Бактериологический метод включает бактериоскопию материала от больного, выделение чистой культуры возбудителя и его идентификацию с определением чувствительности к антибиотикам и химиопрепаратам.

Выбор материала для исследования бактериоскопическим методом зависит от предполагаемой этиологии заболевания, стадии болезни с учетом ее патогенеза, биологических свойств возбудителя и других моментов.
1. При инфекционных болезнях , протекающих с бактериемией (брюшной тиф, генерализованные и септические формы сальмонеллеза); при сепсисе любой этиологии, вызываемом не только гноеродной кокковой микрофлорой, синегнойной палочкой, но и более редкими ее возбудителями (Serratia Salinaria, неферментирующие бактерии, анаэробы, L-формы стрептококка (метод Сукнева) и другие микроорганизмы), прибегая в этих случаях к посевам на специальные питательные среды. Следует подчеркнуть, что успех частоты и спектр выделяемых возбудителей из крови и других биологических секретов больного зависят от эрудиции, пытливости, настойчивости и упорства работников бактериологической лаборатории.
2. Спинномозговая жидкость (гнойные менингиты; туберкулезный менингит при длительном выращивании (более месяца) на специальных для выделения туберкулезных бактерий питательных средах.
3. Мокрота (острые пневмонии и трахеобронхиты, туберкулез, коклюш, чума, редкие формы брюшного тифа (пневмотиф), легионеллез, респираторный микоплазмоз и хламидиозы).
4. Слизь, гной с миндалин (стрептококковые и стафилокковые ангины).

5. Налет и слизь с миндалин , из зева и носа, отделяемое с конъюнктивы, половых органов (дифтерия).
6. Соскоб со слизистой носа (проказа).
7. Отделяемое из носа и ротоглотки (синуиты, озена, риносклерома).

8. Отечная жидкость, кусочки пораженных мышц, некрозированные ткани (анаэробные инфекции); отделяемое ран (ботулизм; в случае необходимости и столбняк).
9. Пунктат из увеличенных лимфоузлов (туберкулез, токсоплазмоз).
10 Содержимое карбункула и пунктат из нагноившихся лимфоузлов (чума, туляремия, септикопиемия, сибирская язва).

Бактериологические исследования при особо опасных инфекциях (чума, туляремия, бруцеллез, холера (при которой исследуются только испражнения(!)) выполняются в специальных режимных лабораториях, исключающих возможность самозаражения ее сотрудников при работе с бактериальными культурами и распространение возбудителей за пределы этих лабораторий.

Серологические исследования . Внедрены в клинику несколько позднее бактериологического метода, предложенного Р. Кохом. В 1896 г. Ф. Видаль обнаружил, что сыворотки крови больных брюшным тифом к концу 1-й недели болезни приобретают способность агглютинировать брюшнотифозную палочку - возбудителя брюшного тифа (положительная реакция Видаля). При полимикробной этиологии инфекционных болезней после открытия Видаля стали также прибегать к определению титров сывороточных агглютининов к выделяемым из патологического материала нескольким видам бактерий (реакция аутовидаля) и контролировать их динамику в зависимости от стадии болезни. Наиболее высокие титры агглютининов к одному из видов выделенных бактерий свидетельствуют в пользу его большей этиологической причастности к развитию болезни.

Уже в начале применения реакции Видаля в клинике было замечено, что самые тяжелые формы, например, брюшного тифа могут протекать при отсутствии в крови агглютининов (отрицательная реакции Видаля), что указывает на относительную диагностическую ценность этого метода как при брюшном тифе, так и при других инфекционных болезней. Позднее он был заменен более чувствительными серологическими методами. Но приоритетное значение открытия Видаля останется навсегда.

