Лазерний мікроскоп. Лазерний скануючий кольоровий конфокальний мікроскоп OPTELICS HYBRID. Оптичні інтерференційні виміри

Власники патенту UA 2285279:

Винахід відноситься до оптичних пристроїв для вимірювання оптичної різниці фаз методами інтерферометрії, вимірювання поляризації світла, а також управління інтенсивністю, фазою і поляризацією випромінювання. Мікроскоп містить джерело лазерного випромінювання, на шляху проходження променя якого послідовно встановлені світлодільний елемент, скануюча система з двома дзеркальними дефлекторами і об'єктив, а на шляху променя, відбитого від досліджуваного зразка і світлодільного елемента, розміщений приймач випромінювання з системою обробки сигналу. Перед світлодільнім елементом встановлений перетворювач поляризації випромінювання кругову, а між світлодільнім елементом і скануючою системою розміщений променеразводний випромінювання застосований вимірювач. Винахід дозволяє покращити співвідношення сигнал-шум за рахунок застосування диференціального контрасту, а також підвищити чутливість до слабких перепадів оптичної щільності об'єктів та збільшити лінійність вимірювання висоти профілю об'єкта, що досліджується. 8 з.п. ф-ли, 1 іл.

Відомі растрові оптичні мікроскопи з оптичними схемами, що реалізують сканування променя по куту без зміщення в площині вхідного вікна об'єктива в режимі відображення (Дюков В.Г. і Кудеяров Ю.А. «Розстрова оптична мікроскопія», Москва, 1991, С.134) .

Цей мікроскоп включає джерело лазерного випромінювання, на виході якого встановлені розширювач та світлодільна пластина. На шляху променя, що пройшов через світлодільні пластини, встановлені два дзеркальних дефлектора скануючої системи і об'єктив, а на шляху променя, відбитого від досліджуваного об'єкта і світлодільні пластини, встановлений фотоприймач. Перед фотоприймачем розташований просторовий фільтр і спектральний фільтр, що вводиться. Між дефлекторами додано телецентричну систему з двох лінз.

Мікроскоп оснащений цифровою технікою обробки зображень, а також відеокамерою. Такий комбінований прилад дозволяє досліджувати мікрооб'єкти у різних галузях науки та техніки.

Відома конфокальна система для отримання зображення, що містить скануючий багатобарвний лазер і мікроскоп (патент США №5127730, US/C1 356-318, MKU 5 G 01 №21/64). Ця система дозволяє за допомогою фотоумножителей отримати зображення, яким можна отримати уявлення про властивості досліджуваного зразка, підданого впливу барвників.

Відомий конфокальний скануючий мікроскоп (патент США №5032720, US C1 250-236, MKU 5 G 02 B 21/06), вибраний нами як прототип, який має скануючу систему з двома дефлекторами. Кожен із цих дефлекторів сканує відхиляючі промені у взаємно перпендикулярних площинах. Система дзеркал розташована між дефлекторами системи сканування таким чином, щоб передати промінь від одного дефлектора на інший і на мікроскоп з об'єктивом. Світло, відбите зразком, потрапляє на об'єктив, на дефлектори та систему дзеркал до моменту попадання на детектор. Апертура знаходиться перед детектором і блокує будь-який промінь, який виходить із точок, просторово віддалених від променевої плями. Однак конфокальні лазерні мікроскопи, опис аналогів і прототипі в окремих випадках застосування мають недостатньо високе співвідношення сигнал-шум, що, наприклад, важливо при дослідженні біологічних об'єктів.

Технічним результатом запропонованого винаходу є поліпшення співвідношення сигнал-шум за рахунок застосування диференціального розмаїття, крім того досягнута більш висока чутливість до слабких перепадів оптичної щільності об'єктів і збільшена лінійність вимірювання висоти профілю досліджуваного об'єкта.

Цей результат досягається удосконаленням відомого лазерного скануючого мікроскопа, що містить джерело лазерного випромінювання, на шляху променя якого послідовно встановлені світлодільний елемент, скануюча система з двома дзеркальними дефлекторами і об'єктив, а на шляху променя, відбитого від досліджуваного і світлодільного елемента, розміщений приймач обробки сигналу

Удосконалення полягає в тому, що перед світлодільнім елементом встановлений перетворювач плоскополяризованого променя в промінь з круговою поляризацією, а між світлодіючим елементом і скануючою системою розміщений променеразводящий елемент, що перетворює вхідний пучок випромінювання в два пучка з цим ортогональними напрямками поляризації випромінювання застосований вимірювач потужності компонент схрещених поляризацій випромінювання.

