Главная · Болезни кишечника · Анализ на бешенство у собак: методики выявления вируса. Современные методы лабораторной диагностики бешенства собак Условия выполнения исследований и требования безопасности

Анализ на бешенство у собак: методики выявления вируса. Современные методы лабораторной диагностики бешенства собак Условия выполнения исследований и требования безопасности

ГОСТ 26075-2013

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ЖИВОТНЫЕ

Методы лабораторной диагностики бешенства

Animals. Methods of Laboratory Diagnostic of Rabies

Дата введения 2015-01-01

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ")

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 июня 2013 г. N 57-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Армения

Минэкономики Республики Армения

Беларусь

Госстандарт Республики Беларусь

Киргизия

Кыргызстандарт

Молдова

Молдова-Стандарт

Россия

Росстандарт

Узбекистан

Узстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 сентября 2013 г. N 1127-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 26075-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2015 года

5 ВЗАМЕН ГОСТ 26075-84


Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

1 Область применения

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы лабораторной диагностики бешенства:

- метод флуоресцирующих антител (МФА);

- метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1);

- биопроба на белых мышах;

- метод иммуноферментного анализа (ИФА);

- реакция диффузионной преципитации (РДП).

Примечания

1 Данные методы применимы ко всем представителям рода Lyssavirus .

2 Уличный вирус бешенства относится к микроорганизмам 2 класса патогенности (представляет смертельную опасность для человека и животных).

3 При необходимости генотипирования вируса бешенства с помощью готовых тест-систем применяют метод обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции (от-ПЦР).

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 12.0.004-90 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.008-76 Система стандартов безопасности труда. Биологическая безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация

ГОСТ 17.0.0.01-76 Система стандартов в области охраны природы и улучшения использования природных ресурсов. Основные положения

ГОСТ 177-88 Водорода перекись. Технические условия

ГОСТ 2603-79 Реактивы. Ацетон. Технические условия

ГОСТ 2768-84 Ацетон технический. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия.

ГОСТ ISO 7218-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ГОСТ 8074-82 Микроскопы инструментальные. Типы, основные параметры и размеры. Технические требования.

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13739-78 Масло иммерсионное для микроскопии. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 21241-89 Пинцеты медицинские. Общие технические условия.

ГОСТ 22967-90 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 24861-91 (ИСО 7886-84) Шприцы инъекционные однократного применения

ГОСТ 25046-81 (ИСО 7864-81) Иглы инъекционные однократного применения. Основные размеры. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29230-91 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины, определения и сокращения

3.1 В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1.1 бешенство: Инфекционное заболевание человека и животных, вызываемое представителями семейства Rhabdoviridae рода Lyssavirus (рабдовирус), и приводящее к летальному исходу в 100% случаев.

3.1.2 вирус бешенства: Возбудитель инфекционного заболевания человека и животных.

3.1.3 антиген вируса бешенства: Поверхностные белковые структуры вируса бешенства, на которые вырабатываются антитела.

3.1.2* метод флуоресцирующих антител (МФА): Метод выявления антигена вируса бешенства меченными флуоресцеинизотиоцианатом антирабическими антителами, с образованием характерных светящихся комплексов-включений, обнаруживаемых в поле зрения люминесцентного микроскопа.
________________

3.1.3 метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1): Метод выделения антигена вируса бешенства, основанный на размножении вируса в культуре клеток и его идентификации методом флуоресцирующих антител.

3.1.3* биопроба: Метод выделения вируса бешенства на белых мышах путем введения им суспензии патологического материала с последующей идентификацией вируса методом флуоресцирующих антител.
________________
* Нумерация соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.

3.1.4 метод иммуноферментного анализа (ИФА): Метод выявления антигена вируса бешенства, основанный на его специфическом взаимодействии с антирабическим антителом, иммобилизованном на твердом носителе, с последующим выявлением связавшегося антигена с помощью второго меченного ферментом антитела путем окрашивания продукта реакции хромогеном.

3.1.5 реакция диффузионной преципитации (РДП): Метод выявления вируса бешенства, основанный на способности антител и вирусного антигена бешенства диффундировать в агаровом геле и при специфическом взаимодействии образовывать комплекс "антиген-антитело", наблюдаемый невооруженным глазом в виде линии преципитации.

3.1.6 метод обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции (от-ПЦР): Метод выявления генома вируса бешенства путем перевода специфической последовательности РНК вируса в ДНК с последующим многократным копированием полученной ДНК и обнаружением продуктов реакции, осуществляемый in vitro.

3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:

ФАГ - флуоресцирующий антирабический иммуноглобулин;

АнГ - антирабический глобулин;

КФГ - контрольный флуоресцирующий глобулин;

ФБР - фосфатно-буферный раствор;

НГУК-1 - невринома Гассерова узла крысы;

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцинат;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

CCL-131 - культура клеток мышиной нейробластомы;

ОФД - ортофенилдиамин;

ТМБ - тетраметилбензидин.

4 Условия выполнения исследований и требования безопасности

4.1 Условия выполнения исследований

4.1.1 Общие требования проведения микробиологического анализа и работы с микроорганизмами I-II групп патогенности - по ГОСТ ISO 7218 .

4.1.2 Общие требования к помещениям - по ГОСТ ISO 7218 .

4.1.3 Требования к персоналу - по ГОСТ ISO 7218 , ГОСТ ИСО/МЭК 17025 , .

К проведению исследований допускаются квалифицированные сотрудники, имеющие опыт работы с микроорганизмами I-II групп патогенности, изучившие методики микробиологических работ, вакцинированные против бешенства.

4.2 Требования безопасности

4.2.1 Общие требования безопасности при проведении работ согласно ГОСТ 12.1.008 .

4.2.2 Средства защиты работающих должны соответствовать требованиям ГОСТ 12.4.011 .

4.2.3 Воздух рабочей зоны должен соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.005 .

4.2.4 Обучение персонала безопасности труда в соответствии с ГОСТ 12.0.004 .

4.2.5 Утилизацию полученного для исследования материала, а также использованных индивидуальных средств защиты, инструментов и т.д. проводят путем кипячения в течение 30 мин или автоклавирования в течение 15 мин при давлении (0,11±0,20) МПа.

5 Средства измерений, оборудование, материалы, реактивы и животные

5.1 Для проведения исследований используют:

- спектрофотометр сканирующий со спектральным диапазоном измерения длин волн от 190 до 1100 нм с погрешностью не более ±0,5 нм и диапазоном измерения оптической плотности (ОП) от 0,1 до 3,0;

- планшеты для иммунологических реакций 96-луночные;

- термостат, обеспечивающий поддержание температуры от 20 °С до 50 °С;

- холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры от 0 °С до 10 °С по ГОСТ 16317 ;

- центрифугу лабораторную;

- баню водяную;

- микроскоп люминесцентный инвертированный по ГОСТ 8074 ;

- ступки фарфоровые с пестиком по ГОСТ 9147 или гомогенизатор по ГОСТ ИСО/МЭК 17025 ;

- стекла предметные по ГОСТ 9284 ;

- пробирки стеклянные по ГОСТ 25336 ;

- чашки Петри по ГОСТ 25336 ;

- кювету по ГОСТ 25336 ;

- пипетки вместимостью 1,0; 2,0 и 10,0 см по ГОСТ 29230 ;

- пипетки автоматические вместимостью от 0,05 до 0,20 см с наконечниками;

- пинцеты медицинские по ГОСТ 21241 ;

- шприцы инсулиновые вместимостью 1,0 см по ГОСТ 22967 или ГОСТ 24861 ;

