Главная · Правильное питание · Постановка нокаутирующего удара. Постановка нокаутирующего удара Метод генетического нокаута требования к эксперименту

Постановка нокаутирующего удара. Постановка нокаутирующего удара Метод генетического нокаута требования к эксперименту

На вопрос Зачем нокаутируют.. . и как нокаутируют гены? заданный автором Ѕуршид лучший ответ это Читала в журнале статью о том, как у мышек из стволовых клеток
вынимали часть генов, чистили их, а затем ставили обратно в цепочку.
Таким образом получали особи мышек без тех заболеваний, что были
у них до очистки и за которые отвечали очищенные гены.
Вот как именно проходит эта очистка сейчас не опишу, просто боюсь
запутаться в терминах. Но... перспективы фантастические, если честно!
А ещё бывает, что часть генов отправляют в нокдаун, на время снижая
их активность и пока они "без сознания", организм успевает самонастроиться
на здоровый лад!))
Источник: Доброго вечера, Хуршид!!))... простите незнайку почти, просто вопрос красив...)
Солнышкова_Я.
Высший разум
(134249)
Салют,родная Кош!))
Вот всё мечтаю об образовательном канале для детей!))

Ответ от Низкосортный [гуру]
Нокаут гена (англ. gene knockout) - это метод молекулярной генетики, при котором из организма удаляют или делают неработоспособными определенные гены. Таким образом получают организм, "нокаутный" по неработающим генам. Нокаутные организмы помогают узнать функции генов, нуклеотидная последовательность которых известна. Различия между нокаутным и нормальным организмом могут свидетельствовать о функции выключенного гена.
Метод нокаута генов позволяет получать линии нокаутных мышей (knock-out mice) - мутантных мышей, у которых выключены определенные гены.
Этот метод позволяет исследовать роль каждого конкретного гена в развитии организма и его нормальной и патологической работе и изучать различные человеческие болезни, используя мышей в качестве модельных объектов. Выключенный ген приводит к тем или иным нарушениям. Характер этих нарушений позволяет судить о функциях данного гена.
Способ нокаута (выключения) генов изобрели лауреаты Нобелевской премии по физиологии и медицине 2007 года Марио Капекки и Оливер Смитис. Для этого искусственно синтезируют фрагменты ДНК, соответствующие измененному участку целевого гена, и вводят их в выращиваемые в культуре клетки посредством электропорации - через поры в клеточной мембране, созданные с помощью электрического поля. В некоторых клетках эта измененная последовательность ДНК внедряется в хромосому на место нормальной. На основе «испорченного» таким образом гена в клетках будет синтезироваться «неправильный» белок, или вообще не будет синтезироваться никакого белка.
Третий нобелевский лауреат Мартин Эванс изобрел способ получения на основе метода нокаутирования генов мутантных (нокаутных) мышей, в клетках которых не синтезируется тот или иной белок.
Применение метода нокаута генов стало особенно актуальным в последние годы, после завершения секвенирования (прочтения последовательности) полных геномов как человека (2003), так и мыши (2002), а также ряда других видов животных. Последовательно нокаутируя различные гены в пределах мышиного генома, исследователи выясняют функции каждого из них. Учитывая, что у человека и мыши очень многие гены сходны и выполняют одни и те же функции, нокаутные мыши предоставляют исследователям богатый материал для изучения роли генов в нормальном развитии и жизни человеческого организма и в патологических процессах. По-видимому, рано или поздно благодаря методу нокаута генов удастся изучить свойства всех (нескольких десятков тысяч) генов мышиного генома. Работы в этом направлении ведутся во многих странах мира, не исключая и Россию.
Метод нокаута генов можно применять не только на мышах, но и на других животных. Однако именно нокаутные мыши нашли особенно широкое применение – в связи с тем, что они эволюционно (и, соответственно, генетически) довольно близки к человеку, а получить нокаутные линии у них намного проще, чем у большинства других лабораторных животных. В частности, у крыс первые нокаутные линии были получены только в 2003 году, через много лет после создания первых нокаутных мышей.
Хозяйке на заметку: как нокаутировать мышь
ссылка


Ответ от Вопросник [гуру]
ведут к вырождению и смерти


Ответ от Европейский [гуру]
Крокодилы Гены...


Ответ от Barinova Tanya [гуру]
ген - отрезок молекулы ДНК. Гено́м - совокупность наследственного материала
Gene knockout - это метод молекулярной генетики, при котором из организма удаляют или делают неработоспособными определенные гены. Таким образом получают организм, "нокаутный" по неработающим генам.
Гены составляют всего лишь около 2,5-3% ДНК человеческого генома, и причиной развития генетически обусловленных заболеваний зачастую является не поломки генов, а мутации некодирующей ДНК, составляющей бОльшую часть хромосом. Часть некодирующей ДНК регулирует генную активность и процессы упаковки ДНК в ядре. По данным разных авторов, действительно бесполезной – «мусорной» – является от 5% до 50% некодирующей ДНК, однако, вполне возможно, что и она выполняет какие-то важные функции. (Это гипотеза, которую ученые, стараются превратить в закон) .
Зачем используют Gene knockout ?
Получают возможность увидеть, как скажется его отсутствие на жизнедеятельности организма. То есть - это биотехнология. Как пример - репродуктивная медицина - яйцеклетка одной женщины используется (без ген. материала для создания зиготы, в которой используется ДНК 2-х других людей) - биологическими родителями по ДНК-тесту будут те, чьи ДНК использованы, а не донор клетки, в которую "упакован" материал.
Теперь, (несмотря на то что, вопрос в разделе "Наука")... вспомним о "мусорной" составляющей.. . Как-то, на фоне достижений в коммерческой биотехнологии и генетике, в целом, ученые "забывают" подчеркнуть, что завораживая несведующих в биологии людей красивыми словами "геном человека" - не говорят, что несмотря на то, последовательность нашего генома уже известна, но. . вопрос о том, как будет выглядеть то, что записано в ДНК - в геноме отсутствует. То есть - основной общей схемы в геноме - попросту нет. Вопрос как возникает жизнь и где хранится описание - остается тайной, для ученых. По мне так лучше бы он тайной и оставался. . Неконтролируемая коммерческая биотехнология, создание трансмутаций - опасная дорога. Особенно при отсутствии нравственного контроля. Любопытство ученых (в этом случае) может привести к краху того, что мы называем своим миром.
Доброе утро, Хуршид)
Наука сделала нас богами раньше, чем мы научились быть людьми.


Ответ от Pavel [гуру]
Как нокаутируют гены?
Приводят к неработоспособности определенный ген, удалив его.
Зачем это делается?
Для изучения мутаций в уже известной последовательности.


