Постановка нокаутирующего удара. Получение мышей с нокаутом (knock-out) и нокином (knockin) генов - метод направленного мутагенеза Метод генетического нокаута требования к эксперименту

Вступление

1.1 Особенности векторных конструкций

1.2 Внесение вектора в эмбриональные стволовые клетки

2. Роль метилирования ДНК в контроле генома

3."Программируемый нокаут генов"

4. Линии нокаутных мышей

4.1 ФНО/ЛТ панель

4.3 B6SJL-Tg(SOD1-G93A)dl1Gur/J

4.5 C57BL/6Kaiso

5.Примеры использования нокаутированных мышей для изучения функций генов и наследственных заболеваний человека

Список литературы

Нокаут гена (gene knockout) - это метод молекулярной генетики, при котором из организма удаляют или делают неработоспособными заданные гены. Таким образом получают организм, нокаутный по неработающим генам. Нокаутные организмы помогают узнать функции генов, нуклеотидная последовательность которых известна. Различия между нокаутным и нормальным организмом свидетельствуют о функции выключенного гена.

Эта методика заключается в целенаправленном внесении измененного, мутированного гена в наследственную информацию клеток. Новый ген вносится в получаемые из эмбрионов стволовые клетки, а результат оценивается во взрослом животном, поэтому пока не идет речи о применении данной технологии у людей: многие работы со стволовыми клетками человека почти повсеместно запрещены, да и выращивание мутантных особей Homo sapiens в экспериментальных целях представляется малореальным.

Стандартной биологической моделью, для которой разработана методика, являются лабораторные мыши.

Вступление

С первых дней возникновения генетики как науки, ученые мечтали получать направленные мутации, затрагивающие гены изучаемых ими признаков. Первым шагом к осуществлению этой мечты было открытие радиационного и химического мутагенеза. Окончание секвенирования генома человека в 2001 г. вывело на новый уровень исследования по обнаружению новых генов и функционально значимых последовательностей генома. В настоящее время биотехнология и биоинформатика в комбинации с классической биохимией и генетикой являются мощным инструментом для анализа уже имеющейся последовательности генома человека и модельных организмов. Но настоящий прорыв в области направленных мутаций был осуществлен благодаря использованию феномена гомологичной рекомбинации между сравнительно небольшим участком экзогенной и клеточной ДНК. Данный метод получил название направленной инактивации гена или нокаут гена (от англ. knockout, синоним – gene targeting). Зная последовательность изучаемого гена человека, стало возможно посредством инактивации гомологичного гена у модельного организма определить биохимическую и физиологическую роль его продукта. Поскольку значительное число болезней человека в своей основе имеет наследственный компонент, модели заболеваний, созданные с использованием этой стратегии, позволяют расширить наше понимание биохимии и физиологии наследственных патологий и приведут к созданию новых подходов к лечению.

Лауреатами Нобелевской премии 2007 года в области медицины и физиологии стали Марио Капекки, Оливер Смитис и сэр Мартин Эванс – разработчики технологии gene targeting – способа изменить отдельные гены у млекопитающих. Речь идет о передней границе современной науки о живом, настоящей генетической инженерии, о которой мечтал еще Уэллс в "Острове доктора Моро".

1. Метод генетического нокаута

Нокаут гена – это молекулярно-генетический метод, в ходе которого задуманные исследователем изменения вносятся в нуклеотидную последовательность изучаемого гена или его регуляторных элементов. Мышь является наиболее адекватным модельным животным для использования технологии инактивации генов. Это обусловлено следующими причинами:

а) мышь – хорошо изученный и доступный объект;

б) геном мыши и человека содержит приблизительно одинаковое число генов;

в) сходство аминокислотных последовательностей всех белков человека и мыши составляет около 90%.

Однако основной причиной использования мыши в качестве модели для инактивации гена является возможность изолирования эмбриональных стволовых клеток, в которых любой ген может быть модифицирован . Клеточные линии, содержащие модифицированный ген, могут быть привнесены в развивающийся зародыш, что позволяет получить химерное животное, несущее искусственно созданную мутацию (рис. 1).

Рис. 1. Стратегия получения линии нокаутированных мышей .

Молекулярно-генетическим механизмом, позволяющим осуществлять инактивацию гена, является гомологичная рекомбинация между экзогенной ДНК, несущей задуманные исследователем изменения, и геномной ДНК объекта.

Классическая схема получения нокаутированных мышей включает несколько этапов: получение векторной конструкции, с последующим внесением ее в культуру эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и отбор трансформантов. Трансформированные ЭСК вносят в зародыш, и полученных химерных животных скрещивают для получения линии мышей, гомозиготных по полученной мутации (см. рис. 1).

1.1 Особенности векторных конструкций

В зависимости от поставленной задачи используются два типа векторов: замещающий и вставочный. Первый тип векторов позволяет заменить участок гена мишени, в то время как второй интегрирует в изучаемую последовательность. Строение обоих типов векторов одинаково, кроме ориентации фланкирующих последовательностей (рис. 2). Наиболее часто используются замещающие вектора.

Рис. 2. Два типа векторов – замещающий (А) и вставочный (Б) – и их механизмы интеграции в геном .

Вектор для трансформации несет клонированную последовательность изучаемого гена, с внесенными в нее необходимыми изменениями. Это может быть: внесение стоп-кодона, приводящее к синтезу короткого неактивного пептида; делеция одного или нескольких экзонов; делеция промоторной области; вставка, приводящая к нарушению нормального функционирования гена и любые другие изменения, приводящие к отсутствию функционального продукта изучаемого гена или значительно снижающие его активность. Также в эту последовательность вносится положительный селективный маркер (МПС), которым является ген neo. Продукт этого гена дает несущим его клеткам устойчивость к антибиотикам неомицину и канамицину. Модифицированная последовательность должна быть фланкирована неизмененными участками, по которым будет проходить рекомбинация. Эффективность рекомбинации зависит от длины фланкирующих последовательностей , что в свою очередь зависит от возможностей вектора (рис. 3). При длине гомологичного плеча около 5 тыс. п.н. процент рекомбинации составляет 0,001.

Рис. 3. Зависимость частоты интеграции вектора от длины гомологичных плеч .

В качестве вектора можно использовать бактериальные искусственные хромосомы (BAC), со вставками фрагментов генома мыши. В этом случае размер одного плеча может составлять до 150 тыс. п.н., а размер делеции до 25 тыс. п.н. Наилучший процент рекомбинации (8,3%) получен авторами с использованием длины плеча 110 тыс. п.н. .

Существует вероятность, что рекомбинация пройдет не по исследуемым нами участкам генома, а в любой другой сходной области. При этом ген neo (МПС) сохранится, и в отобранном пуле ЭСК будут присутствовать рекомбинантные клетки, не несущие необходимых изменений. Эта проблема решается внесением в векторную конструкцию маркера отрицательной селекции (МОС). Им может служить ген тимидин-киназы простого вируса герпеса (HSV-tk) или ген дифтерийного токсина А (DT-A), продукты которых убивают эукариотические клетки. Положение МОС с наружной стороны гомологичного плеча вектора позволяет элиминировать его после прохождения гомологичной рекомбинации (рис. 4). В случае же негомологичной рекомбинации, МОС оказывается интегрированным в геном трансформированной клетки, что приводит к ее элиминации. Наличие двух маркеров селекции (положительного и отрицательного) позволяет быстро и эффективно проводить отбор нужных трансформантов .

