В этом разделе представлены инструкции по применению интерферонов альфа 2b и альфа 2a первого поколения, которые еще называют линейными, простыми или короткоживущими. Единственное преимущество этих прераратов - это сравнительно низкая цена.

В далеком 1943 году В. и Дж. Хейле открыли так называемый феномен интерферирования. Первоначальное представление об интерфероне было таким: фактор, препятствующий размножению вирусов. В 1957 году английский ученый Алик Айзакс и швейцарский исследователь Джин Линденман выделили этот фактор, четко описали его и назвали интерфероном.

Интерферон (ИФН) - это белковая молекула, которая вырабатывается в организме человека. В генетическом аппарате человека закодирован «рецепт» ее синтеза (ген интерферона). Интерферон - это один из цитокинов, сигнальных молекул, играющих важную роль в работе иммунной системы.

За прошедшие со времени открытия ИФН полвека были изучены десятки свойств этого белка. С медицинской точки зрения главными являются противовирусная и противоопухолевая функции.

В организме человека вырабатывается около 20 видов - целое семейство - интерферонов. ИФН подразделяют на два типа: I и II.

ИФН I типа - альфа, бета, омега, тета - продуцируются и секретируются большинством клеток организма в ответ на действие вирусов и некоторых других агентов. К ИФН II типа относится интерферон гамма, который продуцируется клетками иммунной системы в ответ на действие чужеродных агентов.

Вначале препараты интерферона получали только из клеток донорской крови; они так и назывались: лейкоцитарные интерфероны. В 1980 году началась эпоха рекомбинантных, или генно-инженерных, интерферонов. Производство рекомбинантных препаратов стало значительно дешевле, чем получение аналогичных препаратов из донорской крови человека или другого биологического сырья; при их производстве не используется донорская кровь, которая может служить источником инфекции. Рекомбинантные препараты не содержат посторонних примесей и поэтому оказывают меньше побочных эффектов. Их лечебный потенциал выше, чем уаналогичных природных препаратов.

Для лечения вирусных заболеваний, в частности гепатита C , используется преимущественно интерферон альфа (ИФН-α ). Различают «простые» («короткоживущие») интерфероны альфа 2b и альфа 2a и пегилированные (пегинтерферон альфа-2a и пегинтерферон альфа-2b). «Простые» интерфероны в ЕС и США практически не применяются, однако у нас, в силу их сравнительной дешевизны, используются довольно часто. В терапии гепатита С применяются обе формы «коротких» ИФН-α : интерферон альфа-2a и интерферон альфа-2b (различающиеся одной аминокислотой). Инъекции простыми интерферонами делаются обычно через день (пегинтерферонами - раз в неделю). Эффективность лечения короткоживущими ИФН при вводе их через день ниже, чем пегинтерферонами. Некоторые специалисты рекомендуют ежедневные инъекции «простых» ИФН, так как при этом эффективность ПВТ при этом несколько выше.

Ассортимент «коротких» ИФН довольно широк. Они выпускаются разными производителями под разными названиями: Роферон-А, Интрон А, Лаферон,Реаферон-ЕС,Реальдирон, Эберон,Интераль,Альтевир,Альфарона и другими.
Наиболее исследованными (соответственно, - дорогими), являются Роферон-А и Интрон-А. Эффективность лечения данными ИФН в комбинации с рибавирином, в зависимости от генотипа вируса и других факторов, составляет от 30% до 60%. Список основных торговых марок производителей простых интерферонов и их описание приведены в таблице.

Все интерфероны должны храниться в охлажденном состоянии (от +2 до +8 градусов Цельсия). Их нельзя нагревать или замораживать. Не встряхивайте и не подвергайте препарат действию прямых солнечных лучей. Перевозить препараты необходимо в специальных контейнерах.

Форма выпуска, состав и упаковка

Раствор для инъекций прозрачный, бесцветный.

Вспомогательные вещества:

0.5 мл - ампулы (5) - упаковки ячейковые контурные (1) - пачки картонные.
0.5 мл - ампулы (5) - упаковки ячейковые контурные (2) - пачки картонные.
0.5 мл - флаконы (1) - пачки картонные.
0.5 мл - флаконы (5) - упаковки ячейковые контурные (1) - пачки картонные.
0.5 мл - шприцы стеклянные (1) - упаковки ячейковые контурные (1) - пачки картонные.
0.5 мл - шприцы стеклянные (1) - упаковки ячейковые контурные (3) - пачки картонные.
0.5 мл - шприцы стеклянные (3) - упаковки ячейковые контурные (1) - пачки картонные.
0.5 мл - шприцы стеклянные (3) - упаковки ячейковые контурные (3) - пачки картонные.

Раствор для инъекций прозрачный, бесцветный.

Вспомогательные вещества: натрия ацетат, натрия хлорид, этилендиамин тетрауксусной кислоты динатриевая соль, твин-80, декстран 40, вода д/и.

1 мл - ампулы (5) - упаковки ячейковые контурные (1) - пачки картонные.
1 мл - ампулы (5) - упаковки ячейковые контурные (2) - пачки картонные.
1 мл - флаконы (1) - пачки картонные.
1 мл - флаконы (5) - упаковки ячейковые контурные (1) - пачки картонные.
1 мл - шприцы стеклянные (1) - упаковки ячейковые контурные (1) - пачки картонные.
1 мл - шприцы стеклянные (1) - упаковки ячейковые контурные (3) - пачки картонные.
1 мл - шприцы стеклянные (3) - упаковки ячейковые контурные (1) - пачки картонные.
1 мл - шприцы стеклянные (3) - упаковки ячейковые контурные (3) - пачки картонные.

Клинико-фармакологическая группа

Фармакологическое действие

Интерферон. Альтевир ® оказывает противовирусное, иммуномодулирующее антипролиферативное и противоопухолевое действие.

Интерферон альфа-2b, взаимодействуя со специфическими рецепторами на поверхности клетки, инициирует сложную цепь изменений внутри клетки, включающую в себя индукцию синтеза ряда специфических цитокинов и ферментов, нарушает синтез вирусной РНК и белков вируса в клетке. Результатом этих изменений является неспецифическая противовирусная и антипролиферативная активность, связанная с предотвращением репликации вируса в клетке, торможением пролиферации клеток и иммуномодулирующим действием интерферона. Интерферон альфа-2b стимулирует процесс презентации антигена иммунокомпетентным клеткам, обладает способностью стимулировать фагоцитарную активность макрофагов, а также цитотоксическую активность Т-клеток и ""натуральных киллеров"", участвующих в противовирусном иммунитете.

Предотвращает пролиферацию клеток, особенно опухолевых. Оказывает угнетающее влияние на синтез некоторых онкогенов, приводящее к ингибированию опухолевого роста.

Фармакокинетика

Всасывание

При п/к или в/м введении интерферона альфа-2b его биодоступность составляет от 80% до 100%. После введения интерферона альфа-2b Т max в плазме крови составляет 4-12 ч, T 1/2 - 2-6 ч. Через 16-24 ч после введения рекомбинантный интерферон в сыворотке крови не определяется.

Метаболизм

Метаболизм осуществляется в печени.

Интерфероны альфа способны нарушать окислительные метаболические процессы, снижая активность микросомальных ферментов печени системы цитохрома Р450.

Выведение

Выводится в основном почками путем клубочковой фильтрации.

Показания к применению препарата

В составе комплексной терапии у взрослых:

— при хроническом вирусном гепатите В без признаков цирроза печени;

— при хроническом вирусном гепатите С в отсутствии симптомов печеночной недостаточности (монотерапия или комбинированная терапия с рибавирином);

— при папилломатозе гортани;

— при остроконечных кондиломах;

— при волосатоклеточном лейкозе, хроническом миелолейкозе, неходжкинской лимфоме, меланоме, множественной миеломе, саркоме Капоши на фоне СПИД, прогрессирующем раке почки.