Ответ от Ёоломон Сальмонелло [гуру]
Нокаут боксёрский термин...


Ответ от Дед* АБСЕНТ [гуру]
тебе-то зачем?


Ответ от Кошка по имени чебурашка [гуру]
к сожалению, я НЕгенетик... поэтому квалифицированно ответить на вопрос ЗАЧЕМ - пожалуй, не сумею (((
а вот КАК нокаутируют гены.. . это с моей точки зрения, просто.. .)))
...это когда природа генов.. . и природа талантов и стремлений человека НЕсоответствуют друг другу.. .
это касаемо НЕтолько спортивных достижений, но и возможности добиться серьёзных результатов в сферах науки и искусства.. .
житейских примеров этому масса... генные заболевания.. . сердечно-сосудистой системы, разрушения суставов, ввиду прогрессирующего диф. артроза... всё это мешает раскрытию таланта.. . и художникам.. . и писателям.. . и деятелям науки... со спортсменами оказывается много проще.. . уже на сегодняшний день есть возможность на основании исследований генов, обьяснить ПОЧЕМУ у конкретного человека НЕсоответствие умения и приложенных стараний - конкретно достигнутому результату... (например, стайеру и боксёру, важнее гены, что "отвечают" за выносливость.. . а спринтеру, за возможномть максимального развития скорости на короткой дистанции.. . грубо говоря, если спортсмен с генами "выносливости" занимается теми видами спорта, в которых данные генные способности НЕглавные, а гены, что "отвечают" за его достижения в виде спорта, которым он занимается, "не работают" с полной "отдачей", то и ожидаемого максимальножеланного результата не будет.. . сколько бы стараний он не прилагал...))) - вот он и накаут ГЕНОВ!!!((()))
среди учёных, занимающихся генной инженерией, уже НЕпервый год бытует гипотеза возможности коррекции генного состава... "подсадки" конкретного супер гена (для конкретной, максимально результативной "идеально" выбранной природной направленности)...уже положено начало, для создания банка таких генов.. .
тема очень интересная.. .
вспомнилось интервью Высоцкого... у него есть песенка о бегунах.. . и как-то в интервью... он высказал предположение, что мол надо отьесть коленную чашечку кенийца - и победа обеспечена)))


Нокаут гена. Для изучения функции того или иного гена может быть применен нокаут гена (gene knockout). Так называется техника удаления одного или большего количества генов, что позволяет исследовать последствия подобной мутации. Для нокаута синтезируют такой же ген или его фрагмент, изменённый так, чтобы продукт гена потерял свою функцию


Для получения нокаутных мышей полученную генно-инженерную конструкцию вводят в эмбриональные стволовые клетки, где конструкция подвергается соматической рекомбинации и замещает нормальный ген, а измененные клетки имплантируют в бластоцисту суррогатной матери. У плодовой мушки дрозофилы мутации инициируют в большой популяции, в которой затем ищут потомство с нужной мутацией. Сходным способом получают нокаут у растений и микроорганизмов.


Искусственная экспрессия. Логичным дополнением нокаута является искусственная экспрессия, то есть добавление в организм гена, которого у него ранее не было. Этот способ генной инженерии также можно использовать для исследования функции генов. В сущности процесс введения дополнительных генов таков же, как и при нокауте, но существующие гены не замещаются и не повреждаются.




Хотя и в небольшом масштабе, генная инженерия уже используется для того, чтобы дать шанс забеременеть женщинам с некоторыми разновидностями бесплодия. Для этого используют яйцеклетки здоровой женщины. Ребёнок в результате наследует генотип от одного отца и двух матерей.








При котором из организма удаляют или делают неработоспособными определенные гены . Таким образом получают организм, "нокаутный" по неработающим генам. Нокаутные организмы помогают узнать функции генов, нуклеотидная последовательность которых известна. Различия между нокаутным и нормальным организмом могут свидетельствовать о функции выключенного гена.

Метод введения генов knock-in имеет сходства с методом gene knockout , но в случае knock-in заданный ген не удаляется из организма, а заменяется другим.

Примечания

См. также

  • Knock-in

Wikimedia Foundation . 2010 .

Смотреть что такое "Нокаут гена" в других словарях:

    нокаут (в биотехнологии) - Выключение определенного гена(ов) в организме с целью изучения функции отдельного белка Тематики биотехнологии EN knockout … Справочник технического переводчика

    Нокаут генов н - Нокаут, генов н. * накаўт, генаў н. * knockout or gene kn. инактивация определенных генов, которую часто проводят у лабораторных организмов (дрожжей, мышей) с целью изучения их роли в развитии наследственных заболеваний. Технология… …

    У этого термина существуют и другие значения, см. нокдаун. Нокдаун гена (англ. Gene knockdown) методика, позволяющая снизить экспрессию одного или нескольких генов при помощи изменения соответствующей последовательности нуклеотидов,… … Википедия

    Разрыв гена - * разрыў гена * genedisruption ключевая методология при анализе функций генов. Включает в себя различные методы случайных разрывов генов в геноме модельных организмов (приводящие к нокаут или нуль мутациям этих генов), а затем определения, во… … Генетика. Энциклопедический словарь

    Нокаутные мыши Генетическая инженерия (генная инженерия) совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие… … Википедия

Методика постановки нокаутирующего удара

Любой акцентированный удар включает в себя две фазы. Первая, начальная, — так называемый«срыв» . Отработав эту фазу, вы получите возможность действовать в бою неожиданно, что является решающим фактором эффективности нокаутирующего удара. «Срыв» требует полногорасслабления мышц и соответствующего психологического настроя , как бы «нежелания» бить, — удар проводится на уровне подсознания.

    Удар по сигналу «касание» . Спортсмен, стоя в боевой стойке и полностью расслабившись, наносит удары по мешку или по воздуху, реагируя на прикосновение партнера, стоящего сзади. Касания можно осуществлять рукой или ногой в разные точки тела, с разными интервалами то ощутимыми толчками, то легкими прикосновениями. Получив сигнал, обучающийся «взрывается» хлестким ударом. Его задача — сократить до минимума время от прикосновения партнера до завершения выхлеста кулаком.

    Удар по звуковому сигналу . Стоящий вне поля зрения спортсмена партнер подает условный звуковой сигнал (например, хлопок в ладоши), по которому обучающийся производит удар. Для повышения остроты реакции полезно менять характер сигнала (скажем, резкий окрик «Эй!»), на что спортсмен реагировать не должен. Задача упражнения — та же, что и в первом случае.