Рис. 4. Действие системы позитивной – негативной селекции: А) интеграция вектора в нужный участок генома, приводящая к нокауту гена, Б) случайная интеграция (синтез тимидин-киназы и гибель клеток) .

1.2 Внесение вектора в эмбриональные стволовые клетки

Для трансформации используют эмбриональные стволовые клетки мышей. Помимо того, что культура ЭС клеток способна расти in vitro, при пересадке во взрослую мышь или эмбрион клетки имеют свойство приживаться. ЭС клетки, в отличие от специализированных соматических клеток, сохраняют генетические потенции без тканевой специализации. Эти клетки имеют "минимальный" фенотип: минимум рецепторов и программ для взаимодействия с микроокружением, поскольку лишь 5% из 500 генов транссигнализации экспрессировано в пролиферирующих ЭСК. Второй важнейшей характеристикой ЭСК в культуре является практически неограниченный потенциал пролиферации, обусловленный особенностями фенотипа незрелых клеток. Третьей особенностью ЭСК является рост суспензионными клонами без какой-либо примеси продвинутых клеток, прикрепленных к подложке. Каждый клон в такой культуре является производным одной прародительской ЭСК .

Эмбриональные стволовые клетки мыши впервые получены в 1981 году , что дало возможность для развития работ по инактивации генов. Внесение линеализированного вектора в ЭС клетки возможно несколькими методами: микроинъекция, трансфекция (электропорация), трансдукция (вирусная инфекция). Перечисленные методы имеют свои преимущества и недостатки.

Нобелевскую премию по физиологии и медицине в этом году получат Марио Капекки, Оливер Смитис и сэр Мартин Эванс за «открытие принципов введения специфических генных модификаций в организм мышей посредством эмбриональных стволовых клеток», то есть за изобретение метода нокаута генов.

На днях были объявлены лауреаты Нобелевской премии по физиологии и медицине 2007 года. Премию этого года разделят Марио Капекки (Mario R. Capecchi) из Университета Юты (США), Оливер Смитис (Oliver Smithies) из Университета Северной Каролины и сэр Мартин Эванс (Sir Martin J. Evans) из Кардиффского университета (Великобритания). Премия присуждена за «открытие принципов введения специфических генных модификаций в организм мышей посредством эмбриональных стволовых клеток» («for their discoveries of principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells»), то есть за изобретение метода нокаута генов (gene knockout). Этот метод, разработанный лауреатами в конце восьмидесятых годов, широко используется в современных генетических исследованиях для определения функций генов.

Марио Капекки родился в 1937 году в Вероне (Италия). Его отец, летчик, погиб на войне, а мать попала в немецкий концлагерь за антифашистскую деятельность. В четыре года Капекки остался беспризорным. К счастью, ему удалось выжить, а мать нашла его после освобождения из концлагеря. Вскоре он вместе с матерью переехал в Соединенные Штаты, где и получил образование. Диссертацию по специальности «Биофизика» он подготовил в Гарварде под руководством одного из первооткрывателей структуры ДНК, Джеймса Уотсона (James D. Watson). C 1973 года Капекки работает в Университете Юты.

Оливер Смитис родился в Галифаксе (Англия) в 1925 году. Он учился в Оксфорде , где и защитил диссертацию по специальности «Биохимия». В пятидесятых годах Смитис намеревался эмигрировать в США и работать в Университете Висконсина (где он и начал впоследствии опыты, принесшие ему мировую славу), но из-за проблем с визой (sic!) в течение семи лет (1953-1960) жил в Канаде и работал в Торонтском университете . В 1988 году Смитис вместе с женой, которая не смогла найти себе позицию в Висконсине, переехал в Северную Каролину и стал работать в Университете Северной Каролины, где сотрудничает и поныне. Смитис — дальтоник , но несмотря на это не только успешно занимается биохимией, но и увлекается планеризмом.

Мартин Эванс родился в Великобритании в 1941 году и учился в Кембридже и в Университетском колледже в Лондоне. Он работал в Университетском колледже (1966-1978) и в Кембридже (1978-1999), а с 1999 года работает в Кардиффском университете в Уэльсе. В 2004 году Мартин Эванс был посвящен королевой Елизаветой II в рыцари за заслуги перед медициной.

Метод нокаута генов позволяет получать линии нокаутных мышей (knock-out mice, knockout mice) — мутантных мышей, у которых выключены определенные гены. Этот метод позволяет исследовать роль каждого конкретного гена в развитии организма и в его нормальной и патологической работе и изучать различные человеческие болезни, используя мышей в качестве модельных объектов. Выключенный ген приводит к тем или иным нарушениям. Характер этих нарушений позволяет судить о функциях данного гена. С тех пор как эта методика была разработана, ее применение позволило создать тысячи различных линий нокаутных мышей, из которых несколько сотен служат модельными объектами для изучения человеческих болезней, в частности заболеваний сердечно-сосудистой и нервной систем и злокачественных опухолей.

В основе метода лежит явление гомологичной рекомбинации — обмена соответствующими участками между парами гомологичных хромосом. Марио Капекки и Оливер Смитис независимо друг от друга изобрели способ выключения (нокаутирования) генов за счет гомологичной рекомбинации с участием искусственно синтезированных фрагментов ДНК, имеющих определенную последовательность нуклеотидов, соответствующую участку одного из генов, но некоторым образом видоизмененную. Такие фрагменты вводят в выращиваемые в культуре (то есть в искусственной среде отдельно от организма) клетки посредством электропорации — через поры в клеточной мембране, созданные искусственно с помощью электрического поля. За счет рекомбинации в некоторых из клеток культуры введенная последовательность внедряется в хромосому на место нормальной.

Если видоизменить внедряемую последовательность определенным образом, то на основе испорченного таким образом гена у получивших этот ген клеток будет синтезироваться нефункциональный (не выполняющий своей функции) белок, или вообще не будет синтезироваться никакого белка. Если видоизменить исходную последовательность, не только испортив некоторый ген, но и добавив другой ген, не свойственный мышиным клеткам и делающий их устойчивыми к действию некоторого антибиотика, рекомбинантные клетки можно легко отделить от остальных, подействовав на культуру данным антибиотиком, и получить таким образом культуру рекомбинантных клеток. Капекки и Смитис научились выключать с помощью этого метода гены в культурах клеток, но разработанная ими технология еще не позволяла получать нокаутные многоклеточные организмы.

Мартин Эванс, который около 1980 года одним из первых разработал способ выращивания в культуре эмбриональных стволовых (недифференцированных) клеток мышей, впоследствии изобрел метод, позволяющий передавать определенные гены потомству мышей, этими генами не обладающих. Он вводил стволовые клетки, полученные из эмбрионов мышей одной линии, в эмбрионы мышей другой линии и, используя какую-либо мышь в качестве суррогатной матери, вынашивающей эти эмбрионы, получал химерных мышей (состоящих из клеток, полученных от разных организмов). У некоторых из них предшественники гамет (половых клеток) были потомками инъецированных в эмбрионы стволовых клеток. Потомству таких химер доставались гены той линии, от которой были взяты стволовые клетки. Отбирая потомков химер, обладающих признаками этой линии, Эванс получил мышей, генетически идентичных инъецированным ранее в эмбрионы стволовым клеткам.

