Реакция торможения гемагглютинации. Механизм. Компоненты. Применение

(РТГА) - метод идентификации вируса или выявления противовирусных антител в сыворотке крови больного, основанный на феномене отсутствия агглютинации эритроцитов препаратом, содержащим вирус, в присутствии иммунной к нему сыворотки крови.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на блокаде, подавлении антигенов вирусов антителами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты.

РТГА применяют для диагностики многих вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещевого энцефалита и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных.

Механизм . Типирование вируса проводят в реакции торможения гемаг-глютинации (РТГА) с набором типоспецифических сывороток. Результаты реакции учитывают по отсутствию гемагглютинации. Подтипы вируса А с антигенами H 0 N 1 , H 1 N 1 , Н 2 N 2 , H 3 N 2 и др. могут быть дифференцированы в РТГА с набором гомологичных типоспецифических сывороток.

Реакция преципитации. Механизм. Компоненты. Способы постановки. Применение

Реакция преципитации (РП) - это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.

РП ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое распространение получили разновидности РП в полужидком геле агара или агарозы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др.

Механизм . Проводится с прозрачными коллоидными растворимыми антигенами, экстрагированными из патологического материала, объектов внешней среды или чистых культур бактерий. В реакции используют прозрачные диагностические преципитирующие сыворотки с высокими титрами антител. За титр преципитирующей сыворотки принимают то наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии с иммунной сывороткой вызывает образование видимого преципитата -- помутнение.

Реакция кольцепреципитации ставится в узких пробирках (диаметр 0,5 см), в которые вносят по 0,2--0,3 мл преципити-рующей сыворотки. Затем пастеровской пипеткой медленно наслаивают 0,1--0,2 мл раствора антигена. Пробирки осторожно переводят в"вертикальное положение. Учет реакции производят через 1--2 мин. В случае положительной реакции на границе между сывороткой и исследуемым антигеном появляется преципитат в виде белого кольца. В контрольных пробирках преципитат не образуется.

Это серологическая реакция, в которой специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), нейтрализуют его и лишают способности агглютинировать эритроциты, т.е. тормозят реакцию гемагглютинации (РТГА) позволяет с ее помощью определить вид и даже тип вирусов, обнаруженных при постановке РГА.

Поставка реакции. 0,25 мл противовирусной сыворотки в последовательных двукратных разведениях от 1:10 до1:2560 смешивают с равным объемом материала, содержащего вирус, разведенного в 4 раза меньше титра, установленного в РГА. Смесь встряхивают и помещают в термостат на 30 мин, после чего добавляют по 0,5 мл 1-2% взвеси эритроцитов.

Реакцию сопровождают 3 контролями.

Учет результатов производят после второй инкубации в термостате 30 или 45 мин при комнатной температуре. При правильной постановке опыта в контроле сыворотки и эритроцитов должна образоваться «пуговка» - нет агглютинирующего эритроциты фактора; в контроле антигена образуется «зонтик» - вирус вызвал агглютинацию эритроцитов.

В опыте, если сыворотка гомологична изучаемому вирусу, образуется «пуговка» - сыворотка нейтрализовала вирус. Титр сыворотки – это ее максимальное разведение, в котором происходит задержка гемагглютинации.

Реакция непрямой гемагглютинации

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) основана на том, что эритроциты, если на их поверхности адсорбировать растворимый антиген, приоб­ретают способность агглютинироваться при взаимодей­ствии с антителами к адсорбированному антигену. РНГА широко применяют при диагностике ряда инфекций.

Постановка реакции. Испытуемую сыворотку прогревают 30 мин при 56 °С, разводят последовательно в соотношении 1:10-1:1280 и разливают по 0,25 мл в пробирки или лунки, куда затем добавляют по 2 капли эритроцитарного диагностикума (эритроциты с адсорбированным на них антигеном).

Рис.70 Схема реакции пассивной гемагглютинации (РПГА).

А - получение эритроцитарного диагностикума; Б -РПГА: 1-эритроцит: 2 - изу­чаемый антиген: 3 - эритроцитарный диагностикум; 4 - антитело к изучаемому антигену; 5 - агглютинат.

Контроли: взвесь эритроцитарного диагностикума с заведомо иммун­ной сывороткой; взвесь диагностикума с нормальной сывороткой; взвесь нормальных эритроцитов с испытуемой сывороткой. В первом контроле должна произойти агглютинация, во втором и третьем ее не должно быть.

При помощи РНГА можно определять неизвестный антиген, если на эритроциты адсорбировать заведомо известные антитела.