- иглы инъекционные по ГОСТ 25046 ;

- стекла культуральные на восемь лунок;

- клетки для содержания мышей;

- ацетон по ГОСТ 2603 или ГОСТ 2768 ;

- флуоресцирующий антирабический иммуноглобулин (ФАГ);

- антирабический глобулин (АнГ);

- контрольный флуоресцирующий глобулин (КФГ);

- масло нефлуоресцирующее иммерсионное по ГОСТ 13739 ;

- воду дистиллированную по ГОСТ 6709 ;

- раствор фосфатно-буферный молярной концентрации 0,01 моль/дм (ФБР), рН 7,2-7,4;

- раствор натрия хлорида стерильный 0,9%-ный изотонический;

- культуру клеток мышиной нейробластомы CCL-131 или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1;

- пенициллин;

- стрептомицин;

- среду Игла МЕМ с двойным набором аминокислот и витаминов (ДМЕМ), рН 7,2;

- раствор трипсина 0,25%-ный;

- сыворотку эмбриональную крови крупного рогатого скота для культур клеток 10%-ную;

- глютамин 3%-ный:

- перекись водорода 3%-ную по ГОСТ 177 ;

- набор препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом ИФА;

- раствор серной кислоты молярной концентрации 2 моль/дм по ГОСТ 4204 ;

- бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026 ;

- штамп для приготовления лунок;

- мертиолят;

- агар "Дифко" или аналогичный;

- раствор метилового оранжевого 1%-ный в 50%-ном этиловом спирте;

- антигены положительный и отрицательный;

- сыворотку антирабическую или иммуноглобулин;

- мышей белых клинически здоровых массой 6-8 г.

5.2 Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов и материалов по качеству не ниже указанных выше. Допускается использование посуды одноразового применения.

6 Отбор проб

6.1 Для проведения исследований на наличие вируса бешенства в лабораторию направляют патологический материал - свежий труп или голову мелких животных, голову или головной мозг крупных животных.

6.2 Отобранный для исследований патологический материал упаковывают во влагонепроницаемую тару и доставляют в лабораторию в металлических контейнерах. Замороженный материал помещают в криоконтейнер.

6.3 Патологический материал сопровождают документом, содержащим следующие данные: наименование и адрес отправителя, вид животного, анамнестические и клинико-эпизоотологические данные.

6.4 Лабораторные исследования проводят сразу же при получении патологического материала.

6.5 Для исследования отбирают от крупных животных кусочки ткани из каждого отдела головного мозга (аммоновы рога, мозжечок, кору больших полушарий, продолговатый мозг) размером 0,5-1,0 см, мозг мелких животных, например мышей, исследуют целиком.

Для исследования МФА и методом выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или НГУК-1) пригодны только свежие или свежезамороженные пробы ткани головного мозга. Не допускаются для исследований пробы мозга животных, разлагающиеся (в стадии загнивания), консервированные глицерином, фиксированные метиловым спиртом, формалином или другими средствами, способствующими возникновению неспецифической флуоресценции.

Для постановки биопробы допускается использовать пробы мозга, консервированные в 30%-50%-ном растворе глицерина. Использование других консервантов не допускается. Для сохранности патологический материал может быть заморожен при температуре не выше минус 10 °С.

7 Метод флуоресцирующих антител (МФА)

7.1 Сущность метода

Сущность метода флуоресцирующих антител заключается в специфическом взаимодействии флуоресцирующих антирабических антител с гомологичным антигеном вируса бешенства. Образующийся при этом комплекс "антиген-антитело", меченный ФИТЦ, обнаруживается визуально по характерному свечению в поле зрения при рассмотрении под люминесцентным микроскопом.

7.2 Подготовка к исследованию

7.2.1 Подготовка проб

7.2.1.1 Из кусочков ткани, отобранных по 6.5, готовят не менее трех препаратов (отпечатков или мазков) из каждого отдела мозга на тщательно обезжиренных предметных стеклах. Если состояние патологического материала позволяет, то готовят отпечатки, в остальных случаях делают мазки.

7.2.1.2 Приготовление отпечатков

Кусочки ткани, отобранные по 6.5, кладут на фильтровальную бумагу, сложенную в четыре-шесть слоев. Мозг мелких животных разрезают поперек, захватывая все его отделы, и кладут его пинцетом срезом вверх на фильтровальную бумагу, сложенную в четыре-шесть слоев. К поверхности среза прикасаются предметным стеклом, слегка надавливая его до получения на стекле тонкого отпечатка.

7.2.1.3 Приготовление мазков

Кусочек ткани из каждого отдела мозга (у мелких животных весь мозг целиком), отобранный по 6.5, растирают в фарфоровой ступке пестиком до образования гомогенной массы, из которой делают мазки на предметных стеклах.

7.2.1.4 Для контроля делают мазки или отпечатки из мозга здоровых, не болевших бешенством и не вакцинированных против бешенства, белых мышей, как описано в 7.3.1.2 и 7.3.1.3.

7.2.1.5 После приготовления мазки или отпечатки высушивают на воздухе в течение 20-30 мин, фиксируют в охлажденном ацетоне при температуре 4 °С в течение 4-12 ч или при температуре минус 20 °С в течение 1 ч, после чего извлекают из ацетона и высушивают на воздухе в течение 10-15 мин.

7.2.2 Подготовка реактивов

ФАГ, АнГ и КФГ растворяют дистиллированной водой до указанного на этикетке ампулы первоначального объема. Срок хранения растворенных ФАГ, АнГ и КФГ при температуре (5±2) °С - не более двух недель.

Непосредственно для исследования необходимое количество растворенных ФАГ, АнГ и КФГ разводят ФБР до рабочего разведения, указанного на этикетке ампулы. Рабочие разведения растворенных ФАГ, АнГ и КФГ используют в день приготовления.

7.3 Проведение исследования

Предметные стекла с препаратами (мазками или отпечатками) по 7.2.1 помещают во влажную камеру (чашку Петри или кювету с увлажненным дном). Затем на один из трех приготовленных препаратов наносят ФАГ в рабочем разведении равномерно на всю поверхность мазка или отпечатка при помощи пипетки. На второй препарат наносят рабочее разведение КФГ. Закрывают камеру с препаратами, помещают в термостат при температуре (37±1) °С и выдерживают в течение 30 мин. Параллельно окрашивают контрольные препараты. По окончании окрашивания препараты трехкратно промывают, погружая их каждый раз на 10 мин в сосуд с ФБР, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе в течение 20-30 мин.

На третий препарат наносят рабочее разведение АнГ, помещают в термостат при температуре (37±1) °С и выдерживают в течение 30 мин. Затем препарат трехкратно промывают, погружая каждый раз на 10 мин в сосуд с ФБР, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе в течение 20-30 мин и окрашивают рабочим разведением ФАГ, как описано выше.


7.4 Обработка результатов

В окрашенных препаратах не пораженная вирусом бешенства мозговая ткань светится тусклым, серовато-желтым цветом.

Антиген вируса бешенства выявляется в нейронах и вне клеток в виде ярких зеленых гранул различной формы и величины - от едва заметных до имеющих размер в диаметре 15-20 мкм. Иногда отмечается большое количество мелких ярких зеленых частиц (размером до 1 мкм) округлой и овальной формы.

Диагноз бешенство считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа в исследуемом препарате обнаруживают типичные желтовато-зеленые гранулы. При этом в контрольных препаратах (в мазках или отпечатках из мозга здоровых не болевших бешенством белых мышей, окрашенных ФАГ), а также в исследуемых препаратах, окрашенных КФГ и предварительно обработанных АнГ и окрашенных ФАГ, подобных образований быть не должно.