Режим дозирования

Применяют п/к, в/м и в/в. Лечение должно быть начато врачом. Далее с разрешения врача пациент может вводить себе поддерживающую дозу самостоятельно (в случаях, когда препарат назначен п/к или в/м).

Хронический гепатит В: Альтевир ® вводят п/к или в/м в дозе 5-10 млн. ME 3 раза в неделю в течение 16-24 недель. Лечение прекращают после 3-4 месяцев применения при отсутствии положительной динамики (по данным исследования ДНК вируса гепатита В).

Хронический гепатит С: Альтевир ® вводят п/к или в/м в дозе 3 млн. ME 3 раза в неделю в течение 24-48 недель. У пациентов с рецидивирующим течением заболевания и больных, ранее не получавших лечение интерфероном альфа-2b, эффективность лечения увеличивается при комбинированной терапии с рибавирином. Продолжительность комбинированной терапии составляет не менее 24 недель. Терапию Альтевиром следует проводить 48 недель больным хроническим гепатитом С и 1-м генотипом вируса с высокой вирусной нагрузкой, у которых к концу первых 24 недель лечения в сыворотке крови не определяется РНК вируса гепатита С.

Папилломатоз гортани: Альтевир ® вводят п/к в дозе 3 млн. МЕ/м 2 3 раза в неделю. Лечение начинают после хирургического (или лазерного) удаления опухолевой ткани. Дозу подбирают с учетом переносимости препарата. Достижение положительного ответа может потребовать проведения лечения в течение 6 месяцев.

Волосатоклеточный лейкоз: рекомендуемая доза Альтевира для п/к введения пациентам после спленэктомии или без нее составляет 2 млн. МЕ/м 2 3 раза в неделю. В большинстве случаев нормализация одного и более гематологических показателей наступает через 1-2 месяца лечения, возможно увеличение сроков лечения до 6 месяцев. Этого режима дозирования следует придерживаться постоянно, если при этом не происходит быстрого прогрессирования заболевания или возникновения симптомов тяжелой непереносимости препарата.

Хронический миелолейкоз: рекомендуемая доза Альтевира в качестве монотерапии - 4-5 млн. МЕ/м 2 в день п/к ежедневно. Для поддержания числа лейкоцитов может потребоваться применение в дозе 0.5-10 млн. МЕ/м 2 . Если лечение позволяет добиться контроля числа лейкоцитов, то для поддержания гематологической ремиссии препарат следует применять в максимальной переносимой дозе (4-10 млн. МЕ/м 2 ежедневно). Препарат необходимо отменить через 8-12 недель, если терапия не привела к частичной гематологической ремиссии или клинически значимому снижению числа лейкоцитов.

Неходжкинская лимфома: Альтевир ® применяют в качестве адъювантной терапии в комбинации со стандартными схемами химиотерапии. Препарат вводят п/к в дозе 5 млн. МЕ/м 2 3 раза в неделю в течение 2-3 месяцев. Дозу необходимо корректировать в зависимости от переносимости препарата.

Меланома: Альтевир ® применяют в качестве адъювантной терапии при имеющемся высоком риске рецидива у взрослых после удаления опухоли. Альтевир ® вводят в/в в дозе 15 млн. МЕ/м 2 5 раз в неделю в течение 4 недель, затем п/к в дозе 10 млн. МЕ/м 2 3 раза в неделю в течение 48 недель. Дозу необходимо корректировать в зависимости от переносимости препарата.

Множественная миелома : Альтевир ® назначают в период достижения устойчивой ремиссии в дозе 3 млн. МЕ/м 2 3 раза в неделю п/к.

Саркома Капоши на фоне СПИД: оптимальная доза не установлена. Препарат можно применять в дозах 10-12 млн. МЕ/м 2 /сут п/к или в/м. В случае стабилизации заболевания или ответа на лечение, терапию продолжают до тех пор, пока не произойдет регресс опухоли или не потребуется отмена препарата.

Рак почки: оптимальная доза и схема применения не установлены. Рекомендуется применять препарат п/к в дозах от 3 до 10 млн. МЕ/м 2 3 раза в неделю.

Приготовление раствора для в/в введения

Набирают объем раствора Альтевира, необходимый для приготовления требуемой дозы, добавляют к 100 мл стерильного 0.9% раствора натрия хлорида и вводят в течение 20 мин.

Побочное действие

Общие реакции: очень часто - лихорадка, слабость (являются дозозависимыми и обратимыми реакциями, исчезают в течение 72 ч после перерыва в лечении или его прекращения), озноб; менее часто - недомогание.

Со стороны ЦНС: очень часто - головная боль; менее часто - астения, сонливость, головокружение, раздражительность, бессонница, депрессия, суицидальные мысли и попытки; редко - нервозность, тревожность.

Со стороны костно-мышечной системы: очень часто - миалгия; менее часто - артралгия.

Со стороны пищеварительной системы: очень часто - снижение аппетита, тошнота; менее часто - рвота, диарея, сухость во рту, изменение вкуса; редко - боль в животе, диспепсия; возможно обратимое повышение активности печеночных ферментов.

Со стороны сердечно-сосудистой системы: часто - снижение АД; редко - тахикардия.

Дерматологические реакции: менее часто - алопеция, повышенное потоотделение; редко - кожная сыпь, кожный зуд.

Со стороны системы кроветворения : возможны обратимые лейкопения, гранулоцитопения, снижение уровня гемоглобина, тромбоцитопения.

Прочие: редко - снижение массы тела, аутоиммунный тиреоидит.

Противопоказания к применению препарата

— тяжелые сердечно-сосудистые заболевания в анамнезе (неконтролируемая хроническая сердечная недостаточность, недавно перенесенный инфаркт миокарда, выраженные нарушения сердечного ритма);

— тяжелая почечная и/или печеночная недостаточность (в т.ч. вызванная наличием метастазов);

— эпилепсия, а также тяжелые нарушения функций ЦНС, особенно выражающиеся депрессией, суицидальными мыслями и попытками (в т.ч. в анамнезе);

— хронический гепатит с декомпенсированным циррозом печени и у больных, получающих или получавших недавно лечение иммунодепрессантами (за исключением завершенного кратковременного курса лечения ГКС);

— аутоиммунный гепатит или иное аутоиммунное заболевание;

— лечение иммунодепрессантами после трансплантации;

— заболевание щитовидной железы, не поддающееся контролю общепринятыми терапевтическими методами;

— декомпенсированные заболевания легких (в т.ч. ХОБЛ);

— декомпенсированный сахарный диабет;

— гиперкоагуляция (в т.ч. тромбофлебит, тромбоэмболия легочной артерии);

— выраженная миелодепрессия;

— беременность;

— период лактации (грудного вскармливания);

— повышенная чувствительность к компонентам препарата.

Применение препарата при беременности и кормлении грудью

Препарат противопоказан при беременности и в период лактации (грудного вскармливания).

Применение при нарушениях функции печени

Применение при нарушениях функции почек

Препарат противопоказан при тяжелой почечной и/или печеночной недостаточности (в т.ч. вызванными наличием метастазов).

Особые указания

До лечения Альтевиром хронического вирусного гепатита В и С рекомендуется провести биопсию печени, чтобы оценить степень повреждения печени (признаки активного воспалительного процесса и/или фиброза). Эффективность лечения хронического гепатита С увеличивается при комбинированной терапии Альтевиром и рибавирином. Применение Альтевира не эффективно при развитии декомпенсированного цирроза печени или печеночной комы.

В случае возникновения побочных эффектов во время лечения Альтевиром дозу препарата следует снизить на 50% или временно отменить препарат до их исчезновения. Если побочные эффекты сохраняются или возникают вновь после снижения дозы, или наблюдается прогрессирование заболевания, то лечение Альтевиром следует прекратить.