Реакцию гемагглютинации можно ставить в объеме 0,025 мл (микрометод), пользуясь микротитратором Такачи.

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ

В реакции преципитации происходит выпадение в оса­док специфического иммунного комплекса, состоящего из растворимого антигена (лизата, экстракта, (аптена) и специфического антитела в присутствии электролитов.

Образующееся в результате этой реакции мутное кольцо или осадок называют преципитатом. От реак­ции агглютинации эта реакция в основном отличается размером частиц антигена.

Реакцию преципитации обычно применяют для опреде­ления антигена при диагностике ряда инфекций (сибирская язва, менингит и др.); в судебной медицине - для опреде­ления видовой принадлежности крови, спермы и др.; в санитарно-гигиенических исследованиях - при установле­нии фальсификации продуктов; с ее помощью определяют филогенетическое родство животных и растений. Для реакции необходимы:

1. Антитела (преципитины) - иммунная сыворотка с высоким титром антител (не ниже 1:100 000). Титр преципитирующей сыворотки устанавливают по наибольшему разведению антигена, с которым она дает реакцию.
Сыворотку обычно применяют неразведенной или в разведении 1:5-1:10.

2. Антиген - растворенные вещества белковой или
липоиднополисахаридной природы (полные антигены и
гаптены).

3. Изотонический раствор.

Основные методы проведения реакции преципитации: реакция кольцепреципитации и реакция преципитации в агаре (геле).

Внимание! Все компоненты, участвующие в реакции преципита­ции, должны быть совершенно прозрачными.

Рис.71 Реакция преципитации: А - реакция кольцепреципитации; Б - реакция преципитации по Оухтерлони

Реакция кольцепреципитации. В преципитационную пробирку с помощью пастеровской пипетки вносят 0,2 - 0,3 мл (5-6 капель) сыворотки (сыворотка не должна попадать на стенки пробирки). На сыворотку осторож­но наслаивают антиген в таком же объеме, наливая его тонкой пастеровской пипеткой по стенке пробирки. Про­бирку при этом держат в наклонном положении. При правильном наслаивании между сывороткой и антигеном должна получиться четкая граница. Осторожно, чтобы не перемешать жидкости, пробирку ставят в штатив. При положительном результате реакции на границе антигена и антитела образуется мутное «кольцо» - преципитат (см. рис. 48).

Реакцию сопровождают рядом контролей (табл. 18). Очень важна последовательность внесения в пробирку ингредиентов реакции. Нельзя наслаивать сыворотку на антиген (в контроле - на изотонический раствор), так как относительная плотность сыворотки больше, она опустит­ся на дно пробирки, и граница между жидкостями не выявится.

Схема постановки реакции кольцепреципитации

Таблица №13

Примечание. + наличие «кольца»; - отсутствие «кольца».

Учет результатов производят через 5-30 мин, в некоторых случаях через час, как всегда начиная с контролей. «Кольцо» во 2-й пробирке свидетельствует о способности иммунной сыворотки вступать в специфиче­скую реакцию с соответствующим антигеном. В 3-5-й пробирках «колец» не должно быть - там нет соответству­ющих друг другу антител и антигенов. «Кольцо» в 1-й пробирке - положительный результат реакции - говорит о том, что испытуемый антиген соответствует взятой им­мунной сыворотке, отсутствие «кольца» («кольцо» только во 2-й пробирке) свидетельствует о их несоответствии - отрицательный результат реакции.

Реакция преципитации в агаре (геле). Особенность реакции в том, что взаимодействие антигена и антитела происходит в плотной среде, т. е. в геле. Образующийся преципитат дает в толще среды мутную полосу. Отсут­ствие полосы свидетельствует о несоответствии компонен­тов реакции. Эту реакцию широко применяют при медико-биологических исследованиях, в частности при изу­чении токсинообразования у возбудителя дифтерии.

Изучите характер взаимодействия антигена с антителом в реакции
преципитации в агаре, зарисуйте результат (чашку получите у преподавателя).

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) - метод идентификации вируса или выявления противовирусных антител в сыворотке крови больного, основанный на феномене отсутствия агглютинации эритроцитов препаратом, содержащим вирус, в присутствии иммунной к нему сыворотки крови.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на блокаде, подавлении антигенов вирусов антителами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты.

РТГА применяют для диагностики многих вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещевого энцефалита и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных.

Механизм. Типирование вируса проводят в реакции торможения гемаг-глютинации (РТГА) с набором типоспецифических сывороток. Результаты реакции учитывают по отсутствию гемагглютинации.

Подтипы вируса А с антигенами H0N1, H1N1, Н2N2, H3N2 и др. могут быть дифференцированы в РТГА с набором гомологичных типоспецифических сывороток.