О результатах исследования сообщают компетентным органам в соответствии с порядком, действующим на территории государства, принявшего стандарт.

В случае отрицательного результата проводят исследования по 8 или 9.

8 Метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1)

8.1 Сущность метода

Сущность метода заключается в выделении вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL31 или НГУК-1 с последующей его идентификацией методом флуоресцирующих антител.

Метод является альтернативным биопробе на белых мышах по 9.

8.2 Подготовка к исследованию

8.2.1 Подготовка проб

Равные части ткани, стерильно отобранные из каждого участка головного мозга мелкого животного (аммоновы рога, мозжечок, кора больших полушарий, продолговатый мозг), или кусочки ткани из каждого отдела головного мозга крупного животного, отобранные по 6.5, измельчают ножницами и растирают в ступке или гомогенизаторе, постепенно добавляя стерильный 0,9%-ный изотонический раствор натрия хлорида до получения 10%-ной суспензии. В суспензию мозга добавляют пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/см и 1 мг/см соответственно.

Полученную суспензию тщательно перемешивают и центрифугируют в течение 5-10 мин при скорости 2000 об./мин. Надосадочную жидкость переносят в стерильную пробирку и хранят при температуре не выше 4 °С до использования.

8.2.2 Подготовка культуральных стекол

Суточную культуру клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или НГУК-1) снимают с культурального флакона при помощи 0,25%-ного раствора трипсина и разводят средой ДМЕМ с 10%-ной эмбриональной сывороткой крови крупного рогатого скота и 3%-ным глютамином до концентрации 210 клеток/см. В лунки культурального стекла вносят по 0,1 см полученной суспензии клеток, накрывают крышкой и помещают во влажный -инкубатор с содержанием 5% при температуре (37±1) °С на 18-20 ч.

8.3 Проведение исследования

В две лунки культурального стекла по 8.2.2 вносят по 0,05 см суспензии из каждого отдела головного мозга. На каждом стекле оставляют две лунки для положительного и отрицательного контроля. В качестве положительного контроля используют суспензию мозга мыши, зараженной вирусом бешенства - штаммом CVS. В качестве отрицательного контроля вносят суспензию мозга клинически здоровой мыши. Культуральное стекло помещают во влажный -инкубатор с содержанием 5% при температуре (37±1) °С на 42-48 ч.

По окончании инкубации с помощью автоматической пипетки из лунок культурального стекла удаляют среду, один раз промывают клетки ФБР (с помощью автоматической пипетки вносят по 0,2 см раствора в каждую лунку) и подсушивают в ламинарном потоке воздуха в течение 20-30 мин. Затем в каждую лунку вносят по 0,1 см охлажденного до температуры минус 20 °С ацетона и оставляют при комнатной температуре на 30 мин.

После фиксации клеток культуральное стекло переворачивают и встряхивают для удаления ацетона, а затем высушивают в ламинарном потоке воздуха в течение 20-30 мин. С помощью скальпеля и пинцета удаляют пластиковую насадку и подсушивают стекло еще в течение 5-10 мин. В каждую лунку добавляют по 0,05-0,10 см ФАГ в рабочем разведении (подбирают опытным путем), приготовленном в ФБР, помещают во влажную чашку Петри и инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 30 мин.

По окончании окрашивания стекла трехкратно промывают, погружая их каждый раз на 10 мин в сосуд с ФБР. Затем препараты ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе в течение 20-30 мин.

На окрашенные препараты наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают в люминесцентном микроскопе.

8.4 Обработка результатов

В окрашенных препаратах не пораженная вирусом бешенства культура клеток светится тусклым, серовато-желтым цветом (отрицательный контроль). Антиген вируса бешенства выявляется в цитоплазме культуры клеток в виде ярких зеленых гранул различной формы и величины с четкими очерченными краями (положительный контроль).

Диагноз на бешенство считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа в исследуемом препарате обнаруживают типичные желто-зеленые гранулы.

Если в культуре клеток вирус бешенства не выявлен, то ставится отрицательный диагноз.

Результаты выделения вируса бешенства в культуре клеток окончательные, дальнейшие исследования не проводят.

9 Биопроба на белых мышах

9.1 Сущность метода

Сущность метода заключается в выделении вируса бешенства путем интрацеребрального введения патологического материала белым мышам с последующей идентификацией вируса методом флуоресцирующих антител по 7.

9.2 Подготовка проб к исследованию - по 8.2.1.

9.3 Проведение исследования

Пять-шесть белых мышей заражают 10%-ной суспензией патологического материала интрацеребрально в объеме 0,02-0,03 см. Зараженных мышей помещают в отдельную клетку, на которую наклеивают этикетку с указанием даты заражения, количества мышей, способа заражения и номера экспертизы патологического материала. Наблюдение за животными проводят не менее 30 дней. Количество здоровых, больных и погибших мышей регистрируют в журнале.

9.4 Обработка результатов

При оценке результатов учитывают наличие клинических признаков у зараженных мышей (взъерошенность шерсти, поедаемость корма, нарушение координации движения, параличи, тремор, прострация). Гибель мышей в первые двое суток после заражения не учитывают. Пробы мозга от больных и погибших животных, начиная с третьих суток, исследуют МФА по 7.

Биопробу считают положительной, если, начиная с третьих суток после заражения, заболела и погибла хотя бы одна мышь и в пробе мозга с помощью МФА обнаружены специфические включения вируса бешенства.

Отрицательный диагноз может быть дан только по истечении 30 сут наблюдения при условии, что все зараженные животные останутся живыми и здоровыми.

Результаты биопробы считаются окончательными, дальнейшие исследования не проводят.

10 Метод иммуноферментного анализа (ИФА)

10.1 Сущность метода

В основе ИФА лежит специфическое взаимодействие антигена вируса бешенства с антителом, иммобилизованным на твердом носителе. Связанный антиген выявляется с помощью второго антирабического антитела, меченного пероксидазой, продукт реакции которой окрашивается при добавлении хромогена. Интенсивность окрашивания продукта реакции прямо пропорциональна количеству антигена.

10.2 Подготовка к исследованию

10.2.1 В качестве исследуемого материала (антиген) используют пробы ткани головного мозга павших, вынужденно убитых, подозреваемых в заболевании бешенством или экспериментально зараженных вирусом бешенства животных.

10.2.2 Приготовление исследуемого антигена

Пробы ткани головного мозга, полученные по 6.5, измельчают, растирают в ступке и готовят 10%-ные суспензии в 0,9%-ном изотоническом растворе хлористого натрия, прогревают в водяной бане при температуре 60 °С в течение 15 мин и центрифугируют в течение 5-10 мин при скорости 2000 об./мин. Надосадочную жидкость используют в качестве исследуемого антигена.

10.2.3 Подготовка реагентов

Все растворы и реагенты перед постановкой реакции необходимо выдержать не менее 30 мин при температуре (22±1) °С.

Подготовку компонентов набора проводят согласно инструкции по применению.

10.3 Проведение исследования

10.3.1 ИФА проводят в сэндвич-варианте с использованием компонентов, входящих в набор для выявления антигена возбудителя бешенства в патологическом материале.

Для проведения ИФА используют планшеты для иммунологических реакций с плоским дном.

Объем ингредиентов, вносимых поэтапно в лунки планшета, равен между собой и составляет 0,1 см.

