Витамин в 6 количественный анализ. Определение витаминов. Протокол самостоятельной работы

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Методы количественного ОФС.1.2.3.0017.15

определения витаминов Взамен ст. ГФ XI , вып.2

В данной статье изложены общие принципы определения витаминов в субстанциях и лекарственных формах с использованием методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), спектрофотометрии и титриметрии.

Приведенные типовые методики позволяют количественно определять следующие соединения: витамин А (ретинол, ретинола ацетат и ретинола пальмитат), витамин D (холекальциферол и эргокальциферол), витамин Е (a-токоферол и a— токоферола ацетат), витамин К 1 (фитоменадион), b-каротин, витамины В 1 (тиамина хлорид, тиамина бромид и тиамина мононитрат), В 2 (рибофлавин, рибофлавинмононуклеотид), В 3 (кислоту никотиновую, никотинамид), В 5 (кислоту пантотеновую и ее соли, пантенол), В 6 (пиридоксина гидрохлорид), В С (кислоту фолиевую), В 12 (цианокобаламин), витамин С (кислоту аскорбиновую или ее натриевую или кальциевую соли, аскорбилпальмитат), d — биотин, рутин.

ГОСТ Р 54635-2011

Группа Н59

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ

Метод определения витамина А

Functional food products. Method of vitamin A determination

ОКС 67.050
ОКСТУ 9109

Дата введения 2013-01-01

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом N 184-ФЗ "О техническом регулировании" от 27 декабря 2002 г. , а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Учреждением Российской академии медицинских наук Научно-исследовательским институтом питания

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 36 "Функциональные пищевые продукты"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 12 декабря 2011 г. N 784-ст

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ


Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

1 Область применения

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на функциональные пищевые продукты и устанавливает метод определения массовой доли витамина А в виде ретинола, ацетата ретинола, пальмитата ретинола с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ).

Диапазон измерений массовой доли витамина А составляет от 0,5 до 10,0 млн.

Примечание - Настоящий стандарт допускается распространять на пищевые продукты при условии соблюдения диапазона измерений.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 8.563-2009 Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений

ГОСТ Р 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2006 * Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
________________
ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ Р 52062-2003 Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ Р 52179-2003 Маргарины, жиры для кулинарии, кондитерской, хлебопекарной и молочной промышленности. Правила приемки и методы контроля

ГОСТ Р 52349-2005 Продукты пищевые. Продукты пищевые функциональные. Термины и определения

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 4166-76 Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4517-87 Реактивы. Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9293-74 Азот газообразный и жидкий. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13496.0-80 * Комбикорма, сырье. Методы отбора проб
________________
* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ Р ИСО 6497-2011 , здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия

ГОСТ 19627-74 Гидрохинон (парадиоксибензол). Технические условия

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб канализу

ГОСТ 27025-86 Реактивы. Общие указания по проведению испытаний

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ Р 52349 , а также следующий термин с соответствующим определением:

4 Сущность метода

Определение витамина А в экстракте, полученном из анализируемой пробы, проводят разделением методом ВЭЖХ с последующим фотометрическим или флуориметрическим детектированием. При необходимости экстракт получают после щелочного гидролиза анализируемой пробы.

Количественный анализ проводят методом внешнего стандарта с использованием площади или высоты пиков ретинола, ацетата ретинола, пальмитата ретинола.

5 Требования безопасности

5.1 Условия безопасного проведения работ

При выполнении испытаний необходимо соблюдать требования пожарной безопасности, установленные ГОСТ 12.1.004 , электробезопасности - ГОСТ Р 12.1.019 , техники безопасности при работе с реактивами - ГОСТ 12.1.007 , а также требования, изложенные в технической документации на спектрофотометр, хроматограф, другие приборы и оборудование.

Помещение, в котором проводят испытания, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Контроль за содержанием вредных веществ в воздухе рабочей зоны следует проводить в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005 .

При работе с газовыми баллонами необходимо руководствоваться .

5.2 Требования к квалификации оператора

К выполнению испытаний и обработке результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием по профессиям: химик, инженер-химик, техник, лаборант, с опытом работы в химической лаборатории. Первое применение метода в лаборатории следует проводить под наблюдением квалифицированного специалиста в области ВЭЖХ.

6 Условия выполнения испытания

6.1 Общие условия

Испытания проводят в нормальных лабораторных условиях: температура окружающей среды - (25±5) °С; относительная влажность - (65±15)%; частота переменного тока - (50±5) Гц; напряжение в сети - (220±10) В.

При приготовлении и хранении растворов следует выполнять требования ГОСТ 27025 , ГОСТ 4517 .

Для предотвращения разрушения витамина А анализ испытуемого материала и стандартов проводят в присутствии антиоксиданта (аскорбиновой кислоты, гидрохинона, пирогаллола), предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного света.

6.2 Условия фотометрических измерений

Условия фотометрических измерений приведены в таблице 1.


Таблица 1 - Условия фотометрических измерений

6.3 Условия хроматографического анализа

Температура хроматографической колонки: 25 °С или температура окружающей среды.

Скорость потока подвижной фазы: 0,7 см/мин (ориентировочное значение).

Объем вводимой пробы: 50·10 см.

Подвижная фаза: смесь ацетонитрила, метилового спирта, метилена хлористого в объемном соотношении 50:45:5.

Проверку оптимальности условий хроматографического разделения осуществляют путем хроматографического анализа смешанного раствора ретинола, ацетата ретинола, пальмитата ретинола с массовой концентрацией каждого вещества не менее 0,4 мкг/см. Данный смешанный раствор готовят из основных растворов ретинола, ацетата ретинола, пальмитата ретинола по аналогии с методикой приготовления рабочих растворов по 8.1.2. Эффективность хроматографического разделения признается удовлетворительной, если коэффициент разделения соседних пиков ретинола, ацетата ретинола, пальмитата ретинола составляет не менее 1,3. В противном случае для достижения требуемой эффективности разделения экспериментальным путем подбирают скорость потока подвижной фазы или проводят испытания других колонок.

7 Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

7.1 Для определения содержания массовой доли витамина А применяют следующие средства измерений, вспомогательное оборудование и материалы:

- весы по ГОСТ Р 53228 , обеспечивающие точность взвешивания с пределами допускаемой абсолютной погрешности ±0,1 мг;

- спектрофотометр со спектральным диапазоном работы от 190 до 1100 нм, основной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1%;

- кюветы кварцевые с длиной оптического пути 1 см;

- хроматограф высокоэффективный жидкостный, включающий следующие элементы: насос; устройство для ввода проб; флуориметрический детектор (длины волн, нм: возбуждения - 325 нм, эмиссии - 470 нм) или спектрофотометрический детектор (длина волны детектирования - 325 нм) с уровнем шумов не более 10 единиц оптической плотности и относительной погрешностью измерений не более 10%; колонку аналитическую для ВЭЖХ диаметром 0,30-0,46 см, длиной 10-25 см, заполненную октадецилсиликагелем с размером частиц 5 мкм; регистрирующее устройство - интегратор или самописец, позволяющий проводить измерение площади (или высоты) пика с погрешностью не более 1%; программное обеспечение для обработки полученных результатов измерений;

- фильтры для фильтрования подвижной фазы и анализируемых растворов (например, с размером пор 0,45 мкм);

- микрошприц типа "Гамильтон" вместимостью 0,1 см для ввода проб в жидкостный хроматограф;

- пипетки градуированные 1(2,3)-1(2)-1-0,5(1,2,5,10,25) по ГОСТ 29227 или дозаторы автоматические с аналогичными или изменяемыми объемами доз с относительной погрешностью дозирования не более ±1%;

- цилиндры 1-50(100,250)-1(2) по ГОСТ 1770 ;

- колбы мерные 2-50(100,250,500,1000)-2 по ГОСТ 1770 ;

- пробирки мерные с притертыми пробками П-2-5(10,15,20,25)-0,1(0,2)ХС по ГОСТ 1770 ;

- стаканы В(Н)-1-50(100,150,250)ТХС по ГОСТ 25336 ;

- колбы круглодонные К-1-100(250,500)-29/32ТС по ГОСТ 25336 ;

- воронки В-36(56)-80ХС, В-75-110(140)ХС, В-100-150ХС по ГОСТ 25336 ;

- линейка металлическая с ценой деления 1 мм по ГОСТ 427 ;

- встряхиватель для колб и пробирок с диапазоном частот колебаний платформ 100-150 колебаний в минуту;

- центрифуга, обеспечивающая 4-6 тыс. об/мин;

- баня водяная с регулятором нагрева, поддерживающая температуру от 40 ° до 100 °С;

- баня ультразвуковая лабораторная рабочим объемом не менее 2 дм;

- испаритель ротационный с диапазоном рабочего давления от 7 мм рт.ст. до 760 мм рт.ст. (от 9·10 Па до 10·10 Па) или насос водоструйный по ГОСТ 25336 ;

- холодильники стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336 ;

- термометр лабораторный жидкостный диапазоном температур от 0 °С до 100 °С, ценой деления шкалы 1 °С по ГОСТ 28498 ;

- баллон с газообразным азотом по ГОСТ 9293 , ос.ч., и по ;

- бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026 ;

- плитка электрическая закрытого типа по ГОСТ 14919 ;

- мельница лабораторная электрическая;

- холодильник бытовой по ГОСТ 16317 .

7.2 При выполнении измерений применяют следующие реактивы и материалы:

- спирт этиловый абсолютный () массовой долей основного вещества не менее 99,9%;

- спирт этиловый ректификованный () массовой долей основного вещества не менее 96% или по ГОСТ Р 51652 , ГОСТ 18300 ;

- спирт метиловый () массовой долей основного вещества не менее 99,9%;

- ацетонитрил () массовой долей основного вещества не менее 99,8%;

- метилен хлористый () массовой долей основного вещества не менее 99,8%;

- н-гексан () массовой долей основного вещества не менее 99%;

- этилацетан () массовой долей основного вещества не менее 99% или по ГОСТ 8981 ;

- пропанол-2 () массовой долей основного вещества не менее 99%;

- эфир петролейный, перегнанный при температуре (50±10) °С, очищенный от перекисей;

- эфир диэтиловый, очищенный от перекисей, содержащий 0,1% пирогаллола, по ;

- калия гидроокись (КОН) по ГОСТ 24363 , х.ч. или ч.д.а., раствор КОН массовой долей 50%;

- натрий сернокислый () безводный массовой долей основного вещества не менее 99,5% или по ГОСТ 4166 , х.ч.;

- воду дистиллированную по ГОСТ 6709 ;

- кислоту аскорбиновую () по или , х.ч.;

- гидрохинон () массовой долей основного вещества не менее 99% или по ГОСТ 19627 ;

- пирогаллол () массовой долей основного вещества не менее 99%;

- бутилгидрокситолуол () массовой долей основного вещества не менее 99%;

- ретинол ()=286,5 г/моль, массовой долей основного вещества не менее 90%;

- ретинола ацетат ()=328,5 г/моль, массовой долей основного вещества не менее 90% или по ;

- ретинола пальмитат ()=524,9 г/моль, массовой долей основного вещества не менее 90% или по .

