Діагностична реакція аглютинації. Лекція з мікробіології "Імунні реакції. Застосування імунних реакцій у діагностиці інфекційних захворювань". Реакції антиген-антитіло та їх застосування

У цих реакціях беруть участь антигени у вигляді частинок (мікробні клітини, еритроцити та інші корпускулярні антигени), які склеюються антитілами та випадають у осад.

Для постановки реакції аглютинації(РА) необхідні три компоненти: 1) антиген (аглютиноген);

2) антитіло (аглютинін)

3) електроліт (ізотонічний розчин хлориду натрію).

Орієнтовна реакція аглютинації (РА)

Орієнтовна або пластинчаста РА ставиться на предметному склі при кімнатній температурі. Для цього пастерівською піпеткою на скло наносять окремо краплю сироватки в розведенні 1:10 - 1:20 та контрольну краплю ізотонічного розчину натрію хлориду. У ту і іншу бактеріологічну петлю вносять колонії або добову культуру бактерій (краплю діагностикуму) і ретельно перемішують їх. Реакції враховують за кілька хвилин візуально, іноді за допомогою лупи (х5). При позитивній РА у краплі із сироваткою відзначають появу великих і дрібних пластівців, при негативній – сироватка залишається рівномірно каламутною.

Рис. 2. Орієнтовна реакція аглютинації.

Розгорнута реакція аглютинаціїз метою виявлення титру специфічних антитіл у хворого.

Розгорнута РА для серодиагностики ставиться у сироватці хворих. Її розводять і ізотонічному розчині натрію хлориду від 1:50 - 1:100 до 1:800 або 1: 1600. Так як у нижчих титрах сироватки можуть перебувати нормальні аглютиніни, що є у здорових людей або хворих з іншим діагнозом (діагностичний ти. Як антиген у цій реакції використовують діагностикуми - свідомо відомі суспензії, як правило, убитих бактерій.

В аглютинаційні пробірки попередньо розливають по 1 мл ізотонічного розчину хлориду натрію. У першу з них доливають 1 мл сироватки, розведеної 1:100, змішавши її, 1 мл переносять у другу, з другої - в третю і т.д. В отримані дворазові розведення сироваток (від 1:100 до 1:1600 і більше) вносять по 1-2 краплі суспензії бактерій, що містить 3 млрд. мікробних тіл в 1 мл. Пробірки струшують і поміщають у термостат при 37°З 2 години, потім витримують добу при кімнатній температурі.

Облік реакції розгорнутої аглютинації роблять, оцінюючи послідовно кожну пробірку, починаючи з контрольних, при обережному струшуванні. У контрольних пробірках аглютинації не повинно бути. Інтенсивність реакції аглютинації відзначають такими знаками: ++++ - повна аглютинація (пластівки аглютинату в абсолютній прозорій рідині); +++ - неповна аглютинація (пластівки у слабоопалесцирующей рідини); ++ - часткова аглютинація (пластівці чітко помітні, рідина злегка каламутна); + - слабка, сумнівна аглютинація - рідина дуже каламутна, пластівці в ній погано помітні; - - відсутність аглютинації (рідина рівномірно каламутна).

За титр сироватки приймають останнє її розведення, в якому інтенсивність аглютинації оцінюється не менш як два плюси (++)

Рис. 7. Розгорнута реакція аглютинації.

Реакція непрямої (пасивної) гемаглютинації (РНГА, РПГА)

Реакція ставиться:

1) для виявлення полісахаридів, білків, екстрактів бактерій та інших високодисперсних речовин, рикетсій та вірусів, комплекси яких з аглютинінами у звичайних РА побачити не вдається,

2) для виявлення антитіл у сироватках хворих до цих високодисперсних речовин та найдрібніших мікроорганізмів.

Під непрямою або пасивною аглютинацією розуміють реакцію, в якій антитіла взаємодіють з антигенами, попередньо адсорбованими на інертних частинках (латекс, целюлоза, полістерол, оксид барію та ін. або еритроцити барана, I(0)-групи крові людини)

У реакції пасивної гемаглютинації (РПГА) як носій використовують еритроцити. Навантажені антигеном еритроцити склеюються у присутності специфічних антитіл до цього антигену і випадають осад. Сенсибілізовані антигеном еритроцити використовують у РПГА як еритроцитарний діагностикум для виявлення антитіл (серодіагностика). Якщо навантажити еритроцити антитілами (еритроцитарний антільний діагностикум), можна застосовувати виявлення антигенів.

Рис. 3. Схема РПГА: еритроцити (1), навантажені антигеном (3), зв'язуються специфічними антитілами (4).

Постановка. У лунках полістиролових планшетів готують низку послідовних розведень сироватки. У передостанню лунку вносять - 0,5 мл свідомо позитивної сироватки та в останню 0,5 мл фізіологічного розчину (контролі). Потім у всі лунки додають по 0,1 мл розведеного еритроцитарного діагностикуму, струшують і поміщають термостат на 2 год.

Облік. У позитивному випадку еритроцити осідають на дні лунки у вигляді рівного шару клітин зі складчастим або зазубреним краєм (перевернутий парасольку), у негативному - осідають у вигляді гудзика або кільця.

Рис.4. Облік РНДА (РПДА).

Врахування результатів РНГА, поставленої з метою виявлення ботулотоксину.

Збудник ботулізму - Clostridium botulinum виробляє токсини семи сероварів (А, B, C, D, E, F, G), проте найчастіше зустрічаються серовари А, В, Е. Всі токсини відрізняються за антигенними властивостями і можуть бути диференційовані в реакціях типоспецифічними сироватками . Для цієї мети можна поставити реакцію пасивної (непрямої) гемаглютинації із сироваткою хворого, в якій передбачається наявність токсину, та еритроцитами, навантаженими антитілами антитоксичних протиботулінічних сироваток типів А, В, Е. Контролем служить нормальна сироватка.

Рис. 3. Постановка та результат РНДА.

Облік. У позитивному випадку еритроцити осідають на дні лунки у вигляді рівного шару клітин зі складчастим або зазубреним краєм (перевернутий парасольку), у негативному - осідають у вигляді гудзика або кільця.

Висновок: У сироватці хворого виявлено ботулотоксин тип Е.

Реакція гальмування гемаглютинації (РТГА).

Рис. 8. Реакція гальмування гемаглютинації (РТГА) (схема).

Принцип реакції заснований на здатності АТ пов'язувати різні віруси та нейтралізувати їх, позбавляючи можливості аглютинувати еритроцити. Візуально цей ефект і проявляється у «гальмуванні» гемаглютинації. РТГА застосовують при діагностиці вірусних інфекцій для виявлення специфічних антигемагглютинінів та ідентифікації різних вірусів за їх гемагглютиніном, що виявляє властивості Аг.

Типування вірусу проводять реакції РТГА з набором типоспецифічних сироваток. Результати реакції враховують за відсутністю гемаглютинації. Підтипи вірусу типу А з антигенами H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 та інші можуть бути диференційовані в РТГА з набором гомологічних типоспецифічних сироваток

Рис. 9. Результати РТГА при типуванні вірусу грипу

Умовні позначення: - гальмування гемаглютинації (гудзик); - гемаглютинація (парасолька).

Висновки: Досліджуваний матеріал містить вірус грипу тип А з антигеном H3N2

Лекція №16

Словник

НЕПОСЕРЕДНИЙ -прямо наступний без чогось, без наступних ланок.

ПОПЕРЕДЖЕНО- Через інші клітини, не прямо.

ЗНИЖУВАТИ ≠ ЗБІЛЬШУВАТИ (активність клітин).

Зторгнути –не прийняти, відкинути. Організм відкинув трансплантований орган.

Реакція імунітету.