10.3.2 Сенсибилизация планшета

В лунки полистиролового планшета вносят АнГ в рабочем разведении, указанном на этикетке. Планшет с АнГ накрывают крышкой и инкубируют в термостате при температуре (37±0,5) °С в течение 3 ч или при температуре 4 °С в течение 18 ч. По окончании инкубации лунки планшета трехкратно промывают отмывающим буферным раствором. При каждой отмывке содержимое лунок вытряхивают, а остатки раствора удаляют постукиванием о фильтровальную бумагу.

10.3.3 Внесение антигенов

В ряды планшета A, B и C вносят отмывающий буфер. В лунки планшета вносят контрольные положительный (лунка A1) и отрицательный (лунка A2) антигены, входящие в состав набора, а также исследуемые пробы (лунки A3, A4 и т.д.) и титруют по вертикали, получая разведения от 1:2 до 1:8. При большом количестве проб заполняют и другие ряды планшета. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в термостате при температуре (37±0,5) °С в течение 1 ч. По окончании инкубации проводят трехкратную отмывку лунок планшета от не связавшихся с иммуноглобулином антигенов, как описано в 10.3.2.

10.3.4 Внесение антирабического пероксидазного конъюгата

В лунки планшета вносят антирабический пероксидазный конъюгат в рабочем разведении, после чего накрывают крышкой и инкубируют в термостате при температуре (37±0,5) °С в течение 1 ч. Затем лунки планшета трехкратно отмывают, как описано в 10.3.2.

10.3.5 Внесение субстратной смеси

Для проявления реакции в лунки планшета вносят готовую субстратную смесь. Реакцию проявляют в течение 15-30 мин при температуре (22±0,5) °С в темноте. Реакцию останавливают добавлением раствора серной кислоты молярной концентрации 2 моль/дм.

10.4 Обработка результатов

Учет реакции проводят визуально или на сканирующем спектрофотометре в соответствии с инструкцией по применению набора.

Если в субстратной смеси в качестве хромогена используют ОФД, то измерение оптической плотности проводят при 490 нм, если используют ТМБ, то при 450 нм.

Реакцию учитывают только в том случае, если в лунках с контрольным отрицательным антигеном специфическое окрашивание отсутствует при интенсивном окрашивании в лунках с контрольным положительным антигеном. При визуальном учете пробу считают положительной, если хотя бы в одном (первом) разведении наблюдается специфическое окрашивание.

При спектрофотометрическом учете результата ИФА проводят расчет коэффициента специфичности , который равен отношению оптической плотности (ОП) продукта реакции в лунках с контрольным положительным антигеном или исследуемым материалом (ОП) к оптической плотности субстратной смеси в лунках с контрольным отрицательным антигеном (ОП). Реакцию считают положительной, если коэффициент специфичности более 2,1 и отрицательной, если менее 2,1.

Пример

ОП 0,641, ОП 0,120, 5,34 - реакция положительная или ОП 0,180, ОП 0,120 1,5 - реакция отрицательная.

В случае положительной реакции диагноз считают установленным. Отрицательный результат должен быть подтвержден другими методами по 7-9.

11 Реакция диффузионной преципитации (РДП)

11.1 Сущность метода

Сущность метода РДП заключается в способности антител и вирусного антигена диффундировать в агаровом геле и при специфическом взаимодействии образовывать комплекс "антиген-антитело", наблюдаемый невооруженным глазом в виде линии преципитации.

11.2 Подготовка к исследованию

11.2.1 Подготовка проб

Подготовка проб к исследованию - по 8.2.1.

Для исследования допускаются несвежие пробы мозга животных, контаминированные бактериальной микрофлорой.

11.2.2 Подготовка агара

Для приготовления агара смешивают 1,5 г агара "Дифко", 1 см 1%-ного раствора метилового оранжевого в 50%-ном этиловом спирте, 0,01 г мертиолята, 100 см изотонического раствора натрия хлорида. Полученную смесь кипятят до полного расплавления агара, разливают по пробиркам, автоклавируют при давлении 0,5 атм в течение 30 мин и хранят в холодильнике при температуре 4 °С.

11.2.3 Подготовка предметных стекол (чашек Петри)

Реакцию ставят либо на предметных стеклах, либо на чашках Петри. На обезжиренное стекло наносят каплю расплавленного агара, равномерно распределяют ее по стеклу и оставляют при комнатной температуре на 20-30 мин для застывания агара. Затем наносят на стекло 2,5 см расплавленного агара, образуя слой толщиной около 2 мм, и оставляют на 20-30 мин. В застывшем слое агара с помощью специального штампа или металлической тонкостенной трубочки диаметром 4-5 мм делают лунки. Столбики агара осторожно извлекают, не повреждая и не допуская отслаивания от стекла тонкого слоя агарового геля, с помощью глазного пинцета или другого инструмента.

Чашки Петри готовят аналогично, внося в них 10-15 см расплавленного агара для получения слоя толщиной 2-3 мм.

11.3 Проведение исследования

Непосредственно перед постановкой реакции готовят разведения антирабической сыворотки (иммуноглобулина), для чего в четыре пробирки вносят по 1,0 см изотонического раствора натрия хлорида. В первую пробирку добавляют 1,0 см антирабической сыворотки, получая разведение 1:2, перемешивают, и переносят 1,0 см смеси во вторую пробирку и т.д. Таким образом, получают четыре пробирки с разведениями 1:2, 1:4, 1:8 и 1:16.

В приготовленные лунки вносят по 0,05-0,07 см пробы мозга (каждую пробу в отдельную лунку), полученной по 8.2.1, и разведения антирабической сыворотки или иммуноглобулина (1:2; 1:4; 1:8; 1:16) согласно рисунку 1.

Рисунок 1 - Схема внесения материала

Ар - аммонов рог; Пм - продолговатый мозг; А+ - положительный контрольный антиген; М - мозжечок; К - кора больших полушарий; А- - отрицательный контрольный антиген

Возможно применение других схем внесения материала, но при этом обязательно использование положительного и отрицательного антигенов.

Предметные стекла с исследуемым материалом помещают в чашки Петри с увлажненным дном или влажный эксикатор, а затем в термостат при температуре (37±1) °С на 48 ч (чашки Петри накрывают крышкой и помещают в термостат).

Реакцию учитывают через 6, 24 и 48 ч.

11.4 Обработка результатов

Реакцию считают положительной при появлении даже одной линии преципитации любой интенсивности между лунками, содержащими исследуемый материал и антирабическую сыворотку (иммуноглобулин).

При этом между положительным антигеном и антирабической сывороткой (иммуноглобулином) должна наблюдаться заметная линия преципитации, а между отрицательным антигеном и антирабической сывороткой (иммуноглобулином) линии преципитации быть не должно.

В случае положительной реакции диагноз считают установленным. Отрицательный результат должен быть подтвержден другими методами по 7-10.

Библиография

ЕС Guide to Good Manufacturing Practice for Medicinal Products for Human and Veterinary Use



УДК 619:616.98:579.852.1:615371 МКС 11.220

Ключевые слова: бешенство, диагностика, метод флуоресцирующих антител, иммуноферментный анализ, биопроба, реакция диффузионной преципитации

____________________________________________________________________________________

Электронный текст документа
подготовлен ЗАО "Кодекс" и сверен по:
официальное издание
М.: Стандартинформ, 2014

Бешенство - острая инфекционная болезнь, протекающая с тяжелым поражением нервной системы, как правило, с леталь­ным исходом. Восприимчивы человек и все млекопитающие жи­вотные.

Бешенство распространено повсеместно. Возбудителя инфек­ции передают собаки, кошки, дикие грызуны и хищники, а также кровососущие летучие мыши-вампиры.