Затем Эванс модифицировал этот метод для получения трансгенных мышей (то есть мышей с искусственно внедренными генами), добавляя гены в хромосомы инъецируемых стволовых клеток c помощью ретровирусов (вирусов, гены которых встраиваются в хромосомы клеток хозяина). Потомки химер, полученных таким способом, если у этих химер предшественники половых клеток образовывались из инъецированных в эмбрион стволовых клеток, оказывались носителями внедренного в стволовые клетки гена.

Достижения Эванса сделали возможным создание мышей, у которых определенный ген был бы выключен посредством нокаутирования за счет гомологичной рекомбинации с участием искусственно синтезированных фрагментов ДНК, то есть объединив метод Эванса с методом Капекки и Смитиса — нокаутируя гены в инъецируемых в эмбрион стволовых клетках. Именно в лабораториях Капекки и Смитиса (снова независимо, и в разных вариантах) подобный модифицированный метод и был впервые применен на практике, положив начало множеству работ с нокаутными мышами.

Применение метода нокаута генов стало особенно актуальным в последние годы, после завершения секвенирования (прочтения последовательности) полных геномов как человека (2003), так и мыши (2002), а также ряда других видов животных. Последовательно нокаутируя различные гены в пределах мышиного генома, исследователи выясняют функции каждого из них. Учитывая, что у человека и мыши очень многие гены сходны и выполняют одни и те же функции, нокаутные мыши предоставляют исследователям богатый материал для изучения роли генов в нормальном развитии и жизни человеческого организма и в патологических процессах. По-видимому, рано или поздно благодаря методу нокаута генов удастся изучить свойства всех (нескольких десятков тысяч) генов мышиного генома. Работы в этом направлении ведутся во многих странах мира, не исключая и Россию.

Метод нокаута генов можно применять не только на мышах, но и на других животных. Однако именно нокаутные мыши нашли особенно широкое применение — в связи с тем, что они эволюционно (и, соответственно, генетически) довольно близки к человеку, а получить нокаутные линии у них намного проще, чем у большинства других лабораторных животных. В частности, у крыс первые нокаутные линии были получены только в 2003 году, через много лет после создания первых нокаутных мышей.

Церемония награждения Нобелевскими премиями состоится, как обычно, 10 декабря, в день смерти Альфреда Нобеля (1896), в Стокгольме.

В прошлом году Нобелевскую премию по физиологии и медицине получили Эндрю Файр (Andrew Z. Fire) и Крейг Мелло (Craig C. Mello) за открытие другого пути выключения генов — РНК-интерференции , которая может происходить даже на поздних стадиях развития организма под действием участка двухцепочечной РНК, последовательность нуклеотидов в котором соответствует фрагменту выключаемого гена. При этом выключение происходит не за счет повреждения самого гена в хромосоме, а за счет уничожения считанных с него матричных РНК. Их уничтожение не позволяет синтезировать белок, кодируемый данным геном.

Вступление

1.1 Особенности векторных конструкций

1.2 Внесение вектора в эмбриональные стволовые клетки

3."Программируемый нокаут генов"

4. Линии нокаутных мышей

4.1 ФНО/ЛТ панель

4.3 B6SJL-Tg(SOD1-G93A)dl1Gur/J

4.5 C57BL/6Kaiso

Список литературы

Стандартной биологической моделью, для которой разработана методика, являются лабораторные мыши.

Вступление

1. Метод генетического нокаута

а) мышь – хорошо изученный и доступный объект;

б) геном мыши и человека содержит приблизительно одинаковое число генов;

в) сходство аминокислотных последовательностей всех белков человека и мыши составляет около 90%.

Рис. 1. Стратегия получения линии нокаутированных мышей .

1.1 Особенности векторных конструкций

Рис. 2. Два типа векторов – замещающий (А) и вставочный (Б) – и их механизмы интеграции в геном .

Рис. 3. Зависимость частоты интеграции вектора от длины гомологичных плеч .

1.2 Внесение вектора в эмбриональные стволовые клетки

Микроинъекция позволяет с частотой до 100 процентов вносить экзогенную ДНК в клетку, а частота гомологичной рекомбинации составляет около 0,67%. Этот метод, несомненно, является наиболее эффективным. Однако для осуществления микроинъекции требуется дорогое оборудование и высокая квалификация экспериментатора. Помимо этого, сам метод очень трудоемок и занимает много времени. Векторные конструкции микроинъекцией можно вносить и в зиготу, но отобрать нужные трансформанты в этом случае невозможно.

Наиболее экономичными и достаточно эффективными методами внесения экзогенной ДНК в клетку являются электропорация и ретровирусная инфекция. К их достоинствам, в первую очередь, следует отнести возможность одноразово обработать сотни тысяч клеток, которые благодаря системе позитивной-негативной селекции достаточно быстро проходят отбор. Это существенно упрощает и делает экономически выгодным, по сравнению с микроинъекцией, процедуру получения трансформированных клеток. Оба метода имеют свои недостатки: больший процент негомологичной рекомбинации при внесении векторных систем электропорацией по сравнению с другими методами, ограниченые размеры ретровирусных векторов и т.д. . Наиболее часто внесение векторов в клетку проводят с помощью электропорации. В то же время ретровирусная инфекция позволяет вносить экзогенную ДНК не только в ЭС клетки, но и в эмбрионы. Итак, линия трансформированных клеток получена и поддерживается. Следующий этап – внесение клеток в эмбрион мыши (как правило, на стадии бластулы). Химерный зародыш подсаживают в матку ложно беременной самки. Полученную таким образом химеру скрещивают с нормальным, но имеющим отличия (например, цвет) животным. Если полученные в первом поколении мыши имеют фенотип линии, из которой получены ЭС клетки, то их можно использовать для насыщающего скрещивания. Результатом будет получение линии животных, гомозиготных по созданной мутации.

2. Роль метилирования ДНК в контроле генома

Одним из способов видоизменения гена является его замена на бессмысленную последовательность ДНК - тогда ген "выключается". Исследователи систематически "выключают" гены и наблюдают, к каким последствиям на уровне организма приводит это "выключение". Такая методика называется "генетический нокаут" (gene knockout).

Она позволяет подробно изучить функцию конкретного гена во время эмбрионального развития и после рождения животного. Можно проследить, как каждый ген влияет на развитие организма и возникновение той или иной патологии. В связи с этим, метод ещё получил название "генетическое планирование". К настоящему моменту уже проведены опыты по "выключению" десяти тысяч генов мыши, это половина всего мышиного генома.