Реакция связывания комплемента. Механизм. Компоненты. Применение

Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комплексом антиген--антитело. Если же комплекс антиген--антитело не образуется, то комплемент остается свободным.

Специфическое взаимодействие АГ и AT сопровождается адсорбцией (связыванием) комплемента. Поскольку процесс связывания комплемента не проявляется визуально, Ж. Борде и О.Жангу предложили использовать в качестве индикатора гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка), которая показывает, фиксирован ли комплемент комплексом АГ-АТ. Если АГ и AT соответствуют друг другу, т. е. образовался иммунный комплекс, то комплемент связывается этим комплексом и гемолиза не происходит. Если AT не соответствует АГ, то комплекс не образуется и комплемент, оставаясь свободным, соединяется со второй системой и вызывает гемолиз.

Компоненты. Реакция связывания комплемента (РСК) относится к сложным серологическим реакциям. Для ее проведения необходимы 5 ингредиентов, а именно: АГ, AT и комплемент (первая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (вторая система).

Антигеном для РСК могут быть культуры различных убитых микроорганизмов, их лизаты, компоненты бактерий, патологически измененных и нормальных органов, тканевых липидов, вирусы и вирусосодержащие материалы.

В качестве комплемента используют свежую или сухую сыворотку морской свинки.

Механизм. РСК проводят в две фазы: 1-я фаза -- инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (индикаторная) -- выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген--антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит -- ан-тиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз; реакция отрицательная.

Применение. РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифилиса (реакция Вассермана).

Гемагглютинации реакция торможения

серол. реакции, основанные на торможении агглютинации эритроцитов. Применяют 2 вида Г. т. р: реакция торможения активной (РТГА) и пассивной (РТПГА) Гемагглютинации. РТГА используют для серодиагностики вирусных инфекций и типирования неизвестных вирусов. В первом варианте к сериям двукратных разведении с-к б-ного, взятых в начале болезни и спустя 10-14 дней в объеме 0,25 мл, добавляют по 0,25 мл стандартного вирусного диагностикума. После часовой экспозиции при комнатной температуре в каждую пробирку (лунку) доливают по 0,5 мл 1% взвеси куриных эритроцитов. Через 30 - 60 мин в обоих рядах определяют последние разведения с-к, в к-рых отмечено торможение (отсутствие) Гемагглютинации. В случае нарастания титра Ат в 4 раза и более дают положительный ответ, в остальных случаях - отрицательный. Для типирования вирусов готовят серии двукратных разведении стандартной типовой с-ки в объеме 0,25 мл, к каждому разведению добавляют равный объем иссл. вирусной суспензии активностью в 4 гемаг-глютинирующие ед. (дозы), выдерживают при комнатной температуре 1 ч и доливают по 0,5 мл 1% взвеси куриных эритроцитов. Учет осуществляют так же, как и в предыдущем варианте. Вирус признают идентичным с-ке, если РТГА достигает титра или 1/2 титра стандартной с-ки. К тому и др. варианту ставят 3 контроля: с-ки, вируса, эритроцитов. РТПГА обычно проводят для обнаружения бактериальных, грибковых, протозойных Аг (гаптенов) в иссл. материале. Она высокочувствительна, специфична, но трудоемка в постановке. РТПГА осуществляют также в 2 этапа. На 1-м этапе к серии двукратных разведений иссл. на Аг материала добавляют равный (обычно 0,25 мл) объем стандартной иммунной с-ки, взятой в рабочей дозе. Пробирки выдерживают в термостате 2 ч. При наличии соответствующего с-ке Аг в материале имеет место связывание Ат и при последующем добавлении эритроцитарного диагностикума в ряде пробирок (и в зависимости от количества Аг) происходит торможение агглютинации сенсибилизированных эритроцитов. Опыт сопровождают контролями с-ки, эритроцитов и материала.