Продолжительность инкубационного периода зависит от ме­ста и силы укуса, количества и вирулентности попавшего в рану вируса, резистентности покусанного животного. Инкубационный период длится от 1-3 нед до года и даже более.

Болезнь протекает остро. Клинические признаки ее в основ­ном одинаковы у всех животных, но наиболее типичны они у со­бак, у которых может наблюдаться как буйное, так и тихое (па­ралитическое) течение болезни. У крупного рогатого скота бе­шенство может протекать атипично (потеря аппетита, атония рубца, паралич глотки, слюнотечение). Стадии возбуждения мо­жет не быть.

Патологоанатомические изменения неспецифичны. У мясоедных (в основном у собак) в желудке можно обнаружить инородные предметы.

Вирус бешенства обладает выраженной нейропробазией. Про­никая с периферии (место укуса) по нервным стволам в централь­ную нервную систему центростремительно, он распространяется в организме центробежно по периферическим нервам и попадает в разные органы, включая слюнные железы.

Вирус относится к семейству Rhabdoviridae, родуLyssavirus . Вирионы имеют форму стержня с обрубленным концом. Вирион виру­са - РНК-содержащий со спиральным типом симметрии, имеет липопротеидную оболочку. Низкие температуры консервируют вирус. Температура 60 °С убивает его через 5-10 мин, солнечный свет - за 5-7 дней. Растворы формалина, фенола, соляной кислоты (5%-ные) инактивируют вирус за 5-10 мин.

Вирион вируса бешенства содержит гликопротеидный (наруж­ный) и нуклеокапсидный (внутренний) антигены. Гликопротеидный антиген индуцирует образование вируснейтрализующих анти­тел, а нуклеокапсидный - комплементсвязывающих и преципитирующих антител.

В организме вирус локализуется главным образом в централь­ной нервной системе, а также в слюнных железах и слюне.

Культи­вируется на мышах, кроликах, морских свинках и других живот­ных, а также в первичных культурах клеток (почки хомячка, эмбриона овец, телят и др.) и перевиваемых клетках. Размножение вируса в культурах клеток не всегда проявляется ЦПД. К вирусу бешенства после предваритель­ной адаптации восприимчивы и куриные эмбрионы. Вирус индуци­рует образование цитоплазматических телец-включений, которые чаще всего обнаруживают в клетках аммонова рога, мозжечка, коры головного мозга.



Источником инфекции являются больные животные. Они переда­ют вирус во время укуса. Плотоядные животные могут заражаться при поедании головного и спинного мозга погибших от бешенства животных. Доказана возможность заражения бешенством аэрогенным путем (в местах, где имеются летучие мыши). До 60-х годов основ­ным источником распространения бешенства были собаки и кошки, позднее лисицы, волки, корсаки и другие дикие животные.

Диагноз на бешенство ставят на основании эпизоотологических, клинических данных и результатов лабораторных исследований, име­ющих решающее значение.

При работе с больными животными и инфекционным мате­риалом необходимо строго соблюдать меры личной безопаснос­ти: надевать резиновые перчатки, халаты с нарукавниками, ре­зиновый или полиэтиленовый фартук, резиновые сапоги, защит­ные очки, защитную маску на лицо.

Вскрывать подозрительных на заболевание бешенством жи­вотных в полевых условиях запрещено.

Получение пат.материала . Для исследования на бешенство направляют в лабораторию свежие трупы мелких животных целиком, а от крупных и средних животных - голову с двумя первыми шейными позвонками. Трупы мелких животных перед отправкой на исследование обрабатывают инсектици­дами.

Патологический материал упаковывают в пластмассовые меш­ки, вкладывают в плотно закрывающиеся ящики с влагопоглощающей прокладкой, пропитанной дезинфектантом. Материал и сопроводительное письмо, в котором указаны отправитель и его адрес, вид животного, анамнестические данные и обоснование подозрений в заболевании животного бешенством, дата и подпись врача.

Лабораторная диагностика . Она включает: обнаружение вирус­ного антигена в РИФ и РДП, телец Бабеша-Негри и биопробы на белых мышах.



РИФ. Для данной реакции биопромышленность выпускает флуо­ресцирующий антирабический гамма-глобулин.

Методика постановки РИФ . На обезжиренных предметных стек­лах готовят тонкие отпечатки или мазки из различных отделов голов­ного мозга левой и правой стороны (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок, продолговатый мозг). Готовят не менее двух препаратов каждого отдела мозга. Можно также исследовать спинной мозг, подчелюстные, слюнные железы. Для контроля делают препараты из мозга здорового животного (обычно белой мыши).

Препараты высушивают на воздухе, фиксируют в охлажденном ацетоне (минус 20 °С от 4 до 12 ч), высушивают на воз­духе наносят Флуоресцирующий гамма-глобулин, помещают во влаж­ную камеру при 37 °С на 25-30 мин, затем тщательно промывают физиологическим раствором или фосфатным буфером с рН 7,4, спо­ласкивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе, нано­сят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают под люминесцентным микроскопом.

В препаратах, содержащих антиген вируса бешенства наблюдаются разной величины и формы флуорес­цирующий желто-зеленым цветом гранулы в нейронах , но чаще вне клеток.

В контроле подобного свечения не должно быть , нервная ткань обычно светится тусклым сероватым или зеленоватым цветом. Интенсивность свечения оценивают в крестах.

Отрицатель­ным считают результат при отсутствии специфической флуоресцен­ции.

Материал от животных, вакцинированных против бешенства, нельзя исследовать в РИФ в течение 3 мес. после прививки, так как может быть флуоресценция антигена вакцинного вируса.

В РИФ не подлежат исследованию ткани, консервированные глицерином, формалином, спиртом и

т. д., а также материал, име­ющий признаки даже незначительного загнивания.

РДП в агаровом геле . Метод основан на свойстве ан­тител и антигенов диффундировать в агаровом геле и при встрече образовывать видимые визуально линии преципитации (комплекс антиген +антитело). Применяют для обнаружения антигена в мозге животных, павших от уличного вируса бешенства, или при экспери­ментальной инфекции (биопроба).

Бешенство – это крайне опасное вирусное заболевание, характеризующееся тяжелым поражением головного и спинного мозга. Оно часто заканчивается летальным исходом.

Бешенство встречается у всех млекопитающих и передается с биологическими жидкостями, в основном со слюной. Человек, как правило, заражается им в результате укуса инфицированного животного, чаще всего собаки, кошки, кролика, хорька, лисицы, волка, енота, летучей мыши и др.

На начальном этапе заболевание проявляется усиленным слюноотделением и боязнью воды, а также угнетенным состоянием, которое сменяется приступами агрессии и возбуждения.

Людям, входящим в группу риска развития бешенства, необходимо проходить вакцинацию.

К сожалению, появление симптомов заболевания неизбежно заканчивается летальным исходом, так что лечение предполагает лишь облегчение состояния больного.

Синонимы русские

Рабиес, гидрофобия, водобоязнь.

Синонимы английские

Rabies, Hydrophobia, Canine madness, Lyssa, Madnessan.