7.3 Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

8 Подготовка к выполнению измерений

8.1 Приготовление растворов

8.1.1 Основные стандартные растворы

Растворяют около 50 мг ретинола (или ретинола ацетата, или ретинола пальмитата) в 50 см абсолютного этилового спирта. Массовая концентрация ретинола (или ретинола ацетата, или ретинола пальмитата) в растворе составляет примерно 1,0 мг/см. Далее 2 см раствора ретинола (или ретинола ацетата, или ретинола пальмитата) с помощью пипетки помещают в мерную колбу объемом 50 см и доводят до метки спиртом этиловым абсолютным. Массовая концентрация соединений в полученных основных стандартных растворах составляет примерно 40 мкг/см.

8.1.2 Градуировочные растворы

Из основных стандартных растворов готовят не менее четырех градуировочных растворов ретинола (или ретинола ацетата, или ретинола пальмитата) в диапазоне массовых концентраций 0,4-4,0 мкг/см путем точного разведения основных стандартных растворов спиртом этиловым абсолютным в мерной колбе вместимостью 50 см.

Определение массовой концентрации ретинола (или ретинола ацетата, или ретинола пальмитата), (мкг/см) проводят после измерения оптической плотности градуировочных растворов в кварцевой кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см на спектрофотометре при оптимальной длине волны и вычисляют по формуле

где - значение оптической плотности градуировочного раствора;

- значение оптической плотности градуировочного раствора в абсолютном этиловом спирте или 2-пропаноле массовой концентрации 1 г в 100 см при толщине поглощающего слоя 1 см, приведенное в таблице 1;

10 - коэффициент пересчета;

- коэффициент, учитывающий поглощение сопутствующих компонентов при измерении , вычисляемый по формуле

где - площадь пика стандартного вещества при проведении ВЭЖХ анализа, mAU·с (AU·с);

- сумма площадей пиков сопутствующих компонентов при проведении ВЭЖХ анализа стандартного вещества, mAU·с (AU·с).

Все растворы в ходе приготовления и анализа тщательно защищают от воздействия ультрафиолетового излучения. Растворы ретинола хранят при температуре ниже 4 °С в течение 2 мес. Свежеприготовленные растворы ретинола ацетата или ретинола пальмитата используют для измерений в течение 2-3 ч при комнатной температуре.

8.2 Отбор и подготовка проб

8.2.1 Отбор проб проводят по ГОСТ 13496.0 , ГОСТ 26809 , ГОСТ Р 52062 , ГОСТ Р 52179 .

8.2.2 Крупные частицы средней пробы, выделенной методом квартования из лабораторной пробы, измельчают с использованием подходящего оборудования (например, лабораторной мельницы) до такого состояния, чтобы весь продукт проходил через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Размолотую пробу тщательно перемешивают.

Анализируемые пробы гомогенизируют, избегая воздействия повышенной температуры.

8.2.3 Пищевые продукты на масложировой основе с массовой долей воды 1% и менее, обогащенные ацетатом ретинола или пальмитатом ретинола

2-5 г анализируемой пробы переносят в мерную колбу вместимостью 25 см, растворяют в 10-15 см н-гексана, используя ультразвуковую баню для ускорения растворения. Раствор доводят до метки н-гексаном. При необходимости раствор можно использовать для последующего разведения н-гексаном. Затем аликвоту гексанового раствора упаривают в токе азота и сухой остаток перерастворяют в элюенте.

8.2.4 Пищевые продукты на масложировой основе с массовой долей воды не более 20%, обогащенные ацетатом ретинола или пальмитатом ретинола

2-5 г анализируемой пробы растворяют при интенсивном перемешивании в 10-15 см н-гексана, используя ультразвуковую баню для ускорения растворения. Удаляют избыток воды добавлением безводного сульфата натрия. Содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр для отделения нерастворившегося осадка. Колбу промывают дважды 5 см н-гексана. Фильтраты собирают в мерную колбу вместимостью 25 см. Раствор доводят до метки н-гексаном. Затем аликвоту гексанового раствора упаривают в токе азота и сухой остаток перерастворяют в элюенте.

8.2.5 Другие пищевые продукты, обогащенные ацетатом ретинола или пальмитатом ретинола

Для проведения щелочного гидролиза 1-30 г анализируемой пробы сухого или жидкого материала помещают в круглодонную колбу вместимостью 100-500 см. К сухому материалу добавляют 5-20 см воды и нагревают на водяной бане при температуре 60 °С - 70 °С при перемешивании в течение 5 мин. Затем прибавляют 50-150 см этилового ректификованного спирта (или метилового спирта), 0,2-1,0 г антиоксиданта (аскорбиновой кислоты, гидрохинона, бутилгидрокситолуола), 4-40 см 50%-ного раствора гидроокиси калия и нагревают в течение 15-45 мин на водяной бане с обратным холодильником при температуре 80 °С-100 °С.

Рекомендуемые соотношения испытуемого материала и реактивов приведены в таблице 2.


Таблица 2 - Рекомендуемые соотношения испытуемого материала и реактивов

При проведении щелочного гидролиза при комнатной температуре в течение не менее 16 ч используют вышеуказанные соотношения материала и реактивов.

Если после охлаждения на поверхности смеси остается слой масла или жира, то объем добавленного раствора KОН и время проведения щелочного гидролиза увеличивают.

После окончания гидролиза содержимое колбы быстро охлаждают до (20±5) °С и количественно переносят в делительную воронку. Колбу ополаскивают водой, объем которой равен объему добавленного этилового спирта (или метилового), и воду сливают в ту же воронку. Витамин А экстрагируют диэтиловым (или петролейным) эфиром, н-гексаном, н-гексаном с добавкой диэтилового (или петролейного) эфира в объемном соотношении 1:1 в течение двух минут. Для учета возможной неполной экстракции витамина А следует использовать метод добавок стандартов.

Экстракцию повторяют три-четыре раза порциями экстрагента 50-100 см. Объединенный экстракт отмывают от щелочи три-четыре раза порциями воды 50-150 см до исчезновения щелочной реакции промывных вод (по универсальной индикаторной бумаге).

Для удаления воды экстракт фильтруют через фильтр с 2-5 г безводного сульфата натрия. Далее экстракт упаривают досуха, используя роторный испаритель при температуре не выше 50 °С и затем перерастворяют в элюенте. При необходимости раствор можно использовать для последующего разведения.

Раствор, полученный по 8.2.3 (8.2.4, 8.2.5), анализируют методом ВЭЖХ. Массу анализируемой пробы и объем растворителя подбирают таким образом, чтобы концентрация определяемых веществ в анализируемом растворе находилась в диапазоне от 0,4 до 4,0 мкг/см.

8.3 Подготовка жидкостного хроматографа

Подготовку жидкостного хроматографа к работе осуществляют в соответствии с инструкцией по эксплуатации оборудования. Перед началом работы колонку промывают элюентом.

8.4 Построение градуировочной зависимости

Процедуры построения градуировочной зависимости выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования. Проводят хроматографический анализ всех градуировочных растворов, приготовленных по 8.1.2.

Градуировочный график строят в координатах "аналитический сигнал" - "массовая концентрация витамина в градуировочном растворе, мкг/см". Для каждого анализируемого градуировочного раствора проводят два параллельных измерения и находят среднеарифметическое значение. Различие между измеренными значениями аналитических сигналов и значениями времени удерживания не должно превышать 5% от средних значений. Линейные участки градуировочного графика должны соответствовать всему диапазону определяемых массовых концентраций витамина А.

Коэффициент градуировочного графика , мкг/см/(mAU·с) или мкг/см/(AU·с) определяют как среднеарифметическое значение коэффициентов , вычисляемых по формуле

где - массовая концентрация стандартных веществ в -м градуировочном растворе, мкг/см;

- площадь (высота) аналитического сигнала при анализе -го градуировочного раствора, mAU·с (AU·с) или высота пика, мм.

Правильность построения градуировочной зависимости контролируется значением достоверной аппроксимации 0,997.

Градуировка проводится в следующих случаях: на этапе освоения метода, при изменении условий хроматографического анализа или при выявлении несоответствия метрологическим требованиям результатов оперативного контроля или внутреннего аудита.

9 Выполнение измерений

В колонку хроматографа последовательно вводят равные объемы испытуемого и градуировочного растворов. В качестве градуировочного выбирают раствор, высота пика которого наименее отличается от высоты пика испытуемого раствора. Концентрацию витамина А () в растворе, используемом для градуировки, уточняют в день его использования по 8.1.2.

Для идентификации пиков сопоставляют время удерживания ретинола (или ретинола ацетата или ретинола пальмитата) испытуемого раствора и раствора стандарта, а также добавляют к испытуемому раствору раствор стандарта с близким содержанием витамина А.

10 Обработка и оформление результатов

Массовую долю витамина А , млн, вычисляют по формулам:

где - коэффициент градуировочного графика по 8.4;


- объем разведения, см;

- масса анализируемой пробы, г.

С использованием градуировочного раствора

где - массовая концентрация градуировочного раствора, мкг/см;

- объем разведения, см;

- среднеарифметическое значение результатов измерений площади (высоты) пика анализируемого компонента для двух параллельных хроматографических анализов испытуемого раствора, mAU·с (AU·с) или высота пика, мм;

- масса анализируемой пробы, г;

- среднеарифметическое значение результатов измерений площади (высоты) пика анализируемого компонента для двух параллельных хроматографических анализов градуировочного раствора, mAU·с (AU·с) или высота пика, мм.