Реакції імунітету – це реакції специфічної взаємодії (зв'язування) антигену та антитіла або антигену та сенсибілізованого Т-лімфоциту.

Ці реакції протікають in vitro (у пробірці) та in vivo (у живому організмі).

У цих реакціях бере участь сироватка (serum), тому вони називаються серологічні.

Реакції імунітету використовуються для діагностики інфекційних захворюваньПри цьому невідомий компонент визначається за відомим компонентом, що засноване на специфічності взаємодії антигену з антитілом. Якщо відомо антитіло, то можна виявити (виявити) невідомий антиген. Якщо ж відомий антиген, то по ньому можна виявити невідомі антитіла.

Таким чином, реакції імунітету використовуються:

1) для серологічної діагностики (серодіагностики) захворювань -виявлення у сироватці крові хворих людей антитіл до певного збудника інфекційного захворювання (відомого антигену); якщо в сироватці крові хворої людини є антитіла до якого-небудь збудника, то саме цей збудник і викликав дане інфекційне захворювання;

2) для серологічної ідентифікації (сероідентифікації) мікробів -для встановлення виду збудника захворювання за допомогою імунних діагностичних сироваток (відомих антитіл); якщо антитіла пов'язують збудника, виділеного від хворої людини, цей мікроб ідентичний тому, яким імунізували тварини при отриманніімунної діагностичної сироватки .

Реакції імунітету протікають у 2 фази:

1) специфічна фаза- поєднання активного центру антитіла з детермінантною групою антигену з утворенням комплексів антиген-антитіло; ця фаза протікає швидко, але немає видимого ефекту;

2) неспецифічна фаза- Поява видимого ефектувзаємодії антигену та антитіла – випадання осаду(аглютинація) або помутніння(преципітація), що дозволяє побачитиосвіта комплексів антиген-антитілоі зробити висновок про відповідноантигену та антитіла один одному.

До реакцій імунітету відносяться реакція аглютинації (РА), реакція преципітації (РП), реакція зв'язування комплементу (РЗК).

Реакція аглютинації- це склеювання та випадання в осад мікробних або інших клітин (еритроцитів) під дією антитіл у присутності електроліту. Видимий ефект реакції (феномен аглютинації) – утворення осаду, що називається аглютинатом.

Цю реакцію використовують для серодіагностикиі сероідентифікації. РА використовують для серодіагностики (виявлення антитіл у сироватці крові хворих) черевного тифу та паратифу(Реакція Відаля), бруцельозу(Реакція Райта), туляремії та лептоспірозу. РА використовують для сероідентифікації (визначення виду збудника, виділеного від хворого) при кишкових інфекціях, кашлюку, холеріта ін.

Компонентиреакції:

1. А нтиген (аглютиноген) -це цілі (не зруйновані) мікробні або інші клітини ( корпускулярний, нерозчинний антиген). Аглютиногени– це завись живихабо вбитихмікробних клітин або інших клітин. Антигени можуть бути як невідомими, і відомими. Невідомий аглютиноген - це мікробна культура, виділена з організму хворого, яку необхідно визначити. Відомий антиген - діагностикум- діагностичний препарат - завись убитихмікробів відомого видуу фізіологічному розчині. Ця завись каламутна (непрозора)), т.к. мікробні клітини не розчиняються, а залишаються цілими. Відомий аглютиноген використовуватиметься для виявлення невідомих антитіл у сироватці крові хворих.

2. Антитіло (аглютинін)– перебуває у сироватці крові. Антитіла можуть бути як невідомими, так і відомими. Невідомі антитіла, які потрібно визначити, перебувають у сироватці крові хворої людини. Відомі антитіла знаходяться в імунних діагностичних сироваткахякі називаються аглютинуючими сироватками. Вони застосовуються для сероідентифікації, тобто. визначення невідомого антигену – виду мікробної культури.

3. Електроліт- 0,9% розчин хлориду натрію.

Отримання діагностикуму.

Вирощену на скошеному агарі чисту культуру збудника відомого виду (наприклад, збудника черевного тифу) змивають 3-4 мл ізотонічного розчину, поміщають у стерильну пробірку, яким-небудь способом вбивають мікроби (наприклад, кип'ятінням і визначають густоту (має бути 3 млрд. мікробних клітин) в 1 мл) Якщо мікробні клітини вбивають високою температурою, отримують О-діагностикум (О-антиген), якщо ж її обробляють формаліном, то отримують Н-діагностикум (Н-антиген).

Приклади діагностикумів: сальмонельозний діагностикум, бруцельозний діагностикум, туляремійний діагностикум.

Отримання аглютинуючих сироваток.

Тваринам (частіше кроликам) 5 – 7 разів через проміжки часу парентерально вводять у дозах, що зростають, мікробні діагностикуми ( проводять гіперімунізацію)а потім у них відбирають сироватку крові, в якій містяться антитіла до тих мікробів, з яких приготовлений діагностикум. Якщо імунізацію проводять О-діагностикумом, то одержують О-аглютинуючі сироватки (містять О-антитіла), якщо Н-діагностикумом – Н-аглютинуючі сироватки.

Аглютинуючі сироватки можуть бути неадсорбованимиабо нативними та адсорбованими.

Неадсорбовані сироваткимістять групові антитіла до декількох близьких видів мікробів.

Адсорбовані сироваткимістять антитіла до одного чи кількох антигенів одного виду мікроба. Якщо сироватки містять антитіла тільки одного антигену, вони називаються монорецепторнимиабо моновалентними,якщо до кількох антигенів – груповимиадсорбованими сироватками .

Приклади аглютинуючих сироваток:сальмонельозна монорецепторна Н-аглютинуюча сироватка, сальмонельозна групова адсорбована О-аглютинуюча сироватка, протихолерна О-аглютинуюча сироватка та ін..

Титраглютинуючої сироватки – найбільше розведення сироватки, при якому ще виявляється реакція аглютинації з антигеном (титр залежить від кількості антитіл у крові: чим більше антитіл, тим вищий титр сироватки).

Методи постановки РА.

1. Орієнтовна (пластинчаста) РА- Проводиться на склі. На предметне скло наносять 2 краплі сироватки та 1 краплю ізотонічного розчину. В одну з крапель сироватки і краплю ізотонічного розчину петлею вносять мікробну культуру і перемішують. Крапля ізотонічного розчину з мікробами – контроль антигену, крапля сироватки без мікробів – контроль антитіла, крапля сироватки з мікробами – досвід.Якщо в сироватці є антитіла, що відповідають мікробним антигенам, які з нею змішуються, то антитіла та антигени специфічно зв'язуватимуться один з одним і через 1 – 3 хв у дослідній краплі з'являться пластівці аглютинату. Контроль антигену має бути каламутним, а контроль антитіла – прозорим. Облік результатів реакції проводиться за появою пластівців аглютинату . Якщо випадають пластівці – реакція позитивна, тобто. антиген відповідає антитілу і антигеном можна визначити антитіло або навпаки. Якщо залишається помутніння – негативна реакція.

2. Розгорнута реакція аглютинації –проводиться у пробірках. Спочатку готують 2-разові розведення сироватки крові хворої людини від 1:50 до 1:1600. У 6 пробірок наливають по 1 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. У першу пробірку вносять 1 мл сироватки крові хворого у розведенні 1:50, перемішують і одержують розведення 1:100, потім 1 мл розведення 1:100 переносять у другу пробірку та одержують розведення 1:200 і т.д. Дві пробірки залишають для контролю антигену та сироватки. У контроль сироватки додають тільки сироватку в розведенні 1:50, контроль антигену - тільки антиген. У решту всіх пробірок додають 0,1 мл антигену - діагностикуму (Про- або Н-) і ставлять всі пробірки в термостат при 37°С на 18-20 годин. Облік результатів реакції проводять за характером, кількістю осаду, що утворився (аглютинату) і ступеня каламутності. Облік проводять лише за наступних результатів у контролю: контроль сироватки – прозорий, контроль антигену – каламутний. О-антитіла дають дрібнозернистий осад. Н-антитіла – крупнозернистий. По останній пробірці, в якій ще видно реакцію аглютинації, встановлюють діагностичний титр.