    Работа в паре, нанесение удара в корпус партнера , отскакивающего при этом на полную дистанцию контактного удара. Задача состоит в том, чтобы «достать» ударом партнера до того, как он окажется на безопасной дистанции. Здесь важную роль играет психологическое расслабление (то самое «нежелание» бить), которое через поведение обучающегося в немалой степени передается и партнеру.

    Удары по боксерской лапе , держа которую, тренер или партнер то меняет дистанцию (но не дальше дистанции контактного удара), то резко убирает снаряд вверх или вниз.

    Удар по куску газеты размером 25х25 см, который партнер держит за верхние углы. Это упражнение — из области «высшего пилотажа». Если вам удастся не просто разорвать газету, а пробить ее ударом голого кулака, значит вы обладаете достаточно «острым» ударом, наносимым с высокой степенью точности.

Прежде чем говорить о второй фазе акцентированного удара, следует обратить внимание на одно обстоятельство. Внешняя сторона кисти нетренированного человека весьма уязвима . Фаланги пальцев достаточно хрупки и не защищены мышцами. Любой рукопашный боец, и боксер в частности, нанося удар, рискует «получить» вместо желаемой досрочной победы ощутимую травму руки, если кулаки его не прошли процесс «закалки».

Способы этой закалки весьма многообразны. Наиболее эффективными признаны отжимания от пола в упоре лежа, но не на ладонях, а на сжатых кулаках — поначалу на фалангах, а затем и на согнутых костяшках пальцев. Во избежание болевых ощущений отжимания надо проводить сначала на мягкой подстилке или на настиле ринга, а потом можно перейти и на жесткий пол зала. Когда ваши кисти достаточно закалены, можно перейти к «ходьбе» на кулаках, передвигаясь в упоре лежа по залу.

Второй метод закаливания рук — работа на мешках . Тут необходимо сделать отступление. Можно приобрести мешок в магазине спорттоваров, достаточно дорого заплатить за него и… не получить того, что вам нужно. Ибо фабричные мешки приспособлены главным образом к работе в боксерских перчатках и не пригодны для закаливания рук участников рукопашных боев (они «работают» голыми кулаками), да и боксеров, по большому счету, тоже.

Не пожалейте времени и сил, изготовьте для своей секции мешки сами. Из двойного слоя брезента или дерматина сшейте цилиндр диаметром 50-60 см, длиной с обычный боксерский мешок. Снизу пришейте дно по размеру окружности цилиндра, сверху — два или четыре ремня (можно с металлическими кольцами) для крепления мешка к потолку. Когда основание готово, внутрь цилиндра вставляется обычный мешок из-под сахара или крупы и заполняется сухим зерном, лучше всего пшеницей или ячменем. Горловина внутреннего мешка туго завязывается, чтобы зерно не «гуляло». Мешок готов и может прослужить без смены зерна 10-15 лет. Главное его преимущество в том, что зерно создает вариант плотности, близкой к плотности человеческого тела, то есть того препятствия, которое будет встречать рука бойца — что в рукопашном бою, что в боксе. Вес мешка должен колебаться в пределах 60-80 кг. Добавлю, что изготовление подобного снаряда обойдется на порядок дешевле, нежели приобретение магазинного мешка.

А теперь, когда ваш зал соответствующим образом оборудован, переходим к дальнейшим занятиям. Вторая фаза удара — разгон кулака . Ее эффективность зависит от скоростно-силовой подготовки спортсмена. Тренировка может носить различный характер. Некоторые тренеры, например, исключают из тренировок своих подопечных упражнения с отягощениями, чтобы не «посадить» скорость удара. Это ошибочное мнение. Быстрый удар без силового акцента далеко не всегда может оказаться нокаутирующим, особенно если он наносится в корпус. В смысле набора выигрышных очков в спортивном каратэ или любительском боксе он эффективен, но этим его тактическая значимость и ограничивается. Что же касается мощного скоростного удара , то его основой помимо скорости является еще и сила .

    Жим штанги от груди лежа. Вес снаряда должен позволять спортсмену выполнить 12 повторений на средней скорости.

    Толчок двух гирь весом 24-32 кг, выполняемый в быстром темпе. К работе подключаются мышцы ног и спины.

    Рывок одной рукой гири весом 24-32 кг. Выполняется в быстром темпе.

    Отжимания в упоре лежа (о них уже шла речь выше):

    • в быстром темпе на кулаках и на пальцах;

      в упоре лежа с хлопками ладоней между отжиманиями;

      в упоре сидя, опираясь на небольшое возвышение, расположенное сзади.

Работа на мешке . Здесь немалую роль играет воображение спортсмена. «Целью» удара должна быть не поверхность мешка, а некая точка, расположенная в его глубине. Нужно стремиться, как говорят опытные тренеры, «пробить мешок»:

    из боевой стойки — мощный одиночный удар с ударной руки, затем — с измененной стойки. «Пробить мешок» на возможно дальнюю глубину внутрь;

    двойной удар по мешку одной или двумя руками, первый удар — на среднюю глубину, второй — на максимальную;

    мощный проникающий удар навстречу по приближающемуся мешку.

Работа на боксерских лапах . Лапа остается самым универсальным снарядом для боксеров — участников рукопашного боя и т.д., поскольку ее перемещения лучше всего имитируют смещения целей удара в реальном бою. Итак:

    удар по лапе на зрительный сигнал. Выполняется с выпадом из стойки с близко поставленными ногами. При этом партнер с лапой должен постоянно менять ритм показа, перемещать снаряд вверх-вниз, влево-вправо;

    удар по лапе, которую партнер держит на одном уровне, сам постоянно передвигаясь. Нападающий «охотится» за лапой, также передвигаясь и стараясь нанести мощный удар из наиболее выгодного положения;

    удар с мгновенным отдергиванием кулака назад. Партнер держит лапу неподвижно, но при этом держит в другой руке короткую веревку или матерчатый пояс, которым бьет атакующего по руке в момент нанесения тем удара. Задача последнего — выполнить резкий удар и избежать ответного веревкой или поясом.

Перечисленными выше приемами, конечно же, не исчерпываются все упражнения, направленные на отработку хорошо поставленного нокаутирующего удара . Но и этих, если постоянно применять их в тренировках, вполне достаточно для того, чтобы в вашем тактическом арсенале появилось грозное оружие, применив которое, вы, стоя над поверженным соперником, услышите: «…девять, десять, аут!»

Вступление

4. Линии нокаутных мышей

4.1 ФНО/ЛТ панель

4.3 B6SJL-Tg(SOD1-G93A)dl1Gur/J

4.5 C57BL/6Kaiso

Список литературы

Нокаут гена (gene knockout) — это метод молекулярной генетики, при котором из организма удаляют или делают неработоспособными заданные гены. Таким образом получают организм, нокаутный по неработающим генам. Нокаутные организмы помогают узнать функции генов, нуклеотидная последовательность которых известна. Различия между нокаутным и нормальным организмом свидетельствуют о функции выключенного гена.