Результат вычисляют до третьего десятичного знака и округляют до второго десятичного знака.

При анализе каждой пробы выполняют два параллельных определения, начиная со взятия навески испытуемой пробы.

Расхождение между результатами двух параллельных измерений , (в процентах от среднего значения ), выполненными одним оператором с использованием идентичных реактивов и оборудования и в минимально возможный промежуток времени, не должно превышать (предел повторяемости приведен в таблице 3) с доверительной вероятностью 95%.

При соблюдении этого условия за окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение .

Границы относительной погрешности определения массовой доли витамина А (), в процентах от результата испытания, и при доверительной вероятности 95% не должны превышать значений, указанных в таблице 3.

Результат определения витамина А представляют в следующем виде:

Млн при 95%, (6)

где - среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, млн;

- значение границы абсолютной погрешности определений, млн, вычисляемое по формуле

Результаты испытаний заносят в протокол, в котором указывают:

- ссылку на настоящий стандарт;

- вид, происхождение и название пробы;

- способ и дату отбора пробы;

- дату поступления и испытания пробы;

- результаты исследования;

- причины отклонений в процедуре определения от установленных условий.

МОТИВАЦИОННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕМЫ

Рациональное питание человека требует сбалансированности не только по содержанию белков, жиров, углеводов, но и по содержанию микронутриентов. Результаты изучения фактического питания различных групп населения свидетельствуют о значительной распространенности полигиповитаминозов, недостаточности основных минеральных веществ и пищевых волокон. Устранение недостаточностей микронутриентов не может быть достигнуто простым увеличением потребления продуктов питания. Современные условия жизни и труда большинства населения приводят к уменьшению энергетических затрат, что обусловливает необходимость снижения количества потребляемой пищи и влечет за собой недостаточное потребление содержащихся в ней микронутриентов. Знания клинических проявлений недостаточностей микронутриентов, источников витаминов, минеральных веществ и пищевых волокон в питании, способах сохранения витаминной ценности продуктов, приемах профилактической витаминизации позволяют врачу оптимизировать статус питания пациентов.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: ознакомить с биологической ролью, нормированием и источниками в питании микронутриентов и пищевых волокон; научить определению химического состава рациона питания по содержанию витаминов, минеральных веществ, пищевых волокон расчетным методом (на примере анализа меню-раскладки суточного рациона питания студента-медика), витаминосберегающим способам хранения и кулинарной обработки продуктов, профилактической витаминизацией.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ НА ЗАНЯТИИ

1. Определение качественного состава суточного рациона питания студента по содержанию витаминов, минеральных веществ, пищевых волокон расчетным методом (по меню-раскладке, составленной к теме 3.2.) с использованием «Таблиц химического состава и энергетической ценности пищевых продуктов».

2. Решение ситуационных профессионально ориентированных задач двух типов, оформление решения в протоколе.

3. Лабораторная работа по определению содержания витамина С в овощах. 3.1. Определение содержания витамина С в сыром и вареном картофеле; расчет процента потери витамина С при кулинарной обработке.

3.2. Определение содержания витамина С в капусте; расчет процента потери витамина С при хранении.

4. Заслушивание и обсуждение рефератов, подготовленных студентами

по индивидуальному заданию преподавателя.

ЗАДАНИЕ ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ

1.Биологическая роль, нормирование, источники в питании водорастворимых витаминов.

2.Биологическая роль, нормирование, источники в питании жирорастворимых витаминов.

3. Виды витаминных недостаточностей.

4. Причины гиповитаминозов, их проявления.

5.Приемы сохранения и повышения витаминной ценности рационов питания, профилактика гиповитаминозов.

6.Биологическая роль, нормирование, источники в питании минеральных веществ.

7.Биологическая роль, нормирование, источники в питании пищевых волокон.

ПРОТОКОЛ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

"_____"___________20___г.

Таблица 46

Качественный состав суточного рациона питания студента

2. Решение ситуационной задачи (тип 1) №____

__________________________________________________________________

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

Решение ситуационной задачи (тип2) №___

__________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

3. Определение содержания витамина С в овощах:

вид продукта _____________, навеска продукта ____________г,

количество 0,0001н. раствора иодноватокислого калия, пошедшего на тит-

рование пробы _____мл;

Формула для расчета:

а) сырой картофель _______ м, вареный картофель _______ мг,

потеря витамина С при кулинарной обработке _________%

б) капуста ______ мг, среднее содержание в капусте _____ мг,

потеря витамина С при хранении _____ %.

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

Работу выполнил __________________

Подпись преподавателя _____________

СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ

Дефиниции темы

АВИТАМИНОЗ - полное истощение витаминных ресурсов организма.

АНТИВИТАМИНЫ - соединения, частью или полностью выключающие витамины из обменных реакций организма путем их разрушения, инактивации или препятствуя их ассимиляции. Антивитамины делятся на 2 группы:

а) структуроподобные соединения (конкурентные ингибиторы; вступают с витаминами или их производными в конкурирующие отношения в соответствующих биохимических реакциях обмена веществ), к ним относятся сульфаниламиды, дикумарин, мегафен, изониазид и др.

б) структуроразличные соединения (природные антивитамины; вещества,

которые путем изменения молекулы или комплексного соединения с метаболитами частично или полностью лишают витамин его действия), к ним относятся тиаминаза, аскорбиназа, авидин и др.

ВИТАМИНЫ - необходимые для нормальной жизнедеятельности низкомолекулярные органические соединения с высокой биологической активностью, которые не синтезируются (или синтезируются в недостаточном количестве) в организме и поступают в организм с пищей. Биологическая роль водорастворимых витаминов определяется их участием в построении различных коферментов, жирорастворимых витаминов - в контроле функционального состояния мембран клетки и субклеточных структур.

ВИТАМИНЫ-АНТАГОНИСТЫ: В 1 и В 2 ; А и Д; никотиновая кислота и холин; тиамин и холин (при длительном введении с лечебными целями одного витамина обнаруживаются симптомы недостаточности другого).

ВИТАМИНЫ-СИНЕРГИСТЫ: С и Р; Р, С, К; В 12 и фолиевая кислота; С, К, В 2 ; А и Е; Е и инозит (при комплексном применении в поливитаминных препаратах могут усиливать биологический эффект друг друга). ГИПОВИТАМИНОЗ - резкое снижение обеспеченности организма тем или иным витамином.

СКРЫТАЯ (ЛАТЕНТНАЯ) ФОРМА ВИТАМИННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ не имеет каких-либо внешних проявлений и симптомов, однако, оказывает отрицательное влияние на работоспособность, устойчивость организма к различным неблагоприятным факторам, удлиняет выздоровление после перенесенного заболевания.

ПИЩЕВЫЕ ВОЛОКНА – высокомолекулярные углеводы (целлюлоза, гемицеллюлоза, пектины, лигнин, хитин и др.) главным образом растительного происхождения, устойчивые к перевариванию и усвоению в тонком кишечнике, но подвергающиеся полной или частичной ферментации в толстом кишечнике.

ВАЖНЕЙШИЕ ПРИЧИНЫ ГИПОВИТАМИНОЗОВ И АВИТАМИНОЗОВ

1. Недостаточное поступление витаминов с пищей.

1.1. Низкое содержание витаминов в рационе.

1.2. Снижение общего количества потребляемой пищи в связи с низкими энерготратами.

1.3. Потеря и разрушение витаминов в процессе технологической переработки продуктов питания, их хранения и нерациональной кулинарной

обработки.

1.4. Отклонения от сбалансированной формулы питания (преимущественно углеводное питание требует дополнительного количества тиамина;

при недостаточном введении полноценных белков витамины С, РР, В 1 быстро выводятся с мочой, не участвуют в обменных процессах, задерживается превращение каротина в витамин А).

1.5. Анорексия.

1.6. Присутствие витаминов в некоторых продуктах в неутилизируемой форме (инозит в виде фитина зерновых продуктов).

2. Угнетение кишечной микрофлоры, продуцирующей некоторые витамины (В 6 , К).

2.1. Болезни желудочно-кишечного тракта.

2.2. Последствия химиотерапии (дисбактериозы).

3. Нарушение ассимиляции витаминов.

3.1. Нарушение всасывания витаминов в желудочно-кишечном тракте

при заболеваниях желудка, кишечника, поражениях гепатобилиарной системы, а также в пожилом возрасте (нарушение секреции желчи, необходимое для всасывания жирорастворимых витаминов).

3.3. Нарушение обмена витаминов и образования их биологически активных (коферментных) форм при различных заболеваниях, действии токсических и инфекционных агентов, химиотерапии, в пожилом возрасте.

4. Повышенная потребность в витаминах.

4.1. Особые физиологические состояния организма (интенсивный рост, беременность, лактация).

4.2. Особые климатические условия (потребность в витаминах повышается на 30-60% в связи с повышенными энерготратами при низкой температуре воздуха в климатической зоне Севера).

4.4. Значительная нервно-психическая нагрузка, стрессовые состояния.

4.5. Воздействие вредных факторов производства (Рабочим горячих цехов в условиях воздействия высоких температур /32 градуса/ при одновременной физической нагрузке требуется вдвое больше витаминов С, В 1 , В 6 , пантотеновой кислоты, чем при 18 градусах).

4.6. Инфекционные заболевания и интоксикации (При тяжелых септических процессах потребность организма в витамине С достигает 300-500 мг в сутки).

4.7. Заболевания внутренних органов и эндокринных желез.

4.8. Повышенная экскреция витаминов.

5. Врожденные, генетически обусловленные нарушения обмена и функций витаминов.

5.1. Врожденные нарушения всасывания витаминов.

5.2. Врожденные нарушения транспорта витаминов кровью и через клеточные мембраны.

5.3. Врожденные нарушения биосинтеза витаминов (никотиновой кислоты из триптофана).

5.4. Врожденные нарушения превращения витаминов в коферментные

формы, простетические группы и активные метаболиты.

5.5. Нарушение включения витаминов в состав активного центра фермента.

5.6. Нарушение структуры апофермента, затрудняющее его взаимодействие с коферментом.