В настоящее время для серологической диагностики бактериальных инфекций применяют более чувствительные методы, когда антиген бактерий сорбируют на поверхности эритроцитов (эритроцитарные диагностикумы1). Таким образом, были разработаны принципиально новые серологические реакции: прямой (РПГА) и непрямой гемагглютинации (РИГА). Они широко применяются для серологической диагностики многих бактериальных, вирусных и других инфекций (брюшного тифа, сальмонеллеза, шигеллезов, бруцеллеза, туляремии и др.). Сохраняет свое диагностическое значение реакция преципитации при некоторых заболеваниях (ботулизме и сибирской язве - реакция Асколи для ее диагностики у животных). В серодиагностике особенно широко в настоящее время применяется реакция связывание комплемента (РСК), предложенная в 1901 г. французскими исследователями Борде и Жангу (сифилис, гонорея, бруцеллез, токсоплазмоз, туберкулез, проказа, сап). РСК имеет наибольшее значение для серодиагностики вирусных инфекций (грипп, другие ОРВИ, герпес, энцефалит, эпидемический паротит, орнитоз и др.), а также многочисленных риккетсиозов.

Бактериологический метод исследования. Выделение чистой культуры аэробных бактерий (1-2 этапы)

1. Суть бактериологического метода

3. Методы получения изолированных колоний

4. Методы получения чистой культуры

1. Провести первичный посев методом Коха и Дригальского

2. Выделить чистую культуру

План работы:

1. Бактериологический метод исследования

2. Этапы бактериологического метода

3. Понятие: чистая культура, штамм, колония

4. Методы получения изолированных колоний

5. Методы получения чистой культуры аэробных бактерий

Основным методом лабораторной диагностики инфекционных болезней является бактериологический метод. Суть бактериологического метода заключается в выделении возбудителей из исследуемого материала и его идентификации (определения рода, вида, разновидностей).

Бактериологический метод позволяет определить:

1. Вид возбудителя и поставить диагноз заболевания

2. Антибиотики, убивающие возбудителя и назначить соответствующее лечение

3. Фаговары и серовары возбудителя для выявления источника инфекции

Первый этап - первичный посев исследуемого материала для получения изолированных колоний. Первичный посев проводят на накопительные среды и ДДС (чашечные среды).

Второй этап - характеристика изолированных колоний и получение из них чистой культуры путем пересева на скошенный столбик основной среды.

Третий этап - идентификация чистой культуры - определение рода, вида, разновидностей возбудителя, определение антибиотикочувствительности, определение фаговаров.

Культура микроорганизмов - это бактерии, выросшие на питательных средах. Чистая культура - это бактерии одного вида, выросшие на питательных средах. Внутри вида встречаются разновидности, отличающиеся по одному признаку:

1. Морфовары - отличаются по морфологии

2. Хемовары - отличаются по биохимическим свойствам

3. Серовары - отличаются по антигенным свойствам

4. Фаговары - отличаются по чувствительности к фагам

Чистая культура необходима для проведения идентификации, определения сероваров, фаговаров, чувствительности к антибиотикам. Штамм - это бактерии одного вида, выделенные из конкретного источника (река Волга, больной Иванов и т. д.). Колония - видимое скопление бактерий одного вида, образующееся при размножении одной бактериальной клетки на плотной питательной среде.

Первый этап исследования - первичный посев исследуемого материала для получения изолированных колоний. Перед первичным посевом проводят микроскопию исследуемого материала. Исследуемый материал как правило содержит смесь различных бактерий, в том числе и возбудителей болезни. Для выделения возбудителя необходимо получить изолированные колонии (бактерии одного вида) путем подбора питательной среды и специальными методами посева.

Существует два метода получения изолированных колоний:

1. Метод Дригальского

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: знать принципы культивирования микроорганизмов, питательные среды, их классификация; методы стерилизации и дезинфекции, применяемые в микробиологии и медицине; этапы бактериологического метода диагностики инфекционных заболеваний.

уметь пользоваться аппаратурой для культивирования бактерий (аэробов и анаэробов), выбрать средства, режим стерилизации и дезинфекции в соответствии с конкретными задачами, проводить 1 этап бактериологического метода диагностики инфекционных заболеваний (посевы исследуемого материала на плотные и жидкие питательные среды с целью выделения чистых культур аэробных микроорганизмов).