При серодіагностицізахворювань важливо непросто виявити специфічні антитіла до певного збудника, а й виявити їх кількість, тобто. встановити такий титр антитіл, доколи можна говорити про наявність захворювання, викликаного цим збудником . Цей титр називається діагностичним титром.Наприклад, для діагностики черевного тифу потрібно виявити титр антитіл – 1:400, але не менше. Ще більш точні результати дає виявлення наростання антитіл у парних сироватках.Сироватку хворого відбирають на початку захворювання та через 3 – 5 або більше днів. Якщо титр антитіл зростає не менше, ніж у 4 рази, отже, можна говорити про поточному захворюванні.

Якщо розгорнута реакція аглютинації ставиться для сероідентифікації, то використовують діагностичні аглютинірующие сироватки, розведені до титру або до половини їх титру. РА вважається позитивною, якщо аглютинація виявляється у розведенні, близькому до титру діагностичної сироватки.

1.1. РЕАКЦІЯ АГГЛЮТИНАЦІЇ (РА)

РЕАКЦІЯ АГГЛЮТИНАЦІЇ (РА)

Завдяки своїй специфічності, простоті постановки та демонстративності, реакція аглютинації набула широкого поширення в мікробіологічній практиці для діагностики багатьох інфекційних захворювань.

Реакція аглютинації заснована на специфічності взаємодії антитіл (аглютинінів) з цілими мікробними або іншими клітинами (аглютиногенами). В результаті такої взаємодії утворюються частинки ¦ агломерати, що випадають в осад (аглютинат) у вигляді пластівців.

У реакції аглютинації можуть брати участь як живі, так і вбиті бактерії, спірохети, гриби, найпростіші, рикетсії, а також еритроцити та інші клітини. Реакція протікає у дві фази: перша (невидима) специфічна, з'єднання антигену і антитіл, друга (видима) неспецифічна, склеювання антигенів, тобто. утворення аглютинату.

Аглютинат утворюється при з'єднанні одного активного центру двовалентного антитіла з групою детермінантної антигену. Реакція аглютинації, як будь-яка серологічна реакція, протікає у присутності електролітів.

Зовнішній прояв позитивної реакції аглютинації має двоякий характер. У безжгутикових мікробів, що мають тільки соматичний антиген, відбувається склеювання безпосередньо самих мікробних клітин. Така аглютинація називається дрібнозернистою. Він відбувається протягом 18-22 годин. v

У джгутикових мікробів є два антигени соматичний О антиген і джгутиковий Н антиген. Якщо клітини склеюються джгутиками, утворюються великі пухкі пластівці і така реакція аглютинації називається крупнозернистою. Вона настає протягом 2…4 годин.

Реакцію аглютинації можна ставити як з метою якісного та кількісного визначення специфічних антитіл у сироватці крові хворого, так і з метою визначення видової приналежності виділеного збудника. v

Реакцію аглютинації можна ставити як у розгорнутому варіанті, що дозволяє працювати з розведеною сироваткою до діагностичного титру, так і у варіанті постановки орієнтовної реакції, що дозволяє в принципі виявити специфічні антитіла або визначити видову приналежність збудника.

При постановці розгорнутої реакції аглютинації, з метою виявлення в сироватці крові специфічних антитіл, що обстежується, досліджувану сироватку беруть у розведенні 1:50 або 1:100. Це зумовлено тим, що в цілісній або малорозведеній сироватці можуть бути нормальні антитіла в дуже високій концентрації, і тоді результати реакції можуть бути неточними. Досліджуваним матеріалом у цьому варіанті постановки реакції є кров хворого.

Кров беруть натще або не раніше ніж через 6 годин після їжі (інакше в сироватці крові можуть бути крапельки жиру, що роблять її каламутною та непридатною для дослідження). Сироватку крові хворого зазвичай отримують на другому тижні захворювання, набираючи стерильно з ліктьової вени 3…4 мл крові (до цього часу концентрується максимальна кількість специфічних антитіл). Як відомий антиген використовується діагностикум, приготований з убитих, але не зруйнованих мікробних клітин конкретного виду з конкретною антигенною структурою.

При постановці розгорнутої реакції аглютинації з метою визначення видової, типової приналежності збудника антигеном є живий збудник, виділений з досліджуваного матеріалу. Відомими є антитіла, що містяться в імунній діагностичній сироватці. v

Імунну діагностичну сироватку одержують із крові вакцинованого кролика. Визначивши титр (максимальне розведення, в якому виявляються антитіла), діагностичну сироватку розливають ампули з додаванням консерванту. Цю сироватку і використовують для ідентифікації антигенної структури виділеного збудника.

ВАРІАНТИ РЕАКЦІЇ АГГЛЮТИНАЦІЇ

Для постановки реакції аглютинації (РА) необхідні три компоненти: 1) антиген (аглютиноген); 2) антитіло (аглютинін) та 3) електроліт (ізотонічний розчин натрію хлориду).

ОРІЄНТУВАЛЬНА (ПЛАСТИНЧАТА) РЕАКЦІЯ АГГЛЮТИНАЦІЇ (РА)

Орієнтовна або пластинчаста РА ставиться на предметному склі при кімнатній температурі. Для цього пастерівською піпеткою на скло наносять окремо краплю сироватки в розведенні 1:10 1:20 і контрольну краплю ізотонічного розчину натрію хлориду. У ту і іншу бактеріологічну петлю вносять колонії або добову культуру бактерій (краплю діагностикуму) і ретельно перемішують їх. Реакції враховують за кілька хвилин візуально, іноді за допомогою лупи (х5). При позитивній РА в краплі з сироваткою відзначають появу великих і дрібних пластівців, при негативній сироватка залишається рівномірно каламутною.

РЕАКЦІЯ НЕПРЯМОЇ (ПАСИВНОЇ) ГЕМАГЛЮТИНАЦІЇ (РНГА, РПГА)

Реакція ставиться: 1) для виявлення полісахаридів, білків, екстрактів бактерій та інших високодисперсних речовин, рикетсій та вірусів, комплекси яких з аглютинінами у звичайних РА побачити не вдається, або 2) для виявлення антитіл у сироватках хворих до цих високодисперсних речовин та мілин.

Під непрямою, або пасивною, аглютинацією розуміють реакцію, в якій антитіла взаємодіють з антигенами, попередньо адсорбованими на інертних частинках (латекс, целюлоза, полістерол, оксид барію та ін. або еритроцити барана, I(0) групи крові людини).

У реакції пасивної гемаглютинації (РПГА) як носій використовують еритроцити. Навантажені антигеном еритроцити склеюються у присутності специфічних антитіл до цього антигену і випадають осад. Сенсибілізовані антигеном еритроцити використовують у РПГА як еритроцитарний діагностикум для виявлення антитіл (серодіагностика). Якщо навантажити еритроцити антитілами (еритроцитарний антільний діагностикум), можна застосовувати виявлення антигенів.

Постановка. У лунках полістиролових планшетів готують низку послідовних розведень сироватки. У передостанню лунку вносять 0,5 мл свідомо позитивної сироватки і в останню 0,5 мл фізіологічного розчину (контролі). Потім у всі лунки додають по 0,1 мл розведеного еритроцитарного діагностикуму, струшують і поміщають у термостат на 2 год.