5.7. Нарушение структуры апофермента, приводящее к полной или частичной утрате ферментативной активности вне зависимости от взаимодействия с коферментом.

5.8. Усиление катаболизма витаминов.

5.9. Врожденные нарушения реабсорбции витаминов в почках.

Таблица 47

(в 100 г съедобной части)

Незаменимые вещества пищи, объединяемые под общим названием «витамины», относятся к различным классам химических соединений, что само по себе исключает возможность использования единого метода их количественного определения. Все известные для витаминов аналитические методы основаны либо на определении специфических биологических свойств этих веществ (биологические, микробиологические, ферментативные), либо на использовании их физико-химических характеристик (флуоресцентные, хроматографические и спектрофотометрические методы), либо на способности некоторых витаминов вступать в реакции с некоторыми реагентами с образованием окрашенных соединений (колориметрические методы).

Несмотря на достигнутые успехи в области аналитической и прикладной химии методы определения витаминов в пищевых продуктах еще трудоемки и длительны. Это обусловлено рядом объективных причин, основные из которых следующие.

1. Определение ряда витаминов часто осложняется тем, что многие из них находятся в природе в связанном состоянии в виде комплексов с белками или пептидами, а также в виде фосфорных эфиров. Для количественного определения необходимо разрушить эти комплексы и выделить витамины в свободном виде, доступном для физико-химического или микробиологического анализа. Это достигается обычно путем использования особых условий обработки (кислотным, щелочным или ферментативным гидролизом, автоклавированием).

2. Почти все витамины – соединения весьма неустойчивые, легко подвергающиеся окислению, изомеризации и полному разрушению под воздействием высокой температуры, кислорода воздуха, света и других факторов. Следует соблюдать меры предосторожности: максимально сокращать время на предварительную подготовку продукта, избегать сильного нагрева и воздействия света, использовать антиоксиданты и др.

3. В пищевых продуктах, как правило, приходится иметь дело с группой соединений, имеющих большое химическое сходство и одновременно различающихся по биологической активности. Например, витамин Е включает 8 токоферолов, сходных по химическим свойствам, но отличающихся по биологическому действию; группа каротинов и каротиноидных пигментов насчитывает до 80 соединений, из которых только 10 в той или иной степени обладают витаминными свойствами.

4. Витамины принадлежат к различным классам органических соединений. Поэтому для них не могут существовать общие групповые реакции и общие методы исследования.

5. Кроме того, анализ затрудняет присутствие в исследуемом образце сопутствующих веществ, количество которых может во много раз превышать содержание определяемого витамина (например, стерины и витамин D). Для устранения возможных погрешностей при определении витаминов в пищевых продуктах обычно проводят тщательную очистку экстрактов от сопутствующих соединений и концентрирование витамина. Для этого используют различные приемы: осаждение мешающих анализу веществ, методы адсорбционной, ионобменной или распределительной хроматографии, избирательную экстракцию определяемого компонента и др.

В последние годы для определения витаминов в пищевых продуктах с успехом стали использовать метод ВЭЖХ. Этот метод является наиболее перспективным, так как позволяет одновременно разделять, идентифицировать и количественно определять различные витамины и их биологически активные формы, что позволяет сократить время анализа.

Физико-химические методы исследования витаминов. Методы основаны на использовании физико-химических характеристик витаминов (их способности к флуоресценции, светопоглощению, окислительно-восстановительным реакциям и др). Благодаря развитию аналитической химии, приборостроения физико-химические методы почти полностью вытеснили длительные и дорогостоящие биологические методы.

Определение витамина С. Витаминб С (аскорбиновая кислота) может присутствовать в пищевых продуктах как в восстановленной, так и в окисленной форме. Дегидроаскорбиновая кислота (ДАК) может образовываться при обработке и хранении пищевых продуктов в результате окисления, что вызывает необходимость ее определения. При определении витамина С в пищевых продуктах используют различные методы: колориметрические, флуоресцентные, методы объемного анализа, основанные на окислительно-восстановительных свойствах АК, и ВЭЖХ.

Ответственный момент количественного определения АК – приготовление экстракта образца. Извлечение должно быть полным. Наилучшим экстрагентом является 6% раствор метафосфорной кислоты, обладающей способностью осаждать белки. Используются также уксусная, щавелевая и соляная кислоты, а также их смеси.

1. Для суммарного и раздельного определения окисленной и восстановленной форм АК часто используют метод Роэ с применением 2,4-динитрофенилгидразинового реактива. АК (гулоновая кислота) под действием окислителей переходит в ДАК, а затем в 2,3-дикетогулоновую кислоту, которая образует с 2,4-динитрофенилгидразином соединения, имеющие оранжевую окраску. Сам 2,4-динитрофенилгидразин представляет собой основание, неспособное существовать в аци-форме. Однако соответствующие гидразоны под влиянием щелочей превращаются в интенсивно окрашенные аци-соли. При определении витамина С этим методом мешает присутствие восстановителей (глюкоза, фруктоза и др). Поэтому при большом содержании сахаров в исследуемом продукте используют хроматографию, что осложняет определение.

2. В последнее время для определения общего содержания витамина С (сумма АК и ДАК) получил признание весьма чувствительный и точный флуоресцентный метод. ДАК конденсируясь с о-фенилендиамином, образует флуоресцирующее соединение хиноксалин, обладающее максимальной флуоресценцией при длине волны возбуждающего света 350 нм.

Интенсивность флуоресценции хиноксалина в нейтральной среде при комнатной температуре прямо пропорциональна концентрации ДАК. Для количественного определения АК ее предварительно окисляют в ДАК. Недостатком метода является достаточно дорогое оборудование.

Методы, основанные на окислительно-восстановительных свойствах АК.

3. Из методов, основанных на окислительно-восстановительных свойствах АК, наибольшее применение нашел метод титрования раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола, имеющим синюю окраску. Продукт взаимодействия АК с реактивом – бесцветный. Метод может быть использован при анализе всех видов продуктов. При анализе продуктов, не содержащих естественных пигментов, в картофеле, молоке используют визуальное титрование. В случае присутствия естественных красителей, используют потенциометрическое титрование или метод индофенол-ксилоловой экстракции. Последний метод основан на количественном обесцвечивании 2,6-дихлорфенолиндофенола аскорбиновой кислотой. Избыток краски экстрагируется ксилолом и измеряется оптическая плотность экстракта при 500 нм.

В реакцию вступает только АК. ДАК предварительно восстанавливают цистеином. Для отделения АК от восстановителей, присутствующих в пищевых продуктах, подвергшихся тепловой обработке, или длительно хранившиеся экстракты обрабатывают формальдегидом. Формальдегид в зависимости от рН среды избирательно взаимодействует с АК и посторонними примесями восстановителей (рН = 0). Указанным методом определяют сумму АК и ДАК.

2,6-дихлорфенолиндофенол может быть использован и для фотометрического определения АК. Раствор реактива имеет синюю окраску, а продукт взаимодействия с АК – бесцветен, т.е. в результате реакции уменьшается интенсивность синей окраски. Оптическую плотность измеряют при 605 нм (рН = 3,6).

4. Еще одним методом, основанным на восстановительных свойствах АК, является колориметрический метод, в котором используется способность АК восстанавливать Fe(3+) до Fe(2+) и способность последнего образовывать с 2,2’-дипиридилом соли, интенсивно окрашенные в красный цвет. Реакцию проводят при рН 3,6 и температуре 70ºС. Оптическую плотность раствора измерят при 510 нм.

5. Фотометрический метод, основанный на взаимодействии АК с реактивом Фолина. Реактив Фолина представляет собой смесь фосфорномолибденовой и фосфорновольфрамовой кислот, т.е. это – известный метод, основанный на образовании молибденовых синей, поглощающих при 640–700 нм.

6. Для определения витамина С во всех пищевых продуктах с успехом может быть использован высоко чувствительный и специфичный метод ВЭЖХ. Анализ достаточно прост, лишь при анализе продуктов, богатых белками, необходимо предварительно удалить их. Детектирование осуществляется по флуоресценции.

Кроме названных методов определения витамина С существует еще целый ряд способов, например, окисление хлоридом золота и образование гидроксамовых кислот, но эти методы не имеют практического значения.

Определение тиамина (В 1 ). В большинстве природных продуктов тиамин встречается в виде дифосфорного эфира – кокарбоксилазы. Последняя, являясь активной группой ряда ферментов углеводного обмена, находится в определенных связях с белком. Для количественного определения тиамина необходимо разрушить комплексы и выделить исследуемый витамин в свободном виде, доступном для физико-химического анализа. С этой целью проводят кислотный гидролиз или гидролиз под воздействием ферментов. Объекты, богатые белком, обрабатывают протеолитическими ферментами (пепсином) в среде соляной кислоты. Объекты, с высоким содержанием жира (свинина, сыры), для его удаления обрабатывают эфиром (тиамин практически нерастворим в эфире).

1. Для определения тиамина в пищевых продуктах используют, как правило, флуоресцентный метод, основанный на окислении тиамина в щелочной среде гексацианоферратом калия (3+) с образованием сильно флуоресцирующего в ультрафиолетовом свете соединения тиохрома. Интенсивность его флуоресценсции прямо пропорциональна содержанию тиамина (длина волны возбуждающего света 365 нм, испускаемого – 460–470 нм (синяя флуоресценция)). При использовании этого метода возникают трудности, связанные с тем, что в ряде объектов присутствуют флуоресцирующие соединения. Их удаляют очисткой на колонках с ионообменными смолами. При анализе мяса, молока, картофеля, пшеничного хлеба и некоторых овощей очистка не требуется.

2. Тиамин характеризуется собственным поглощением в УФ области (240 нм – в водном растворе, 235 нм – в этаноле), а значит он может быть определен методом прямой спектрофотометрии.

3. Для одновременного определения тиамина и рибофлавина используют ВЭЖХ.

Определение рибофлавина (В 2 ). В пищевых продуктах рибофлавин присутствует главным образом в виде фосфорных эфиров, связанных с белками, и, следовательно, не может быть определен без предварительного протеолитического расщепления. Свободный рибофлавин в значительном количестве содержится в молоке.