При снижении уровня тромбоцитов ниже 50x10 9 /л или уровня гранулоцитов ниже 0.75x10 9 /л рекомендуется уменьшение дозы Альтевира в 2 раза с контролем анализа крови через 1 неделю. Если указанные изменения сохраняются, то препарат следует отменить.

При снижении уровня тромбоцитов ниже 25x10 9 /л или уровня гранулоцитов ниже 0.5 х10 9 /л рекомендуется отмена препарата Альтевир ® с контролем анализа крови через 1 неделю.

У пациентов, получающих препараты интерферона альфа-2b, в сыворотке крови могут определяться антитела, нейтрализующие его противовирусную активность. Практически во всех случаях титры антител невысоки, их появление не приводит к снижению эффективности лечения или возникновению других аутоиммунных нарушений.

Передозировка

Данные по передозировке препарата Альтевир ® не предоставлены.

Лекарственное взаимодействие

Лекарственное взаимодействие между Альтевиром и другими лекарственными средствами полностью не изучено. С осторожностью следует применять Альтевир ® одновременно со снотворными и седативными средствами, наркотическими анальгетиками и препаратами, потенциально оказывающими миелодепрессивный эффект.

При одновременном назначении Альтевира и теофиллина следует контролировать концентрацию последнего в сыворотке крови и при необходимости изменять режим его дозирования.

При применении Альтевира в комбинации с химиотерапевтическими препаратами (цитарабин, циклофосфамид, доксорубицин, тенипозид) повышается риск развития токсических эффектов.

Условия отпуска из аптек

Препарат отпускается по рецепту.

Условия и сроки хранения

Препарат следует хранить в недоступном для детей месте, в соответствии с СП 3.3.2-1248-03 при температуре от 2° до 8°С; не замораживать. Срок годности - 18 месяцев.

Транспортировать при температуре от 2° до 8°С; не замораживать.

2018-02-02T17:43:00+03:00

Доказанная эффективность интерферона альфа 2b

Впервые об интерфероне – естественном белке организма человека мир узнал в 1957 году, когда ученые Алик Айзекс и Жан Линденманн открыли такое явление, как интерференция – сложный механизм биологических процессов, благодаря которому организм способен бороться с различными заболеваниями. Но в прошлом веке наверняка не подозревали, что этот белок станет главной составляющей многих лекарственных препаратов.

Интерфероны – это белки, которые вырабатываются клетками организма при внедрении в них вирусов. Благодаря им происходит активация генов, отвечающих за синтез защитных внутриклеточных молекул, которые обеспечивают противовирусное действие путем подавления синтеза белков вируса и препятствия его размножения. Другими словами, эти белки (их еще называют цитокинами) в нашем организме выступают в роли мощных защитников, которые стоят на страже здоровья и строго бдят, чтобы в случае необходимости сразу же отразить атаку вирусов и победить заболевание.

Для защиты зараженного вирусами организма интерферон вырабатывается практически всеми клетками нашего организма. Кроме того, его образование могут стимулировать не только вирусы, но и бактериальные токсины, поэтому этот белок эффективен и при некоторых бактериальных инфекциях. Таким образом можно сделать вывод, что этот цитокин является очень важным компонентом иммунной системы человека. Без него человечество давно бы победили многочисленные вирусы и бактерии.

Виды интерферонов

Интерфероны разделяют на три типа: альфа, бета и гамма, которые продуцируют разные клетки.

• Интерферон alpha активизирует так называемые естественные киллеры – лейкоциты, которые уничтожают вирусы, бактерии и другие «вражеские» агенты.
• Интерферон бета образуется в фибробластах, клетках эпителия и макрофагах, которые поглощают возбудителей инфекции.
• Интерферон гамма продуцируется Т-лимфоцитами, главная его функция, так же как и других видов – регуляция иммунитета.

Чем доказана эффективность интерферона при ОРВИ?

Как известно, в своей деятельности при назначении терапии врачи полагаются на свой опыт и уже сложившуюся систему знаний. Но медицина стремительно развивается: каждый год в мире разрабатываются новые эффективные методики лечения и патентуются новые лекарства. Поэтому возникла необходимость в систематизации новейших достижений и открытий в медицине, результатом чего явились клинические рекомендации и стандарты лечения. Эти задокументированные алгоритмы, основанные на доказанном клиническом опыте, описывают необходимые для выполнения инструкции по диагностике, лечению, реабилитации, профилактике заболеваний и помогают врачу принимать решения по выбору тактики терапии в той или иной ситуации.

Например, по вопросам оказания медицинской помощи детям по проблеме ОРВИ и гриппа группа разработчиков насчитывает примерно 40 человек и включает ведущих специалистов России в области инфекционных болезней из разных учреждений и различных ведомств. Логично, что особое внимание специалисты уделяют медицинским препаратам, которые способны максимально быстро справляться с заболеваниями и при этом обладают минимумом побочных эффектов. Сейчас речь идет о препаратах с содержанием интерферона, которые помогают бороться с ОРВИ у взрослых и детей.

Как упоминалось выше, их способность бороться с вирусами была открыта при изучении интерференции учеными Айзексом и Линденманном. Они описывали интерферон как «белок, значительно меньший, чем им­муноглобулины, который производится клетками организма после заражения живыми или инактивированными вирусами; способный подавлять рост разно­образных вирусов в дозах, нетоксичных для клеток». На сегодняшний день известно, что эти белки могут вырабатываться практически всеми клетками организма в ответ на внедрение чужеродной информации, вне зависимости от ее этиологии (вирусы, грибы, бактерии, внутриклеточные патогенны, онкогены). А основной их биологический эффект заключается в процессах распознавания и удаления этой чужеродной информации. Другими словами, эти защитные молекулы «умеют» мягко и аккуратно уничтожать вирусы, которые оккупировали клетки, без повреждения самих клеток. Это было подтверждено многочисленными научными исследованиями.

Что же касается методов применения препаратов с содержанием интерферонов, то здесь необходимо упомянуть о некоторых нюансах. Одна из основных проблем интерферонотерапии заключается в том, чтобы «доставить» действующую дозу препарата, при этом не вызвав негативных последствий. В некоторых случаях внутримышечное или внутривенное введение лекарств с содержанием интерферона приводит к побочным эффектам в виде лихорадки, озноба, головной боли и других нежелательных явлений. Эти симптомы не критичны для организма и вскоре проходят, но в процессе лечения вызывают дискомфорт.

Свести к минимуму побочные явления интерферонотерапии либо вовсе обойтись без них позволило применение суппозиториев с содержанием интерферона альфа-2б. Согласно научным исследованиям, ректальное применение рекомбинантного человеческого интерферона в первые дни заболевания ОРВИ снижает длительность лихорадки, борется с насморком и позволяет быстрее победить болезнь 2 . Интраназальное применение препаратов (когда лекарство наносится на слизистую носа) с содержанием интерферона alfa-2b дополняет лечение и обеспечивает оптимальный эффект терапии. Один из препаратов, который подходит для борьбы с гриппом и другими ОРВИ на любой стадии заболевания – это ВИФЕРОН. Он выпускается в виде суппозиториев (свечей), геля и мази.

Краткая инструкция по применению и переносимости препаратов с содержанием интерферона альфа-2б

Кто может принимать препараты ВИФЕРОН:

• взрослые;
• дети с первых дней жизни;
• беременные женщины с 4-й недели гестации.

Признание научным сообществом

Интерферон альфа-2b (ВИФЕРОН) включен в три федеральных стандарта оказания медицинской помощи как рекомендованный препарат для лечения гриппа и ОРВИ, а также в три Федеральных Протокола лечения этих заболеваний. 1 Если принимать во внимание не только грипп и ОРВИ, но и другие заболевания, то количество стандартов и рекомендаций касаемо этого препарата еще больше – интерферон (ВИФЕРОН) включен в 30 федеральных стандартов оказания медицинской помощи взрослым и детям, утвержденных Минздравом РФ, а также в 21 Протокол (Клинические рекомендации) оказания медицинской помощи взрослым, в том числе беременным женщинам, и детям.