(Источник: «Словарь терминов микробиологии»)

Смотреть что такое "Гемагглютинации реакция торможения" в других словарях:

реакция торможения гемагглютинации - РТГА Лабораторный, серологический метод. [Англо русский глоссарий основных терминов по вакцинологии и иммунизации. Всемирная организация здравоохранения, 2009 г.] Тематики вакцинология, иммунизация Синонимы РТГА EN hemagglutination inhibition… … Справочник технического переводчика

- (РТГА) метод идентификации вируса или выявления противовирусных антител в сыворотке крови больного, основанный на феномене отсутствия агглютинации эритроцитов препаратом, содержащим вирус, в присутствии иммунной к нему сыворотки крови … Большой медицинский словарь

РТГА

РТГ - реакция торможения гемагглютинации … Словарь сокращений русского языка

- (позднелат. infectio заражение) группа болезней, которые вызываются специфическими возбудителями, характеризуются заразительностью, циклическим течением и формированием постинфекционного иммунитета. Термин «инфекционные болезни» был введен… … Медицинская энциклопедия

Эта страница глоссарий. # А … Википедия

Основные сокращения, принятые в Ветеринарном энциклопедическом словаре - a., aa, artena, arteriae aa ana (поровну) АМН СССР Академия медицинских наук СССР АН СССР Академия наук СССР Bac. Bacillus Bact. Bacterium БССР Белорусская ССР в., вв. век, века v., vv. vena, venae ВАСХНИЛ Всесоюзная ордена Ленина и… … Ветеринарный энциклопедический словарь

Аг антиген АЕ антитоксическая или антигенная единица антибактер. антибактериальный Ат антитело АТФ аденозинтрифосфорная кислота бактер. бактериальный бактериол бактериологический бактериоскоп. бактериоскопический БАС бактерицидная активность… … Словарь микробиологии

- (от лат. serum сыворотка и...Логия) буквально учение о свойствах сыворотки крови; обычно под С. понимают раздел иммунологии, изучающий взаимодействие антител (См. Антитела) сыворотки с антигенами (См. Антигены). Серологические реакции… … Большая советская энциклопедия

Существует множество методов качественного и количественного определения вирусоспецифических антител. С помощью этих методов можно обнаружить как IgM и IgG одновременно, так и отдельно иммуноглобулины каждого класса. Как правило, в реакции связывания комплемента выявляются только вирусоспеци-фические IgG. Однако при тестировании этим методом микробиологических антигенов возможно одновременное определение специфических IgM и IgG.

Иммунологические методы используются главным образом в двух целях: во-первых, для диагностики текущей, завершившейся или врожденной вирусной инфекции и, во-вторых, для обнаружения специфических антител, присутствие которых указывает на прошедшую инфекцию и, следовательно, на иммунитет к возможной повторной инфекции. По силе иммунного ответа на вирусную инфекцию люди сильно отличаются друг от друга. На рис. 3 показана типичная кривая нарастания титра

антител в ответ на первичную инфекцию краснухи. Легко заметить, что установление диагноза краснухи возможно по нарастанию титра специфических IgG и выявлению специфических IgM. Присутствие специфических IgM в крови новорожденного свидетельствует о внутриматочном инфицировании, поскольку материнские IgM в отличие от IgG задерживаются плацентой. Специфические IgG, образовавшиеся в результате первичной инфекции, обычно сохраняются в течение всей жизни. Поэтому присутствие антител этого класса в сыворотке крови свидетельствует об иммунитете к соответствующей повторной инфекции.

Ниже приведены иммунологические методы обнаружения специфических антител к вирусу краснухи, особенно эффективные для диагностики заболевания плода и определения титра специфических антител в сыворотке крови. Подробные описания методов, используемых для диагностики краснухи, можно найти в обзорах Паттисона и Моргана-Капнера.

Реакция торможения гемагглютинации

Вирус краснухи вызывает гемагглютинацию эритроцитов многих видов животных. Чаще всего в РТГА используют эритроциты однодневных цыплят. Гемагглютинирующим антигеном вируса краснухи при постановке этой реакции служит выращенный в культуре и обработанный Твин 80 и эфиром вирус. Предварительная обработка увеличивает ГА-титр вируса.

5.1.1 Стандартизация ГА-антигена вируса краснухи

1. 1 мл 50%-ной суспензии эритроцитов цыплят трижды промывают в вероналовом буфере с декстраном и желатином центрифугированием и ресуспендированием осадка в 15-мл градуированной центрифужной пробирке. Отмытые клетки ресуспендируют в DGV-буфере для получения 30%-ной суспензии.

Таблица 3. Приготовление вероналового буфера с декстраном и желатином

2. Разводят лиофилизированный препарат ГА-антигена вируса краснухи в требуемом по инструкции объеме дистиллированной воды.

3. В каждую из восьми лунок двух соседних рядов 96-луноч-ного полистиролового планшета для микротитрования с U-об-разными лунками вносят по 1 объему DGV.

4. В первые лунки двух рядов вносят по одному объему ГА-антигена вируса краснухи.

5. Готовят последовательные двукратные разведения ГА-антигена вируса краснухи, начиная от 1:2 и до 1:256, используя 0,025-мл микротитратор. Перед употреблением головку микро-титратора следует прокалить в пламени докрасна, затем остудить в течение нескольких секунд, поместить в дистиллированную воду и промакнуть фильтровальной бумагой.