Для развития организма достаточно одной клетки с единичной (конечно же, диплоидной) копией ДНК, которая при делении точно воспроизводится от клетки к клетке. Это относится практически ко всем живым многоклеточным существам. У человека все его клетки содержат идентичную ДНК. Клетки крови, печени, мозга, стволовые клетки - все они одинаковы по ДНК. Чем же определяется многообразие имеющихся у человека высокоспециализированных клеток и тканей? Это достигается за счет включения или выключения генов, ответственных за специализацию клетки. Именно механизмы контроля работы, или как принято говорить, экспрессии генов являются основной темой исследований нашей группы. Одним из таких механизмов является метилирование генов - ковалентное присоединение метильной группы в 5 положении пиримидинового кольца цитозина. ДНК, содержащая метилированные цитозины, является транскрипционно неактивной, и гены, располагающиеся вблизи метилированных районов, молчат.

Роль метилирования ДНК и механизм его негативного воздействия на работу генов в процессе жизнедеятельности позвоночных организмов (на моделях лягушки, мыши и клеточных линий человека).

Метилирование ДНК у позвоночных приобретает смысловую нагрузку в виде подавления транскрипции близлежащих генов двумя основными способами: (А) за счет прямого воздействия на ДНК, в составе которой метилированный цитозин ингибирует связывание транскрипционного фактора со своим участком, и (Б) за счет специфического связывания с метилированным районом специализированных метил-ДНК узнающих белков, которые, в свою очередь, привлекают сложные механизмы подавления транскрипции путем модификации близлежащих гистонов.

Как пример охарактеризован белок Каизо. Каизо, с одной стороны, связывается с катенином р120, а с другой - способен подавлять транскрипционную активность метилированных генов. Каизо имеет доменную структуру и состоит из N-концевого BTB/POZ домена и C-концевых цинковых пальцев типа C2H2. Цинковые пальцы специфично связывают 5-метил цитозин содержащую ДНК.

Нокаут гена Каизо приводит к частичной резистентности животных к раку кишечника. Кривая выживаемости животных с нокаутом гена Каизо (красная линия) в модели спонтанного рака кишечника APC(Min). Черной линией показана кривая выживаемости контрольных животных

Проведен генетический нокаут гена Каизо у мышей. Показано, что животные без Каизо (Каизо-КО) развиваются нормально и не имеют выраженных патологий. При переведении Каизо-КО животных на генетический фон с высоким процентом спонтанных опухолей кишечника происходит увеличение срока жизни животных, уменьшается средний размер полипов в кишечнике. Таким образом, установлено, что без Каизо происходит замедление роста опухолей кишечника в APC(Min) моделях Напротив, при выключении гена Каизо в зиготах лягушки происходит апоптотическая смерть клеток эмбрионов на стадии нейрулы. В отличие от мыши, ген Каизо является необходимым для жизнедеятельности земноводных. Эти данные были подтверждены и на рыбах Danio Rerio . Получены линии клеток с множественными генетическими нокаутами генов MBD2, MeCP2 и Каизо. Показано, что белки MBD2, MeCP2 и Каизо оказывают синергетическое действие (репрессируют) метилированный промотор гена Xist . Показано, что мутации в гене Каизо не являются ключевыми в инициировании синдрома Ретта (нейродегенративное заболевание у девочек) , хотя другой метил ДНК связывающий белок MeCP2 напрямую вовлечен в эту патологию.

В геноме позвоночных найдены и охарактеризованы два гена, кодирующих белки ZBTB4 и ZBTB38, которые по своей аминокислотной последовательности и расположению консервативных доменов являются родственниками Каизо. Показано, что эти два белка являются метил ДНК зависимыми транскрипционными репрессорами.

Каизо подобный белок ZBTB4 расположен в метилированных участках гетерохроматина. Клетки без метилирования - мышиные эмбриональные фибробласты с генетической делецией генов dnmt1-/- и p53-/-. Клетки с нормальным уровнем метилирования - мышиные эмбриональные фибробласты p53-/-. В случае dnmt1-/- p53-/- клеток видно отсутствие корреляции между локализацией ZBTB4 в гетерохроматине (DAPI), в то время, как в p53-/- клетках видна полная ко-локализация ZBTB4 и гетерохроматина.

3. "Программируемый нокаут генов"

Следует отметить, что не все гены можно инактивировать на стадии зародыша. И, естественно, нельзя получить клетки или животных, нокаутированных по так называемым генам домашнего хозяйства. Однако для генов, принимающих участие в эмбриональном развитии, разработан подход, позволяющий проводить их инактивацию после развития организма. Данная стратегия позволяет "выключать" гены в определенных условиях ("программируемый нокаут генов", англ. conditional knockout), а именно в необходимой исследователю ткани или группе клеток и/или под воздействием индуцирующего вещества.

Это можно осуществить с помощью методики, сочетающей гомологичную рекомбинацию, как в случае классического нокаута генов, и системы сайт-специфической рекомбинации. Сайт-специфические рекомбиназы – это ферменты, узнающие особые участки ДНК и совершающие обмен между ними. Наиболее часто используются Cre рекомбиназа бактериофага P1 и Flp рекомбиназа (флипаза) дрожжей. Эти ферменты распознают нуклеотидные последовательности в 34 основания, называемые, соответственно, loxP и frt сайты . Если эти последовательности расположены в одной ориентации, рекомбинация по ним приведет к делеции фланкированного участка. Если же ориентация последовательностей различна, то это приведет к инверсии фрагмента между ними (рис. 5).

Рис. 5. Схема механизма сайт-специфической рекомбинации. В зависимости от ориентации loxP-сайтов происходит либо делеция, либо инверсия фланкированого фрагмента .

Использование стратегии "программируемого нокаута гена" требует создания двух линий мышей. Линия А несет интегрированную в геном последовательность гена Cre под контролем ткане-специфичного или индуцибельного промотора. Линия В содержит два loxP сайта, фланкирующих подлежащую удалению последовательность исследуемого гена (экзон, промотор и т.д.) . Следует отметить, что вставки в геномную последовательность loxP сайтов и гена Cre осуществляются с использованием тех же приемов, что и при классическом нокауте генов, но не должны затрагивать функциональные последовательности (рис. 6).

Рис. 6. Схема использования тканеспецифичной Cre-loxP рекомбинации для получения мышей с программируемым нокаутом гена .

Полученные таким образом гомозиготные линии мышей скрещивают. У потомков от этого скрещивания исследуемый ген будет инактивирован в ткани или группе клеток, где будет активен промотор, контролирующий активность гена Cre . Используя стратегию "программируемой инактивации гена", можно добиться результатов, недоступных при использовании стандартной процедуры нокаута генов.

4. Линии нок-аутных мышей

4.1 ФНО/ЛТ панель

Окраска шерсти: черные.

Происхождение: линии выведены в лаборатории молекулярной иммунологии ИМБ им. В. А. Энгельгардта РАН методом генетического нокаута и переведены на генетическую основу C57BL/6 путем возвратного скрещивания. Панель содержит линии мышей с модифицированным геном фактора некроза опухолей (ФНО) и лимфотоксина (ЛТ), подготовленные к тканеспецифической делеции гена, а также линии мышей с делецией гена ФНО или ЛТ специфично в макрофагах/нейтрофилах, либо в Т- или В-лимфоцитах, либо в клетках зародышевой линии.