Принцип действия препарата

Интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный, входящий в состав препарата ВИФЕРОН, обладает противовирусными, иммуномодулирующими свойствами и подавляет репликацию РНК- и ДНК-содержащих вирусов. К противовирусной терапии против гриппа можно приступить на любой фазе заболевания. Это поможет улучшить состояние и предотвратить развитие осложнений 2 . В препарат ВИФЕРОН входят общепризнанные высокоактивные антиоксиданты: в свечах это витамины Е и С, в мази – витамин Е, в геле – витамин Е, лимонная и бензойная кислоты. На фоне такой антиоксидантной поддержки отмечается повышение противовирусной активности интерферонов.

Результаты испытаний препарата

ВИФЕРОН прошел полный цикл клинических испытаний при широком спектре различных заболеваний в ведущих клиниках России. Результатом проведенных исследований явилось доказательство лечебно-профилактической эффективности препарата ВИФЕРОН при различных инфекционно-воспалительных заболеваниях у взрослых и детей, включая новорожденных, и беременных женщин. Научно доказано, что комплексный состав и форма выпуска обеспечивает препарату ВИФЕРОН уникальные фармакокинетические характеристики, с пролонгированием действия интерферона при отсутствии побочных эффектов, присущих парентеральным препаратам рекомбинантных интерферонов 3 .

При каких заболеваниях применяются препараты на основе интерферона alpha -2 b

Препарат ВИФЕРОН в виде суппозиториев, геля и мази применяется для лечения следующих заболеваний:

• ОРВИ, в том числе грипп;
• герпес;
• папилломавирусная инфекция;
• энтеровирусная инфекция;
• ларинготрахеобронхит;
• хронические гепатиты В, С, D, включая осложненные циррозом печени;
• бактериальный вагиноз;
• кандидоз;
• микоплазмоз;
• уреаплазмоз;
• гарднереллез.

Применение препарата ВИФЕРОН в составе комплексной противовирусной терапии позволяет снизить терапевтические дозы антибактериальных и гормональных лекарственных средств, а также уменьшить токсические эффекты указанной терапии.

Врач общей практики

1. http://www.rosminzdrav.ru, Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации, http://www.raspm.ru; http://www.niidi.ru; http://www.pediatr-russia.ru; http://www.nnoi.ru
2. Нестерова И.В. «Препараты интерферона в клинической практике: когда и как», «Лечащий врач», сентябрь 2017.
3. «ВИФЕРОН – комплексный противовирусный и иммуномодулирующий препарат для лечения инфекционно-воспалительных заболеваний в перинатологии». (Руководство для врачей), Москва, 2014.

Используемые источники: http://www.lsgeotar.ru

Побочные эффекты Interferon beta.

Изобретение относится к генной инженерии, биотехнологии, медицине, фармакологии. Новая рекомбинантная мультикопийная плазмидная ДНК pSX50, кодирующая синтез лейкоцитарного альфа-2b интерферона человека, экспрессия которого находится под контролем лактозного и триптофанового промоторов и терминатора транскрипции. В результате трансформации клеток реципиентного штамма Е. coli BL21 рекомбинантной плазмидной ДНК pSX50 получен штамм Е. coli SX50 - продуцент рекомбинантного лейкоцитарного альфа-2b интерферона человека с продуктивностью до 0.9-1.0 г альфа-2b интерферона с 1 л культуральной среды. Способ получения рекомбинантного альфа-2b интерферона основан на использовании созданного рекомбинантного штамма Е. coli SX50 и предусматривающий его глубинное культивирование на питательной среде с пониженным содержанием триптофана при непрерывном добавлении питательных субстратов в процессе биосинтеза, механическое разрушение клеток микроорганизма при высоком давлении, растворение агрегированного белка в концентрированном растворе гуанидин гидрохлорида с последующей ренатурацией интерферона в физиологических буферных растворах в присутствии хаотропных агентов и его очисткой с использованием трехстадийной хроматографической очистки интерферона на смолах типа Chelating Sepharose Fast Flow иммобилизованной ионами Cu +2 , ионообменной хроматографии на ионообменных смолах типа СМ Sephsrose Fast Flow и гель фильтрационной хроматографии на смолах типа Superdex 75. Способ позволяет получать субстанцию интерферона более 99% чистоты по данным электрофореза в редуцирующих и нередуцирующих условиях при окрашивании гелей серебром и более 98% по данным RF HPLC и не содержащую пирогенов (LAL-тест) в количествах не менее 400-800 мг с 1 л культуральной среды. 3 н. и 3 з.п ф-лы, 6 ил.

Рисунки к патенту РФ 2242516

Изобретение относится к генно-инженерным лекарственным препаратам, получаемым биотехнологическим путем, а именно к способам промышленного получения рекомбинантного лейкоцитарного интерферона альфа-2b человека медицинского назначения (далее интерферон), а также к рекомбинантньм штаммам продуцентам Escherichia coli (E.coli) и плазмидным ДНК, кодирующим синтез интерферона.

Интерфероны представляют собой белковые молекулы с молекулярной массой от 15000 до 21000 дальтон, продуцируемые и секретируемые клетками в ответ на вирусную инфекцию или другие возбудители. Выделяют три основные группы интерферонов: альфа, бета и гамма. Сами по себе эти группы не являются однородными и могут содержать несколько различных молекулярных разновидностей интерферона. Так, выделено более 14 генетических разновидностей интерферона альфа, которые представляют интерес и находят широкое применение в медицине в качестве противовирусных, антипролиферативных и иммуномодулирующих средств.

Известны способы получения лейкоцитарного интерферона человека из лейкоцитов донорской крови человека, индуцированных вирусами и другими индукторами (SU1713591, RU 2066188 , RU 2080873).

Основным недостатком этих способов получения интерферонов являются вероятность контаминации конечного продукта вирусами человека, такими как вирус гепатитов В и С, вируса иммунодефицита и др.

В настоящее время более перспективным признан способ получения интерферона микробиологическим синтезом, который обеспечивает возможность получения целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья. Используемые при этом подходы позволяют создать оптимальные для бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию.

В качестве исходных микроорганизмов используют различные конструкции штаммов Pichia pastoris, Pseudomonas putida и Escherichia coli.

Недостатком использования P. pastoris в качестве продуцента интерферона (J.N. Garcia, J.A. Aguiar et. al. //High level expression of human IFN-2b in Pichia pastoris.//Biotecnologia Aplicada, 12(3),152-155, 1995), является крайне сложные условия ферментации этого типа дрожжей, необходимость строго поддерживать концентрацию индуктора, в частности метанола, в процессе биосинтеза. Недостатком использования штаммов Ps. putida (SU1364343, SU1640996, SU1591484, RU1616143, RU2142508) является сложность процесса ферментации при низком уровне экспрессии (10 мг интерферона на 1 л культуральной среды). Более продуктивным является использование штаммов Escherichia coli (Semin. Oncol.,1997, Iun; 24 (3 Suppl. 9):S9-41-S9-51).

Известно большое количество плазмид и созданных на их основе штаммов Е. coli, экспрессирующих интерферон: штаммы Е. coli ATCC 31633 и 31644 с плазмидами Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 или Z-pBR 322(Pstl)/HclN SN 35-AHL6 (SU 1764515), штамм Е. coli pINF- AP2 (SU 1312961), штамм Е. coli pINF- F-Pa (AU 1312962), штамм E.Coli SG 20050 с плазмидой p280/21FN (Кравченко В.В. и др. Биоорганическая химия, 1987, т.13, №9, с.1186-1193), штамм E.Coli SG 20050 с плазмидой pINF14 (SU 1703691), штамм E.coli SG 20050 с плазмидой pINF16 ( RU 2054041) и др. Недостатком технологий, основанных на использовании этих штаммов, является их нестабильность, а также недостаточный уровень экспрессии интерферона.