1. Вопросы для самоподготовки:

1. Состав и требования, предъявляемые к питательным средам

2. Классификация питательных сред

3. Асептика и антисептика

4. Дезинфекция, методы и контроль эффективности дезинфекции

5. Стерилизация, методы, аппаратура и режимы стерилизации

6. Методы определения эффективности стерилизации

7. Вид, штамм, колония, чистая культура микроорганизмов

8. Методы выделения чистых культур микроорганизмов

9. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Цель и последовательность выполнения 1 этапа бактериологического метода выделения аэробов

10. Техника посева микроорганизмов на жидкие и плотные питательные среды

11. Особенности культивирования анаэробных микроорганизмов. Аппаратура и оборудование, используемая для культивирования анаэробных бактерий

2. Контрольные вопросы:

1) Выписать требования, предъявляемые к питательным средам

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2) Выписать классификацию питательных сред

а) по консистенции (с примерами, указать концентрацию агар-агара): ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

б) по целевому назначению (дать определение, привести примеры)

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

3) Выписать методы стерилизации

а) с использованием высоких температур ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

б) без использования высоких температур ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4) Перечислить аппаратуру для стерилизации ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5) Выписать в тетрадь а) методы контроля режима стерилизации

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

б) методы контроля стерильности питательных сред ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

в) методы контроля стерильности инструментов, перевязочного, шовного материала и др. ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

6) Перечислить все методы культивирования аэробов

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

7) Перечислить все методы культивирования анаэробов

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

8) Изучить схему бактериологического метода диагностики, назвать этапы метода

Выписать цель и схему бактериологического метода исследования

ЦЕЛЬ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

СХЕМА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Ознакомиться с питательными средами и заполнить таблицу «Питательные среды».

Заполните таблицу «Основные методы стерилизации»

Базовый текст

Состав и требования, предъявляемые к питательным средам

Пи­тательные среды необходимы для получения чистых культур микроорганизмов, изучения особенностей их морфологии и физиологии, а также для сохранения мик­роорганизмов в виде чистых культур в лабораторных и производственных условиях.

Питательная среда должна удовлетворять сле­дующим требованиям:

1. Питательность (полноценность) - содержание необходимых для жизнедеятельности микробов факторов – источников углерода, азота, серы, источников энергии, необходимых неорганических ионов в форме доступной для усвоения микроорганизмами.

2. Изотоничность, создаваемая 0,85% NaCl (концентрация солей в питательной среде должна соответствовать их концентрации в микробной клетке).

3. Оптимальные значения ряда биохимических показателей: концентрации водородных ионов (диапазон рН 4,5-8,5, обычно 7,2-7,4), окислительно-востановительного потенциала (Eh для анаэробов – низкий 0,0120-0,060 В, для аэробов – высокий более 0,080 В), осмотического давления.

4. Иметь достаточную влажность (не менее 60% для плотных сред), так как микробы пита­ются по законам диффузии и осмоса.

5. Определенная вязкость (наиболее оптимальная для диффузии веществ).

6. Прозрачность, для визуализации роста бактерий.

7. Стерильность.

Компоненты питательных сред

Источ­ником азота для микроорганизмов являются белки, но большинство мик­робов неспособны усваивать нативный белок, поэтому используются про­дукты кислотного и ферментного расщепления белка: пептон, казеин. Исходными компонентами искусственной питательной среды является мясная вода, кислотный и ферментный гидролизат казеина, пептон, также к основе добавляют хлорид натрия. Мясная вода содержит минеральные вещества, углеводы, витамины. Казеин пищевой кислотный является отходом молочной промышленности, содержит полноценный набор аминокислот и характеризуется высокой питательностью. Пептон – это продукт неполного переваривания белка, получаемый путем ферментного или кислотного гидролиза отходов производства мясных или рыбных продуктов или молочного казеина. Содержит альбумозы, пептоны и полипептиды аминокислот в незначительном коли­честве, состав их зависит от глубины расщепления белка. Пептон представляет собой порошок светло-желтого цвета, хорошо растворяется в воде, не свертывается при нагревании. Используется как источник азота и углерода.