При определении рибофлавина наибольшее распространение получили микробиологический и физико-химический (флуоресцентный) методы анализа. Микробиологический метод специфичен, высоко чувствителен и точен; применим ко всем продуктам, но длителен и требует специальных условий.

Физико-химический метод разработан в двух вариантах, которые отличаются способом оценки флуоресцирующих веществ:

· вариант прямой флуоресценции (определение интенсивности флуоресценции рибофлавина) и

· люмифлавиновый вариант.

1. Свободный рибофлавин и его фосфорные эфиры обладают характерной желто-зеленой флуоресценцией при длине волны возбуждающего света 440–500 нм. На этом свойстве основан наиболее широко используемый флуоресцентный метод определения рибофлавина. Рибофлавин и его эфиры дают очень сходные спектры флуоресценции с максимумом при 530 нм. Положение максимума не зависит от рН. Интенсивность флуоресценции значительно зависит от рН и от растворителя (по-разному для рибофлавина и его эфиров), поэтому предварительно разрушают эфиры и анализируют свободный рибофлавин. Для этого используют гидролиз с соляной и трихлоруксусной кислотами, автоклавирование, обработку ферментными препаратами.

Интенсивность желто-зеленой флуоресценции рибофлавина в УФ-свете зависит не только от его концентрации, но и от значения рН раствора. Максимальная интенсивность достигается при рН=6-7. Однако измерение проводят при рН от 3 до 5, так как в этом интервале интенсивность флуоресценции определяется только концентрацией рибофлавина и не зависит от других факторов – значения рН, концентрации солей, железа, органических примесей и др.

Рибофлафин легко разрушается на свету, определение проводят в защищенном от света месте и при рН не выше 7. Следует отметить, что метод прямой флуоресценции не применим к продуктам с низким содержанием рибофлавина.

2. Люмифлавиновый вариант основан на использовании свойства рибофлавина при облучении в щелочной среде, переходить в люмифлавин, интенсивность флуоресценции которого измеряют после извлечения его хлороформом (голубая флуоресценция, 460–470 нм). Поскольку при определенных условиях в люмифлавин переходит 60–70% общего рибофлавина, при проведении анализа необходимо соблюдать постоянные условия облучения, одинаковые для испытуемого и стандартного раствора.

Определение витамина В 6 . Для определения витамина могут быть использованы следующие методы:

1. Прямая спектрофотометрия. Пиридоксина гидрохлорид характеризуется собственным поглощением при 292 нм (e = 4,4·10 3) при рН = 5.

2. Метод Кьельдаля. Определение осуществляется по аммиаку, образующемуся при окислении витамина.

3. Фотометрический метод, основанный на реакции с 2,6-дихлорхинонхлоримином (реактив Гиббса) при рН 8–10, в результате которой образуются индофенолы, имеющие синюю окраску. Индофенолы экстрагируют метил-этилкетоном и измеряют оптическую плотность экстракта при 660–690 нм (реакцию Гиббса дают фенолы со свободным пара-положением).

4. Флуоресцентный метод, основанный на том, что при облучении пиридоксина и пиридоксамина наблюдается синяя, а пиридоксаля – голубая флуоресценция.

Определение витамина В 9 . Определение фолатов в пищевых продуктах в тканях и жидкостях организма представляет значительные трудности, т.к. в этих объектах они обычно присутствуют в связанной форме (в виде полиглютаматов); кроме того, большинство форм чувствительно к воздействию кислорода воздуха, света и температуры. Для предохранения фолатов от гидролиза рекомендуется вести гидролиз в присутствии аскорбиновой кислоты.

В пищевых продуктах фолаты могут быть определены физическими, химическими и микробиологическими методами. Колориметрический метод основан на расщеплении птероилглутаминовой кислоты с образованием п-аминобензойной кислоты и родственных ей веществ и дальнейшем превращении их в окрашенные соединения. Однако из-за недостаточной специфичности этот метод применяется в основном для анализа фармацевтических препаратов.

Для разделения, очистки и идентификации фолатов разработаны также методы хроматографии на колонках, бумаге и в тонком слое адсорбента.

Определение витамина РР. В пищевых продуктах никотиновая кислота и ее амид находятся как в свободной, так и в связанной форме, входя в состав коферментов. Химические и микробиологические методы количественного определения ниацина предполагают наиболее полное выделение и превращение его связанных форм, входящих в состав сложного органического вещества клеток, в свободную никотиновую кислоту. Связанные формы ниацина освобождают воздействием растворов кислот или гидрооксида кальция при нагревании. Гидролиз с 1 М раствором серной кислоты в автоклаве в течение 30 минут при давлении 0,1 МПа приводит к полному освобождению связанных форм ниацина и превращению никотинамида в никотиновую кислоту. Установлено, что этот способ обработки дает менее окрашенные гидролизаты и может быть использован при анализе мясных и рыбных продуктов. Гидролиз с гидрооксидом кальция предпочтителен при определении ниацина в муке, крупах, хлебобулочных изделиях, сырах, пищевых концентратах, овощах, ягодах и фруктах. Ca(OH) 2 образует с сахарами и полисахаридами, пептидами и гликопептидами соединения, почти полностью нерастворимые в охлажденных растворах. В результате гидролизат, полученый при обработке Ca(OH) 2 , содержит меньше веществ, мешающих химическому определению, чем кислотный гидролизат.

1. В основе химического метода определения ниацина лежит реакция Кенига, протекающая в две стадии. Первая стадия – реакция взаимодействия пиридинового кольца никотиновой кислоты с бромцианом, вторая – образование окрашенного производного глутаконового альдегида в результате взаимодействия с ароматическими аминами. (Сразу после добавления к никотиновой кислоте бромистого циана появляется желтая окраска глутаконового альдегида. В результате взаимодействия его с ароматическими аминами, вводимыми в реакционную смесь, образуются дианилы, которые интенсивно окрашены в желтый, оранжевый или красный цвет, в зависимости от амина (бензидин – красный, сульфаниловая кислота – желтый). Реакцию Кенига применяют для фотометрического определения пиридина и его производных со свободным a-положением. Недостатком метода является его длительность, так как скорость реакций мала.

Получение CNBr возможно двумя способами:

1. CN – + Br 2 = CNBr + Br –

2. SCN – + Br 2 + 4H 2 O = CNBr + SO 4 2– + 8H + + Br –

Существует много модификаций проведения этой реакции в зависимости от температурного режима, рН, источника ароматических аминов. рН и амин существенно влияют на интенсивность и устойчивость развивающейся окраски. Наиболее устойчивую окраску дают продукты реакции никотиновой кислоты с бромродановым (бромциановым) реактивом и сульфаниловой кислотой или метолом (сульфатом пара-метиламинофенола).

2. Никотиновую кислоту и ее амид можно также определять спектрофотометрически благодаря их собственному поглощению в УФ-области. Никотиновая кислота характеризуется максимумом поглощения при 262 нм (Е = 4,4·10 3), а никотинамид при 215 нм, (Е = 9·10 3).

3. Для количественного определения ниацина широко используется микробиологический метод. Он простой, специфичный, но более длительный, чем химический. Микробиологический метод позволяет определять содержание ниацина в объектах, в которых химическим путем это сделать невозможно (продукты с высоким содержанием сахаров и низким уровнем ниацина).

Определение b -каротина . В ряде пищевых продуктов, особенно растительного происхождения, присутствуют так называемые каротиноиды. Каротиноиды (от лат. carota – морковь) – природные пигменты от желтого до красно-оранжевого цвета; полиненасыщенные соединения, содержащие циклогексановые кольца; в большинстве случаев содержат в молекуле 40 атомов углерода.) Некоторые из них (a, b-каротин, криптоксантин и др.) являются провитаминами (предшественниками) витамина А, так как в организме человека и животных могут превращаться в витамин А. Известно около десяти провитаминов А, но самым активным из них является b-каротин.

При анализе пищевых продуктов необходима предварительная обработка образца для извлечения, концентрирования каротина и очистки его от сопутствующих соединений. В этих целях широко используют экстракцию (петролейный эфир, гексан, ацетон и их смеси), омыление и хроматографию. При определении b-каротина следует избегать нагревания. Но в некоторых случаях горячее омыление необходимо, например, когда отношение жира к b-каротину больше, чем 1000:1 (молочные продукты, животные жиры, маргарин, яйца, печень). Омыление проводят в присутствии антиоксиданта. Избыток щелочи ведет к разрушению b-каротина. Для отделения b-каротина от сопутствующих пигментов широко применяют адсорбционную хроматографию на колонках с оксидом алюминия, магния.

1. Большинство применяемых в настоящее время физико-химических методов определения b-каротина в пищевых продуктах основано на измерении интенсивности светопоглощения его растворов. Как соединения с сопряженными двойными связями, каротиноиды имеют характерные спектры поглощения в УФ и видимой области. Положение полосы поглощения зависит от числа сопряженных двойных связей в молекуле каротиноида и от применяемого растворителя. Максимальное поглощение b-каротина наблюдается в бензоле при 464–465 нм, в гексане и петролейном эфире при 450-451 нм.

2. В последнее время для определения b-каротина и других каротиноидов чаще используется метод ВЭЖХ. Метод позволяет сократить время анализа, а значит и вероятность их разрушения под действием света и кислорода воздуха. Метод ВЭЖХ каротиноидов является классическим примером демонстрации возможностей метода разделять и количественно определять пространственные изомеры a- и b-каротина в овощах.

Для определения b-каротина могут быть использованы и химические методы, например, основанные на реакции с хлоридом сурьмы (3+) в хлороформе (синий, 590 нм), аналогично витамину А, и с реактивом Фолина (синий, 640–700 нм). Однако из-за неспецифичности этих реакций они не нашли широкого применения.

Определение витамина А. Важнейшими представителями витамина являются, как уже говорилось, ретинол (А 1 -спирт), рентиналь (А 1 -альдегид), ретиноевая кислота (А 2).

При количественном определении витамина А в пищевых продуктах используют различные методы: колориметрический, флуоресцентный, способ прямой спектроскопии и ВЭЖХ. Выбор метода определяется наличием той или иной аппаратуры, целью исследования, свойствами анализируемого материала, предполагаемым содержанием витамина А и характером сопутствующих примесей.

