокращается, и стержень с помо­щью лизоцима, растворяющего прилегающий фрагмент клеточной стенки, как бы просверливает оболочку клетки. При этом ДНК фа­га, содержащаяся в его головке, проходит в форме нити через канал хвостового стержня и инъецируется в клетку, а капсид фага остается снаружи бактерии.

Некоторые мелкие кубические фаги, спо­собные адсорбироваться на половых пилях, вводят свою нуклеиновую кислоту через ка­нал этих пилей. ДНК нитевидных фагов про­ходит в бактерию вместе с одним из капсид-ных белков.

Инъецированная внутрь бактерии нукле­иновая кислота подавляет биосинтез компо­нентов клетки, заставляя ее синтезировать нуклеиновую кислоту и белки фага. Эти про­цессы схожи с репродукцией вирусов чело­века. После образования компонентов фага происходит самосборка частиц: сначала пус­тотелые капсиды головок заполняются нук­леиновой кислотой, затем сформированные головки соединяются с хвостовыми отростка­ми. В результате изменения внутриклеточного осмотического давления и действия фагового лизоцима происходит разрушение оболочки, лизис бактерии и выход фагов из нее. Весь литический цикл от адсорбции бактериофага на бактерии до его выхода из нее занимает 20-40 мин.

Умеренные бактериофаги в отличие от ви­рулентных взаимодействуют с чувствитель­ными бактериями либо по продуктивному, либо по интегративному типу. Продуктивный цикл умеренного фага идет в той же последовательности, что и у ви­рулентных фагов, и заканчивается лизисом клетки. При интегративном типе взаимодейс­твия ДНК умеренного фага встраивается в хромосому бактерии, реплицируется синх­ронно с геномом размножающейся бактерии, не вызывая ее лизиса. ДНК бактериофага, встроенная в хромосому бактерии, называется профагом, а культура бактерий - лизогенной. Такое сосуществование бактерии и умерен­ного бактериофага называется лизогенией (от греч. lysis - разложение, genea - происхож­дение). Профаг, ставший частью хромосомы бактерии, при ее размножении передается по наследству потомкам.

Каким образом нуклеиновая кислота при­соединяется к бактериальной хромосоме?После проникновения в бактерию ДНК уме­ренного фага приобретает форму кольца, а затем интегрирует по типу кроссинговера в строго определенную гомологичную область хромосомы клетки.

Итак, при лизогении образование фагового потомства не происходит. В основе «сдер­живающего» механизма репродукции фагов лежит образование в бактерии специфическо­го репрессора - низкомолекулярного белка, подавляющего транскрипцию фаговых генов. Биосинтез репрессора детерминируется ге­нами профага. Наличием репрессора можно объяснить способность лизогенных бактерий приобретать иммунитет (невосприимчивость) к последующему заражению гомологичным или близкородственными фагами. Под им­мунитетом в данном случае понимается такое состояние бактерии, при котором исключа­ется процесс вегетативного размножения вы­шеуказанных фагов и лизис клетки. Однако термин «лизогения» отражает потенциальную возможность лизиса бактерии, содержащей профаг. Действительно, профаги некоторой части лизогенной культуры бактерий могут спонтанно (самопроизвольно) или направ­ленно под действием ряда физических или химических факторов дерепрессироваться, исключаться из хромосомы, переходить в ве­гетативное состояние. Этот процесс заканчи­вается продукцией фагов и лизисом бактерий. Частота спонтанного лизиса бактерий в лизогенных культурах невелика (10 2 , 10~ 6), т. е. не захватывает все клетки, обладающие иммуни­тетом. Частоту лизиса бактерий можно значи­тельно увеличить, воздействуя на лизогенную культуру индуцирующими агентами (УФ-лучи, ионизирующее излучение, перекисные соеди­нения, митомицин С и др.). Сам же фено­мен воздействия, приводящий к инактивации репрессора, называется индукцией профага. Явление индукции используют в генной ин­женерии. Однако спонтанный лизис лизогенных культур может нанести вред микробиоло­гическому производству. Так, если микроорга­низмы - продуценты биологически активных веществ оказываются лизогенными, сущест­вует опасность перехода фага в вегетативное состояние, что приведет к лизису производс­твенного штамма этого микроба.

Геном профага может придавать бактерии новые, ранее отсутствовавшие у нее свойс­тва. Этот феномен изменения свойств мик­роорганизмов под влиянием профага получил название фаговой конверсии (от лат. conver - sio - превращение). Конвертироваться могут морфологические, культуральные, биохими­ческие, антигенные и другие свойства бакте­рий. Например, наличие профага в дифтерий­ной палочке обусловливает ее способность продуцировать дифтерийный экзотоксин.

Умеренные фаги могут быть дефектными, т. е. неспособными образовывать зрелые фа­говые частицы ни в естественных условиях, ни при индукции. Геном некоторых умеренных фагов (Р1) может находиться в цитоплазме бактериальной клетки в так называемой плаз-мидной форме, не включаясь в ее хромосому. Такого рода умеренные фаги используют в качестве векторов в генной инженерии.