6. В каждую из заполненных лунок дополнительно вносят по одному объему DGV-буфера. В качестве контроля в лунки 12 первых двух рядов вносят по два объема DGV-буфера.

7. Суспензию отмытых эритроцитов цыплят разводят в 100 раз DGV-буфером, получая таким образом 0,03%-ную суспензию.

8. Во все 18 лунок добавляют по два объема 0,03%-ной суспензии эритроцитов, готовый планшет закрывают другим, неиспользованным планшетом и инкубируют 1 ч при 4 °С.

9. На дне контрольных лунок образуется плотная «бляшка» неагглютинированных эритроцитов. Агглютинированные эритроциты оседают равномерно. ГА-титром считают обратную величину наибольшего разведения ГА-антигена вируса краснухи, при котором еще происходит полная агглютинация. Такое разведение содержит 1 гемагглютинирующую единицу.

Для тестирования сывороток используют 4 ГА-единицы антигена вируса краснухи. Таким образом, если ГА-титр антигена равняется 32, то для обнаружения антител к вирусу краснухи его разводят DGV в восемь раз. Разведенный антиген стабилен в течение 25--48 ч при 4 °С.

5.1.2 Предварительная обработка сыворотки

Все сыворотки содержат неспецифические ингибиторы гемаг-глютинации, которые следует удалить. Неспецифические ингибиторы ГА в основном представляют собой липопротеины, от которых освобождаются, обрабатывая сыворотку каолином. В сыворотках человека, кроме того, могут присутствовать неспецифические агглютинины куриных эритроцитов. Однако предварительная адсорбция тестируемых сывороток эритроцитами не является обязательной, поскольку все неспецифические гемагглютинины, присутствующие в сыворотках, обнаруживаются в контролях.

1. В стеклянные пронумерованные пробирки вносят по 0,2 мл сыворотки. Кроме исследуемых сывороток в каждом опыте необходимы положительные и отрицательные контроли.

2. В каждую пробирку добавляют по 0,8 мл 25%-ного каолина на боратно-солевом буфере.

3. Содержимое пробирок взбалтывают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин.

4. Отработанный каолин осаждают центрифугированием в настольной центрифуге при 2000 об/мин 20 мин.

5. Супернатант переносят в чистые пронумерованные пробирки. В результате очистки получают сыворотки, разбавленные в четыре раза. Их используют для постановки реакции торможения гемагглютинации. Сыворотки можно хранить при 4 °С в течение ночи.

5.1.3 Реакция торможения гемагглютинации

1. Для тестирования одного образца сыворотки вносят по одному объему DGV в один ряд лунок.

2. В первую и последнюю лунки добавляют по одному объему сыворотки, разведенной в четыре раза.

3. С помощью микротитратора готовят последовательные двукратные разведения сыворотки.

4. В лунки 1--10 вносят по одному объему ГА-антигена краснухи, содержащего 4 ГАЕ. В лунку 12 ГА-антиген краснухи не добавляют.

5. В лунки 1--8 другого планшета вносят по одному объему рабочего разведения ГА-антигена краснухи, и затем в восьми лунках готовят последовательные двукратные разведения ГА-антигена. В эти 16 лунок добавляют по одному объему DGV. Это титрование является проверочным для ГА-антигена краснухи. Для контроля в лунки 12 первого и второго рядов вносят по два объема DGV.

6. Закрытые планшеты оставляют на 1 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 °С.

7. Во все заполненные лунки вносят по два объема 0,03%-ной суспензии эритроцитов цыплят и планшеты оставляют на 1 -- 1,5 ч при 4 °С.

8. Просматривая планшеты, определяют титр ГА-антигена краснухи. В контрольных лунках агглютинация не должна произойти.

9. Если же сыворотка агглютинировала эритроциты в отсутствие ГА-антигена краснухи, необходимо провести повторное тестирование исходного разведения сыворотки. Перед этим сыворотку адсорбируют одной каплей 30%-ной суспензии эритроцитов цыплят 1 ч при комнатной температуре, а затем эритроциты осаждают центрифугированием.

10. Титром специфических антител в исследуемой сыворотке считают обратную величину разведения, при котором полностью подавляется гемагглютинация.

5.1.4 Интерпретация результатов

При невысоком титре интерпретировать результаты сложно, так как при небольшом разведении возможно остаточное присутствие неспецифических ингибиторов. Наличие вирусоспецифических антител считается доказанным при титре 16 или выше.