Эта методика заключается в целенаправленном внесении измененного, мутированного гена в наследственную информацию клеток. Новый ген вносится в получаемые из эмбрионов стволовые клетки, а результат оценивается во взрослом животном, поэтому пока не идет речи о применении данной технологии у людей: многие работы со стволовыми клетками человека почти повсеместно запрещены, да и выращивание мутантных особей Homo sapiens в экспериментальных целях представляется малореальным.

Стандартной биологической моделью, для которой разработана методика, являются лабораторные мыши.

Вступление

С первых дней возникновения генетики как науки, ученые мечтали получать направленные мутации, затрагивающие гены изучаемых ими признаков. Первым шагом к осуществлению этой мечты было открытие радиационного и химического мутагенеза. Окончание секвенирования генома человека в 2001 г. вывело на новый уровень исследования по обнаружению новых генов и функционально значимых последовательностей генома. В настоящее время биотехнология и биоинформатика в комбинации с классической биохимией и генетикой являются мощным инструментом для анализа уже имеющейся последовательности генома человека и модельных организмов. Но настоящий прорыв в области направленных мутаций был осуществлен благодаря использованию феномена гомологичной рекомбинации между сравнительно небольшим участком экзогенной и клеточной ДНК. Данный метод получил название направленной инактивации гена или нокаут гена (от англ. knockout, синоним - gene targeting). Зная последовательность изучаемого гена человека, стало возможно посредством инактивации гомологичного гена у модельного организма определить биохимическую и физиологическую роль его продукта. Поскольку значительное число болезней человека в своей основе имеет наследственный компонент, модели заболеваний, созданные с использованием этой стратегии, позволяют расширить наше понимание биохимии и физиологии наследственных патологий и приведут к созданию новых подходов к лечению.

Лауреатами Нобелевской премии 2007 года в области медицины и физиологии стали Марио Капекки, Оливер Смитис и сэр Мартин Эванс - разработчики технологии gene targeting - способа изменить отдельные гены у млекопитающих. Речь идет о передней границе современной науки о живом, настоящей генетической инженерии, о которой мечтал еще Уэллс в "Острове доктора Моро".

1. Метод генетического нокаута

Нокаут гена - это молекулярно-генетический метод, в ходе которого задуманные исследователем изменения вносятся в нуклеотидную последовательность изучаемого гена или его регуляторных элементов. Мышь является наиболее адекватным модельным животным для использования технологии инактивации генов. Это обусловлено следующими причинами:

а) мышь - хорошо изученный и доступный объект;

б) геном мыши и человека содержит приблизительно одинаковое число генов;

в) сходство аминокислотных последовательностей всех белков человека и мыши составляет около 90%.

Однако основной причиной использования мыши в качестве модели для инактивации гена является возможность изолирования эмбриональных стволовых клеток, в которых любой ген может быть модифицирован . Клеточные линии, содержащие модифицированный ген, могут быть привнесены в развивающийся зародыш, что позволяет получить химерное животное, несущее искусственно созданную мутацию (рис. 1).

Рис. 1. Стратегия получения линии нокаутированных мышей .

Молекулярно-генетическим механизмом, позволяющим осуществлять инактивацию гена, является гомологичная рекомбинация между экзогенной ДНК, несущей задуманные исследователем изменения, и геномной ДНК объекта.

Классическая схема получения нокаутированных мышей включает несколько этапов: получение векторной конструкции, с последующим внесением ее в культуру эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и отбор трансформантов. Трансформированные ЭСК вносят в зародыш, и полученных химерных животных скрещивают для получения линии мышей, гомозиготных по полученной мутации (см. рис. 1).

1.1 Особенности векторных конструкций

В зависимости от поставленной задачи используются два типа векторов: замещающий и вставочный. Первый тип векторов позволяет заменить участок гена мишени, в то время как второй интегрирует в изучаемую последовательность. Строение обоих типов векторов одинаково, кроме ориентации фланкирующих последовательностей (рис. 2). Наиболее часто используются замещающие вектора.

Рис. 2. Два типа векторов - замещающий (А) и вставочный (Б) - и их механизмы интеграции в геном .

Вектор для трансформации несет клонированную последовательность изучаемого гена, с внесенными в нее необходимыми изменениями. Это может быть: внесение стоп-кодона, приводящее к синтезу короткого неактивного пептида; делеция одного или нескольких экзонов; делеция промоторной области; вставка, приводящая к нарушению нормального функционирования гена и любые другие изменения, приводящие к отсутствию функционального продукта изучаемого гена или значительно снижающие его активность. Также в эту последовательность вносится положительный селективный маркер (МПС), которым является ген neo. Продукт этого гена дает несущим его клеткам устойчивость к антибиотикам неомицину и канамицину. Модифицированная последовательность должна быть фланкирована неизмененными участками, по которым будет проходить рекомбинация. Эффективность рекомбинации зависит от длины фланкирующих последовательностей , что в свою очередь зависит от возможностей вектора (рис. 3). При длине гомологичного плеча около 5 тыс. п.н. процент рекомбинации составляет 0,001.

Рис. 3. Зависимость частоты интеграции вектора от длины гомологичных плеч .

В качестве вектора можно использовать бактериальные искусственные хромосомы (BAC), со вставками фрагментов генома мыши. В этом случае размер одного плеча может составлять до 150 тыс. п.н., а размер делеции до 25 тыс. п.н. Наилучший процент рекомбинации (8,3%) получен авторами с использованием длины плеча 110 тыс. п.н. .

Существует вероятность, что рекомбинация пройдет не по исследуемым нами участкам генома, а в любой другой сходной области. При этом ген neo (МПС) сохранится, и в отобранном пуле ЭСК будут присутствовать рекомбинантные клетки, не несущие необходимых изменений. Эта проблема решается внесением в векторную конструкцию маркера отрицательной селекции (МОС). Им может служить ген тимидин-киназы простого вируса герпеса (HSV-tk) или ген дифтерийного токсина А (DT-A), продукты которых убивают эукариотические клетки. Положение МОС с наружной стороны гомологичного плеча вектора позволяет элиминировать его после прохождения гомологичной рекомбинации (рис. 4). В случае же негомологичной рекомбинации, МОС оказывается интегрированным в геном трансформированной клетки, что приводит к ее элиминации. Наличие двух маркеров селекции (положительного и отрицательного) позволяет быстро и эффективно проводить отбор нужных трансформантов .