Характеристика линии:

у мышей с полной делецией гена ФНО нарушена защита от ряда патогенов;

у мышей с полной делецией гена ЛТ-бета нарушена структура вторичных лимфоидных органов и антиген-специфическая продукция некоторых классов иммуноглобулинов.

Данные мыши представляют собой уникальную панель для изучения роли тканеспецифической продукции цитокинов семейства ФНО при врожденном и приобретенной иммунодефиците.

Ключевые публикации:

Tumanov et al. Distinct role of surface lymphotoxin expressed by B cells in the organization of secondary lymphoid tissues. Immunity. 2002 Sep;17(3):239-50.

Grivennikov et al. Distinct and nonredundant in vivo functions of TNF produced by t cells and macrophages/neutrophils: protective and deleterious effects. Immunity. 2005 Jan;22(1):93-104.

4.2 BALB/cMBD2

Окраска шерсти: белые.

Происхождение линии: линия получена в Эдинбургском Университете (Великобритания) в лаборатории Эдриана Бёрда (Adrian Bird) путем генетического нокаута гена MBD2 в мышах линии BALB/c..

Характеристика линии:

Особи женского пола имеют ослабленный материнский инстикт. У мышей наблюдается акселерация в развитии в раннем возрасте без акселерации в наборе массы тела. При переведении мутантного MBD2 локуса на генетический фон Min(APC) мышиной модели рака кишечника у животных возникает резистентность к злокачественной трансформации эпителиальных клеток.

Основные области использования:

изучение развития опухолей кишечника;

модель материнского поведения.

Линия BALB/cMBD2 используется в исследованиях, которые проводятся совместными усилиями Эдинбургского Университета и центра "Биоинженерия" РАН.

4.3 B6SJL-Tg(SOD1-G93A)dl1Gur/J

Окраска шерсти: разная: белая, коричневая, чёрная.

Происхождение: линия создана в лаборатории Mark E. Gurney при Северозападном университете США (Northwestern University, USA).

Метод модификации: трансгеноз. Трансгенные мыши G93A, экспрессируют мутантный человеческий ген Cu/Zn-супероксиддисмутазу SOD1 (Gly93/Ala; глицин замещён на аланин в позиции 93).

Характеристика линии: Трансгенные мыши G93A, экспрессирующие мутантный SOD1, характеризуются прогрессирующей дегенерацией мотонейронов, как при боковом амиотрофическом склерозе человека. Мыши становятся парализованными на одну или более конечностей в возрасте 6-7 месяцев. На фоне прогрессирования паралича скелетных мышц животные умирают через 4-6 недель после появления первых клинических признаков заболевания.

Основные области использования:

Боковой амиотрофический склероз

Нейропротекция

Подробности о данной линии животных: Gurney ME, Pu H, Chiu AY, Daly Canto MC, Polchow CY, Alexander DD, Caliendo J, Hentati A, Kwon YW, Deng HX, et al. 1994. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science 264:1772-5.

4.4 C 57 BL / MUC 2

Окраска шерсти: C57BL/MUC2

Происхождение: линия получена в Колледже им. Альберта Эйнштейна (Нью-Йорк, США) в группе Анны Велчич (Anna Velcich) путем генетического нокаута гена Mucin2 в мышах линии C57BL/6. В Питомник "Пущино" линия поступила в 2006 году.

Характеристика: В мышах этой линии нарушена морфология кишечных криптов. В течение 10 месяцев после рождения у мышей развиваются аденомы тонкого кишечника, которые прогрессируют затем в злокачественные аденокарциномы.

Подробности: Velcich et al., Colorectal cancer in mice genetically deficient in the mucin Muc2. Science. 2002 Mar 1;295(5560):1726-9.

Основные области использования: изучение развития опухолей кишечника

4.5 C57BL/6Kaiso

Окраска шерсти: черная.

Происхождение линии: линия получена в Эдинбургском Университете (Великобритания) в группе Егора Прохорчука путем генетического нокаута гена Kaiso в мышах линии C57BL/6.

Характеристика линии:

При переведении мутантного Kaiso локуса на генетический фон Min(APC) мышиной модели рака кишечника у животных возникает резистентность к злокачественной трансформации эпителиальных клеток.

Основные области использования:

изучение развития опухолей кишечника

5. Примеры использования нокаутированных мышей для изучения функций генов и наследственных заболеваний человека

Существует много примеров использования классического нокаута генов для изучения биологических функций индивидуальных генов или семейств генов. Рассмотрим лишь некоторые из них.

Изучение функций генов.

1) Ген Nuk, член семейства рецепторов тиронинкиназы, который был изучен с помощью делеций и модификаций. У мышей с отсутствием продукта этого гена нарушался контроль прорастания нейронов к клетке-мишени. Однако белок Nuk – трансмембранный белок. Чтобы дифференцировать роль внутриклеточных и внеклеточных доменов в миграции аксонов были модифицированы участки гена, кодирующие оба типа доменов. В результате этой работы было показано, что в прорастании аксонов к мишеням основную роль играет внутриклеточный домен белка Nuk .

2) Для изучения процессов созревания лимфоцитов была внесена точечная мутация (стоп-кодон) в ген α-цепи рецептора иммуноглобулина. Мутантные мыши имели незначительные дефекты в раннем развитии В-лимфоцитов, но сильные отклонения в созревании и функциях зрелых лимфоцитов .

3) Метод классического нокаута гена был использован и для получения партеногенетических мышей. Гены Igf2 и H19 – одни из основных импринтируемых генов млекопитающих, действующих в цис-положении и играющих ключевую роль в развитии организма. При этом для нормального развития необходимо наличие как отцовского, так и материнского набора хромосом. При развитии партеногенетических зародышей, получивших обе хромосомы от матери, ген Igf2 оказывается неактивен, что приводит к терминации развития. Делеция гена H19 в одной хромосоме позволила активировать ген Igf2 и получить условно партеногенетическое животное .

Модели генетических нарушений и заболеваний человека, созданные с использованием технологии нокаута генов.

1) Мутации гена TnI были обнаружены у пациентов с гипертрофической кардиомиопатией. Чтобы изучить влияние мутации в данном гене на развитие заболевания были созданы мыши с нокаутом по гену TnI. Гомозиготные нокаутированные животные умирали через 18 дней после рождения вследствие развившейся кардиомиопатии. Таким образом была доказана непосредственная связь мутации гена TnI с данным заболеванием .

2) Для изучения генетических основ развития алкоголизма было инактивировано 18 генов (альдегиддегидрогеназа, рецепторы дофамина, ГАМК-рецепторы, нейропептид Y и др.), предположительно участвующих в этом процессе. Все мутанты были охарактеризованы по поведенческим и фармакологическим тестам, что позволило оценить вклад изучаемых генов в развитие заболевания .

3) Большая работа с использованием методики нокаута генов проводилась с целью изучения функции опиоидной системы мозга. В обзорах проанализированы результаты работ по инактивации μ, δ и κ - опиоидных рецепторов, а также опиоидных пептидов (β-эндорфин, препроэнкефалин и препродинорфин).