Симптомы

Обычно бешенство не вызывает никаких симптомов вплоть до последней стадии заболевания, когда лечение уже невозможно. Инкубационный период (от заражения до появления симптомов) составляет от 7 дней до 1 года, в среднем 20-90 дней. Признаки заболевания часто появляются за несколько дней до смерти больного:

  • перед появлением основных симптомов на месте укуса может возникать припухлость, покраснение, зуд,
  • лихорадка,
  • головная боль, недомогание,
  • потеря аппетита, тошнота, рвота, понос,
  • беспокойство, нарушения сна,
  • депрессия,
  • повышенная чувствительность к слуховым, зрительным раздражителям,
  • угнетенное состояние сознания, тревожность, апатия сменяются приступами возбуждения, беспокойства, агрессии. Приступы возбуждения при этом сопровождаются учащением дыхания и сердцебиения,
  • расстройства дыхания и глотания,
  • гидрофобия – боязнь воды (при разговоре о ней или при попытке попить больной испытывает ужас, у него возникают болезненные спазмы глотки и гортани),
  • чрезмерное слюноотделение,
  • галлюцинации,
  • судороги,
  • частичный паралич.

Общая информация о заболевании

Бешенство – это опасное вирусное заболевание, которое характеризуется тяжелым поражением центральной нервной системы (головного и спинного мозга). На начальном этапе оно протекает бессимптомно, симптомы появляются на поздней стадии, когда лечение уже невозможно.

Распространенность бешенства зависит от степени вакцинированности домашних животных. Наиболее распространено оно в сельской местности и чаще возникает в летний период.

Бешенство может поражать всех млекопитающих и передается с биологическими жидкостями, в основном со слюной. У человека заражение бешенством, как правило, происходит в результате укуса зараженным животным, попадания слюны зараженного животного на поврежденную кожу, слизистую оболочку рта, носа, глаз. Значительно реже бешенство передается при употреблении инфицированного мяса. От человека к человеку заболевание не переходит, крайне редко может встречаться заражение через пересадку органов от инфицированных доноров.

Чаще всего человек заражается от домашних животных – от собак, кошек, кроликов, лошадей, хорьков, реже – от диких – лисиц, енотовидных собак, волков, енотов, летучих мышей и др. Дикие животные, в свою очередь, заражают бешенством домашних.

После того как вирус попадает в организм через кожу или слизистую оболочку, он по нервным волокнам достигает спинного и головного мозга, где фиксируется и начинает делиться. Возникает энцефалит – воспаление головного мозга. Это приводит к повышению рефлекторной возбудимости и к развитию параличей. Затем вирус распространяется по нервным волокнам в обратном направлении, попадая в печень, почки, надпочечники, кожу, сердце, слюнные железы, скелет, вызывая нарушение деятельности нервной системы и нарушение функций различных органов.

Скорость распространения вируса зависит от расположения укуса (при укусах головы, рук она будет высокой), его глубины, от количества возбудителей, попавших в рану, от активности микроорганизмов, от иммунного статуса инфицированного человека.

Инкубационный период заболевания в среднем составляет 20-90 дней, однако может варьироваться от недели до одного года. При появлении симптомов летальный исход, как правило, неизбежен.

Смерть обычно наступает в результате поражения дыхательного центра, что влечет за собой остановку дыхания.

Кто в группе риска?

  • Подвергшиеся укусам домашних или диких животных.
  • Жители сельской местности, держащие дома животных, не вакцинированных от бешенства.
  • Путешествующие по развивающимся странам (по Африке, Юго-Восточной Азии).
  • Выезжающие на природу и контактирующие с дикими животными (лисицами, енотами, летучими мышами и др.)
  • Охотники, звероловы.
  • Служащие зоопарков, питомников, приютов для животных.
  • Ветеринары.
  • Работающие с вирусом бешенства в лаборатории.

Диагностика

Диагноз "бешенство" предполагается при наличии симптомов заболевания после укуса животного и подтверждается исследованием образца кожи с затылка, выделением вируса из слюны, слезной и спинномозговой жидкости.

Лабораторные исследования

  • Общий анализ крови (без лейкоцитарной формулы и СОЭ) . Уровень лейкоцитов может быть повышен.
  • Общий анализ мочи . При бешенстве может отмечаться значительное увеличение числа лейкоцитов в моче при отсутствии бактериального воспаления.
  • Исследование крови, направленное на определение антител к возбудителю бешенства. В ходе анализа с помощью специального иммунофлюоресцентного окрашивания выявляется наличие в крови молекул, вырабатываемых иммунной системой в ответ на попадание в организм вируса бешенства. Диагноз подтверждается при значительном (4 и более раза) повышении количества (титра) антител к вирусу бешенства у больных, которые не подвергались вакцинации.
  • Определение возбудителя бешенства в биологических жидкостях и тканях организма.
    • Исследование биоптатов (фрагментов тканей) кожи затылка, отпечатков роговицы. В полученный материал добавляются меченые антитела (молекулы, специфически связывающиеся с молекулой вируса бешенства). Под воздействием ультрафиолетового излучения комплекс из вирусов, "склеенных" с антителами, дает характерное зеленоватое свечение, что говорит о присутствии вируса бешенства во взятом материале. Данный анализ является наиболее достоверным в течение первой недели заболевания.
    • Исследование генетического материала вируса методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Может использоваться слюна, кровь, спинномозговая жидкость, а также пораженные ткани. Достоверность результатов приближается к 100 %.
    • Исследование тканей мозга в ходе электронной микроскопии. Производится взятие участка ткани мозга (биопсия), который затем подвергается специальному окрашиванию и изучается под электронным микроскопом, который позволяет достичь очень высокой степени увеличения. При этом в пораженных вирусом бешенства клетках нервной ткани выделяются специальные включения или обнаруживается сам вирус.

Другие методы исследования

  • Электроэнцефалография (ЭЭГ) – это метод, оценивающий электрические потенциалы головного мозга.

Лечение

Специфического лечения бешенства не существует. Как правило, заболевание неизлечимо и приводит к летальному исходу.

При укусе дикого животного проводится промывание, тщательный осмотр на предмет инородных тел (например, сломанных зубов) и хирургическая обработка раны. Затем срочно вводятся иммуноглобулины – специальные клетки иммунной системы. Далее в течение двух недель проводится вакцинирование пациента (всего применяется 5 вакцин). Только этот способ позволяет предотвратить заболевание.

После укуса за домашним животным необходимо наблюдать в течение примерно 10 дней и при появлении симптомов бешенства срочно обратиться к врачу для принятия мер по иммунизации пациента. Источник бешенства – больное животное – необходимо изолировать.

Лечение бешенства направлено на облегчение его симптомов – снятие судорог, уменьшение боли. Для этого применяются, соответственно, противосудорожные, обезболивающие, успокаивающие лекарственные препараты.

Для уменьшения контакта с потенциальными раздражителями больной помещается в специальную палату.

Восполняются потери жидкости, минеральных веществ; проводится искусственная вентиляция легких.