Выделение витамина осуществляют кипячением со спиртовым раствором КОН в среде азота; и последующей экстракцией петролейным эфиром.

1. Для количественного определения веществ, обладающих А-витаминной активностью, может быть использован метод прямой спектрофотометрии, основанный на способности этих соединений к избирательному светопоглощению на разных длинах волн в УФ области спектра. Поглощение пропорционально концентрации вещества при измерении на тех длинах волн, где наблюдается свойственный данному соединению максимум абсорбции в используемом растворителе. Метод – наиболее простой, быстрый, достаточно специфичный. Дает надежные результаты при определении витамина А в объектах, не содержащих примесей, обладающих поглощением в той же области спектра. При наличии таких примесей метод может быть использован в сочетании со стадией хроматографического разделения.

2. Перспективным является флуоресцентный метод, основанный на способности ретинола флуоресцировать под действием УФ лучей (длина волны возбуждающего света 330–360 нм). Максимум флуоресценции наблюдается в области 480 нм. Определению витамина А этим методом мешают каротиноиды и витамин D. Для устранения мешающего влияния используют хроматографию на оксиде алюминия. Недостаток флуоресцентного метода – дорогостоящая аппаратура.

3. Ранее наиболее распространенным являлся колориметрический метод определения витамина А по реакции с хлоридом сурьмы. Используют раствор хлорида сурьмы в хлороформе (реактив Карр-Прайса). Механизм реакции точно не установлен и предполагают, что в реакцию вступает примесь SbCL 5 в SbCl 3 . Образующееся в реакции соединение окрашено в синий цвет. Измерение оптической плотности проводят при длине волны 620 нм в течение 3–5 секунд. Существенным недостатком метода является неустойчивость развивающейся окраски, а также высокая гидролизуемость SbCl 3 . Предполагается, что реакция протекает следующим образом:

Эта реакция для витамина А не специфична, аналогичное окрашивание дают каратиноиды, но хроматографическое разделение этих соединений позволяет устранить их мешающее влияние.

Определению витамина А перечисленными методами, как правило, предшествует подготовительная стадия, включающая щелочной гидролиз жироподобных веществ и экстракцию неомыляемого остатка органическим растворителем. Часто приходится проводить хроматографическое разделение экстракта.

4. В последнее время вместо колоночной хроматографии находит все более широкое применение ВЭЖХ, которая позволяет разделить жирорастворимые витамины (A, D, E, K), обычно присутствующие одновременно в пищевых продуктах, и количественно их определить с большой точностью. ВЭЖХ облегчает определение различных форм витаминов (витамин А-спирт, его изомеры, эфиры ретинола), что особо необходимо при контроле за внесением витаминов в пищевые продукты.

Определение витамина Е . К группе веществ, объединяемых общим названием «витамин Е» относятся производные токола и триенола, обладающие биологической активностью a-токоферолла. Кроме a-токоферолла, известно еще семь родственных ему соединений, обладающих биологической активностью. Все они могут встречаться в продуктах. Следовательно, главная трудность при анализе витамина Е состоит в том, что во многих случаях приходится рассматривать группу соединений, имеющих большое химическое сходство, но одновременно различающихся по биологической активности, оценить которую можно только биологическим методом. Это трудно и дорого, поэтому физико-химические методы почти полностью вытеснили биологические.

Основные стадии определения витамина Е: подготовка образца, щелочной гидролиз (омыление), экстракция неомыляемого остатка органическим растворителем, отделение витамина Е от мешающих анализу веществ и разделение токоферолов с помощью различных видов хроматографии, количественное определение. Токоферолы очень чувствительны к окислению в щелочной среде, поэтому омыление и эктсракцию проводят в атмосфере азота и в присутствии антиоксиданта (аскорбиновой кислоты). При омылении могут разрушаться ненасыщенные формы (токотриенолы). Поэтому при необходимости определения всех форм витамина Е, содержащихся в продукте, омыление заменяют другими видами обработки, например, кристаллизацией при низких температурах.

1. Большинство физико-химических методов определения витамина Е основано на использовании окислительно-восстановительных свойств токоферолов. Для определения суммы токоферолов в пищевых продуктах наиболее часто используют реакцию восстановления трехвалентного железа в двухвалентное токоферолами с образованием окрашенного комплекса Fe(2+) с органическими реагентами. Наиболее часто используют 2,2’-дипиридил, с которым Fe(2+) дает комплекс, окрашенный в красный цвет (λ max = 500 нм). Реакция не специфична. В нее также вступают каротины, стиролы, витамин А и др. Кроме того, интенсивность окраски существенно зависит от времени, температуры, освещения. Поэтому для повышения точности анализа токофероллы предварительно отделяют от соединений, мешающих определению, методом колоночной, газожидкостной хроматографии, ВЭЖХ. При определении Е-витаминной ценности продуктов, в которых a-токоферол составляет более 80% общего содержания токоферолов (мясо, молочные продукты, рыба и др.), часто ограничиваются определением суммы токоферолов. Когда в значительных количествах присутствуют другие токоферолы (растительные масла, зерно, хлебобулочные изделия, орехи), для их разделения используют колоночную хроматографию.

2. Для определения суммы токоферолов может быть использован также флуоресцентный метод. Гексановые экстракты имеют максимум флуоресценции в области 325 нм при длине волны возбуждающего света 292 нм.

3. Для определения индивидуальных токоферолов несомненный интерес представляет метод ВЭЖХ, обеспечивающий в одном процессе как разделение, так и количественный анализ. Метод также характеризуется высокой чувствительностью и точностью. Детектирование проводят по поглощению или по флуоресценции.

Определение витамина D. Количественное определение витамина в продуктах представляет собой чрезвычайно сложную задачу ввиду его низкого содержания, отсутствия чувствительных специфических реакций на витамин D и трудностей отделения его от сопутствующих веществ. До недавнего времени использовались биологические исследования на крысах или цыплятах. Биологические методы основаны на установлении минимального количества исследуемого продукта, излечивающего или предотвращающего рахит у крыс (цыплят), находящихся на рахитогенной диете. Степень рахита оценивается рентгенографически. Это достаточно специфичный и точный метод, позволяющий определять витамин D в концентрации 0,01–0,2 мкг%.

1. При исследовании продуктов с содержанием витамина D свыше 1 мкг% может быть использован фотометрический метод, основанный на реакции кальциферолов с хлоридом сурьмы (образуется продукт, окрашенный в розовый цвет). Метод позволяет определять как холекальциферол (D 3), так и эргокальциферол (D 2). Анализ состоит из следующих операций: омыление (щелочной гидролиз), осаждение стеринов, хроматография (колоночная или распределительная) и фотометрическая реакция с хлоридом сурьмы. Метод пригоден для определения содержания витамина D в рыбьем жире, яйцах, печени трески, икре, сливочном масле, продуктах, обогащенных витамином. Описанный метод трудоемок, длителен.

Витамин D 2 необходимо защищать от света и воздуха, иначе происходит изомеризация. D 3 – более устойчив.

2. Более быстрым, надежным и точным является все чаще применяемый метод ВЭЖХ, который успешно используется при анализе детских и диетических продуктов, обогащенных витаминов D.

3. Кальциферолы характеризуются собственным поглощением в УФ и могут быть определены методом прямой спектрофотометрии.

В последние годы в целях определения витамина D успешно применяются хроматографические методы разделения, особенно тонкослойная и газо-жидкостная хроматография. В экспериментальных исследованиях для изучения обмена витамина D в организме животных и человека широко используются радиохимические методы в сочетании с тонкослойной или колоночной хроматографией на силикагеле или оксиде алюминия.

Определение витамина К. Для определения витамина К применяют физические, химические, биологические методы, а также методы спектрографии, основанные на чувствительности витамина К к УФ-излучению.

Для определения 2-метил-1,4-нафтохинонов предложено много колориметрических методов, основанных на цветных реакциях, которые они дают с рядом реактивов: 2,4-динитрофенилгидразином, N,N-диэтилдитиокарбаматом натрия, солями тетразолия и др. Но все эти методы и ряд других физических и химических методов недостаточно специфичны и полученные с их помощью результаты имеют весьма относительную ценность для определения содержания витамина К в пищевых продуктах, органах и тканях человека и животных. Удовлетворительные результаты дают колориметрические и спектрофотометрические методы в сочетании с хроматографией, очисткой и разделением витаминов К на колонках, на бумаге или в тонком слое адсорбента.

Введение

Определение витамина В1 (обзор литературы)

1 Историческая справка

2 Классификация витаминов

4 Синтез витамина В1

Методы определения витаминов

1 Биологические методы

2 Химические методы

3 Физические методы

4 Физико-химические методы

Аналитическое определение витамина В1 (экспериментальная часть)

1 Потенциометрическое определение витамина В1

2 Аргентометрическое определение витамина В1

Заключение

Введение

В настоящее время на рынке появилось огромное количество витаминизированных продуктов питания для человека и кормов для животных, представляющих собой сухие многокомпонентные смеси. Ассортимент таких продуктов представлен достаточно широко. Это, прежде всего, биологически активные добавки к пище, комбикорма для животных и птиц, поливитаминные препараты. Критерием качества таких продуктов может являться их анализ на содержание витаминов и, особенно, таких жизненно необходимых, как водорастворимые и жирорастворимые витамины, количество которых регламентируется нормативными документами и санитарными нормами качества.

Витамины принадлежат к различным классам органических соединений. Поэтому для них не могут существовать общие групповые реакции; каждый из витаминов требует особого аналитического подхода.

Химическая структура витамина В1 (антиневритический витамин, аневрин, бери-бери витамин, анти-бери-бери витамин), позволяет применить различные методы химического и физико-химического количественного определения:

кислотно-основное титрование, осадительное титрование (аргентометрия), физико-химические методики (спектрофотометрические), гравиметрия.

Целью данной курсовой работы, является количественное определение витамина В1. Было выбрано два способа количественного определения- химический и физико-химический методы.

Задачи курсовой работы: Произвести анализ литературы, выполнить два количественных определения тиамина- потенциометрическим титрованием и аргентометрическим методом.

1. Определение витамина В1 (обзор литературы)

1 Историческая справка

Всем известное слово "витамин" происходит от латинского "vita" - жизнь. Такое название эти разнообразные органические соединения получили далеко не случайно: роль витаминов в жизнедеятельности организма чрезвычайно велика.