Облік. У позитивному випадку еритроцити осідають на дні лунки у вигляді рівного шару клітин зі складчастим або зазубреним краєм (перевернутий парасольку), в негативному осідають у вигляді гудзика або кільця.

1.2. РЕАКЦІЯ НЕЙТРАЛІЗАЦІЇ. ЛІЗИСА,
ОПСОНО ФАГОЦИТАРНА РЕАКЦІЯ, РЕАКЦІЯ ПІДВИЩЕНОЇ ЧУВЧИСНОСТІ

РЕАКЦІЯ НЕЙТРАЛІЗАЦІЇ ЕКЗОТОКСИНУ АНТИТОКСИНОМ (РН)

Реакція ґрунтується на здатності антитоксичної сироватки нейтралізувати дію екзотоксину. Вона застосовується для титрування антитоксичних сироваток та визначення екзотоксин.

При титруванні сироватки до різних розведень антитоксичної сироватки додається певна доза відповідного токсину. При повній нейтралізації антигену та відсутності невитрачених антитіл настає ініціальна флокуляція. Реакцію флокуляції можна застосовувати не тільки для титрування сироватки (наприклад, дифтерійної), але і для титрування токсину та анатоксину. Реакція нейтралізації токсину антитоксин має велике практичне значення як метод визначення активності антитоксичних лікувальних сироваток. Антигеном у цій реакції є справжній екзотоксин.

Сила антитоксичної сироватки визначається умовними одиницями АЕ.

1 АЕ ботулінової сироватки - її кількість нейтралізує 1000 DLM ботулінового токсину. Реакцію нейтралізації з метою визначення видової або типової приналежності екзотоксину (при діагностиці правця, ботулізму, дифтерії та ін.) можна проводити in vitro (за Рамоном), а при визначенні токсигенності мікробних клітин у гелі (по Оухтерлоні).

Реакція лізису (РЛ)

Однією із захисних властивостей імунної сироватки є її здатність розчиняти мікроби або клітинні елементи, що надходять до організму.

Специфічні антитіла, що зумовлюють розчинення (лізис) клітин, називаються лізинами. Залежно від характеру антигену вони можуть бути бактериолизинами, цитолизинами, спирохетолизинами, гемолизинами та інших.

Лізини проявляють свою дію тільки в присутності додаткового фактора комплементу. Комплемент, як фактор неспецифічного гуморального імунітету, виявлений майже у всіх рідинах організму, крім спинномозкової рідини та рідини передньої камери ока. Досить високий та постійний вміст комплементу відзначено у сироватці крові людини і дуже багато його у сироватці крові морської свинки. В інших ссавців вміст комплементу в сироватці крові по-різному.

Комплемент - це складна система сироваткових протеїнів. Він нестійкий і руйнується за 55 градусів протягом 30 хвилин. За кімнатної температури комплемент руйнується протягом двох годин. Дуже чутливий до тривалого струшування, до дії кислот та ультрафіолетових променів. Однак, комплемент тривалий час (до шести місяців) зберігається у висушеному стані при низькій температурі. Комплемент сприяє лізису мікробних клітин та еритроцитів.

Розрізняють реакцію бактеріолізу та гемолізу.

Суть реакції бактеріолізу полягає в тому, що при з'єднанні специфічної імунної сироватки з відповідними гомологічними їй живими мікробними клітинами в присутності комплементу відбувається лізис мікробів.

Реакція гемолізу у тому, що з впливу еритроцити специфічної, імунної стосовно них сироваткою (гемолітичної) у присутності комплементу, спостерігається розчинення еритроцитів, тобто. гемоліз.

Реакція гемолізу в лабораторній практиці використовується для визначення тиру комплементу, а також для врахування результатів діагностичних реакцій зв'язування комплементу. Титр комплементу - це найменша його кількість, яка обумовлює лізис еритроцитів протягом 30 хвилин у гемолітичній системі в обсязі 2,5мл. Реакція лізису, як і всі серологічні реакції, відбувається в присутності електроліту.

РЕАКЦІЇ ГІПЕРЧУВНОСТІ (АЛЕРГІЧНІ)

Певні форми антигену при повторному контакті з організмом можуть викликати реакцію, специфічну у своїй основі, але включає неспецифічні клітинні та молекулярні фактори гострої запальної відповіді. Відомі дві форми підвищеної реактивності: гіперчутливість негайного типу (ГНТ) та гіперчутливість уповільненого типу (ГЗТ). Перший тип реакції проявляється за участю антитіл, при цьому реакція розвивається не пізніше 2 годин після повторного контакту з алергеном. Другий тип реалізується за допомогою Т?клітин запалення, (Тгзт) як основних ефекторів реакції, що забезпечують накопичення в зоні запалення макрофагів, реакція проявляється через 6?8 год і пізніше.

Розвитку реакції гіперчутливості передує зустріч із антигеном і виникнення сенсибілізації, тобто. поява антитіл, активно сенсибілізованих лімфоцитів та пасивно сенсибілізованих цитофільними антитілами інших лейкоцитів (макрофагів, гранулоцитів).

Реакції гіперчутливості мають три фази розвитку: імунологічну; патохімічну; патофізіологічну.

У першій, специфічній, фазі алерген взаємодіє з антитілами та (або) сенсибілізованими клітинами. У другій фазі відбувається викид біологічно активних речовин із активованих клітин. Медіатори, що звільнилися (гістамін, серотонін, лейкотрієни, брадикінін та ін.) викликають різні периферичні ефекти, властиві відповідному типу реакції третя фаза.

Реакція підвищеної чутливості четвертого типу

Реакції цього типу обумовлені патогенними міжклітинними взаємодіями сенсибілізованих Тхелперів, цитотоксичних Тлімфоцитів (Ткілерів) та активованих клітин системи мононуклеарних фагоцитів, викликаних тривалою стимуляцією системи імунітету бактеріальними антигенами, при якій виникає відносна недостатність інфекційних захворювань Дані реакції підвищеної чутливості обумовлюють туберкульозні каверни легень, їх казеозний некроз та загальну інтоксикацію у пацієнтів із туберкульозом. Шкірний грануломатоз при туберкульозі та проказі у морфопатогенетичному відношенні багато в чому складається реакціями підвищеної чутливості четвертого типу.

Найбільш відомий приклад реакції підвищеної чутливості четвертого типу - це реакція Манту, що розвивається в місці внутрішньошкірного введення туберкуліну хворому, організм і система якого сенсибілізовані до антигенів мікобактерій. Внаслідок реакції утворюється щільна гіперемована папула з некрозом у центрі, яка з'являється лише через кілька годин (уповільнено) після внутрішньошкірного введення туберкуліну. Формування папули починається з виходу із судинного русла у міжклітинні простори мононуклеарних фагоцитів циркулюючої крові. Одночасно починається еміграція із судинного русла поліморфонуклеарів. Потім інфільтрація нейтрофілами спадає, і інфільтрат починає переважно складатися з лімфоцитів і мононуклеарних фагоцитів. Цим реакція Манту відрізняється від реакції Артюса, коли у місці поразки накопичуються переважно полиморфонуклеарные лейкоцити.

При реакціях підвищеної чутливості четвертого типу тривала стимуляція антигенами сенсибілізованих лімфоцитів призводить в місцях патологічних змін тканин до патологічно інтенсивного і тривалого вивільнення Тхелперами цитокінів. Інтенсивний викид цитокінів у локусах тканинних ушкоджень зумовлює гіперактивацію клітин системи мононуклеарних фагоцитів, що знаходяться там, багато з яких у гіперактивованому стані утворюють тяжи епітеліоїдних клітин, а деякі зливаються між собою з утворенням гігантських клітин. Макрофаги, на поверхні яких експоновані бактеріальні та вірусні антигени можуть знищуватися через функціонування Ткілерів (натуральних кілерів).