Наряду с особенностями используемых штаммов эффективность процесса во многом зависит от используемой технологии выделения и очистки интерферона.

Известен способ получения интерферона, включающий в себя культивирование клеток Ps. putida, разрушение биомассы, обработку полиэтиленимином, фракционирование сернокислым аммонием, гидрофобную хроматографию на фенилсилохроме С-80, рН-фракционирование лизата, его концентрирование и диафильтрацию, ионообменную хроматографию на целлюлозе DE-52, элюирование в градиенте рН, ионообменную хроматографию полученного элюента на целлюлозе СМ-52, концентрирование пропусканием через кассету фильтров и гель-фильтрацию на Сефадексе G-100 (SU 1640996). Недостатком этого способа кроме сложной многостадийной ферментации является многостадийность при получении конечного продукта.

Известен также способ получения интерферона, включающий в себя культивирование штамма E.coli SG 20050/pIF16, в LB-бульоне в колбах в термостатированном шейкере, центрифугирование биомассы, ее промывку буферным раствором и обработку ультразвуком для разрушения клеток. Полученный лизат центрифугируют, промывают 3М раствором мочевины в буфере, растворяют в растворе гуанидин хлорида в буфере, обрабатывают ультразвуком, центрифугируют, проводят окислительный сульфитолиз, диализ против 8 М мочевины, ренатурацию и окончательную двухстадийную хроматографию на СМ-52 целлюлозе и сефадексе G-50 ( RU 2054041). Недостатками этого способа является его относительно невысокая производительность основных этапов процесса выделения и очистки. В особенности это относится к ультразвуковой обработке продукта, диализу и окислительному сульфитолизу, что приводит к нестабильности выхода интерферона, а также к невозможности использования этого метода для промышленного производства интерферона.

В качестве наиболее близкого аналога (прототипа) может быть указан способ получения лейкоцитарного интерферона человека, заключающийся в культивировании рекомбинантного штамма E.coli, замораживании полученной биомассы при температуре не выше -70°С, размораживании, разрушении клеток микроорганизма лизоцимом, удалении ДНК и РНК введением в лизат ДНК-азы и очисткой выделенной нерастворимой формы интерферона отмывкой буферным раствором с детергентами, растворении осадка интерферона в растворе гуанидин гидрохлорида, ренатурации и одностадийной очистке ионообменной хроматографией. В качестве продуцента используют штамм E.coli SS5, полученный с помощью рекомбинантной плазмиды pSS5, содержащей три промотора: P lac , P t7 и P trp , и ген альфа -интерферона с введенными нуклеотидными заменами.

Экспрессия интерферона штаммом E.coli SS5, содержащим эту плазмиду, контролируется тремя промоторами: P lac , P t7 и P trp . Уровень экспрессии интерферона составляет около 800 мг на 1 л клеточной суспензии (RU 2165455).

Недостатком способа является низкая технологичность использования ферментативного разрушения клеток, ДНК и РНК микроорганизма и одностадийная хроматографическая очистка интерферона. Это обуславливает нестабильность процесса выделения интерферона, приводит к снижению его качества и ограничивает возможность использования приведенной схемы для промышленного производства интерферона. Недостатками данной плазмиды и штамма на ее основе являются использование в плазмиде сильного нерегулируемого промотора фага Т7 в штамме Е. coli BL21 (DE3), в котором ген Т7 РНК полимеразы находится под промотором lac оперона и который всегда "течет". Следовательно, в клетке непрерывно происходит синтез интерферона, что приводит к диссоциации плазмиды и снижению жизнеспособности клеток штамма, и в результате - снижение выхода интерферона.

Задачей данного изобретения является конструирование рекомбинантого промышленного штамма продуцента Е. coli с помощью новой рекомбинантной плазмидной ДНК, обладающего высоким уровнем биосинтеза интерферона, и разработка эффективной промышленной технологии получения субстанции интерферона медицинского назначения, соответствующей по качеству "European Pharmacopoeia " для субстанции интерферона альфа-2b.

Указанная задача решалась созданием рекомбинантной плазмидной ДНК pSX50 и штамма Escherichia coli SX50, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных штаммов ФГУП ГосНИИ генетики, номер ВКПМ В-8550,

а также способом получения рекомбинантного альфа-2b интерферона, основанным на использовании рекомбинантного штамма Е. coli SX50 и предусматривающим его глубинное культивирование на питательной среде с пониженным содержанием триптофана при непрерывном добавлении питательных субстратов в процессе биосинтеза, механическое разрушение клеток микроорганизма при высоком давлении, растворение агрегированного белка в концентрированном растворе гуанидин гидрохлорида с последующей ренатурацией интерферона в физиологических буферных растворах в присутствии хаотропных агентов и трехстадийной хроматографической очисткой интерферона на смолах типа Chelating Sepharose Fast Flow, иммобилизованной ионами Сu +2 , ионообменной хроматографии на ионообменных смолах типа CM Sepharose Fast Flow и гель фильтрационной хроматографии на смолах типа Superdex 75.

Согласно изобретению предлагается новая рекомбинантная мультикопийная плазмидная ДНК pSX50, кодирующая синтез лейкоцитарного альфа-2b интерферона человека, экспрессия которого находится под контролем лактозного и триптофанового промоторов и терминатора транскрипции. Плазмида pSX50 имеет 3218 пар оснований (п.о.) и характеризуется наличием следующих фрагментов:

Последовательность с 1 нуклеотида по 176 нуклеотид (н.) включает фрагмент ДНК размером 176 п.о., содержащий триптофановый промотор (P trp);

Последовательность с 177 н. по 194 н. включает синтетический фрагмент ДНК размером 18 п.о., содержащий последовательность Шайн Дельгарно, ответственный за инициацию трансляции;

Последовательность с 195 н. по 695 н. включает фрагмент ДНК размером 501 п.о., содержащий последовательность гена интерферона со следующими нуклеотидными заменами: в положении 37 замена А на С, в положении 39 замена G на Т, в положении 40 замена А на С, в положении 42 замена G на Т, в положении 67 замена А на С, в положении 69 замена G на Т, в положении 70 замена А на С, в положении 72 замена А на Т, в положении 96 замена G на А, в положении 100 замена А на С, в положении 102 замена А на Т, в положении 114 замена А на С, в положении 120 замена С на G, в положении 126 замена G на А, в положении 129 замена G на А, в положении 330 замена С на G, в положении 339 замена G на А, в положении 342 замена G на А, в положении 487 замена А на С, в положении 489 замена А на Т, в положении 495 замена G на А;

Последовательность с 696 н. по 713 н. включает синтетический фрагмент ДНК размером 18 п.о., содержащий синтетический полилинкер;

Последовательность с 714 н. по 1138 н. включает фрагмент ДНК плазмиды рКК223-3 с 4129 н. по 4553 н. размером 425 п.о., содержащий последовательность строгого терминатора транскрипции rrnBT 1 T 2 ;

Последовательность с 1139 н. по 1229 н. включает фрагмент ДНК плазмиды pUC19 с 2487 н. по 2577 н. размером 91 п.о., содержащий промотор гена -лактомазы (ген устойчивости к ампициллину - Аmр R);

Последовательность с 1230 н. по 2045 н. включает фрагмент ДНК плазмиды pUC4K с 720 н. по 1535 н. размером 816 п.о., содержащий структурную область гена kan;

Последовательность с 2046 н. по 3218 н. включает фрагмент ДНК плазмиды pUC19 с 1625 по 453 н. размером 1173 п.н., содержащий последовательность, ответственную за репликацию плазмиды (ori) и lac промотора (P lac).