Витамины представляют собой группу разнообразных по строению химических веществ, принимающие участие во многих реакциях клеточного метаболизма. Они не являются структурными компонентами живой материи и не используются в качестве источников энергии. Большинство витаминов не синтезируются в организме человека и животных, но некоторые синтезируются микрофлорой кишечника и тканями в минимальных количествах, поэтому основным источником этих веществ является пища.

Ко второй половине XIX века было выявлено, что пищевая ценность продуктов питания определяется содержанием в них в основном следующих веществ: белков, жиров, углеводов, минеральных солей и воды.

Однако практика далеко не всегда подтверждала правильность укоренившихся представлений о биологической полноценности пищи.

Экспериментальное обоснование и научно-теоретическое обобщение этого многовекового практического опыта впервые стали возможны благодаря исследованиям русского ученого Николая Ивановича Лунина.

Он провел эксперимент с мышами, разделив их на 2 группы. Одну группу он кормил натуральным цельным молоком, а другую держал на искусственной диете, состоящей из белка-казеина, сахара, жира, минеральный солей и воды.

Через 3 месяца мыши второй группы погибли, а первой остались здоровыми. Этот опыт показал, что помимо питательных веществ, для нормальной жизнедеятельности организма, необходимы еще какие-то компоненты. Это было важное научное открытие, опровергавшее установившееся положения в науке о питании.

Блестящим подтверждением правильности вывода Н. И. Лунина установлением причины болезни бери-бери.

В 1896 году английский врач Эйкман заметил, что куры, питавшиеся полированным рисом, страдали нервным заболеванием, напоминавшим бери-бери у людей. После дачи курам неочищенного риса заболевание прекратилось. Он сделал вывод, что витамин содержится в оболочке зерен. В 1911 году польский ученый Казимир Функ выделил витамин в кристаллическом виде. Окончательное строение витамина В1 было установлено в 1973 году.

По своим химическим свойствам это вещество принадлежало к органическим соединениям и содержало аминогруппу. Функ, полагая, что во всех подобных веществах обязательно должны входить аминные группировки, предложил называть эти неизвестные вещества витаминами, т.е. аминами жизни. В дальнейшем было установлено, что многие из них аминных групп не содержат, но термин «витамин» прижился в науке и практике.

Согласно классическому определению, витамины - это необходимые для нормальной жизнедеятельности низкомолекулярные органические вещества, которые не синтезируются организмом данного вида или синтезируются в количестве, недостаточном для обеспечения жизнедеятельности организма. Витамины необходимы для нормального протекания практически всех биохимических процессов в нашем организме.

2 Классификация витаминов

Современная классификация витаминов не является совершенной. Она основана на физико-химических свойствах (в частности, растворимости) или на химической природе. В зависимости от растворимости в неполярных органических растворителях или в водной среде различают жирорастворимые и водорастворимые витамины. В приводимой классификации витаминов, помимо буквенного обозначения, в скобках указан основной биологический эффект, иногда с приставкой «анти», указывающей на способность данного витамина предотвращать или устранять развитие соответствующего заболевания.

Витамины, растворимые в жирах

Витамин Л (антиксерофгальмический); ретинол

Витамин D (антирахитический); кальциферолы

Витамин Е (антистерильный, витамин размножения); токоферолы

Витамин К (антигеморрагический); нафтохиноны

Витамины, растворимые в воде

.Витамин В1 (антиневритный); тиамин

.Витамин В2 (витамин роста); рибофлавин

.Витамин В6 (антидерматитный, адермин); пиридоксин

.Витамин В12 (антианемический); цианкобаламии; кобаламин

.Витамин РР (антипеллагрический, ниацин); никотинамид

.Витамин Н (антисеборейный, фактор роста бактерий, дрожжей и грибков); биотин

.Витамин С (антискорбутный): аскорбиновая кислота

3 Строение и свойства витамина В1

Витамин В1-тиамин является хлористоводородной солью 4-метил-5-?-оксиэтил- N - (2-метил-4-амино-5-метилпиримидил) -тиазолийхлорида, получается синтетически обычно в виде хлористо-или бромистоводородной соли. В его структуру входят такие гетероциклические системы, как пиримидил и тиазол.

Витамин В1- белый кристаллический порошок горького вкуса, с характерным запахом, хорошо растворяется в воде(1г в 1 мг), ледяной уксусной кислоте, в этиловом спирте. В сильнокислой водной среде тиамин обладает высокой устойчивостью и не разрушается под действием таких энергичных окислителей, как перекись водорода, марганцовокислый калий и озон. При рН=3,5 тиамин может нагреваться до температуры 120ºС без заметных признаков разложения.

Витамин В1 способен окисляться. В щелочной среде под действием красной кровяной соли тиамин переходит в тиохром. Превращение тиамина в тиохром количественный необратимый процесс.

Эта реакция положена в основу одного из количественных методов определения витамина В1. Превращение тиамина в тиохром сопровождается утратой витаминной способности.

1.4 Синтез

Учитывая особенности строения витамина В1, его синтез может быть осуществлен тремя путями: конденсацией пиримидинового и тиазольного компонентов, на основе пиримидинового компонента и на основе тиазольного компонента.

Рассмотрим первый вариант. Оба компонента синтезируются параллельно, а затем соединяются в молекулу тиамина. Конкретно 2- метил-4-амино-5 хлорметилпиримидин взаимодействует с 4-метил-5-оксиэтиазолом, образуя четвертичную тиазолевую соль:

Конденсация проходит при температуре 1200С в толуоле или бутиловом спирте. Далее полученный тиамин выделяют из реакционной смеси осаждением ацетоном и очищают перекристаллизацией из метанола.

5 Распространение в природе и применение

Тиамин распространен повсеместно и обнаруживается у разных представителей живой природы. Как правило, количество его в растениях и микроорганизмах достигает величин значительно более высоких, чем у животных. Кроме того, в первом случае витамин представлен преимущественно свободной, а во втором - фосфорилированной формой. Содержание тиамина в основных продуктах питания колеблется в довольно широких пределах в зависимости от места и способа получения исходного сырья, характера технологической обработки полупродуктов и т. п.

В злаковых семенах растений тиамин, подобно большинству водорастворимых витаминов, содержится в оболочке и зародыше. Переработка растительного сырья (удаление отрубей) всегда сопровождается резким снижением уровня витамина в полученном продукте. Шлифованный рис, например, совсем не содержит витамина.

Витамин В1 широко применяется в медицинской практике для лечения различных нервных заболеваний (неврозов, полиневритов), сердечно - сосудистых расстройств(гипертония) и др.

Витаминизация хлебобулочных изделий и комбикормов в животноводстве и птицеводстве.

Суточная потребность взрослого человека в среднем составляет 2-3 мг витамина В1. Но потребность в нём в очень большой степени зависит от состава и общей калорийности пищи, интенсивности обмена веществ и интенсивности работы. Преобладание углеводов в пище повышает потребность организма в витамине; жиры, наоборот, резко уменьшают эту потребность.

2. Методы определения витаминов

Все методы исследования витаминов подразделяются на биологические (микробиологические), физические, химические и физико-химические.

1 Биологические методы

Несмотря на то, что биологические методы определения некоторых витаминов отличаются высокой чувствительностью и могут использоваться для исследования образцов с незначительным содержанием этих соединений, в настоящее время они представляют главным образом исторический интерес. Точность этих методов невысока, кроме того биологические методы требуют больших затрат времени и средств и неудобны для проведения серийных анализов.

Микробиологические методы основаны на измерении скорости роста бактерий, которая пропорциональна концентрации витамина в исследуемом объекте.

2.2 Химические методы

Специфичность свойств витаминов обусловлена наличием в их молекулах функциональных групп. Это свойство широко используется при количественном и качественном химическом анализе.

Химические методы анализа:

) Фотометрический;

) Титриметрический(заключается в том, что все вещества реагируют между собой в эквивалентных количествах С*V = С*V);

3) Гравиметрический(заключается в выделении вещества в чистом виде и его взвешивании. Чаще всего такое выделение проводят осаждением. Реже определяемый компонент выделяют в виде летучего соединения(метод отгонки). Аналитический сигнал-масса);

) Оптический(основан на поглощении системой некоторого количества лучистой энергии атомами. Количество энергии поглощения находится в прямой зависимости от концентрации вещества в растворе).

3 Физические методы

Применение физических методов в анализе витаминов (например, ПМР) ограничено высокой стоимостью приборов.

Кондуктометрический - основан на измерении электропроводности раствора.

Потенциометрический(в основе метода лежит измерение зависимости равновесного потенциала электрода от активности(концентрации) определяемого иона определяемого иона. Для измерений необходимо сравнивать элемент из подходящего индикаторного электрода и электрода сравнения).

Масс-спектральный - применяется при помощи сильных элементов и магнитных полей, происходит разделение газовых смесей на компоненты в соответствии с атомами или молекулярными массами компонентов. Применяется при исследовании смеси изотопов, инертных газов, смесей органических веществ.

4 Физико-химические методы

В настоящее время в практике фармацевтического анализа находят все большее применение физико-химические методы анализа, как наиболее точные и экспрессные по своему исполнению. К ним относятся оптические, электрохимические и хроматографические методы анализа.

Среди оптических методов наибольшее распространение получили спектрофотометрические и фотоколориметрические методы, основанные на общем принципе - существовании в известных границах концентраций прямой пропорциональной зависимости между светопоглощением раствора и концентрацией растворенного вещества. Спектрофотометрический анализ по непосредственному измерению оптической плотности может быть проведен для веществ, обладающими определенными особенностями строения - в структуре должны быть хромофорные и ауксохромные группы (например, гетероатомы, системы сопряженных связей).

К достоинствам колориметрических (фотометрических) методов можно отнести доступность оборудования и средств измерения, экспрессность. Основным недостатком является низкая селективность, препятствующая применению этих методов к сложным по составу объектам. Сказывается влияние сопутствующих компонентов: провитаминов, антиоксидантов, производных витаминов, продуктов деструкции витаминов, способных подобно витаминам, давать окрашенные продукты. Встречаются трудности при подборе специфического реактива для взаимодействия с определенным витамином.