Рис. 4. Действие системы позитивной - негативной селекции: А) интеграция вектора в нужный участок генома, приводящая к нокауту гена, Б) случайная интеграция (синтез тимидин-киназы и гибель клеток) .

1.2 Внесение вектора в эмбриональные стволовые клетки

Для трансформации используют эмбриональные стволовые клетки мышей. Помимо того, что культура ЭС клеток способна расти in vitro, при пересадке во взрослую мышь или эмбрион клетки имеют свойство приживаться. ЭС клетки, в отличие от специализированных соматических клеток, сохраняют генетические потенции без тканевой специализации. Эти клетки имеют "минимальный" фенотип: минимум рецепторов и программ для взаимодействия с микроокружением, поскольку лишь 5% из 500 генов транссигнализации экспрессировано в пролиферирующих ЭСК. Второй важнейшей характеристикой ЭСК в культуре является практически неограниченный потенциал пролиферации, обусловленный особенностями фенотипа незрелых клеток. Третьей особенностью ЭСК является рост суспензионными клонами без какой-либо примеси продвинутых клеток, прикрепленных к подложке. Каждый клон в такой культуре является производным одной прародительской ЭСК .

Эмбриональные стволовые клетки мыши впервые получены в 1981 году , что дало возможность для развития работ по инактивации генов. Внесение линеализированного вектора в ЭС клетки возможно несколькими методами: микроинъекция, трансфекция (электропорация), трансдукция (вирусная инфекция). Перечисленные методы имеют свои преимущества и недостатки.

Микроинъекция позволяет с частотой до 100 процентов вносить экзогенную ДНК в клетку, а частота гомологичной рекомбинации составляет около 0,67%. Этот метод, несомненно, является наиболее эффективным. Однако для осуществления микроинъекции требуется дорогое оборудование и высокая квалификация экспериментатора. Помимо этого, сам метод очень трудоемок и занимает много времени. Векторные конструкции микроинъекцией можно вносить и в зиготу, но отобрать нужные трансформанты в этом случае невозможно.

Наиболее экономичными и достаточно эффективными методами внесения экзогенной ДНК в клетку являются электропорация и ретровирусная инфекция. К их достоинствам, в первую очередь, следует отнести возможность одноразово обработать сотни тысяч клеток, которые благодаря системе позитивной-негативной селекции достаточно быстро проходят отбор. Это существенно упрощает и делает экономически выгодным, по сравнению с микроинъекцией, процедуру получения трансформированных клеток. Оба метода имеют свои недостатки: больший процент негомологичной рекомбинации при внесении векторных систем электропорацией по сравнению с другими методами, ограниченые размеры ретровирусных векторов и т.д. . Наиболее часто внесение векторов в клетку проводят с помощью электропорации. В то же время ретровирусная инфекция позволяет вносить экзогенную ДНК не только в ЭС клетки, но и в эмбрионы. Итак, линия трансформированных клеток получена и поддерживается. Следующий этап - внесение клеток в эмбрион мыши (как правило, на стадии бластулы). Химерный зародыш подсаживают в матку ложно беременной самки. Полученную таким образом химеру скрещивают с нормальным, но имеющим отличия (например, цвет) животным. Если полученные в первом поколении мыши имеют фенотип линии, из которой получены ЭС клетки, то их можно использовать для насыщающего скрещивания. Результатом будет получение линии животных, гомозиготных по созданной мутации.

2. Роль метилирования ДНК в контроле генома

Одним из способов видоизменения гена является его замена на бессмысленную последовательность ДНК — тогда ген "выключается". Исследователи систематически "выключают" гены и наблюдают, к каким последствиям на уровне организма приводит это "выключение". Такая методика называется "генетический нокаут" (gene knockout).

Она позволяет подробно изучить функцию конкретного гена во время эмбрионального развития и после рождения животного. Можно проследить, как каждый ген влияет на развитие организма и возникновение той или иной патологии. В связи с этим, метод ещё получил название "генетическое планирование". К настоящему моменту уже проведены опыты по "выключению" десяти тысяч генов мыши, это половина всего мышиного генома.

Для развития организма достаточно одной клетки с единичной (конечно же, диплоидной) копией ДНК, которая при делении точно воспроизводится от клетки к клетке. Это относится практически ко всем живым многоклеточным существам. У человека все его клетки содержат идентичную ДНК. Клетки крови, печени, мозга, стволовые клетки - все они одинаковы по ДНК. Чем же определяется многообразие имеющихся у человека высокоспециализированных клеток и тканей? Это достигается за счет включения или выключения генов, ответственных за специализацию клетки. Именно механизмы контроля работы, или как принято говорить, экспрессии генов являются основной темой исследований нашей группы. Одним из таких механизмов является метилирование генов - ковалентное присоединение метильной группы в 5 положении пиримидинового кольца цитозина. ДНК, содержащая метилированные цитозины, является транскрипционно неактивной, и гены, располагающиеся вблизи метилированных районов, молчат.

Роль метилирования ДНК и механизм его негативного воздействия на работу генов в процессе жизнедеятельности позвоночных организмов (на моделях лягушки, мыши и клеточных линий человека).

Метилирование ДНК у позвоночных приобретает смысловую нагрузку в виде подавления транскрипции близлежащих генов двумя основными способами: (А) за счет прямого воздействия на ДНК, в составе которой метилированный цитозин ингибирует связывание транскрипционного фактора со своим участком, и (Б) за счет специфического связывания с метилированным районом специализированных метил-ДНК узнающих белков, которые, в свою очередь, привлекают сложные механизмы подавления транскрипции путем модификации близлежащих гистонов.

Как пример охарактеризован белок Каизо. Каизо, с одной стороны, связывается с катенином р120, а с другой - способен подавлять транскрипционную активность метилированных генов. Каизо имеет доменную структуру и состоит из N-концевого BTB/POZ домена и C-концевых цинковых пальцев типа C2H2. Цинковые пальцы специфично связывают 5-метил цитозин содержащую ДНК.