Плотные питательные среды готовят из жидких с добавлением уплотнителя. В качестве уплотнителя обычно применяют агар-агар. Агар-агар – продукт, получаемый из морских водорослей, представляет собой желтоватый порошок или пластинки, содержит высокомолекулярные полисахариды, не расщепляется большинством микроорганизмов, не разрушается при автоклавировании, питательную ценность сред не изменяет, не подавляет рост микробов. Он способен образовывать в воде гели, плавящиеся при 100°С и уплотняющиеся при 45°С и ни­же, не используемые микроорганизмами в качестве пи­тательного субстрата. Несколько циклов плавления и за­твердевания не влияют на способность агара образовы­вать гель, поэтому агаровые среды можно несколько раз стерилизовать.

Также в состав питательных сред включают кровь, сыворотки, неорганические соли. Все питательные среды, как правило, содержат 0,5 % хлористого натрия, что соответствует изоосмотическим условиям среды, оптимальным для жизнедеятельности микробов. Функцией минеральных элементов в метаболизме микробов является в основном активация различных ферментов. Кроме того, неорганические ионы (в основном Na+ и К+) участвуют в транспорте веществ через клеточные мембраны, в регуляции синтеза белка.

Восстанавливающие вещества. Восстанавливающие вещества добавляют в среды, предназначенные для культивирования анаэробных микроорганизмов, чтобы снизить окислительно-восстановительный потенциал (Eh) и сбалансировать его на оптимальном уровне. Eh - это мера способности раствора отдавать или принимать электроны. При культивировании анаэробов в качестве восстановителей обычно применяют тиогликолят натрия (0,1 %), цистеин (0.1%), аскорбиновую кислоту (0,1 %).

Углеводы, многоатомные спирты, индикаторы . Углеводы являются наилучшим источником углерода для большинства гетеротрофных микроорганизмов. Они входят в состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для определения биохимических свойств микробов.

В состав питательных сред, кроме углеводов и многоатомных спиртов, входят различные индикаторы , в основном кислотно-основные. Изменение цвета среды при посеве микроорганизмов указывает на образование кислоты или щелочи при ферментативной активности микроорганизмов. В качестве индикаторов обычно используют нейтральный красный, бромтимоловый синий, конго красный, смесь розоловой кислоты и водно-голубого (ВР), индикатор Андреде.

Красители. Способность красителей легко и обратимо переходить из окрашенной формы в восстановленную (бесцветную) широко используется в бактериологической практике, в частности, для дифференциации бактерий, разлагающих лактозу, от лактозоотрицательных. В результате указанного процесса лактозоположительные бактерии образуют на среде окрашенные колонии, а лактозоотрицательные – бесцветны. Наиболее употребительными красителями, входящими в состав питательных сред, являются основной фуксин, метиленовая синь и эозин.

Ингибиторы. При исследовании на наличие патогенных бактерий необходимо подавить рост сопутствующей микрофлоры. С этой целью используют различные ингибиторы. В качестве ингибиторов грамотрицательных микроорганизмов в состав сред входят тетратионат натрия и калия, теллурит калия, ацетат таллия, сульфат таллия, селенит натрия. Для угнетения роста грамположительных микробов используются анилиновые красители: бриллиантовый зеленый, кристаллический фиолетовый, этиловый фиолетовый, анилиновый синий. Желчь и соли желчных кислот входят в состав селективных сред для выращивания патогенных энтеробактерий. Смесь желчных кислот, получаемая в результате щелочного гидролиза желчи, входит в состав среды Плоскирева. За рубежом в составе селективных сред используют соли отдельных желчных кислот, в основном дезоксихолат натрия.