Практическое применение фагов. Бактерио­фаги используют в лабораторной диагнос­тике инфекций при внутривидовой иденти­фикации бактерий, т. е. определении фаговара (фаготипа). Для этого применяют метод фаготипирования , основанный на строгой специфичности действия фагов: на чашку с плотной питательной средой, засеянной «газоном» чистой культурой возбудителя, на­носят капли различных диагностических типоспецифических фагов. Фаговар бактерии определяется тем типом фага, ко­торый вызвал ее лизис (образование сте­рильного пятна, «бляшки», или «негативной колонии», фага). Методику фаготипирова­ния используют для выявления источника и путей распространения инфекции (эпидеми­ологическое маркирование). Выделение бак­терий одного фаговара от разных больных указывает на общий источник их заражения.

Фаги применяют также для лечения и про­ филактики ряда бактериальных инфекций. Производят брюшнотифозный, сальмонел-лезный, дизентерийный, синегнойный, ста­филококковый, стрептококковый фаги и комбинированные препараты (колипротейный, пиобактериофаги и др). Бактериофаги назначают по показаниям перорально, парен­терально или местно в виде жидких, таблетированных форм, свечей или аэрозолей.

Бактериофаги широко применяют в генной инженерии в качестве векторов для получе­ния рекомбинантных ДНК.

Качественный метод определения фагов E . coli . Чашку Петри с питательным агаром засевают суточной бульонной культурой кишечной палочки газоном и подсушивают при 37 "С втечение 10-15 мин. Затем на поверхность газона наносят каплю фага и наклоняют так, чтобы капля стекла к противоположному краю. После суточной инкубации в термостате просматривают чаш­ку, отмечая наличие зоны лизиса по месту стекания капли фага.

Количественный метод - определение титра фага по методу Грациа. Для постановки опыта предварительно: а) разливают питательный агар в чашки Петри, подсушивают в термостате; б) приготовленный полужидкий (0,7 %) питательный агар, разлитый по 3-4 мл в пробирки, растапливают в водяной бане. Делают 10-кратные разведения исследуемого фага (10~ 2 -10~ 7 в зависимости от предполагаемого титра) в изотоническом растворе хлорида натрия. Затем 0,5 мл из последнего разведе­ния фага (10~ 7) смешивают с таким же объемом суточной бульонной культуры чувствительных к фагу бактерий и выли­вают в пробирку с полужидким агаром, охлажденным до 45 "С. Смесь быстро выливают на поверхность агара в чашке Петри, где она застывает в виде тонкого слоя. Так же готовят смесь из следующего разведения фага (10~ 6) с бактериями и полу­жидким агаром и выливают на поверхность агара в другой чашке, затем - из разведения 10~ 5 . После застывания второго слоя агара чашки инкубируют при 37 *С, затем подсчитывают число негативных колоний фага. Число этих колоний соответст­вует количеству фаговых частиц в засеянной смеси. Исходя из него, можно вычислить количество пятнообразующих единиц в 1 мл исходной суспензии фага. Эта величина, характеризую­щая концентрацию фага, называется его титром (табл. 5.3.1).

Определение спектра литичес кого действия фага. Чашку с пи­тательным агаром делят на квад­раты по числу испытуемых бак­териальных культур. На каждый квадрат петлей наносят каплю со­ответствующей бульонной куль­туры и распределяют ее по агару в пределах данного квадрата. За­тем на каждый засеянный квад­рат петлей или пастеровской пи­петкой наносят по одной капле испытуемого фага. После суточ­ной инкубации в термостате просматривают чашку, отмечая те квадраты, где имеется сплош­ной лизис бактерий или так на­зываемые стерильные пятна набактериальном газоне. Количество различных бактериальных культур, которые лизируются испытуемым фагом, определяет широту спектра его литического действия.

Фаготипирование бактерий. Испытуемую суточную бульон­ную культуру бактерий засевают на поверхность питательного агара в чашке Петри, слегка подсушивают в термостате, затем делят на квадраты, на которые пастеровской пипеткой наносят по одной капле различных типоспецифических фагов. После суточной инкубации отмечают на чашке те квадраты, в кото­рых имеется сплошной лизис бактерий. Фаготип бактериаль­ной культуры определяется тем типом фага, который вызывает ее лизис.

Определение лизогении. Исследуемую суточную бульонную культуру центрифугируют для отделения фага от бактерий. В том случае, если бактерии спонтанно продуцируют фаг, последний будет содержаться в надосадочной жидкости. Для выявления фага надосадочную жидкость засевают на газон индикаторной (чувствительной) бактериальной культуры, на котором через

1 сут инкубации при 37 "С образуются очаги лизиса - "сте­рильные" пятна. При отрицательном результате опыта иссле­дуемую бактериальную культуру предварительно подвергают УФ-облучению с целью индукции содержащегося в ней профага. Затем поступают так же, как и в предыдущем опыте.