Реакція підвищеної чутливості четвертого типу індукується розпізнаванням чужорідного бактеріального антигену сенсибілізованими по відношенню до нього Т хелперами. Необхідна умова розпізнавання: взаємодія індукторів з антигенами, експонованими на поверхні антиген, що презентують клітин після ендоцитозу та переробки мононуклеарними фагоцитами чужорідних імуногенів. Ще одна необхідна умова – експонування антигенів у комплексі з молекулами І класу з головного комплексу тканинної сумісності. Після розпізнавання антигену сенсибілізовані хелпери вивільняють цитокіни і, зокрема, інтерлейкін 2, що активує натуральні кілери та мононуклеарні фагоцити. Активовані мононуклеарні фагоцити вивільняють протеолітичні ферменти та вільні кисневі радикали, що ушкоджує тканини.

Шкірно¦алергічні проби тести на встановлення сенсибілізації організму до алергенів, визначення його інфікованості, наприклад, туберкульозом, бруцельозом, рівня колективного імунітету, наприклад, туляремії. За місцем введення алергену розрізняють: 1) нашкірні проби; 2) скарифікаційні; 3) внутрішньошкірні; 4) підшкірні. Клінічна реакція на алерген при шкірноалергічній пробі поділяються на місцеві, загальні та вогнищеві, а також на негайні та уповільнені.

Місцеві реакції медіаторного типу ГНТ виникають через 520 хв, виражаються у вигляді еритеми і пухиря, зникають через кілька годин, оцінюються плюсовим методом за величиною еритеми, що вимірюється в мм. Місцеві реакції ГЗТ виникають через 24 48 год, тримаються довго, проявляються у вигляді інфільтрату, іноді з некрозом в центрі, оцінюються за величиною інфільтрату в мм, також за плюсовою системою. При цитотоксичному та імунокомплексному типах ГНТ гіперемія та інфільтрація відзначаються через 3?4 год, досягають максимуму на 6?8 год і затихають приблизно через добу. Іноді спостерігаються комбіновані реакції.

1.3. РЕАКЦІЯ ЗВ'ЯЗУВАННЯ КОМПЛЕМЕНТУ (РСК)

Цю реакцію застосовують при лабораторних дослідженнях для виявлення антитіл у сироватці крові при різних інфекціях, а також для ідентифікації збудника антигенної структури.

Реакція зв'язування комплементу відноситься до складних серологічних реакцій і відрізняється високою чутливістю та специфічністю.

Особливістю цієї реакції є те, що зміна антигену при його взаємодії зі специфічними антитілами відбувається лише у присутності комплементу. Комплемент адсорбується тільки на комплексі «антитіло антиген». Комплекс «антитіло антиген» утворюється тільки в тому випадку, якщо між антигеном і антитілом, що знаходиться в сироватці, є спорідненість.

Адсорбція комплементу на комплексі «антиген - антитіло» може по-різному позначитися на долі антигену в залежності від його особливостей.

Деякі з антигенів піддаються за цих умов різким морфологічним змінам, аж до розчинення (гемоліз, феномен Ісаєва Пфейфера, цитолітична дія). Інші змінюють швидкість пересування (іммобілізація трепонему). Треті гинуть без різких деструктивних змін (бактерицидна чи цитотоксична дія). Нарешті адсорбція комплементу може і не супроводжуватися змінами антигену, легко доступними для спостереження.

За механізмом РСК протікає у дві фази:

Перша фаза - це утворення комплексу «антиген - антитіло» і адсорбція на цьому комплексі комплементу. Результат фази візуально не бачимо (взаємодія антигену та антитіл за обов'язкової участі комплементу).
Друга фаза - це зміна антигену під впливом специфічних антитіл у присутності комплементу. Результат фази може бути візуально видимим або не видимим (виявлення результатів реакції за допомогою індикаторної гемолітичної системи (еритроцити барана і гемолітична сироватка).

Руйнування еритроцитів гемолітичною сироваткою відбувається лише у разі приєднання комплементу до гемолітичної системи. Якщо ж комплемент адсорбувався раніше на комплексі антиген антитіло, то гемоліз еритроцитів не настає.

Результат досвіду оцінюють, відзначаючи наявність чи відсутність гемолізу у всіх пробірках. Реакцію вважають позитивною при повній затримці гемолізу, коли рідина в пробірці безбарвна і еритроцити осідають на дно, негативною при повному лізисі еритроцитів, коли рідина інтенсивно забарвлена («лакова» кров). Ступінь затримки гемолізу оцінюють залежно від інтенсивності фарбування рідини та величини осаду еритроцитів на дні (++++, +++, ++, +).

У разі, коли зміни антигену залишаються недоступними для візуального спостереження, доводиться використовувати другу систему, яка виконує роль індикатора, що дозволяє оцінити стан комплементу і зробити висновок результат реакції.

Ця індикаторна система представлена компонентами реакції гемолізу, у складі якої знаходяться баранячі еритроцити та гемолітична сироватка, що містить до еритроцитів специфічні антитіла (гемолізини), але не містить комплемент. Ця індикаторна система додається в пробірки за годину після постановки основної РСК. Якщо реакція зв'язування комплементу позитивна, то утворюється комплекс антитіло антиген», що адсорбує на собі комплемент. Оскільки комплемент використовується в кількості необхідної тільки для однієї реакції, а лізис еритроцитів може статися тільки за наявності комплементу, то при його адсорбції на комплексі «антиген антитіло», лізис еритроцитів в гемолітичній (індикаторній) системі не відбудеться. Якщо реакція зв'язування комплементу негативна, комплекс «антиген антитіло» не утворюється, комплемент залишається вільним, і при додаванні гемолітичної системи настає лізис еритроцитів.

1.4. ДНК ЗОНДИ. ПОЛІМЕРАЗНО | ЛАНЦЮПНА РЕАКЦІЯ (ПЛР),
ІМУНО ФЕРМЕНТНИЙ МЕТОД (ІФА), МЕТОД ФЛУОРЕСЦІЙНИХ АНТИТЕЛ (МФА)

МЕТОДИ ГЕННОГО ЗОНДУВАННЯ

Інтенсивний розвиток молекулярної біології та створення досконалої методичної бази генетичних досліджень стали основою генетичної інженерії. В діагностиці виникло і бурхливо розвивається напрямок з визначення специфічних нуклеотидних послідовностей ДНК і РНК, так зване генне зондування. В основі подібних методик лежить здатність нуклеїнових кислот до гібридизації утворення дволанцюгових структур за рахунок взаємодії комплементарних нуклеотидів (АТ, ГЦ).

Для визначення послідовності ДНК (або РНК) спеціально створюється, так званий, зонд полінуклеотид з певною послідовністю підстав. До його складу вводять спеціальну мітку, що дозволяє ідентифікувати утворення комплексу.

Хоча генне зондування не можна зарахувати до методів імунохімічного аналізу, основний його принцип (взаємодія комплементарних структур) методично реалізується тими самими способами, як і індикаторні методи імунодіагностики. Крім того, методи генного зондування дозволяють заповнити інформацію про інфекційного агента без його фенотипної експресії (віруси, вбудовані в геном, «мовчі» гени).

Для проведення аналізу ДНК пробу піддають денатурації з метою отримання одноланцюгових структур, з якими і реагують молекули ДНК або РНК зонду. Для приготування зондів використовують різні ділянки ДНК (або РНК), виділені з природного джерела (наприклад, того чи іншого мікроорганізму), як правило представлені у вигляді генетичних послідовностей у складі векторних плазмід, або хімічно синтезовані олігонуклеотиди. У деяких випадках як зонд застосовують препарати геномної ДНК, гідролізованої на фрагменти, іноді препарати РНК, особливо часто рибосомальна РНК. Як мітки використовують ті ж індикатори, що і при різних видах імунохімічного аналізу: радіоактивні ізотопи, флуоресцеїни, біотоп (з подальшим проявом комплексом авідінфермент) і т.п.