Нокаут гена Каизо приводит к частичной резистентности животных к раку кишечника. Кривая выживаемости животных с нокаутом гена Каизо (красная линия) в модели спонтанного рака кишечника APC(Min). Черной линией показана кривая выживаемости контрольных животных

Проведен генетический нокаут гена Каизо у мышей. Показано, что животные без Каизо (Каизо-КО) развиваются нормально и не имеют выраженных патологий. При переведении Каизо-КО животных на генетический фон с высоким процентом спонтанных опухолей кишечника происходит увеличение срока жизни животных, уменьшается средний размер полипов в кишечнике. Таким образом, установлено, что без Каизо происходит замедление роста опухолей кишечника в APC(Min) моделях Напротив, при выключении гена Каизо в зиготах лягушки происходит апоптотическая смерть клеток эмбрионов на стадии нейрулы. В отличие от мыши, ген Каизо является необходимым для жизнедеятельности земноводных. Эти данные были подтверждены и на рыбах Danio Rerio . Получены линии клеток с множественными генетическими нокаутами генов MBD2, MeCP2 и Каизо. Показано, что белки MBD2, MeCP2 и Каизо оказывают синергетическое действие (репрессируют) метилированный промотор гена Xist . Показано, что мутации в гене Каизо не являются ключевыми в инициировании синдрома Ретта (нейродегенративное заболевание у девочек) , хотя другой метил ДНК связывающий белок MeCP2 напрямую вовлечен в эту патологию.

В геноме позвоночных найдены и охарактеризованы два гена, кодирующих белки ZBTB4 и ZBTB38, которые по своей аминокислотной последовательности и расположению консервативных доменов являются родственниками Каизо. Показано, что эти два белка являются метил ДНК зависимыми транскрипционными репрессорами.

Каизо подобный белок ZBTB4 расположен в метилированных участках гетерохроматина. Клетки без метилирования - мышиные эмбриональные фибробласты с генетической делецией генов dnmt1-/- и p53-/-. Клетки с нормальным уровнем метилирования - мышиные эмбриональные фибробласты p53-/-. В случае dnmt1-/- p53-/- клеток видно отсутствие корреляции между локализацией ZBTB4 в гетерохроматине (DAPI), в то время, как в p53-/- клетках видна полная ко-локализация ZBTB4 и гетерохроматина.

3. "Программируемый нокаут генов"

Следует отметить, что не все гены можно инактивировать на стадии зародыша. И, естественно, нельзя получить клетки или животных, нокаутированных по так называемым генам домашнего хозяйства. Однако для генов, принимающих участие в эмбриональном развитии, разработан подход, позволяющий проводить их инактивацию после развития организма. Данная стратегия позволяет "выключать" гены в определенных условиях ("программируемый нокаут генов", англ. conditional knockout), а именно в необходимой исследователю ткани или группе клеток и/или под воздействием индуцирующего вещества.

Это можно осуществить с помощью методики, сочетающей гомологичную рекомбинацию, как в случае классического нокаута генов, и системы сайт-специфической рекомбинации. Сайт-специфические рекомбиназы - это ферменты, узнающие особые участки ДНК и совершающие обмен между ними. Наиболее часто используются Cre рекомбиназа бактериофага P1 и Flp рекомбиназа (флипаза) дрожжей. Эти ферменты распознают нуклеотидные последовательности в 34 основания, называемые, соответственно, loxP и frt сайты . Если эти последовательности расположены в одной ориентации, рекомбинация по ним приведет к делеции фланкированного участка. Если же ориентация последовательностей различна, то это приведет к инверсии фрагмента между ними (рис. 5).

Рис. 5. Схема механизма сайт-специфической рекомбинации. В зависимости от ориентации loxP-сайтов происходит либо делеция, либо инверсия фланкированого фрагмента .

Использование стратегии "программируемого нокаута гена" требует создания двух линий мышей. Линия А несет интегрированную в геном последовательность гена Cre под контролем ткане-специфичного или индуцибельного промотора. Линия В содержит два loxP сайта, фланкирующих подлежащую удалению последовательность исследуемого гена (экзон, промотор и т.д.) . Следует отметить, что вставки в геномную последовательность loxP сайтов и гена Cre осуществляются с использованием тех же приемов, что и при классическом нокауте генов, но не должны затрагивать функциональные последовательности (рис. 6).

Рис. 6. Схема использования тканеспецифичной Cre-loxP рекомбинации для получения мышей с программируемым нокаутом гена .

Полученные таким образом гомозиготные линии мышей скрещивают. У потомков от этого скрещивания исследуемый ген будет инактивирован в ткани или группе клеток, где будет активен промотор, контролирующий активность гена Cre . Используя стратегию "программируемой инактивации гена", можно добиться результатов, недоступных при использовании стандартной процедуры нокаута генов.

4. Линии нок-аутных мышей

4.1 ФНО/ЛТ панель

Окраска шерсти: черные.

Происхождение: линии выведены в лаборатории молекулярной иммунологии ИМБ им. В. А. Энгельгардта РАН методом генетического нокаута и переведены на генетическую основу C57BL/6 путем возвратного скрещивания. Панель содержит линии мышей с модифицированным геном фактора некроза опухолей (ФНО) и лимфотоксина (ЛТ), подготовленные к тканеспецифической делеции гена, а также линии мышей с делецией гена ФНО или ЛТ специфично в макрофагах/нейтрофилах, либо в Т- или В-лимфоцитах, либо в клетках зародышевой линии.

Характеристика линии:

у мышей с полной делецией гена ФНО нарушена защита от ряда патогенов;

у мышей с полной делецией гена ЛТ-бета нарушена структура вторичных лимфоидных органов и антиген-специфическая продукция некоторых классов иммуноглобулинов.

Данные мыши представляют собой уникальную панель для изучения роли тканеспецифической продукции цитокинов семейства ФНО при врожденном и приобретенной иммунодефиците.

Ключевые публикации:

Tumanov et al. Distinct role of surface lymphotoxin expressed by B cells in the organization of secondary lymphoid tissues. Immunity. 2002 Sep;17(3):239-50.

Grivennikov et al. Distinct and nonredundant in vivo functions of TNF produced by t cells and macrophages/neutrophils: protective and deleterious effects. Immunity. 2005 Jan;22(1):93-104.

4.2 BALB/cMBD2

Окраска шерсти: белые.

Происхождение линии: линия получена в Эдинбургском Университете (Великобритания) в лаборатории Эдриана Бёрда (Adrian Bird) путем генетического нокаута гена MBD2 в мышах линии BALB/c..

Характеристика линии:

Особи женского пола имеют ослабленный материнский инстикт. У мышей наблюдается акселерация в развитии в раннем возрасте без акселерации в наборе массы тела. При переведении мутантного MBD2 локуса на генетический фон Min(APC) мышиной модели рака кишечника у животных возникает резистентность к злокачественной трансформации эпителиальных клеток.

Основные области использования:

изучение развития опухолей кишечника;

модель материнского поведения.

Линия BALB/cMBD2 используется в исследованиях, которые проводятся совместными усилиями Эдинбургского Университета и центра "Биоинженерия" РАН.

4.3 B6SJL-Tg(SOD1-G93A)dl1Gur/J

Окраска шерсти: разная: белая, коричневая, чёрная.