На фиг.1-5 изображены схемы конструирования и физическая карта плазмиды рSХ50.

На фиг.6 представлена установленная для плазмиды pSX50 полная последовательность нуклеотидов.

Штамм Escherichia coli SX50 получен трансформацией клеток Escherichia coli BL21 плазмидой pSX50 с использованием традиционной генно-инженерной технологии. Штамм E.Coli SX50 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки

Клетки мелкие, прямые, утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре "Дифко" образуются круглые, гладкие, выпуклые, мутные, блестящие, серые колонии, с ровными краями. При росте в жидких средах (в минимальной среде с глюкозой или в LB-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.

Физико-биологические признаки

Аэроб. Температурный диапазон роста 4-42°С при оптимуме рН 6,5-7,5.

В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной формах, так и органические соединения в виде аминокислот, пептона, триптона, дрожжевого экстракта и т.д.

В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы. Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к канамицину (до 100 мкг/мл).

Штамм Escherichia coli 8Х50 - продуцент интерферона.

Способ, условия и состав среды для хранения штамма

В L-arape с добавлением канамицина до концентрации 20 мкг/мл под маслом, в L-бульоне, содержащем 15% глицерина и соответствующими антибиотиками в ампулах при температуре минус 70°С, в лиофилизированном состоянии в ампулах при температуре плюс 4°С.

Штамм Escherichia coli SX50 идентифицирован по Определителю Берги (1974) как штамм вида Escherichia coli.

Способ промышленного получения альфа-2b интерферона

Особенностью заявляемого способа является разработка технологии, позволяющая выделять интерферон из нерастворимой формы, накапливающейся в течение ферментации, что позволяет существенно упростить технологическую схему процесса выделения и повысить выход целевого продукта.

Способ заключается в культивировании штамма Escherichia coli SХ50 в питательной среде, с постоянным добавлением питательных субстратов, предпочтительно глюкозы и дрожжевого экстракта, в процессе биосинтеза, предпочтительно с пониженным содержанием триптофана, механическом разрушении клеток микроорганизма при высоком давлении 700-900 bar, растворении интерферона в буферном растворе гуанидин гидрохлорида, ренатурации интерферона в физиологических буферных растворах в присутствии хаотропных агентов, с последующей трехстадийной хроматографической очистке интерферона на смолах типа Chelating Sepharose Fast Flow, иммобилизованных ионами Сu +2 , ионообменную хроматографию на ионообменных смолах типа CM Sepharose Fast Flow и гель фильтрационную хроматографию на смолах типа Superdex 75.

Оптимальными условиями проведения отдельных стадий получения интерферона являются следующие:

Ферментацию проводят при непрерывном добавлении субстратов в течение всего процесса, что обуславливает высокий уровень экспрессии интерферона;

Разрушение клеток осуществляют в дезинтеграторе типа Гаулин при давлении 900 bar;

Удаление растворимых клеточных компонентов (ДНК, РНК, белков, липополисахаридов и т.д.) производят промыванием нерастворимой формы интерферона буферными растворами, содержащими детергенты (Тритон XI00, мочевина и т.д.);

Образовавшийся осадок, содержащий интерферон, растворяют в буферном растворе 6 М гуанидина гидрохлорида;

Ренатурацию интерферона проводят в физиологическом буферном растворе, содержащем хаотропные агенты;

Трехстадийную хроматографическую очистку интерферона проводят на Chelating Sepharose Fast Flow, иммобилизованной ионами Сu +2 , на катионообменной смоле СМ Sepharose Fast Flow и гель фильтрационную хроматографию на смоле типа Superdex 75;

После каждой хроматографической очистки проводят стерилизующую фильтрацию через апирогенные фильтры с размерами пор 0.22 мкм.

Выход интерферона в результате применения описанного способа составляет примерно 400-800 мг интерферона с 1 л культуральной среды. Качество получаемого продукта соответствует нормам и требованиям "European Pharmacopoeia" для субстанции альфа-2b интерферона.

Существенными отличиями заявляемого способа от прототипа являются:

Использование конструкции штамма, с более высокой производительностью, что позволяет получать при биосинтезе большее количество интерферона с 1 л культуральной среды;

Использование эффективного механического разрушения клеточной биомассы, что позволяет получать более чистый экстракт нерастворимой формы интерферона за более короткое время, с меньшими потерями;

Использование физиологических буферных растворов при ренатурации в присутствии хаотропных агентов позволяет повысить выход корректно ренатурированной формы интерферона;

Трехстадийная хроматографическая очистка интерферона позволяет получать субстанцию интерферона более 99% чистоты по данным электрофореза в редуцирующих и нередуцирующих условиях при окрашивании гелей серебром и более 98% по данным RF HPLC и практически не содержащую пирогенов (LAL-тест).

Сущность и преимущества заявляемой группы изобретений иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды рSХ50

Способ конструирования плазмиды pSX50 включает следующие этапы:

Конструирование векторной плазмиды pSX10;

1. конструирование плазмиды pSX3 (2641 п.о.)

2. конструирование векторной плазмиды pSX10 (2553 п.о.)

Конструирование рекомбинантной плазмиды pSX41 (3218 п.о.);

Конструирование рекомбинантной плазмиды pSX43 (3218 п.о.);

Конструирование рекомбинантной плазмиды pSX45 (3218 п.о.);

Конструирование рекомбинантной плазмиды pSX50 (3218 п.о.).

Конструирование векторной плазмиды pSX10

Векторная плазмида pSX10 представляет собой вектор pUC19, в котором кодирующая последовательность гена бета лактомазы, обеспечивающая устойчивость к ампициллину, заменяется кодирующей последовательностью гена kаn и содержит терминатор транскрипции из плазмиды рКК223-3.

Конструирование векторной плазмиды pSS10 проводят в две стадии:

Получение плазмиды pSX3 (2641 п.о.), представляющей собой плазмиду pUC19, в которой кодирующая область аmp гена заменяется на кодирующую область гена kan;

Получение веторной плазмиды pSX10 (2553 п.о.), представляющей собой плазмиду pSX3, в которой за BamHI сайтом вставлен фрагмент ДНК, кодирующий терминатор транскрипции ггBT 1 T 2 .

Для получения плазмиды pSX3 проводят пять раундов амплификации ДНК методом ПЦР (полимеразная цепная реакция). В ходе первого раунда, используя ДНК плазмиды pUC19 в качестве матрицы, проводят амплификацию фрагмента ДНК размером 1828 п.о. (фрагмент PU1-PU2) с помощью праймеров:

Данную и последующие ПЦР реакции проводят в следующих условиях: 20 mМ Tis-HCl, рН 8.8, 10 mM (NH 4) 2 SO 4 ,10 mМ КСl, 2 тМ MgCl 2 , 0.1% Triton Х100,0.1 mg/ml BSA, 0.2 mM каждого dNTP, 1.25 ед. Pfu ДНК полимеразы, 100 нг ДНК. Процесс амплификации состоит из следующих стадий: прогревание при 95°С 5 мин, 35 циклов ПЦР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 2 мин 72°С) и инкубация 10 мин при 72°С. После амплификации (и после последующих амплификаций) фрагмент ДНК очищают электрофоретически в 1% агарозном геле. В ходе второго и третьего раундов, используя ДНК плазмиды pUC4K в качестве матрицы, проводят амплификацию фрагмента ДНК размером 555 п.о. (фрагмент КМ1-КМ2) с помощью праймеров:

и амплификацию фрагмента ДНК размером 258 п.о. (КМЗ-КМ4) с праймеров

В пятом раунде ПЦР проводят объединение фрагментов (PU1-PU2) и (КМ1-КМ4) в следующих условиях: прогревание при 95°С 5 мин, 5 циклов ПЦР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 10 мин 72°С) и инкубация 10 мин при 72°С. ДНК, полученную после последней ПЦР, прямо трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 час при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК и проводят рестрикционный анализ. В результате получают плазмиду рSХ3 размером 2641 п.о.