4) Инактивация гена FMR-1 мыши позволила создать модель синдрома ломкой Х хромосомы и изучить отклонения в поведении животных и молекулярные механизмы заболевания .

5) С помощью нокаута была показана роль рецептора инсулина и внутриклеточных белков-мессенджеров в развитии диабета второго типа , роль цитокинов и хемокинов в развитии астмы и др. респираторных заболеваний . Также показано участие генетических факторов в развитии некоторых инфекционных заболеваний , участие NO синтазы в развитии атеросклероза , влияние продукта гена, кодирующего VI-a рецептор вазопрессина, на формирование социального поведения и поведения беспокойства у мышей .

Прежде ученые могли просто выявлять те или иные изменения в генетическом материале животных и пытаться с помощью отбора выделить "чистые линии" обладающих теми или иными особенностями мышей. Этот пассивный путь не давал и толики той свободы, которую исследователи обрели, научившись напрямую воздействовать на нужный ген.

Самое продуктивное использование этой технологии – "выключать" те или иные гены и смотреть, какое влияние оказало это выключение на организм животного. Таким образом можно точно установить функцию каждого гена, а значит, понять механизмы нормального развития организма и формирования определяемых наследственностью заболеваний – рака, диабета, болезней сердца и т.д.

Это "выключение" получило название "генетического нокаута" (gene knockout). В наследственном материале мышей, по современным представлениям, функционирует около двадцати тысяч генов, каждый из которых, упрощенно говоря, отвечает за какой-либо признак в организме животного. К моменту присуждения Капекки, Смитису и Эвансу нобелевской премии ученым удалось исследовать последствия выключения половины из них, то есть десяти тысяч. Как говорится в сообщении Нобелевского комитета, в ближайшем будущем генетики надеются провести последовательный нокаут каждого из мышиных генов.

Нокаут, таким образом, дает возможность "препарировать" каждое генетическое заболевание и каждый аспект нормального развития живого существа, что делает его универсальным методом, приложимым практически в любой сфере исследований.

Список литературы

1. Репин В.С. Эмбриональная стволовая клетка: от фундаментальной биологии к медицине // Успехи физиологических наук. - 2001. - Т. 32, №1. - С. 3-18

2. Тронько М.Д., Пушкарьов В.М. Механiзм дiї таксолу та перспективи його використання для лiку-вання злоякiсних пухлин щитоподiбної залози // Ендокринологiя. – 2003. – 8, № 2. – С. 228–243.

3. Пушкарьов В.М., Ковзун О. I., Тронько М.Д. та iн. Участь фосфоiнозитидiв, протеїнкiназ С та А упередачi регуляторного сигналу К+ в адренокортикальних клiтинах людини // Укр. бiохiм. журн. –2005. – 77, № 1. – С. 65–71.

4. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцрогенеза // Биохимия. – 2000. – 65, № 1. – С. 5–33.

5. Тронько М.Д., Левчук Н. I., Попадюк I.Д. та iн. Дiя протипухлинного препарату таксолу на клiтинианапластичного раку щитовидної залози // Доп. НАН України. – 2006. – № 8. – С. 204–206.

6. Фiляк Є., Фiляк О., Афанасьєв С., Стойка Р. Дефiцит гену бiлка секурину (PTTG) знижує рiвеньактивацiї Т лiмфоцитiв, iндукованої лектином // Експерим. та клiн. фiзiологiя та бiохiмiя. – 2006. –№ 4. – С. 18–24.

7. Фiляк Є., Держко I., Фiляк О., Стойка Р. Втрата гену бiлка секурину (PTTG) веде до пригнiчення активацiї Т-лiмфоцитiв // Мед. хiмiя. – 2007. – № 1. – С. 11–19.

8. Анисимов В.Н. Фактор времени в многостадийном канцерогенезе // Вопр.онкол.- 1990.- T. 36.- C. 771-784.

9. Анисимов В.Н. Канцерогенез и онтогенез: основные направления и результаты исследований // Вопр. онкологии. - 1997. - Т. 43, N 1. - С. 88- 94.

10. Анисимов В.Н. Роль индуцируемой 5-бромодезокcиуридином нестабильности генома в механизмах ускоренного старения и канцерогенеза // Успехи геронтологии. - 1997. -- Т. 1. - С. 50-56.

11. Бауэр Э.С. Теоретическая биология. - М.; Л.: Изд.-во Всесоюзного института экспериментальной медицины, 1935. - 206 с.

12. Газиев А.И., Подлуцкий А.Я. Бредбери Р. Увеличение с возрастом частоты спонтанных и индуцированных g-радиацией hprt-мутаций в лимфоцитах селезенки мышей // Докл. РАН. - 1994. - Т. 339. - С. 276-278.

14. Bardoni B., Mandel J.L., Fisch G.S. FMR1 gene and fragile X syndrome // Am. J. Med. Genet. - 2000. - Vol. 97, №2. - P. 153-163.

15. Bielsky I.F., Hu S.B., Szegda K.L., Westphal H., Young L.J. Profound impairment in social recognition and reduction in anxiety-like behavior in vasopressin V1a receptor knockout mice // Neuropsychopharmacology. - 2004. - Vol. 29, №3. - P. 483-493.

16. Capecchi M.R. Altering the genome by homologous recombination // Science. - 1989. - Vol. 244. - P. 1288-1292.

17. Chen L., Toth M. Fragile X mice develop sensory hyperreactivity to auditory stimuli // Neuroscience. - 2001. - Vol. 103, №4. - P. 1043-1050.

18. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos // Nature. - 1981. - Vol. 292, №5819. - P. 154-156.

19. Frankland P.W., Wang Y., Rosner B., Shimizu T., Balleine B.W., Dykens E.M., Ornitz E.M., Silva A.J. Sensorimotor gating abnormalities in young males with fragile X syndrome and Fmr1-knockout mice // Mol. Psychiatry. - 2004. - Vol. 9. - P. 417-425.

20. Henkemeyer M., Orioli D., Henderson J.T., Saxton T.M., Roder J., Pawson T., Klein R. Nuk controls pathfinding of commissural axons in the mammalian central nervous system // Cell. - 1996. - Vol. 86. - P. 35-46.

21. Kawashima S., Yokoyama M. Dysfunction of endothelial nitric oxide synthase and atherosclerosis // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2004. - Vol. 24, №6. - P. 998-1005

22. Kieffer B.L., Gaveriaux-Ruff C. Exploring the opioid system by gene knockout // Prog. Neurobiol. - 2002. - Vol. 66, №5. - P. 285-306.

23. Kilby N.J., Snaith M.R., Murray J.A.H. Site-specific recombinases: tools for genome engineering // Trends Genet. - 1993. - Vol. 9. - P.413-421.

24. Kono T., Obata Y., Wu Q., Niwa K., Ono Y., Yamamoto Y., Park E.S., Seo J.S., Ogawa H. Birth of parthenogenetic mice that can develop to adulthood // Nature. - 2004. - Vol. 428, №6985. - P. 860-864.

25. Loebel D.A., Tam P.P. Genomic imprinting: mice without a father // Nature. - 2004. - Vol. 428, №6985. - P. 809-811.

26. Mansour S.L., Thomas K.R., Capecchi M.R. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes // Nature. - 1988. - Vol. 336, №6197. - P. 348-352.