Порядок проведення аналізу визначається властивостями наявного зонда

В даний час все частіше застосовуються комерційні набори, що містять усі необхідні інгредієнти.

У більшості випадків процедуру проведення аналізу можна розділити на наступні стадії: підготовка зразків (у тому числі екстракція та денатурація ДНК), фіксація проби на носії (найчастіше полімерний мембранний фільтр), передгібридизація, власне гібридизація, відмивання продуктів, що не зв'язалися, детекція. За відсутності стандартного препарату ДНК або РНК зонду попередньо проводиться його отримання та введення мітки.

Для підготовки проби може бути потрібне попереднє «підрощування» досліджуваного матеріалу для ідентифікації окремих колоній бактерій або збільшення концентрації вірусів у клітинній культурі. Проводиться безпосередній аналіз зразків сироватки крові, сечі, формених елементів крові або цільної крові на присутність інфекційного агента. Для звільнення нуклеїнових кислот зі складу клітинних структур проводять лізис клітин, а деяких випадках очищають препарат ДНК з допомогою фенолу.

Денатурація ДНК, тобто перехід її в одноланцюгову форму, відбувається при обробці лугом. Потім зразок нуклеїнових кислот фіксують на носії нітроцелюлезної або нейлонової мембрани, зазвичай шляхом інкубації від 10 хв до 4 год при 80 ° С у вакуумі. Далі в процесі передгібридизації досягається інактивація вільних місць зв'язування для зменшення неспецифічної взаємодії зонда з мембраною. Процес гібридизації займає від 2 до 20 год, залежно від концентрації ДНК у зразку, концентрації використовуваного зонда та його розміру.

Після закінчення гібридизації і відмивання незв'язаних продуктів проводиться детекція комплексу, що утворився. Якщо до складу зонда входить радіоактивна мітка, то прояви реакції мембрану експонують з фотоплівкою (ауторадиографія). Для інших тегів використовують відповідні процедури.

Найбільш перспективним є отримання нерадіоактивних (так званих холодних) зондів. На цій основі розвивається методика гібридизації, що дозволяє встановлювати наявність патогену в препаратах зрізів, пунктатів тканини, що особливо важливо при патоморфологічному аналізі (гібридизація insitu).

Істотним етапом у розвитку методів генного зондування стало використання полімеразної реакції ампліфікації (ПЛР). Цей підхід дозволяє збільшити концентрацію певної (заздалегідь відомої) послідовності ДНК у пробі з допомогою синтезу численних копій in vitro. Для проведення реакції до досліджуваного зразка ДНК додають препарат ферменту ДНК полімерази, надлишок дезоксинуклеотидів для синтезу і, так звані, праймери два типу олігонуклеотидів величиною 20 25 основ, відповідних кінцевим ділянкам послідовності ДНК, що цікавить. Один з праймерів повинен бути копією початку ділянки зчитування кодуючого ланцюга ДНК при напрямку зчитування 53, а другий копією протилежного кінця ланцюга, що не кодує. Тоді при кожному циклі полімеразної реакції відбувається подвоєння кількості ДНК копій.

Для здійснення зв'язування праймерів необхідна денатурація ДНК (плавлення) при 94°З подальшим доведенням суміші до 40°55°С.

Для проведення реакції сконструйовані програмовані інкубатори мікропроб, що дозволяють легко чергувати зміни температури оптимальної для кожного етапу реакції.

Реакція ампліфікації дозволяє суттєво підвищити чутливість аналізу при генному зондуванні, що особливо важливо за низької концентрації інфекційного агента.

Однією з істотних переваг генного зондування з ампліфікацією є можливість дослідження субмікроскопічної кількості патологічного матеріалу.

Іншою особливістю методу, важливішою для аналізу інфекційного матеріалу, є можливість виявлення прихованих генів, що мовчать. Методи, пов'язані з використанням генного зондування безумовно, ширше впроваджуватимуться у практику діагностики інфекційних захворювань у міру їх спрощення та здешевлення.

Методи ІФА та РІФ більшою мірою носять якісний або напівкількісний характер. При дуже низьких концентраціях компонентів утворення комплексу антиген антитіло не може бути зареєстроване ні візуально, ні простими інструментальними засобами. Індикація комплексу антиген антитіло в таких випадках може бути здійснена, якщо в один із вихідних компонентів антиген або антитіло ввести мітку, яку можна легко детектувати в концентраціях, порівнянних з визначається концентрацією аналізованої речовини.

Як мітки можуть використовуватися радіоактивні ізотопи (наприклад, 125I), флюоресцентні речовини, ферменти.

Залежно від використовуваної мітки розрізняють радіоімунний (РІА), флюоресцентний імунний (ФІА), імуноферментний (ІФА) методи аналізу та ін. В останні роки широке практичне застосування отримав ІФА, що пов'язане з можливістю кількісних визначень, високої чутливості, специфічності та автоматизації обліку.

Імуноферментні методи аналізу – група методів, які дозволяють виявити комплекс антиген – антитіло за допомогою субстрату, який розщеплюється ферментом з появою забарвлення.

Суть методу полягає в поєднанні компонентів реакції антиген антитіло з вимірюваною ферментною міткою. Антиген або антитіло, що вступають у реакцію, мітяться ферментом. По перетворенню субстрату під дією ферменту можна судити про кількість компоненту реакції антиген, що вступив у взаємодію, антитіло. Фермент у разі служить маркером імунної реакції і дозволяє спостерігати її візуально чи інструментально.

Ферменти є дуже зручними мітками, оскільки їх каталітичні властивості дозволяють їм діяти як підсилювачі, оскільки одна молекула ферменту може сприяти утворенню більше 1?105 молекул продукту каталітичної реакції за хвилину. Необхідно підібрати такий фермент, який довго зберігає свою каталітичну активність, не втрачає її при зв'язуванні з антигеном або антитілом, і має високу специфічність по відношенню до субстрату.

Основні способи отримання антитіл або антигенів, мічених ферментом, кон'югатів: хімічні, імунологічні та генно-інженерні. Для постановки ІФА найчастіше використовуються ферменти: пероксидаза хрону, лужна фосфатаза, галактозидаза та ін.

Для виявлення активності ферменту в комплексі антиген антитіло з метою візуального та інструментального обліку реакції використовують хромогенні субстрати, розчини яких, спочатку безбарвні, в процесі ферментативної реакції набувають забарвлення, інтенсивність якого пропорційна кількості ферменту. Так, для виявлення активності пероксидази хрону в твердофазному ІФА як субстрат використовують 5аміносаліцилову кислоту, що дає інтенсивне коричневе фарбування, ортофенілендіамін, що утворює оранжево-жовте фарбування. Для виявлення активності лужної фосфатази та ¦галатозидази використовують нітрофенілфосфати та нітрофенілгалактозиди відповідно.

Результат реакції при утворенні забарвленого продукту визначають візуально або за допомогою спектрофотометра, що вимірює поглинання світла певною довжиною хвилі.

Відомо багато варіантів постановки ІФА. Розрізняють гомогенний та гетерогенний варіанти.

За методикою постановки розрізняють конкурентний та неконкурентний методи ІФА. Якщо на першій стадії в системі присутні тільки аналізована сполука і відповідні центри зв'язування (антиген і специфічні антитіла), то метод є неконкурентним. Якщо на першій стадії присутні аналізована сполука (антиген) та її аналог (мічений ферментом антиген), які конкурують між собою за зв'язування з наявними в нестачі центрами специфічного зв'язування (антитілами), то метод є конкурентним. У цьому випадку чим більше досліджуваного антигену містить розчин, тим менше кількість мічених антигенів, що зв'язуються.