Происхождение: линия создана в лаборатории Mark E. Gurney при Северозападном университете США (Northwestern University, USA).

Метод модификации: трансгеноз. Трансгенные мыши G93A, экспрессируют мутантный человеческий ген Cu/Zn-супероксиддисмутазу SOD1 (Gly93/Ala; глицин замещён на аланин в позиции 93).

Характеристика линии: Трансгенные мыши G93A, экспрессирующие мутантный SOD1, характеризуются прогрессирующей дегенерацией мотонейронов, как при боковом амиотрофическом склерозе человека. Мыши становятся парализованными на одну или более конечностей в возрасте 6-7 месяцев. На фоне прогрессирования паралича скелетных мышц животные умирают через 4-6 недель после появления первых клинических признаков заболевания.

Основные области использования:

Боковой амиотрофический склероз

Нейропротекция

Подробности о данной линии животных: Gurney ME, Pu H, Chiu AY, Daly Canto MC, Polchow CY, Alexander DD, Caliendo J, Hentati A, Kwon YW, Deng HX, et al. 1994. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science 264:1772-5.

4.4 C 57 BL / MUC 2

Окраска шерсти: C57BL/MUC2

Происхождение: линия получена в Колледже им. Альберта Эйнштейна (Нью-Йорк, США) в группе Анны Велчич (Anna Velcich) путем генетического нокаута гена Mucin2 в мышах линии C57BL/6. В Питомник "Пущино" линия поступила в 2006 году.

Характеристика: В мышах этой линии нарушена морфология кишечных криптов. В течение 10 месяцев после рождения у мышей развиваются аденомы тонкого кишечника, которые прогрессируют затем в злокачественные аденокарциномы.

Подробности: Velcich et al., Colorectal cancer in mice genetically deficient in the mucin Muc2. Science. 2002 Mar 1;295(5560):1726-9.

Основные области использования: изучение развития опухолей кишечника

4.5 C57BL/6Kaiso

Окраска шерсти: черная.

Происхождение линии: линия получена в Эдинбургском Университете (Великобритания) в группе Егора Прохорчука путем генетического нокаута гена Kaiso в мышах линии C57BL/6.

Характеристика линии:

При переведении мутантного Kaiso локуса на генетический фон Min(APC) мышиной модели рака кишечника у животных возникает резистентность к злокачественной трансформации эпителиальных клеток.

Основные области использования:

изучение развития опухолей кишечника

5. Примеры использования нокаутированных мышей для изучения функций генов и наследственных заболеваний человека

Существует много примеров использования классического нокаута генов для изучения биологических функций индивидуальных генов или семейств генов. Рассмотрим лишь некоторые из них.

Изучение функций генов.

1) Ген Nuk, член семейства рецепторов тиронинкиназы, который был изучен с помощью делеций и модификаций. У мышей с отсутствием продукта этого гена нарушался контроль прорастания нейронов к клетке-мишени. Однако белок Nuk - трансмембранный белок. Чтобы дифференцировать роль внутриклеточных и внеклеточных доменов в миграции аксонов были модифицированы участки гена, кодирующие оба типа доменов. В результате этой работы было показано, что в прорастании аксонов к мишеням основную роль играет внутриклеточный домен белка Nuk .

2) Для изучения процессов созревания лимфоцитов была внесена точечная мутация (стоп-кодон) в ген α-цепи рецептора иммуноглобулина. Мутантные мыши имели незначительные дефекты в раннем развитии В-лимфоцитов, но сильные отклонения в созревании и функциях зрелых лимфоцитов .

3) Метод классического нокаута гена был использован и для получения партеногенетических мышей. Гены Igf2 и H19 - одни из основных импринтируемых генов млекопитающих, действующих в цис-положении и играющих ключевую роль в развитии организма. При этом для нормального развития необходимо наличие как отцовского, так и материнского набора хромосом. При развитии партеногенетических зародышей, получивших обе хромосомы от матери, ген Igf2 оказывается неактивен, что приводит к терминации развития. Делеция гена H19 в одной хромосоме позволила активировать ген Igf2 и получить условно партеногенетическое животное .

Модели генетических нарушений и заболеваний человека, созданные с использованием технологии нокаута генов.

1) Мутации гена TnI были обнаружены у пациентов с гипертрофической кардиомиопатией. Чтобы изучить влияние мутации в данном гене на развитие заболевания были созданы мыши с нокаутом по гену TnI. Гомозиготные нокаутированные животные умирали через 18 дней после рождения вследствие развившейся кардиомиопатии. Таким образом была доказана непосредственная связь мутации гена TnI с данным заболеванием .

2) Для изучения генетических основ развития алкоголизма было инактивировано 18 генов (альдегиддегидрогеназа, рецепторы дофамина, ГАМК-рецепторы, нейропептид Y и др.), предположительно участвующих в этом процессе. Все мутанты были охарактеризованы по поведенческим и фармакологическим тестам, что позволило оценить вклад изучаемых генов в развитие заболевания .

3) Большая работа с использованием методики нокаута генов проводилась с целью изучения функции опиоидной системы мозга. В обзорах проанализированы результаты работ по инактивации μ, δ и κ - опиоидных рецепторов, а также опиоидных пептидов (β-эндорфин, препроэнкефалин и препродинорфин).

4) Инактивация гена FMR-1 мыши позволила создать модель синдрома ломкой Х хромосомы и изучить отклонения в поведении животных и молекулярные механизмы заболевания .

5) С помощью нокаута была показана роль рецептора инсулина и внутриклеточных белков-мессенджеров в развитии диабета второго типа , роль цитокинов и хемокинов в развитии астмы и др. респираторных заболеваний . Также показано участие генетических факторов в развитии некоторых инфекционных заболеваний , участие NO синтазы в развитии атеросклероза , влияние продукта гена, кодирующего VI-a рецептор вазопрессина, на формирование социального поведения и поведения беспокойства у мышей .

Прежде ученые могли просто выявлять те или иные изменения в генетическом материале животных и пытаться с помощью отбора выделить "чистые линии" обладающих теми или иными особенностями мышей. Этот пассивный путь не давал и толики той свободы, которую исследователи обрели, научившись напрямую воздействовать на нужный ген.

Самое продуктивное использование этой технологии - "выключать" те или иные гены и смотреть, какое влияние оказало это выключение на организм животного. Таким образом можно точно установить функцию каждого гена, а значит, понять механизмы нормального развития организма и формирования определяемых наследственностью заболеваний - рака, диабета, болезней сердца и т.д.