Сухие питательные среды. Приготовление питательных сред - один из наиболее ответственных участков работы бактериологической лаборатории. В связи с этим биопромышленность выпускает стандартные, консервированные, сухие питательные среды, различного назначения, для культивирования микроорганизмов. Они представляют со­бой гигроскопические порошки с влажностью до 10%. Го­товят среды по прописи, указанной на этикетке. Постоянство состава, стан­дартность среды, простота и удобство в работе, легкость транспортировки и хранения являются большим преимуще­ством сухих питательных сред. После установления соответствую­щего рН среду кипятят, фильтруют, осветляют, разливают во флаконы, пробирки и стерилизуют. Следует учитывать, что после стерилизации среда становится более кислой.

Культуральныйметод исследования представляет собой выделение из питательной средыбактерий определённого вида путём культивирования,с их последующей видовой идентификацией. Вид бактерий определяется с учётом их строения, культуральных и экологических данных, а также генетических, биохимических и биологических показателей. Для проведения бактериологической диагностики используются схемы, которые утверждены Минздравом.

Выведенные из питательной среды новые виды бактерий, свойства которых ещё не определены, называются чистой культурой . После окончательной идентификации их характеристик, бактерии,выведенные из определённого места и в определённое время, получают название штамм. При этом допускается незначительное различие в свойствах, месте или времени выделения штамма одного вида.

Цель метода :

1. Этиологический диагноз, то есть выделение и идентификация чистой культуры бактерий.

2. Определение количества микроорганизмов и их особых характеристик. Например, специфическая реакция на антибиотики.

3. Выявление внутриродовых отличий микроорганизмов, на основе их эпидемиологической и генетической составляющей. Это необходимо для определения общности микроорганизмов выделенных в разных местах и разных условиях, что важно для эпидемиологических целей.

Данный метод исследования имеет определённый ряд этапов, различных для аэробных, факультативных и облигатных аэробных бактерий.

Выведение чистой культуры для аэробных и факультативных аэробных бактерий.

1 этап

А) Подготовительные мероприятия . Эта стадия включает в себя забор, хранение итранспортировку материала. Также, при необходимости, может проводиться его обработка, в зависимости отсвойств изучаемых бактерий. Например, при обследовании материала на туберкулёз, для выявления кислоустойчивых микробактерий используются растворы щёлочи или кислоты.

Б) Обогащение . Данная стадия не является обязательной и проводится в том случае, если количества бактерий в исследуемом материале недостаточно для проведения полноценного исследования. Например, при выделении гемокультуры, исследуемую кровь помещают в среду в соотношении 1 к 10 и хранят в течение суток при температуре 37 о.

В) Микроскопия . Мазок исследуемого материала окрашивается и изучается под микроскопом - исследуется микрофлора, её свойства и количество. В дальнейшем из первичного мазка необходимо отдельно выделить все находящиеся в нём микроорганизмы.

Г) Создание отдельных колоний . На чашку, со специальной, селективной средой, наносится материал, для этого используют петлю или шпатель. Далее, устанавливают чашку вверх дном, для защиты колоний от конденсата, и хранят в термостате около 20 часов, поддерживая температуру 37 о.

Важно! Следует помнить, что в процессе исследования, необходимо придерживаться правил изоляции. С одой стороны, для защиты исследуемого материала и выводимых бактерий, и с другой стороны, для предотвращения заражения окружающих лиц и внешней среды.

Что касается условно-патогенных микроорганизмов, то при их выведении, имеет значение их количественная характеристика. В этом случае, проводится количественный посев, при котором проводят несколько стократных разведений материала в изотоническом растворе хлорида натрия. После, осуществляют посев в чашки Петри по 50 мкл.