МЕТОД ФЛЮОРЕСЦІЙНИХ АНТИТЕЛ (МФА) або РЕАКЦІЇ ІМУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦІЇ (РІФ)

Імунофлюоресцентний метод є методом вибору для швидкого виявлення та ідентифікації невідомого мікроорганізму в досліджуваному матеріалі.

Аг + АТ + електроліт = комплекс, що світиться в УФ, променях

Мікроб сироватка, мічена флюорохромом

Часто використовують барвник ізотіоціонат флюоресціїна ФІТЦ

Під час дослідження цим методом використовують люмінесцентний мікроскоп.

Постановка РІФ

На мазок наносять 30 мкл розчину ФІТЦ помічених антитіл.

Поміщають скло у вологу камеру і витримують при кімнатній температурі протягом 2025 хв, або в термостаті при 37°С протягом 15 хв.

Промивають скло у проточній водопровідній воді 2 хв, обполіскують дистильованою водою та висушують на повітрі.

На висушений мазок наносять краплю рідини, що монтує, мазок накривають покривним склом і мікроскопують з використанням люмінесцентного мікроскопа або люмінесцентної насадки до звичайного оптичного мікроскопа.

Аглютинація крові - це склеювання та осідання у вигляді осаду еритроцитів, бактерій та інших клітин, які несуть антигени.

Процес відбувається під впливом аглютинінів, які є специфічними речовинами. У ролі цих речовин виступають лектини чи антитіла.

Можливі види аглютинації щодо групи крові

Аглютинація буває специфічною та неспецифічною. У першому випадку реакція відбувається за участю трьох компонентів:

антигенів;
антитіл;
електролітів (застосовується ізотонічний розчин).

Використовуються всі можливі види аглютинації щодо групи крові, проте це єдиний випадок.

З якою метою використовується?

Реакція аглютинації крові застосовується у тому, щоб виявити збудника інфекційного захворювання. При цьому він осідає і його легко виявити в осаді. Цей процес використовується, як вже згадувалося вище, і при цьому саме про це й йтиметься далі.

Які особливості?

Еритроцити містять антигени типу А і В. Вони зв'язуються з антитілами і β відповідно. Групи крові та реакції аглютинації:

1, 0 (ά, β) - відсутні антигени на поверхні еритроцитів;
2, А (β) - присутній антиген А та антитіло β;
3, В (ά) - міститься антиген В і антитіло ά;
4, АВ (00) - присутні два антигени, антитіла відсутні.

Варто зазначити, що антигени вже спостерігаються у ембріона. Щодо антитіл, вони з'являються після народження, на першому місяці життя.

Від групи крові залежить сумісність людей. У цьому полягає причина відторгнення плоду організмом матері. Іншими словами, у неї є антитіла до антигенів крові майбутньої дитини. І тут виникає несумісність. Крім того, група крові обов'язково враховується під час переливання.

Підготовка

Групи крові та реакції аглютинації - сумісні поняття, які найчастіше використовуються в медицині.

Перед тестом важливо дотримуватись певних інструкцій. Слід на якийсь час виключити вживання деяких продуктів і лікарських препаратів. Це допоможе зробити результати точнішими. Рекомендації, яких слід дотримуватися, призначає лікар. Справа в тому, що у різних лабораторій можуть не збігатися діапазони отриманих значень, тобто вони дещо відрізняються.

Умови проведення тесту

Щоб групу крові було визначено точно, важливо підібрати правильне оснащення. До такого належать:

та піпетка;
скляні палички;
стандартні ізогемагглютинуючі сироватки;
сухі фаянсові тарілки, які поділені на 4 сектори.

Існують вимоги та до умов проведення тесту:

денне висвітлення;
температура в приміщенні вище +16?
використання об'ємів крові та сироватки у співвідношенні 1:10;
достовірні результати виходять упродовж 5 хвилин.

Вище представлені основні умови та інструменти. Аглютинація крові може проводитися декількома способами, і кожен із них висуває індивідуальні вимоги.

Методи

Можливі методи визначення групи крові за допомогою аглютинації:

стандартний метод;
перехресна реакція;
використання цоліклонів;
експрес-методика із застосуванням набору «Ерітротест-группокарт».

Стандартний метод

Аглютинація крові проявляється з використанням еритроцитів пацієнта. Також застосовуються стандартні сироватки, що містять відомі антигени.

На плоску тарілку розміщується по 1 краплі чотирьох сироваток. Потім за допомогою скляних паличок на неї вноситься кров пацієнта, що підлягає дослідженню. В даному випадку зручно використовувати піпетки очей. Слід дотримуватись співвідношення 1:10. Сироватка та кров обережно перемішується. Протягом п'яти хвилин можна проводити оцінку.

Розшифровка результатів тесту простим методом

Після закінчення зазначеного часу у краплях сироватки спостерігається просвітлення. У деяких можна побачити, що аглютинація еритроцитів відбулася (дрібні пластівці), в інших вона відсутня.

Існують такі варіанти:

реакції немає у всіх пробах сироваток – 1 група;
згортання відбулося скрізь, крім 2 проби – 2 група;
відсутність реакції лише у 3 пробі - 3 група;
аглютинація відбулася скрізь – 4 група.

Таким чином, головне – правильно розподілити сироватки. Тоді розшифрувати результат не складе труднощів. Якщо аглютинація крові проявляється слабо, рекомендується провести аналіз повторно. У випадку з дрібними пластівцями їх розглядають під мікроскопом.

Перехресна реакція

Іноді у простий спосіб неможливе точне визначення групи крові. Аглютинація у такому разі проводиться за допомогою методу перехресної реакції. На відміну від першого варіанта тесту, важливе значення мають тут стандартні еритроцити. Кров пацієнта набирається у пробірку, центрифугується, а потім піпеткою відкачується сироватка для подальших досліджень.

Вона в кількості 2 крапель поміщається на тарілку, потім до неї додаються стандартні еритроцити груп А і В. Вміст розмішується шляхом похитування ємності.

Результати методу перехресної реакції

За п'ять хвилин проби готові до розгляду. Варіанти такі:

склеювання відбулося в обох краплях – 1 група;
пластівці не спостерігаються в жодній із проб - 4 група;
процес видно в одному зразку – 2 або 3 група (залежно від того, де саме згорнулася кров).

Метод із використанням цоліклонів

Для визначення групи крові аглютинація у такий спосіб проводиться із застосуванням синтетичних замінників сироваток. Вони називаються цоліклонами. Вони містяться штучні замінники ά і β-аглютинів, відомих як еритротести (рожевого і синього кольору відповідно). Реакція відбувається між ними та еритроцитами крові пацієнта.

Такий метод є найточнішим і найнадійнішим. Здебільшого не вимагає повторного проведення дослідження. Оцінка результатів здійснюється аналогічно, як у випадку стандартного методу. Особливість полягає в тому, що має бути обов'язково підтверджена реакцією зі специфічним синтетичним замінником (анти-АВ). Крім того, у ній не спостерігається склеювання при додаванні розчину натрію хлориду.

Експрес-методика з набором «Ерітротест-группокарт»

Розглядаючи можливі методи аналізу щодо групи крові, слід зазначити, що цей спосіб має свої особливості. Вони полягають у тому, що результат можна оцінити у лабораторії, а й у польових умовах. Для проведення дослідження використовують спеціальний набір. Він включає картку з лунками, на дні яких вже присутні висушені реагенти. Крім анти-АВ, анти-А та анти-В, застосовується анти-D, що дозволяє визначити резус-фактор.