Несмотря на недостатки этого метода, для многих витаминов разработаны методики фотометрического определения.

Несмотря на разнообразие методик фотометрического определения витаминов ученые до сих пор интересуются этим методом, унифицируют старые методики и создают новые.

Хроматографические методы анализа очень распространены в фармацевтической практике. Эти методы перспективны при анализе веществ, содержащих витамины и имеющих сложную структуру.

Вплоть до относительно недавнего времени наиболее часто из хроматографических методов использовали газожидкостную хроматографию (ГЖХ).

В настоящее время альтернативным способом быстрого определения витаминов в разнообразных объектах является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

Определение витаминов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии не требует длительной пробоподготовки, достаточно высока чувствительность метода, однако высокая стоимость оборудования существенно ограничивает применение этого метода.

Электрохимические методы анализа основаны на использовании ионообменных или электрообменных процессов, протекающих на поверхности электрода или в при электродном пространстве. Аналитическим сигналом служит любой электрический параметр (потенциал, сила тока, сопротивление, электропроводность и т.д.), функционально связанный с составом и концентрацией раствора.

Электрохимические методы анализа играют важную роль в современной фармацее, поскольку характеризуются высокой чувствительностью, низкими пределами обнаружения, широким интервалом определяемых содержаний. Самыми распространенными методами являются полярография и вольтамперометрия. Литературные данные по полярографическому исследованию витаминов самые многочисленные. Полярографически можно определять количественное содержание каждого витамина в индивидуальных и в сложных фармацевтических препаратах.

Метод достаточно чувствительный, но использование полярографии ограничено применением токсичного ртутного электрода.

Вместе с тем метод потенциометрического титрования является экспрессным, простым в выполнении, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов.

3. Экспериментальная часть

1 Потенциометрическое определение витамина В1

В структуру витамина В1 входит подвижный хлор (С12Н18ОN4Cl2S):

витамин тиамин титрование потенциометрический

Это дало возможность использовать осадительное потенциометрическое титрование для определения тиамина. В качестве индикаторного электрода использовался серебряный электрод. Титрантом служил раствор нитрата серебра с концентрацией 0,05 моль/л.

Для проведения анализа готовили растворы с концентрацией витамина В1 0,02968моль/л. Для этого содержимое 10 ампул количественно переносили в колбу на 50 мл и доводили до метки дистиллированной водой. Объем ампул равен 1 мл, содержание витамина В1 - 50 мг (Производитель: ОАО «Мосхимфармпрепараты» им. Н.А.Семашко). Отбирали аликвоты, объемом по 5 мл и проводили потенциометрическое титрование. Эквивалентный объем раствора нитрата серебра при титровании 5 мл раствора витамина 6 мл. Было выполнено 8 потенциометрических измерений.

Примеры кривых титрования представлены на рисунках 1, 2, 3, 4, 5. Кривые титрования построены в координатах- интегральные кривые V, мл- Е, Вт, а дифференциальные кривые в координатах - ?V -

Рис.1 Кривая потенциометрического титрования витамина В1(Val=5 мл)

Рис.2 Кривая потенциометрического титрования витамина В1(Val=5 мл)

Рис.3 Кривая потенциометрического титрования витамина В1(Val=5 мл)

Рис.4 Кривая потенциометрического титрования витамина В1(Val=5 мл)

Рис.5 Кривая потенциометрического титрования витамина В1(Val=5 мл)

где ТAgNO3/вит.В1.= (0,05*337)/1000=0,01685г/мл; Vэ- объем нитрата серебра, пошедший на титрование.

где Vколбы = 50мл, ТAgNO3/вит.В1 =0,008425г/мл, Vэ - объем нитрата серебра, пошедший на титрование, Val = 5 мл, N - число ампул (10 шт).

Результаты анализа представлены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты анализа потенциометрического титрования.

№V, мла, мгm, г160.10110,05055260.10110,0505536,50,10950,05476460.10110,05055560.10110,05055660.10110,05055760.10110,05055860.10110,05055<среднее>6,06250,102150,051076

где x - "подозрительное" значение (вероятный промах) - это максимальное или минимальное значение выборки, xближайшее - ближайшее к подозрительному значение, xmin и xmax - максимальное и минимальное значения выборки. Значение Q сравнивают с табличным значением(Таблица 2). Доверительную вероятность берут равной 0.90 или 0.95. Если Q> Qтабл - подозрительный результат является промахом и исключается из дальнейшего рассмотрения;Q< Qтабл - подозрительный результат не является промахом.

Таблица 2. Критические значения Q-критерия для различной доверительной вероятности p и числа измерений n.

np0.900.950.9930.9410.9700.99440.7650.8290.92650.6420.7100.82160.5600.6250.74070.5070.5680.68080.4680.5260.63490.4370.4930.598100.4120.4660.568

Вычисления: n=8; р=0.90;= =1,0>0,468 критерий свидетельствует, что результат является промахом, и мы его не учитываем.

Исключая промах получаем m= 0,05055 г, по нормативным документам содержание витамина В1 должно быть равным 0,05 г.

Погрешность составляет:

Х= 0,05055-0,05= 0,00055 г

1,1%

. Среднее квадратичное отклонение, характеризующее разброс результатов КХА:

Таблица 3. Вспомогательная таблица для расчета СКО.

mimi - (mi - )2S0,050550,050550000,050550,050550000,050550,050550000,050550,050550000,050550,050550000,050550,050550000,050550,05055000

. Доверительный интервал:

0,05055

3.2 Аргентометрическое определение витамина В1

Аргентометрическое определение по методу Фаянса,. Метод Фаянса - это метод прямого титрования галогенидов раствором AgNO30,1М в слабо кислой среде с применением адсорбционных индикаторов, которые показывают изменение цвета не в растворах, а на поверхности выпавшего осадка. Использовали раствор, приготовленный для первого метода количественного определения тиамина с концентрацией витамина 0,02968моль/л. Val= 5 мл. Прибавляли 2-3 капли раствора бромфенолового синего и по каплям разведенную уксусную кислоту до получения зеленовато-желтого окрашивания. Полученный раствор титровали 0,1 М раствором нитрата серебра до фиолетовой окраски.

Титрование идет по уравнению:

(С12Н17N4ОS)Cl- .HCl +2AgNO3= 2AgCl + (С12Н17N4ОS)NO3- .HNO3

Таблица 4. Результаты аргентометирического определения витамина В1

№V, млm, г11,50,0505521,50,0505531,50,0505541,50,0505551,40,0471861,50,0505571,50,0505581,50,0505591,40,04718101,50,05055<среднее>1,480,04988

Приведённые результаты свидетельствуют о наличии выпадающих результатов. Определение промахов ведем по Q-критерию: Тестовая статистика Q-критерия вычисляется по формуле:

Вычисления: n=10; р=0.90;

> 0,412критерий свидетельствует, что результат является промахом, и мы его не учитываем в дальнейших расчетах.

1.Установление титра AgNO3 0,1 N по раствору NaCl 0,1 N

= ;

V-объем AgNO3, пошедший на титрование, мл.

2.Погрешность составляет:

Х= 0,05055 -0,05= 0,00055 г

1,1%

Математическая обработка результатов КХА (количественного химического анализа)

. Среднее квадратичное отклонение, характеризующее разброс результатов КХА

Таблица 5. Вспомогательная таблица для расчета СКО.

mimi - (mi - )2S0,050550,050550000,050550,050550000,050550,050550000,050550,050550000,050550,050550000,050550,050550000,050550,050550000,050550,05055000

. Доверительный интервал:

Верхнюю и нижнюю границы интервала, в котором погрешность результатов КХА находится с доверительной вероятностью 0,95, определяли следующим образом:

0,05055

Заключение

В данной курсовой работе стояла задача количественно определить витамин В1. Для определения витаминов применяют различные методы. Так же необходимо учитывать химическое строение каждого витамина. Широко используемые оптические методы анализа трудоемки, требуют больших затрат времени и дорогостоящих реактивов, применение хроматографических методов осложнено использованием дорогостоящего оборудования. Было выбрано два метода определения тиамина:

.Потенциометрическое титрование, который имеет ряд преимуществ по сравнению с существующими методами анализа фармпрепаратов, на содержание в них витаминов: метод прост, экспрессен, не требует дорогостоящего оборудования, расход реактивов минимален, исключено влияние субъективных факторов.

По этому методу ошибка составляет 1,1%.

.Титрование, заключается в том, что все вещества реагируют между собой в эквивалентных количествах С*V = С*V

В данном методе определения тиамина ошибка составляет 1,1%.

Доверительный интервал: 0,05055.

Список используемой литературы

1. Биохимия: учеб.для вузов 3-е изд., стереотип. / В.П. Комов; В.Н. Шведова М.: Дрофа, 2008. -638 с.

Химия витаминов/ В.М. Березовский М.: «Пищевая промышленность», 1973. -632 с.

Основы аналитической химии книга 2 методы химического анализа / Ю.А. Золотов «Высшая школа» год; 2002. -494 с.

4. Аналитическая химия, учебное пособие/ Н.Я. Логинов; А.Г.Воскресенский; И.С. Солодкин-. М.: «Просвещение» 1975.- 478 с.

5. Михеева Е.В. Вольтамперометрическое определение водорастворимых витаминов В1 и В2 в витаминизированных подкормках и кормах./ Е. В. Михеева, Л. С. Анисимова // Материалы 6 конференции « Аналитика Сибири и Дальнего Востока» г.Новосибирс.-2000.-с.367.

Химические методы в количественном анализе лекарственных средств: Методическое указание для студентов V курса по «Контроль качества лекарственных средств»/ Государственный Университет Медицины и Фармации им. Н. Тестемицану.- Кишинэу.- 2008

ГОСТ 29138-91

8. Л.Н. Корсун, Г.Н. Баторова, Э.Т. Павлова/- Математическая обработка результатов химического эксперимента: учебное пособие для студентов химических, медицинских и биологических специальностей и направлений-Улан-Удэ.- 2011.-70 с.

Репетиторство

Нужна помощь по изучению какой-либы темы?

Наши специалисты проконсультируют или окажут репетиторские услуги по интересующей вас тематике.
Отправь заявку с указанием темы прямо сейчас, чтобы узнать о возможности получения консультации.