2 этап

А) Изучение морфологических свойств колоний в средах и их микроскопия . Исследуются чашки и отмечаются свойства микроорганизмов, показатели их количества, темпы роста, а также отмечается наиболее подходящая питательная среда. Для изучения лучше всего выбрать колонии, располагающиеся ближе к центру, и если образуется несколько типов чистых культур, то изучить каждую в отдельности.Для изучения морфотипной чистоты культуры используют мазок колонии, его окрашивают (обычно используется метод по Граму или же любой другой) и тщательно микроскопируют.

Б) Накопление чистой культуры . Для этого колонии всех морфотипов рассаживают в отдельные пробирки с питательной средой и содержат в термостате при определённой температуре(для большинства микроорганизмов подходящей является температура 37 о, но в некоторых случаях может быть иной).

Питательной средой для накопления часто служит среда Клиглера.Она имеет «скошенный» вид в пробирках, где 2/3 её части в виде столбика, а 1/3 – скошенная поверхность, окрашена в светло-красный цвет. Состав:

· МПА

· 0,1% глюкозы

· 1% лактозы

· Специальный реактив на сероводород

· Феноловыйкрасный индикатор.

3 этап

А) Уровень роста и чистоты культуры . В общем порядке, выведенная чистая культура имеет однородный рост и при микроскопическом рассмотрении клетки имеют одинаковое морфологическое и тинкториальное строение. Но встречаются некоторые виды бактерий с ярковыраженным плеофоризмом, при этом, встречаются клетки, имеющие различное морфологическое строение.

Если в качестве питательной среды использовалась среда Клиглера, то по изменению цвета столбика и скошенной части определяются биохимические характеристики. Например, если происходит разложение лактозы - желтеет скошенная часть, если глюкозы - пожелтение столбика; при продукции сероводорода происходит почернение из-за перехода сульфата в сульфид железа.

Как можно заметить на рисунке, среда Клиглера имеет свойство изменять свой цвет. Это происходит из-за того, что расщепление бактериями азотистых веществ и образование продуктов щёлочи происходит неоднородно как в столбике (анаэробные условия), так и на скошенной поверхности (аэробные условия).

В аэробной среде (скошенная поверхность) наблюдается более активное образование щёлочи, чем в анаэробной среде (столбик). Поэтому, когда происходит разложение глюкозы, кислота на скошенной поверхности без труда нейтрализуется. Но, при разложении лактозы, концентрация которой намного больше, кислоту не выходит нейтрализовать.

Что касается анаэробной среды, то щелочных продуктов генерируется крайне мало, поэтому здесь можно наблюдать, как глюкоза ферментируется.

Рис. Питательная среда Клиглера:

1 – исходная среда,

2 – рост E. coli,

3 – рост S. paratyphi B,

4 – рост S. Typhi.

E . coli – способствует разложению глюкозы и лактозы с образованием газов, не производит водород. Вызывает пожелтение всей среды с разрывами.

S. paratyphi – способствует разложению глюкозы с образованием газов, лактозоотрицателен. Скошенная часть цвет не изменяет, столбик – желтеет.
S. paratyphi A- не продуцирует сероводород.
S. paratyphi B – сероводород продуцируется (по ходу укола проявляется чёрный цвет).

S. typhi – глюкоза разлагается без газообразования, сероводород продуцируется, лактозоотритателен. Скошенная часть не изменяет цвета, столбик – желтеет и среда чернеет по ходу укола.

Shigella spp.- лактозоотрицателен, глюкозоположителен, сероводород не продуцируется. Столбик приобретает жёлтый оттенок, а скошенная часть остаётся прежней.

Б) Финальная идентификация чистой культуры и её реакция на антибиотики . На данном этапе изучаются биохимические, биологические, серологические и генетические свойства культуры.

В исследовательской практике не возникает необходимости в изучении полного спектра свойств микроорганизмов. Достаточно использовать простейшие тестирования для определения принадлежности микроорганизмов к тому или иному виду.

20. Характеристика бактериологического метода исследования

Культуральный (бактериологический) метод исследования - совокупность способов, направленных на выделение и идентификацию чистых культур микроорганизмов (бактерий) с помощью культивирования на питательных средах.