Цей метод не вимагає особливої підготовки, можна використовувати кров, яка взята з пальця, допускається наявність в ній консервантів. Спочатку необхідно внести в кожну лунку краплі води, щоб розчинити інгредієнти. Після цього додається кров, трохи розмішується. Через три хвилини буде отримано результат.

Хибна аглютинація

Іноді дані, отримані після тесту, не відповідають дійсності. Таке явище залежить від певних чинників.

Виділяють три види помилкової реакції:

Псевдоаглютинація. Справжнє склеювання не відбувається, еритроцити складаються у вигляді монетних стовпчиків. Якщо додати кілька крапель фізіологічного розчину, вони розпадаються. Подібне явище розпізнається під мікроскопом.

Холодна аглютинація крові. Така реакція спостерігається у разі, якщо умови щодо дослідження були несприятливими. Коли температура нижче +16 ˚С, може виявлятись склеювання.

Панаглютинація. За наявності інфекції у крові результати тестів може бути хибними. Таке явище також можливе у випадку з онкологічними захворюваннями при сепсисі.

Аглютинація дуже важлива в медицині. Вона дозволяє не лише визначати групу крові, а й виявляти збудника захворювань, а також наявність інфекцій. Головне, дотримуватися рекомендацій лікаря під час підготовки до цієї процедури. Що стосується медичного персоналу, його завдання полягає у створенні сприятливих умов та дотриманні всіх правил. Тільки таким чином можна досягти точних результатів при виконанні аглютинації крові.

/ 50
Найгірший Найкращий

У цих реакціях беруть участь антигени у вигляді частинок (мікробні клітини, еритроцити та інші корпускулярні антигени), які склеюються антитілами і випадають в осад.

Залежно від виду імунодиагностикуму, що використовується, розрізняють реакцію мікробної аглютинації, гемагглютинації, латекс-аглютинації, коаглютинації і т.д.

Для діагностики інфекційних захворювань реакцію аглютинації проводять у двох напрямках: визначають вид виділеного від хворого мікроба-збудника за допомогою діагностичної аглютинуючої сироватки (серологічна ідентифікація мікроба) і виявляють специфічні антитіла в сироватці хворого, використовуючи стандартний мікробний діагностик.

Розрізняють пряму та непряму реакції аглютинації

Реакція прямої аглютинації бактерій (РА). У цій реакції антитіла (аглютиніни) безпосередньо аглютинують корпускулярні антигени (аглютаногени). Зазвичай вони представлені суспензією інактивованих мікроорганізмів (реакція мікробної аглютинації). За характером аглютинату, що утворюється, розрізняють зернисту і пластівцеву аглютинацію. Зерниста аглютинація відбувається при склеюванні мікробів, що містять О-антиген. Бактерії, що мають джгутики (Н-антиген), аглютинуються з утворенням великих пластівців.

Для визначення виду мікроорганізмів використовують стандартні діагностичні аглютинуючі сироватки. Їх одержують гіперімунізацією лабораторних тварин суспензією бактерій. Титром такої сироватки є найбільше розведення, при якому спостерігається чітка аглютинація відповідного антигену. Однак через складність антигенної структури бактерій, аглютинуючі сироватки містять антитіла не тільки до видоспецифічних, але і до групових антигенів і можуть давати групову аглютинацію з спорідненими видами бактерій. Титри антитіл до видоспецифічних антигенів у сироватці завжди вищі, ніж до групових. Для видалення групоспецифічних антитіл до сироватки послідовно додають мікроорганізми, до складу яких входять групові антигени (метод Кастелані). Таким методом одержують адсорбовані сироватки, які містять антитіла до певного виду мікроба.

Методи реакції аглютинації.Найбільш поширені пластинчаста (орієнтовна) та розгорнута РА. Пластинчасту РА ставлять на склі. У цій реакції використовують сироватки з невеликим розведенням або нерозведені. Використовують її як прискорений спосіб виявлення антитіл або ідентифікації мікроорганізмів. На скло наносять краплю сироватки, в яку петлею вносять невідому культуру бактерій, перемішують і через 2-3 хвилини спостерігають появу дрібнозернистої або пластівцевої аглютинації. Для контролю використовують краплю фізіологічного розчину, у якій після внесення бактерій спостерігається помутніння. При використанні неадсорбованих сироваток реакція на склі має лише орієнтовне значення.

Розгорнуту РА проводять у пробірках чи лунках пластин. При цьому діагностичну сироватку розводять до титру та вносять однакові кількості антигену. При позитивному результаті дні пробірки утворюється пухкий осад як " парасольки " , при негативному - осад як " гудзики " . Оскільки титри групоспецифічних антитіл у сироватці значно нижчі, ніж титр видоспецифічних, групові реакції спостерігаються лише у невеликих розведеннях сироватки. Якщо аглютинація відбувається до титру або до половини титру сироватки, вона є видоспецифічною.

Для визначення антитіл у сироватці хворого (серологічний діагноз) використовують стандартний мікробний діагностикум, що містить завис відомих мікробів або їх антигенів. У цьому випадку також можна ставити пластинчасту та розгорнуту РА.

Реакція прямої аглютинації клітин. Для визначення груп крові використовують стандартні сироватки крові донорів, що містять відомі анти-А або анти-В антитіла. Реакції ставлять на склі чи пластинах. За наявності на еритроцитах А (2-а група крові), В (3-я група крові) або обох антигенів (4-а група крові) відповідні сироватки аглютинують еритроцити. Застосовується також проба на сумісність крові, коли краплі крові донора та реципієнта змішують та оцінюють аглютинацію.

У клініках застосовують реакцію аглютинації лейкоцитів, тромбоцитів та інших клітин для виявлення аутоантитіл, а також визначення антигенів на цих клітинах.

Реакція непрямої (пасивної) аглютинації. Для отримання феномену аглютинації антиген попередньо адсорбують на корпускулярному носії, яким служать інертні частки (латекс, целюлоза, полістирол, оксид барію та ін) або клітини (еритроцити барана, I(0) групи крові людини).

У реакції пасивної гемаглютинації (РПГА) як носій використовують еритроцити. Навантажені антигеном еритроцити склеюються у присутності специфічних антитіл до цього антигену і випадають осад. Сенсибілізовані антигеном еритроцити використовують у РПГА як еритроцитарний антигенний діагностикум для виявлення антитіл (серодіагностика, встановлення серологічного діагнозу). Якщо навантажити еритроцити антитілами, їх можна застосовувати виявлення антигенів.

Пряма та непряма антиімуноглобулінові реакції Кумбса. Використовуються для виявлення "неповних" (неаглютинуючих) антитіл, які утворюються при різних захворюваннях: резус-конфлікті, аутоімунних захворюваннях, деяких інфекціях. Для встановлення цих реакцій необхідна антиглобулінова сироватка, яку отримують шляхом імунізації кролика імуноглобулінами людини. Така сироватка містить повні (бівалентні) антитіла-антіімуноглобуліни.

Пряма реакція: до відмитих еритроцитів крові хворого додають антиімуноглобулінову сироватку. Якщо на еритроцитах є неповні антитіла (імуноглобуліни), що спостерігається при гемолітичній анемії, резус-конфлікті (еритроцити плода), вони аглютинуються.

Непряма реакція виявляє вільні антиеритроцитарні антитіла у сироватці крові хворого. До цієї сироватці додають відмиті еритроцити донора 0(І) групи крові. Суміш інкубують при 37°С протягом 30 хвилин і еритроцити відмивають. Потім до них додають антиімуноглобулінову сироватку. Якщо у сироватці хворого були неповні антиеритроцитарні антитіла, то настане аглютинація.