Это "выключение" получило название "генетического нокаута" (gene knockout). В наследственном материале мышей, по современным представлениям, функционирует около двадцати тысяч генов, каждый из которых, упрощенно говоря, отвечает за какой-либо признак в организме животного. К моменту присуждения Капекки, Смитису и Эвансу нобелевской премии ученым удалось исследовать последствия выключения половины из них, то есть десяти тысяч. Как говорится в сообщении Нобелевского комитета, в ближайшем будущем генетики надеются провести последовательный нокаут каждого из мышиных генов.

Нокаут, таким образом, дает возможность "препарировать" каждое генетическое заболевание и каждый аспект нормального развития живого существа, что делает его универсальным методом, приложимым практически в любой сфере исследований.

Список литературы

1. Репин В.С. Эмбриональная стволовая клетка: от фундаментальной биологии к медицине // Успехи физиологических наук. - 2001. - Т. 32, №1. - С. 3-18

2. Тронько М.Д., Пушкарьов В.М. Механiзм дiї таксолу та перспективи його використання для лiку-вання злоякiсних пухлин щитоподiбної залози // Ендокринологiя. - 2003. - 8, № 2. - С. 228-243.

3. Пушкарьов В.М., Ковзун О. I., Тронько М.Д. та iн. Участь фосфоiнозитидiв, протеїнкiназ С та А упередачi регуляторного сигналу К+ в адренокортикальних клiтинах людини // Укр. бiохiм. журн. -2005. - 77, № 1. - С. 65-71.

4. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцрогенеза // Биохимия. - 2000. - 65, № 1. - С. 5-33.

5. Тронько М.Д., Левчук Н. I., Попадюк I.Д. та iн. Дiя протипухлинного препарату таксолу на клiтинианапластичного раку щитовидної залози // Доп. НАН України. - 2006. - № 8. - С. 204-206.

6. Фiляк Є., Фiляк О., Афанасьєв С., Стойка Р. Дефiцит гену бiлка секурину (PTTG) знижує рiвеньактивацiї Т лiмфоцитiв, iндукованої лектином // Експерим. та клiн. фiзiологiя та бiохiмiя. - 2006. -№ 4. - С. 18-24.

7. Фiляк Є., Держко I., Фiляк О., Стойка Р. Втрата гену бiлка секурину (PTTG) веде до пригнiчення активацiї Т-лiмфоцитiв // Мед. хiмiя. - 2007. - № 1. - С. 11-19.

8. Анисимов В.Н. Фактор времени в многостадийном канцерогенезе // Вопр.онкол.- 1990.- T. 36.- C. 771-784.

9. Анисимов В.Н. Канцерогенез и онтогенез: основные направления и результаты исследований // Вопр. онкологии. - 1997. - Т. 43, N 1. - С. 88- 94.

10. Анисимов В.Н. Роль индуцируемой 5-бромодезокcиуридином нестабильности генома в механизмах ускоренного старения и канцерогенеза // Успехи геронтологии. - 1997. -- Т. 1. - С. 50-56.

11. Бауэр Э.С. Теоретическая биология. - М.; Л.: Изд.-во Всесоюзного института экспериментальной медицины, 1935. - 206 с.

12. Газиев А.И., Подлуцкий А.Я. Бредбери Р. Увеличение с возрастом частоты спонтанных и индуцированных g-радиацией hprt-мутаций в лимфоцитах селезенки мышей // Докл. РАН. - 1994. - Т. 339. - С. 276-278.

14. Bardoni B., Mandel J.L., Fisch G.S. FMR1 gene and fragile X syndrome // Am. J. Med. Genet. - 2000. - Vol. 97, №2. - P. 153-163.

15. Bielsky I.F., Hu S.B., Szegda K.L., Westphal H., Young L.J. Profound impairment in social recognition and reduction in anxiety-like behavior in vasopressin V1a receptor knockout mice // Neuropsychopharmacology. - 2004. - Vol. 29, №3. - P. 483-493.

16. Capecchi M.R. Altering the genome by homologous recombination // Science. - 1989. - Vol. 244. - P. 1288-1292.

17. Chen L., Toth M. Fragile X mice develop sensory hyperreactivity to auditory stimuli // Neuroscience. - 2001. - Vol. 103, №4. - P. 1043-1050.

18. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos // Nature. - 1981. - Vol. 292, №5819. - P. 154-156.

19. Frankland P.W., Wang Y., Rosner B., Shimizu T., Balleine B.W., Dykens E.M., Ornitz E.M., Silva A.J. Sensorimotor gating abnormalities in young males with fragile X syndrome and Fmr1-knockout mice // Mol. Psychiatry. - 2004. - Vol. 9. - P. 417-425.

20. Henkemeyer M., Orioli D., Henderson J.T., Saxton T.M., Roder J., Pawson T., Klein R. Nuk controls pathfinding of commissural axons in the mammalian central nervous system // Cell. - 1996. - Vol. 86. - P. 35-46.

21. Kawashima S., Yokoyama M. Dysfunction of endothelial nitric oxide synthase and atherosclerosis // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2004. - Vol. 24, №6. - P. 998-1005

22. Kieffer B.L., Gaveriaux-Ruff C. Exploring the opioid system by gene knockout // Prog. Neurobiol. - 2002. - Vol. 66, №5. - P. 285-306.

23. Kilby N.J., Snaith M.R., Murray J.A.H. Site-specific recombinases: tools for genome engineering // Trends Genet. - 1993. - Vol. 9. - P.413-421.

24. Kono T., Obata Y., Wu Q., Niwa K., Ono Y., Yamamoto Y., Park E.S., Seo J.S., Ogawa H. Birth of parthenogenetic mice that can develop to adulthood // Nature. - 2004. - Vol. 428, №6985. - P. 860-864.

25. Loebel D.A., Tam P.P. Genomic imprinting: mice without a father // Nature. - 2004. - Vol. 428, №6985. - P. 809-811.

26. Mansour S.L., Thomas K.R., Capecchi M.R. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes // Nature. - 1988. - Vol. 336, №6197. - P. 348-352.

27. Reeves R.H. Exploring development and disease through germ-line genetic engineering in the mouse // Anat. Rec. - 1998. - Vol. 253, №1. - P. 19-23.

28. Thomas K.R., Capecchi M.R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells // Cell. - 1987. - Vol. 51, №3. - P. 503-512.

29. Vasquez Y.R., Spina D. What have transgenic and knockout animals taught us about respiratory disease? // Respir. Res. - 2000. - Vol. 1, №2. - P. 82-86.

30. Volarevic S., Pende M., Pullen N. Manipulating mammalian genome by gene targeting // Croat. Med. J. - 1999. - Vol. 40, №3. - P. 368-374.