27. Reeves R.H. Exploring development and disease through germ-line genetic engineering in the mouse // Anat. Rec. - 1998. - Vol. 253, №1. - P. 19-23.

28. Thomas K.R., Capecchi M.R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells // Cell. - 1987. - Vol. 51, №3. - P. 503-512.

29. Vasquez Y.R., Spina D. What have transgenic and knockout animals taught us about respiratory disease? // Respir. Res. - 2000. - Vol. 1, №2. - P. 82-86.

30. Volarevic S., Pende M., Pullen N. Manipulating mammalian genome by gene targeting // Croat. Med. J. - 1999. - Vol. 40, №3. - P. 368-374.

* Газиев А.И., Подлуцкий А.Я. Бредбери Р. Увеличение с возрастом частоты спонтанных и индуцированных g-радиацией hprt-мутаций в лимфоцитах селезенки мышей // Докл. РАН. - 1994. - Т. 339. - С. 276-278.

В настоящее время биотехнология и биоинформатика в комбинации с классической биохимией и генетикой являются мощным инструментом для анализа уже имеющейся последовательности генома человека и модельных организмов. Но настоящий прорыв в области направленных мутаций был осуществлен благодаря использованию феномена гомологичной рекомбинации между сравнительно небольшим участком экзогенной и клеточной ДНК. Данный метод получил название направленной инактивации гена или нокаут гена (от англ. knockout, синоним – gene targeting). Зная последовательность изучаемого гена человека, стало возможно посредством инактивации гомологичного гена у модельного организма определить биохимическую и физиологическую роль его продукта. Поскольку значительное число болезней человека в своей основе имеет наследственный компонент, модели заболеваний, созданные с использованием этой стратегии, позволяют расширить наше понимание биохимии и физиологии наследственных патологий и приведут к созданию новых подходов к лечению.

Метод генетического нокаута

а) мышь – хорошо изученный и доступный объект;

б) геном мыши и человека содержит приблизительно одинаковое число генов;

в) сходство аминокислотных последовательностей всех белков человека и мыши составляет около 90%.

Однако основной причиной использования мыши в качестве модели для инактивации гена является возможность изолирования эмбриональных стволовых клеток, в которых любой ген может быть модифицирован. Клеточные линии, содержащие модифицированный ген, могут быть привнесены в развивающийся зародыш, что позволяет получить химерное животное, несущее искусственно созданную мутацию (рис. 1).

Рис. 1. Стратегия получения линии нокаутированных мышей
(по книге Тронько М.Д., Левчук Н. I., Попадюк I.Д. та iн. Дiя протипухлинного препарату таксолу на клiтинианапластичного раку щитовидної залози // Доп. НАН України. – 2006. – № 8. – С. 204–206. ).

Метод нокаута/нокина генов (т.е. удаления или добавления определенного гена или генов в геном организма) - это метод получения клеток или целых организмов (мышей), в которых целенаправленно разрушен определенный ген или встроен дополнительный ген. Для осуществления подобного необходимо иметь:

клонированный заданный ген;
два «методических» гена для селекции искомых клеток с удачно инактивированным геном и соответствующую селективную среду культивирования;
особую уникальную линию перевивных стволовых эмбриональных мышиных клеток - ES (embryonic stem cell line), сохраняющих способность дифференцироваться в надлежащих условиях во все типы клеток организма мыши, включая гаметы;
здоровых мышей и трудолюбие примерно на год упорной работы.

Эванс, Кауфман и соавт. опубликовали в «Nature» работу о выведении перевиваемой (трансформированной) линии эмбриональных стволовых клеток - ES (embryonic stem cells). Независимо от них аналогичную работу выполнил G. Martin и опубликовал ее в том же 1981 г. в PNAS. Эти перевивные линии клеток авторы получили из эмбрионов мышей на самых ранних стадиях развития - стадиях бластулы, выводя их в культуру на подслой фидерных клеток - эмбриональных фибробластов в присутствии факторов, подавляющих диф- ференцировку (например, L1F - leukemia inhibitory factor).
Позже разные авторы вывели несколько линий и сублиний ES (D3, ССЕ, АВ-1, E14TG2a, Л, R1, НМ-1 и др.). Данные клетки используют для создания мутантных мышей - с отсутствием определенного гена (генетический нокаут) или с введением лишнего гена (генетический нокин) в исследовательских целях. Массовый характер работы по генетическому нокауту приняли с 1991 г. Работы по выведению эмбриональных стволовых клеток человека имеют место, но в настоящее время такие работы «не принимают» в ответственном научном сообществе по двум причинам:

всегда подозревается трансформированность перевиваемых in vitro клеток, т.е. возможность их опухолевого перерождения, что для подавляющего большинства биологов и медиков является абсолютным запретом на применение эмбриональных стволовых клеток у людей;
в настоящее время нет благоразумных аргументов для оправдания работ по созданию запланированных кем бы то ни было людей-мутантов, аналогичных мышам с генетическим нокаутом или нокином.

Методики удаления/встраивания генов основаны на природном феномене гомологичной рекомбинации. При половом размножении живых организмов природа «предусмотрела» мейоз и кроссинговер в мейозе, при котором происходят физическое сближение гомологичных генов в гомологичных хромосомах и обмен участками ДНК между гомологичными генами. Оказывается, если в клетку ввести отдельный ген, то он тоже в состоянии найти в хромосомах гомологичный себе ген (одноименный) и вступить с ним в гомологичную рекомбинацию, т.е. произвести обмен участками ДНК. Для направленного мутагенеза (или нокаута) заданного гена в клетку вводят не интактный гомологичный ген, а умышленно поврежденный. Дальше все происходит по природным механизмам: поврежденный, но гомологичный экзоген находит одноименный интактный клеточный ген, вступает с ним в гомологичную рекомбинацию, и в результате в хромосоме на месте прежнего интактного гена появляется поврежденный «подлог». Цель достигнута.
Учитывая выдающиеся возможности этой методики, опишем ее подробнее. В качестве «методических» генов используют обычно два - ген резистентности к неомицину пеог и ген вирусной тимидинкиназы из вируса простого герпеса HSV-tk. Если в некой клетке есть ген пео\ то такая клетка способна жить в присутствии препарата - аналога неомицина G418. Клетки, не имеющие гена пео\ погибают в присутствии G418. Если в клетке есть вирусный ген HSV-tk, то такая клетка погибнет при добавлении в среду культивирования противовирусного препарата ганцикловира. Клеткам, не имеющим гена HSV-tk, ганцикловир не страшен.
Сначала в ДНК препарата заданного гена (т.е. in vitro), примерно в середину последовательности, встраивают ген пео\ Сбоку на некотором расстоянии помещают ген HSV-tk. Это и есть экзогене- тическая конструкция, необходимая и достаточная для попытки направленного мутагенеза в какой-либо клетке. Для «создания» целой мыши без заданного гена используют клетки линии ES. В них трансфицируют описанную выше генетическую конструкцию, клетки помещают в селективную культуральную среду, содержащую G418 и ганцикловир.
Возможны 3 варианта внутриклеточной «судьбы» экзогенетиче- ской конструкции:

она не встраивается в хромосомы и бесследно теряется при делении клетки; такие клетки, просто ES, погибают в селективной среде от отравления препаратом G418;
экзогенетическая конструкция встраивается на случайные места в геноме; она, как правило, сохраняет свою целостность, несет и ген пео\ и ген HSV-tk\ такие клетки тоже погибают в селективной среде, но под действием ганцикловира;
экзогенетическая конструкция находит гомологичный клеточный ген и вступает с ним в гомологичную рекомбинацию: эти клетки и есть искомые; «хвост» с геном HSV-tk (он вне гомологичной области) выщепляется и теряется при делении клетки; ген пео\ поскольку он расположен в середине гомологичной последовательности ДНК, как раз оказывается встроенным в хромосому; в результате искомые клетки несут ген пеот, но не несут ген HSV-tk и поэтому способны жить и делиться в селективной среде, содержащей и G418, и ганцикловир; такие клетки и выделяют из массы остальных.

В описанном варианте направленный мутагенез, или нокаут гена, произошел на одной из гомологичных хромосом. Его можно выполнить и на обеих гомологичных хромосомах, для чего нужны еще два других «методических» гена для селекции. Но мышей с нокаутом гена можно получить и в случае нокаута одного из гомологичных генов в клетках ES следующим образом. От «свежезабеременевшей» мыши выделяют эмбрионы на стадии бластулы или морулы (или проводят оплодотворение in vitro). В эти ранние эмбрионы инъецируют одномутированные клетки ES и имплантируют их в матку подготовленной псевдобеременной самке. Из такой сконструированной бластулы развиваются здоровые (по мышиным меркам) эмбрионы, рождаются мышата-мозаики, часть клеток которых во всех тканях, включая половые клетки, происходит из одномутированных клеток ES. Поскольку половые клетки гаплоидны, то часть из них несет в «чистом виде» нокаутированный ген.
Подобных мышат используют для инбредного размножения, и в потомстве второго поколения какая-то часть мышат обязательно получается гомозиготной по нокаутированному (испорченному) гену. Это и есть конечная цель работы. Чтобы удостовериться в правильности полученного результата, выполняют контрольную ПЦР на ген пеот.
Таких мышей размножают инбридингом и получают необходимое и достаточное для запланированной работы число особей с заданным генетическим нокаутом (т.е. с отсутствием функционально дееспособного гена).
Генетический нокаут возможен только в отношении генов, отсутствие которых позволяет организму развиться, родиться и начать жить. Если какой-то ген абсолютно необходим для реализации онтогенеза организма, то нокаут по данному гену осуществим в перевиваемых in vitro клетках, и в какой-то мере на моделях in vitro исследуемы последствия отсутствия гена для жизнедеятельности клетки.
Вышеперечисленным потенциал метода не исчерпывается. Можно получить библиотеку экзогенов, в которых «методический» ген (а именно его внедрение и нарушает генетический код, т.е. является мутирующим фактором) повреждает разные участки исследуемого гена. Одним из генов библиотеки производят нокаут. Затем в отдельные «нокаутированные» клетки трансфицируют интактный ген (если происходит реставрация экспрессии соответствующего белка, то она доказывает «от противного»: исходно сделанный нокаут был истинным), а также (по одному) разные гены из библиотеки поврежденных генов. Анализируют, не произойдет ли реставрация экспрессии продукта в случае ретрансфекции каких-то генов из поврежденных. Таким образом, удается установить функциональную нагрузку различных участков одного гена.
Существенные усовершенствования в методы генетического нокаута внесли работы В. Sauer (1993), N.J. Kilby и соавт. (1993), Н. Gu и К. Rajewsky (1993) и других исследователей, первыми использовавших сайтспецифичную рекомбиназу Cre (Causes recombination), выделенную Sauer из бактериофага Р1. Если в геном мыши ввести ранее описанным методом «слева» и «справа» от интересующего гена сайты, специфичные для Сге, то вырезание гена (точнее, его инверсию и как следствие потерю функции) можно осуществить не в клетках ES, а в любой момент онтогенеза, т.е. у мышей в любом возрасте. Последовательность нуклеотидов, узнаваемая Сге, носит название LoxP (locus of X-over PI) и состоит из 34 пар оснований, включающих 13 пар инвертированных повторов по краям: ATAACTTGGTATA- GCATACAT-TATACGAAGTTAT.
Систему «LoxP-Сге» используют и в модели трансгенных мышей. Таким образом, существуют способы тканеспецифичного выключения заданного гена в заданный момент онтогенеза. Это весьма трудоемкие работы, но их познавательная ценность сегодня кажется огромной.
Трансгенная мышь есть мышь, в чей геном введен посторонний ген (экзоген). Чтобы «сделать» трансгенную мышь, необходимо иметь в качестве препарата чистую ДНК, строго воспроизводящую последовательность нуклеотидов заданного экзогена (как минимум). Обычно к ДНК экзогена с определенным смыслом пристраивают еще регуляторные последовательности ДНК-промоторы и энхансеры. Получают вектор экспрессии в виде кольцевой ДНК (фактически - искусственный вирус).
«Готовят» мышь-самку: ей вводят фолликулостимулирующий гормон и хорионический гонадотропин для индукции суперовуляции. Такую самку спаривают с самцом, после чего у самки быстро извлекают оплодотворенные яйцеклетки. Микроманипулятором в мужской пронуклеус инъецируют ДНК экзогена в дозе несколько сот копий, и такие яйцеклетки имплантируют в матку или яйцеводы другой подготовленной псевдобеременной самки. И ждут от нее потомства. Опыт показывает, что примерно 25% новорожденных мышат несут

экзоген (теперь уже трансген) в своем геноме. Экзогены ковалентно встраиваются (интегрируются) в одно или в несколько десятков мест собственного генома мыши (кстати, как ретровирусы типа ВИЧ). Если в собственном геноме нет генов, гомологичных экзогену, то встраивание экзогена происходит в случайные места генома.
Встраивание осуществляется очень быстро после ввода экзогенной ДНК в пронуклеус - до первой репликации ДНК зиготы, так как большинство мышей, получивших экзоген (75%), имеют его в каждой клетке своего тела, включая гаметы. Интересно, но факт: встраивание чужеродной ДНК в геном в большинстве случаев допускает нормальное развитие и рождение организма, разумеется, если трансген не кодирует синтез токсичного для организма белка. В первом поколении мышей трансген находится в гетерозиготном состоянии. Таких мышей спаривают, и во втором поколении отбирают гомозигот по трансгену. Вот они уже и есть полноценные трансгенные мыши.
Дополнение трансгена тканеспецифичными и/или индуцибель- ными промоторами позволяет манипулировать экспрессией трансгена по усмотрению экспериментатора (не во всех клетках; а только, например, в Т-лимфоцитах или только в р-клетках островков Лангерганса, не постоянно, а только после введения в организм индуктора). Таким образом, можно изучать как будут проходить развитие и жизнедеятельность организма при излишней экспрессии определенного гена (overexpression).