Профилактика

  • Людям, входящим в группу риска развития бешенства, следует обязательно пройти вакцинацию.
  • После укуса дикого животного необходимо тщательно промыть рану водой с мылом и срочно обратиться к врачу, чтобы пройти курс иммунизации и вакцинации против бешенства.
  • Профилактическая вакцинация домашних животных.
  • Домашних животных следует держать дома и контролировать их при нахождении на улице. Для этого могут применяться клетки и закрытые загоны. Это поможет избежать заражения домашних животных от диких. Следует уделить особое внимание кроликам, морским свинкам, хомякам и другим мелким питомцам, так как они не могут быть вакцинированы против бешенства. Нередко домашнее животное заражается за городом, где у него есть возможность контактировать с дикими, например коты, собаки могут убегать в лес и контактировать там с инфицированными грызунами, лисицами.
  • Следует соблюдать правила общения при встрече с бродячими животными – не трогать их, не гладить во избежание укуса.
  • Необходимо избегать контакта с дикими животными (например, лисами, енотами). Здоровые дикие животные сами избегают людей, поэтому зверь, который не боится людей и не пытается убежать, должен вызвать подозрение.
  • Поводом для обращения к врачу может стать и укус домашнего животного, например в случае если вы не знаете, может ли быть оно заражено бешенством, и тем более если животное в течение нескольких дней после укуса погибло.
  • Общий анализ крови
  • Общий анализ мочи

Литература

  • Dan L. Longo, Dennis L. Kasper, J. Larry Jameson, Anthony S. Fauci, Harrison"s principles of internal medicine (18th ed.). New York: McGraw-Hill Medical Publishing Division, 2011.
  • Manning SE, Rupprecht CE, Fishbein D, et al. Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. MMWR Recomm Rep. May 23 2008;57:1-28.
  • Hemachudha T. Human rabies: clinical aspects, pathogenesis, and potential therapy. Curr Top Microbiol Immunol. 1994;187:121-43.
  • Gerald L. Mandell. Mandell, Douglas, and Bennett"s Principles and Practice of Infectious Diseases: Expert Consult Premium Edition. Churchill Livingstone, 2009.

Бешенство представляет собой вирус, передающийся человеку через инфицированное животное вследствие укуса или путем попадания зараженной слюны. Данное заболевание не поддается лечению, ведь до сих пор медицина не нашла противодействие подобному заражению. Бешенство начинает проявляться только через несколько дней, летальный исход наступает через пару дней после начала заражения. Дабы не столкнуться с этой проблемой, можно предотвратить ее появление путем вакцинации. Так же прививка может оказать противодействие в первые же часы после укуса.

При укусе животным необходимо незамедлительно сдать анализ на бешенство. Данный вирус передается человеку от зараженного животного. Наиболее распространенные случаи заражения от диких не привитых животных (лисица, волк, мышь, енот) или домашних, которые не были привиты в течение года(собака, кошка, рогатый скот).

Заразиться от больного животного можно в процессе следующих обстоятельств:

  • во время укуса зараженного животного;
  • при попадании слюнных выделений на слизистую человека или поврежденные участки кожи. Это может быть рана или обычная царапина.

При любом виде контакта со слюной зараженного животного, необходимо незамедлительно обратиться в медицинское учреждение для проведения профилактических мер, так как лечению данный вид заражения не поддается. Не исключено заражение в процессы вдыхания воздуха или частиц пыли, которые содержат инфекцию, в медицинской практике есть случаи инфицирования в процессе обработки лисьих шкур. Контакт с фекалиями или мочой больного животного не грозит заболеванием, то же самое касается и неповрежденной кожи. Мясо без обработки не содержит в себе вируса, профилактика после употребления необработанного мяса не нужна.

Важно знать, что вирус бешенства не передается от людей к человеку, поэтому не нужно опасаться такого человека, нужно своевременно ему помочь.

Симптоматика

Инфицирование не сопровождается симптомами мгновенно, для их выявления может понадобиться несколько дней, но на этой стадии любые действия по спасению будут уже бессмысленны. Инкубационный период в среднем бывает около месяца, но может достигать и года. Каким же образом проявляется бешенство? Наиболее выраженные признаки:

  • отек, зуд, покраснение на месте укуса животным;
  • лихорадка, повышение температуры тела;
  • отсутствие сил, постоянная усталость, недомогание;
  • частые головные боли;
  • нарушение нормального сна, бессонница;
  • обострение к зрительным и слуховым раздражителям;
  • судороги;
  • депрессивное настроение, чувство апатии;
  • постоянная смена страха и тревоги на агрессию и беспокойство;
  • расстройства в работе дыхательной системы и проблемы с глотанием;
  • учащение сердечного ритма, одышка;
  • увеличение слюноотделения;
  • неясность сознания, галлюцинации;
  • паралич конечностей или другой части тела.

Инкубационный период

Данный период представляет собой промежуток от заражения вирусом до момента появления первых признаков недуга. Он длиться в течение месяца, но диапазон составляет от пары дней до целого года. Такие случаи крайне редки и случаются один раз на миллион случаев.

Скорость развития инкубационного периода напрямую зависит от расположения инфекции к головному мозгу. Чем ближе данный вирус, тем быстрее наступит неминуемая гибель. Укус лица или плеча будет способствовать более быстрому развитию событий, инкубационный период в таком случае может наступить уже через пару дней. Этот период крайне важен для человека, потому что за это время нужно успеть сдать кровь и узнать результаты анализа на бешенство у человека. Оперативная вакцинация дает шанс на спасение жизни.

Последующая симптоматика

После первых видимых проявлений наступают более выраженные признаки заражения. Существует две разновидности бешенства, которое прогрессирует:

  • в большинстве случаев, в 80 из 100 наступает буйное бешенство;
  • тихое бешенство, его еще называют паралитическое. Оно встречается реже.

Заключительная стадия – острый неврологический период.

Буйный тип заражения

В период буйного бешенства у людей может наблюдаться несвойственное им гиперактивное поведение, которое сменяется относительным непродолжительным спокойствием. Люди в этот момент ведут себя странно. Могут проявляться следующие признаки данного типа:

  • возбуждение, часто граничащее с агрессией и озлобленностью. Человек может начать драку, наносить вред, не задумываясь о последствиях;
  • усиленное слюноотделение, неконтролируемое;
  • жар, высокая температура тела, горячка;
  • чрезмерная потливость;
  • галлюциногенные всплески, путаница в реальности;
  • мурашки, волосы на коже становятся дыбом;
  • стойкая эрекция у мужчин.

Во время буйства у людей, зараженных вирусом бешенства, может развиваться боязнь воды – гидрофобия. Возникают затруднения в дыхательной системе, появляются трудности с глотанием. Во время глотания мышцы охватывают спазм, что делает невозможным совершение такого знакомого рефлекса. Спазм может длиться всего несколько секунд, но повторяется при очередной попытке. Далее человек боится совершать попытки из-за страха снова испытать спазм. Могут так же проявляться и другие фобии, например, страх воздуха или яркого света.

Уже через пару дней человек впадает в кому, организм испытывает легочную или сердечную недостаточность и вскоре погибает.

Тихое бешенство

Такой тип вызван слабостью в мышечной структуре. Мышцы не только теряют силу, но и лишены чувствительности, а иногда и частично парализованы. Например, в кистях или стопах может возникнуть легкое онемение, перерастающее в неспособность двигать какими-то элементами конечностей. Такой недуг может распространиться по всему телу и полностью обездвижить человека.

Фобии при таком типе бешенства обычно не возникают. Участь человека все также предопределена: вначале кома, затем летальный исход.

Диагностические исследования

Чтобы врач мог диагностировать бешенство, необходимо подтвердить его следующими данными:

  1. Факт взаимодействия с зараженным или бездомным животным, которое не было привито в течение года. Под контактом подразумевается взаимодействие со слюной больного животного, укус, обработка ран и пр.
  2. Первые проявления инфицирования.
  3. Материалы для анализа зараженного или подозрительного животного при возможности.
  4. Результаты обследования человека с признаками бешенства.

При диагностике используют следующие способы обследования:

  1. Забор тканей участка кожи для выявления антител в борьбе с вирусным заболеванием. Ткани берут с задней поверхности шеи либо же, как материал используется отпечаток роговицы глаза.
  2. ПЦР. Материал для исследования – слюна или спинномозговая жидкость. Но такой анализ довольно дорогостоящий и выполняется не во всех лабораториях.
  3. Исследование спинномозговой жидкости и анализ крови на определение уровня моноцитов.
  4. Исследование участков головного мозга, которое доступно только после констатации смерти больного. В ходе подтверждения диагноза в нервных клетках находятся точки – тельца Негри, которые однозначно свидетельствуют о бешенстве.