Чистая культура - совокупность микроорганизмов одного вида. Чаще всего чистую культуру получают путем отбора и культивирования изолированной колонии (потомство одной микробной клетки).

Этапы метода:

1. Забор материала для исследования.

2. Выделение чистой культуры и ее идентификация.

3. Заключение.

Забор материала для исследования. Вид исследуемого материала зависит от цели исследования (диагностика - от больного; эпиданализ - из внешней среды, продуктов питания, больного и (или) бактерионосителя).

Выделение чистой культуры . Включает 3 или 4 этапа:

1. Посев материала (после предварительной микроскопии) на чашку с плотной питательной средой (лучше дифференциально-диагностической или селективной) с целью получения изолированных колоний. Производят его чаще всего методом механического разобщения. В некоторых случаях (например, кровь) материал предварительно засевают в жидкую среду обогащения с последующим пересевом на чашку с агаровой средой. Иногда до посева проводят селективную обработку материала (с учетом свойств выделяемого микроорганизма; например, обработка кислотой или щелочью для выделения устойчивых бактерий). Культивируют при температуре 37°С в течение 18-24 часов. Время культивирования для разных видов бактерий может колебаться.

2(3):а) изучение колоний на чашке с агаром (культуральные признаки), отбор наиболее типичных; б) приготовление мазков из этих колоний с окраской (по Граму или другими методами); а) отсев остатка исследованной колонии на среду накопления и выращивание в термостате при оптимальной температуре.

3(4). Изучение чистоты культуры, полученной на среде накопления. С этой

целью готовят мазок, окрашивают (чаще по Граму), микроскопически изучают

морфологическую и тинкториальную однородность (в разных полях зрения).

4(5). Идентификация чистой культуры.

Заключение. По совокупности признаков в сравнении со свойствами эталонных (типовых) штаммов указывается вид выделенного из материала микроорганизма.

Оценка метода:

достоинства: относительно высокая чувствительность и точность, возможность определить численность микробов в исследуемом материале, а также чувствительность к антибиотикам;недостатки: относительная длительность, метод дорогостоящий.

21. Питательные среды для аэробов и анаэробов. Требования, предъявляемые к питательным сре­дам, классификация.

Требования:

среды должны быть питательными

должны иметь определенные ph

должны быть изотоническими, т.е. осмотическое давление в среде должго быть такое же как в клетке.

должны быть влажными и не слишком жидкими

должны облпдпть определенным окислительно-восстановительным потенциалом

должны быть стерильными

должны быть унифицированными, т.е. содержать постоянные количества отдельных ингредиентов.

Питательные среды можно разделить:

А) По происхождению:

1} естественные - натуральные продукты питания (мясо, молоко, картофель);

2) искусственные - приготовленные специально для выращивания микробов: - среды из естественных продуктов (мясная вода, мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), - не имеющие постоянного состава; - синтетические питательные среды - растворы строго определенных количеств солей, аминокислот, азотистых оснований, витаминов в дистиллированной воде - имеют постоянный состав, используются для выращивания микроорганизмов и культур клеток при получении вакцин, иммунных сывороток и антибиотиков;

Б) По назначению:

1) общего назначения (МПБ, МПА) - на них растет большинство микробов;

2) элективные - избирательно способствуют росту одного вида микробов из смеси (например, желточно-солевой агар для стафилококков);

3) дифференциально-диагностические - позволяют отдифференцировать по внешнему виду среды один вид микроба от других (например среды Эндо, Левина для кишечной группы микробов).

Кроме того, в зависимости от целей использования в схеме выделения чистых культур, по назначению можно выделить следующие среды:

1) обогащения - подавляют рост микробов, сопутствующих возбудителю;

2) для получения изолированных колоний;

3) накопления чистой культуры;

В) По консистенции:

1) жидкие;

2) полужидкие (при добавлении агар-агара в концентрации 0,5-0,7%);

3) плотные - выше 1%.