Для получения векторной плазмиды pSX10 проводят три раунда амплификации ДНК методом ПЦР. В ходе первого раунда, используя ДНК плазмиды pSX3 в качестве матрицы, проводят амплификацию фрагмента ДНК размером 2025 п.о. (фрагмент 10.1-10.2) с помощью праймеров:

В ходе второго раунда, используя ДНК плазмиды рКК223-3 в качестве матрицы, проводят амплификацию фрагмента ДНК размером 528 п.о. (фрагмент КК1-КК2) с помощью праймеров:

В третьем раунде ПЦР проводят объединение фрагментов (10.1-10.2) и (КК1-КК2) в следующих условиях: прогревание при 95°С 5 мин, 5 циклов ПЦР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 10 мин 72°С) и инкубация 10 мин при 72°С. ДНК, полученную после последней ПЦР, прямо трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 час при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК и проводят рестрикционный анализ. В результате получают плазмиду pSX10 размером 2553 п.о.

Конструирование рекомбинантной плазмиды pSX41

Рекомбинантная плазмида pSX41 представляет собой Hind III - BamHI фрагмент ДНК векторной плазмиды pSX3 (2529 п.о.), Hind III - EcoRI фрагмент ДНК размером 168 п.о., кодирующий промотор триптофанового оперона Е. coli (P trp), EcoRI-XbaI синтетический фрагмент ДНК размером 20 п.о., кодирующий SD последовательность (Шайн-Дельгарно) и XbaI-BamHI фрагмент ДНК размером 501 п.о., кодирующий ген альфа 2b интеферона человека.

Для получения Hind III - ВаmHI фрагмент ДНК векторной плазмиды pSX3 (2529 п.о.) ДНК плазмиды pSX3 обрабатывают ферментами рестрикции HindIII и BamHI с последующей электрофоретической очисткой в 1% агарозном геле. Hind III EcoRI фрагмент ДНК размером 168 п.о., кодирующий промотор триптофанового оперона (P trp) получают методом ПЦР, используя тотальную ДНК Е. coli в качестве матрицы и праймеры TRP1 и PRP2 с последующей обработкой амплифицированного фрагмента рестриктазами Hindlll и EcoRI:

Для получения EcoRI-Xbal синтетический фрагмент ДНК размером 20 п.о., кодирующий SD последовательность (Шайн-Дельгарно), синтезируются следующие комплементарные олигонуклеотиды:

XbaI-ВаmIII фрагмент ДНК размером 501 п.о., кодирующий ген альфа 2b интеферона человека, получают методом ПЦР, используя тотальную ДНК человека в качестве матрицы и праймеры IFN1 и IFN2 с последующей обработкой амплифицированного фрагмента рестриктазами Xbal и ВаmIII:

Далее электрофоретически очищенные фрагменты объединяют, лигируют ферментом лигаза фага Т4, ДНК трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 час при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК, проводят рестрикционный анализ и определяют первичную структуру ДНК. В результате получают плазмиду pSX41 размером 3218 п.о. Далее проводят поэтапный мутагенез гена интерферона для увеличения уровня экспрессии целевого продукта. Мутагенез гена интерферона заключается в замене редко встречающихся в Е. coli триплетов, кодирующих соответствующие аминокислоты на часто встречающиеся в Е. coli триплеты, кодирующие эти же аминокислоты. Мутагенез ДНК гена интерферона проводят методом ПЦР.

Конструирование рекомбинантной плазмиды pSX43

Для получения рекомбинантной плазмиды pSX43 проводят один раунд амплификации ДНК методом ПЦР, используя ДНК плазмиды pSX41 в качестве матрицы и праймеры IFN3 и IFN4:

ПЦР проводят в следующих условиях: прогревание при 95°С 5 мин, 20 циклов ПЦР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 10 мин 72°С) и инкубация 20 мин при 72°С. ДНК, полученную после ПЦР, прямо трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 час при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК, проводят рестрикционный анализ и определяют первичную структуру ДНК. В результате получают плазмиду рSХ43 размером 3218 п.о.

Конструирование рекомбинантной плазмиды pSX45

Для получения рекомбинантной плазмиды pSX45 проводят один раунд амплификации ДНК методом ПЦР, используя ДНК плазмиды pSX43 в качестве матрицы и праймеры IFN5 и IFN6:

ПЦР проводят в следующих условиях: прогревание при 95°С 5 мин, 20 циклов ПЦР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 10 мин 72°С) и инкубация 20 мин при 72°С. ДНК, полученную после ПЦР, прямо трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 час при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК, проводят рестрикционный анализ и определяют первичную структуру ДНК. В результате получают плазмиду pSX45 размером 3218 п.о.

Конструирование рекомбинантной плазмиды pSX50.

Для получения рекомбинантной плазмиды pSX50 проводят один раунд амплификации ДНК методом ПЦР, используя ДНК плазмиды pSX45 в качестве матрицы и праймеры IFN7 и IFN8:

ПЦР проводят в следующих условиях: прогревание при 95°С 5 мин, 20 циклов ПЦР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 10 мин 72°С) и инкубация 20 мин при 72°С. ДНК, полученную после ПЦР, прямо трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 час при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК, проводят рестрикционный анализ и определяют первичную структуру ДНК. В результате получают плазмиду pSX50 размером 3218 п.о.

Пример 2. Получение штамма Е. coli SX50 - продуцента интерферона

Штамм продуцент интерферона Е. coli SX50 получают путем трансформации клеток штамма Е. coli BL21 рекомбинантной плазмидой рSХ50. Штамм продуцент интерферона выращивают в 30 л ферментере до оптической плотности 25.0-30.0 о.е. в среде М9, содержащей 1% кислотного гидролизата казеина (Difco), 1% глюкозы, 40 мкг/мл канамицина, при температуре 38-39°С. В процессе ферментации проводят непрерывное добавление питательного субстрата, используя гравитометрический контроллер.

Пример 3. Способ выделения интерферона из штамма Е. coli SX50

Получение интерферона проводили в 4 этапа:

1 этап. Культивирование штамма Е. coli SX50.

2 этап. Выделение и очистка нерастворимой формы интерферона.

3 этап. Растворение и ренатурация интерферона.

4 этап. Хроматографическая очистка интерферона.

1 этап. Культивирование штамма Е. coli SX50

Выращенный посевной материал штамма Е. coli SX50 в объеме 3 л богатой среде LB в течение 12 ч при 26°С асептически вносят в ферментер, содержащий 27 л стерильной среды, содержащей М9, 1% кислотного гидролизата казеина, 1% глюкозы, 1 мМ MgCl 2 , 0.1 mM CaCl 2 , 40 мг/мл канамицина. Культивирование в ферментере проводят при температуре 38-39°С, поддерживая рН 7±0,15 путем автоматической подтитровки 40%-ным раствором гидроокиси натрия. Концентрацию растворенного кислорода в диапазоне (50±10)% от насыщения поддерживают путем изменения скорости оборотов мешалки от 100 до 800 об/мин и подачи воздуха от 1 до 15 л/мин. Концентрацию субстратов, в частности глюкозы и дрожжевого экстракта, измеряют в течение ферментации и поддерживают их концентрацию путем изменения скорости подачи концентрированных растворов, через перистальтические насосы, используя гравиметрический контроллер.