Лечение заражения

Эффективных методов для лечения проявлений бешенства человечество до сих пор не открыло. Ранее все люди, независимо от своевременности обращения к врачу, заканчивали смертью. Но современная медицина предлагает использовать вакцинацию не только как профилактические меры, но и в качестве противодействия во время инкубационного периода заражения.

В истории есть только пара случаев выздоровления после комплекса противовирусного медикаментозного воздействия, однако в реальной жизни это работает крайне редко и почти никого не спасает от гибели.

Эффективность лечения возможна только сразу же после укуса, в процессе заражения. Своевременные действия могут обезопасить от развития симптоматики и смерти, но нельзя медлить. При заражении вирусом бешенства важна каждая минута, ведь именно она может стоить человеческой жизни.

Вызываемое вирусом бешенства. При том не только для самого питомца, но и для его окружения (владельца и остальных членов семьи). Вирус вызывает воспаление головного мозга у человека и животных. Особенно восприимчивы к заболеванию лисицы, волки, кошки, крупный и мелкий рогатый скот, собаки, овцы, козы, лошади и др. Домашние животные и человек заражаются при укусе больного бешенством животного или от попадания слюны на поврежденный участок кожи, слизистые оболочки или в глаза. Слюна может стать заразной за 10 суток до появления признаков бешенства.
В настоящее время существуют описания других путей передачи: воздушно-капельный способ (алиментарный - через пищу и воду) и трансплацентарный способ (через плаценту в период беременности).
Вирус, распространяясь по нервным путям, достигает слюнных желёз и нервных клеток коры головного мозга и, поражая их, вызывает тяжёлые необратимые нарушения.

Заболевание бешенством животных регистрируют на всем земном шаре (исключением являются лишь Япония, Австралия и Великобритания).

К сожалению, Россия не входит в список исключений. Москва и Московская область также являются благоприятной средой для возникновения заболеваний бешенством у домашних и диких животных.
Вирус нестоек во внешней среде - погибает при нагревании до 56 градусов за 15 минут, а при кипячении за 2 минуты. Вирус бешенства также чувствителен к ультрафиолетовым и прямым солнечным лучам. Однако, вирус бешенства устойчив к низким температурам и антибиотикам.

Инкубационный период во время заражения бешенством может длиться от нескольких суток до нескольких месяцев (в среднем 3-6 недель). Бешенство у человека может протекать даже до года. Проявлению клинической картины предшествует скрытый (инкубационный) период. Животное в это время также опасно.

Симптомы и признаки бешенства у животных

Признаки заболевания бешенством могут появиться у животного спустя пару недель после укуса бешеного животного или контакта с вирусом. Обращайте внимание на поведение питомца. Любое неадекватное и неестественное поведение животного должно вас насторожить и быть более наблюдательными. В некоторых случаях может повыситься температура.
Как известно, дикие животные боятся человека. В случае заболевания дикие звери могут приближаться к дому и даже нападать на домашний скот и людей. Поэтому, если ваш питомец начал вести себя агрессивно или чрезмерно ласково, то это серьезный звоночек, чтобы не рисковать и вызвать ветеринарного специалиста для обследования и диагностики на вероятность заболевания бешенством.

Часто неспецифичная симптоматика и ненадежная прижизненная диагностика должны исключать варианты «на авось», т.к. речь идет о летальных последствиях не только для питомца, но и с большой вероятностью для владельца.

Диагностика бешенства у животных

Диагноз ставится на основе комплексных данных и лабораторных анализов. 100% надежного способа прижизненной диагностики бешенства у животных, применяемых в ветеринарной практике, на сегодняшний день не существует.
Прижизненно вирусный антиген может быть выявлен с помощью МФА в отпечатках роговицы больных бешенством животных. А также, вирус может быть выделен из некоторых тканей и жидкостей организма. Но все же отрицательный результат данного метода не исключает все таки возможность заражения бешенством.
При посмертной диагностики бешенства у животных результаты точнее, т.к. применяются другие методы. Например, одним из точных патологоанатомических диагнозов при исследовании головного мозга является обнаружение специфических включений (телец Бабеша-Негри). Также важнейшим методом остается биопроба - интрацеребральное заражение.
Препятствием для диагностирования бешенства у животных является также наличие различных форм протекания заболевания. Ветеринарные врачи условно поделили проявление бешенства на три формы (некоторые формы имеют разные стадии).


Формы развития и протекания бешенства у животных (клиническая картина):

Буйная форма бешенства:
1 Стадия. Животное избегает людей, прячется в темном и укромном месте. Может проявляться атипичное поведение - повышенная ласковость или пассивная агрессия. При этом возможно проявление зуда на месте укуса. Животное может разлизывать или выкусывать место проникновения вируса (нанесенной травмы). Аппетит снижается. Появляются рвота, слюнотечение и галлюцинации. Затрудняется акт глотания.
2 Стадия. Появляется ярко выраженная агрессия. Нарастает беспокойство, появляется склонность к поеданию несъедобных предметов. Неосознанное стремление к движению. Животное может кусать свое тело (самотравматизм), грызть окружающие предметы, амуницию, землю. Нападение на других животных и даже на хозяина. Питомец не может глотать воду. Из-за этого обильное и неконтролируемое слюноотделение. Прием пищи невозможен. Проявление судорожных припадков. Наступает частичная парализация мускулов лица и групп конечностей. В результате чего развивается косоглазие, нижняя челюсть отвисает, язык выпадает из пасти.
3 Стадия (терминальная — паралитическая). Депрессивное состояние. Сильное истощение организма, развитие паралича. Питомец почти постоянно лежит и впадает в коматозное состояние и кому. Смерть наступает в результате остановки дыхания на фоне паралича дыхательной мускулатуры.

Тихая форма бешенства:
Тихая форма характеризуется развитием паралича, слюнотечением, неспособностью принимать пищу. Через 2 - 4 дня питомец погибает. Фаза возбуждения (неистовства) кратковременна или отсутствует.

Атипичная форма бешенства:
Атипичная форма (сложная диагностируется). Возможно появление диареи или атонии кишечника. Возможно кратковременное улучшение состояния с последующими прогрессирующими неврологическими симптомами. В результате питомец погибает. Данная стадия протекания бешенства может длиться до 3-х месяцев и больше.

У крупного рогатого скота превалирует тихая форма. Возбуждение в этом случае выражено слабо, отмечают хриплое мычание, слюнотечение, шаткую походку, быстро развиваются параличи конечностей. Нередко атипичное течение - отказ от корма, атония преджелудков, частые позывы на дефекацию, приступы судорог, затем развиваются параличи. При буйной форме в момент припадка животные рвутся с привязи, ревут, роют землю, бросаются на стены, нападают на других животных своего вида, особенно агрессивны в отношении собак.
У овец и коз болезнь протекает почти так же, как у крупного рогатого скота, но параличи развиваются быстрее (на вторые сутки).
У лошадей и свиней преобладает буйная форма.

Профилактика бешенства у животных

Самым действенным и эффективным способом профилактики бешенства животных является вакцинация. По закону РФ ежегодная вакцинация обязательна для всех домашних и сельскохозяйственных животных. Сегодня имеется большой выбор вакцин от бешенства у животных, как импортных, так и отечественных производителей. Современные вакцины обеспечивают формирование иммунитета в течение трех лет. Ежегодная вакцинация от бешенства животных не представляет опасности для здорового питомца.