Накопление интерферона в виде нерастворимой формы контролируют с помощью фазово-контрастной микроскопии, методом электрофореза в 15% полиакриламидном геле (SDS-PAAG) и методом обратнофазной высокоэффективной хроматографии (RF HPLC). Ферментацию останавливают по достижении максимальной оптической плотности (~ 25-30 о.е.) и остановки синтеза интерферона. По окончании ферментации культуральную жидкость сепарируют центрифугированием в проточном роторе при скорости вращения 5000-10000 об/мин. Биомассу фасуют в полиэтиленовые пакеты и замораживают при температуре минус 70°С.

2 этап. Выделение и очистка нерастворимой формы интерферона

300-400 г замороженной биомассы штамма Е. coli SX50 суспедируют в 3000 мл буфера 1 (20 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 10 мМ ЭДТА, 0,1% Triton X100). Суспензию пропускают через проточный гомогенизатор типа Гаулин, поддерживают давление 900 бар и центрифугируют в проточном роторе при 15 000 об/мин. Полученный осадок промывают в аналогичных условиях последовательно буферами 2 (20 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 1 мМ ЭДТА, 3 М мочевины) и буфером 3 (20 мМ Tris-HCl pH 8.0, 1 мМ ЭДТА) и окончательно осадок интерферона суспедируют в 200 мл буфера 3. При этом время выделения и очистки нерастворимой формы интерферона составляет не более 5 час.

3 этап. Растворение и ренатурация интерферона

К полученной на предыдущем этапе суспензии нерастворимой формы интерферона добавляют сухой гуанидин гидрохлорид до концентрации 6 М, добавляют дитиотреитол до концентрации 50 мМ, Tris-HCl pH 8.0 до концентрации 50 мМ, NaCl до концентрации 150 мМ и Triton X100 до концентрации 0.1%, инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч. Нерастворившийся материал отделяют при стерилизующей фильтрации через мембраны с диаметрами пор 0.22 микрона.

Ренатурацию интерферона проводят путем медленного разбавления полученного раствора в 100-200 раз буфером 4 (20 мМ Tris-HCl pH 8.0, 100 мМ NaCl, 0.1 мМ ЕДТА). После чего ренатурационную смесь инкубируют при постоянном перемешивании в течение 12-15 час при температуре 4-8°С. Далее добавляют сульфат магния до концентрации 1 мМ и агрегированный материал удаляют стерилизующей фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0.22 микрона.

4 этап. Хроматографическая очистка интерферона

Хроматографическую очистку интерферона осуществляют в три стадии.

1. Полученный ренатурированный интерферон на первом этапе подвергают очистке с помощью аффинной хроматографии на смоле типа Chelating Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences), иммобилизованной ионами Cu +2 . Для этого раствор интерферона наносят на колонну с Cu +2 Chelating Sepharose Fast Flow и интерферон элюируют буфером 0.1 М лимонной кислоты pH 2.2.

2. На второй стадии хроматографической очистки раствор интерферона наносят на катионообменную смолу типа CM Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) и интерферон элюируют градиентом растворов (0.0-0.5 М NaCl) в буфере 50 мМ Nа(СН 3 СОО), рН 5.5.

3. Очистка мономерной формы интерферона от остатков полимерных форм интерферона проводят на третьей стадии очистки интерферона гель-фильтрацией на смоле типа Superdex 75 (Amersham Biosciences). Хроматографию проводят в буфере 50 мМ Na(CH 3 COO), рН 5.0, содержащем 0.15М NaCl.

Описанный способ выделения и очистки интерферона позволяет получить 4-8 г высокоочищенного интерферона за один цикл выделения в течение 7-10 дней из биомассы, полученной с 10 л культуральной среды. Качество получаемого интерферона в полной мере соответствует требованиям "European Pharmacopoeia" для субстанции интерферона альфа-2b, а именно:

Концентрация интерферона не менее 2×10 8 МЕ/мл;

Удельная активность интерферона не менее 2.0×10 8 МЕ/мг;

Электофоретическая чистота препарата не менее 99% в редуцирующих и не редуцирующих условиях при окрашивании гелей серебром;

Изоэлектрическая точка выделенного интерферона находится в районе рН 5.8-6.3;

Пептидная карта выделенного интерферона принципиально не отличается от пептидной карты для Европейского стандарта интерферона альфа 2b CRS;

Как следует из приведенных примеров, заявляемая группа изобретений позволяет получать интерферон альфа-2b с высоким выходом при относительно простой и надежной технологии.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSX50, кодирующая синтез рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона, характеризующаяся тем, что она имеет размер 3218 пар оснований (п.о.) и состоит из следующих фрагментов: последовательность с 1 по 176 нуклеотида (н.) включает фрагмент ДНК размером 176 п.о., содержащий триптофановый промотор (Р trp), последовательность с 177 по 194 н. включает синтетический фрагмент ДНК размером 18 п.о., содержащий последовательность Шайн Дельгарно, ответственный за инициацию трансляции, последовательность с 195 по 695 н. включает фрагмент ДНК размером 501 п.о., содержащий ген интерферона альфа-2b с нуклеотидными заменами: 37 (А>С), 39 (G>T), 40 (А>С), 42 (G>T), 67 (А>С), 69 (G>T), 70 (А>С), 72 (А>Т), 96 (G>A), 100 (А>С), 102 (А>Т), 114 (А>С), 120 (C>G),126 (G>A), 129 (G>A), 330 (C>G), 339 (G>A), 342 (G>A), 487 (A>C), 489 (А>Т), 495 (G>A), последовательность с 696 по 713 н. включает синтетический фрагмент ДНК размером 18 п.о., содержащий синтетический полилинкер, последовательность с 714 по 1138 н. включает фрагмент ДНК плазмиды рКК223-3 с 4129 по 4553 н. размером 425 п.о., содержащий последовательность строгого терминатора транскрипции rrnBT 1 T 2 , последовательность с 1139 по 1229 н. включает фрагмент ДНК плазмиды pUC19 с 2487 по 2577 н. размером 91 п.о., содержащий промотор гена -лактомазы (ген устойчивости к ампициллину -Amp R), последовательность с 1230 по 2045 н. включает фрагмент ДНК плазмиды pUC4K с 720 н. по 1535 н. размером 816 п.о., содержащий структурную область гена kan, последовательность с 2046 н. по 3218 н. включает фрагмент ДНК плазмиды pUC19 с 1625 по 453 н. размером 1173 п.н., содержащий последовательность, ответственную за репликацию плазмиды (ori) и lac промотора (P lac).

2. Штамм бактерий Eschcerichia coli SX50 трансформированный рекомбинантной плазмидой по п.1 - продуцент рекомбинантного лейкоцитарного интерферона альфа-2b человека.

3. Способ получения интерферона альфа-2b человека, включающий культивирование штамма Escherichia coli SX5 по п.2 в питательной среде с постоянным добавлением питательных субстратов в процессе биосинтеза, механическое разрушение клеток микроорганизма при давлении 700-900 bar, растворение интерферона в буферном растворе гуанидин гидрохлорида, ренатурацию интерферона в физиологических буферных растворах в присутствии хаотропных агентов, трехстадийную хроматографическую очистку интерферона на смолах типа Chelating Sepharose Fast Flow, иммобилизованных ионами Сu +2 , ионообменную хроматографию на ионообменных смолах типа CM Sepharose Fast Flow и гель-фильтрационную хроматографию на смолах типа Superdex 75.

4. Способ по п.3, в котором культивирование проводят на питательной среде с пониженным содержанием триптофана при непрерывном добавлении питательных субстратов, предпочтительно глюкозы и дрожжевого экстракта.

5. Способ по п.3, в котором перед растворением интерферона его очищают удалением растворимых клеточных компонентов, включающих ДНК, РНК, белки, липополисахариды, промыванием буферными растворами, содержащими детергенты типа Тритон XI 00, мочевин.

6. Способ по п.3, в котором после каждой хроматографической очистки проводят стерилизующую фильтрацию через фильтры с размерами пор 0.22 мкм.