Як перетворювач поляризації випромінювання може бути використана чвертьхвильова пластина для довжини хвилі використовуваного випромінювання.

Перетворювач випромінювання може бути розміщений у джерелі лазерного випромінювання.

Передбачені також такі вдосконалення:

Променеразводящий елемент виконаний у вигляді пластини з двопроменезаломлюючого матеріалу;

Вимірник потужності складається з призми Волластона та двох фотоприймачів для роздільного вимірювання двох компонентів, схрещених поляризацій випромінювання;

Між світлодіючим елементом та вимірювачем потужності розміщений телескоп з регульованою діафрагмою, встановленою у його внутрішньому фокусі;

Між двома дефлекторами системи сканування введений телескоп, передній і задній фокуси якого розміщені на осях гойдання дефлекторів;

Між системою сканування і об'єктивом розташований додатковий телескоп, один з фокусів якого збігається з віссю гойдання розміщеного поруч з ним дефлектора скануючої системи, а другий збігається з заднім фокусом об'єктива;

Між джерелом лазерного випромінювання та перетворювачем поляризації випромінювання встановлено систему регулювання контролю потужності джерела лазерного випромінювання.

Сутність винаходу пояснюється кресленням, на якому показана структурна оптична схема лазерного скануючого мікроскопа.

Лазерний мікроскоп, що сканує, містить джерело лазерного випромінювання 1, в якості якого можуть бути використані безперервний газовий (наприклад, лазер гелій-неоновий, аргоновий, криптоновий, аргон-криптоновий та інші). На шляху променя газового лазера встановлений плівковий поляризатор 2 (поляризаційний фільтр), призначений для регулювання потужності випромінювання, призму Глана-Томсона 3 для поліпшення його поляризаційних характеристик та розподільча пластина 4 для відщеплення частини променя (близько 5%) з метою здійснення контролю потужності випромінювання допомогою фотоприймача 5.

Далі по ходу основного пучка лазера встановлено перетворювач поляризації випромінювання, зокрема чвертьхвильова пластина даної хвилі випромінювання. Після перетворювача поляризації випромінювання встановлені світлодільний елемент 8, променеразводящий елемент 9, скануюча система, що включає два дзеркальні дефлектори 10, 11, об'єктив 12 і столик 13 для розміщення об'єкта, що досліджується. Променеразводящий елемент 9 виконаний у вигляді пластини з двопроменеломного матеріалу і розміщений у внутрішньому фокусі телескопа 14.

Вісь хитання дефлектора 10 збігається з переднім фокусом телескопа 14, який збігається з переднім фокусом телескопа 15.

Між дефлекторами 10 і 11 розташований телескоп 15 для сполучення точок розгортки променя у двох взаємоперпендикулярних напрямках. Вісь гойдання дефлектора 11 знаходиться в задньому фокусі телескопа 15. У разі необхідності для подальшого збільшення діаметра лазерного променя, а також для перенесення точки кутової розгортки сканування в задній фокус об'єктива 12 між дефлектором 11 і об'єктивом 12 встановлений додатковий телескоп 16. 16 збігається з віссю гойдання дефлектора 11, а інший з заднім фокусом об'єктива 12.

Світлодільний елемент 8 служить для перенаправлення відбитого від досліджуваного об'єкта променя вимірювач потужності, який складається з призми Волластона 17 і двох фотоприймачів 18, 19 для роздільного вимірювання інтенсивності або потужності компонент ортогональних поляризацій випромінювання. Фотоприймачі 18 і 19 служать для перетворення оптичної потужності вимірюваний електричний сигнал.

Світлодільний елемент 8 також може бути використаний для додаткового контролю потужності випромінювання за допомогою фотоприймача 20. Для реалізації конфокального розмаїття перед вимірювачем потужності встановлена діафрагма 21, розміщена у внутрішньому фокусі телескопа 22.

Плівковий поляризатор 2, призму Глана-Томсона 3 і система регулювання потужності джерела лазерного випромінювання, що включає фотоприймач 5 та ділильну пластину 4, передбачені для комерційно доступних лазерів. У разі лазерів зі світловими пучками задовільного якості ці елементи не потрібні.

Працює лазерний скануючий мікроскоп в такий спосіб.

Плоскопаралельний частково поляризований промінь газового лазера 1 проходить плівковий поляризатор 2 і призму Глана-Томсона 3, набуваючи високого рівня поляризації 1:1000 і вище.

Площини поляризації 1 і 3 збігаються, тоді як положення площини 2 поляризації може змінюватися шляхом його обертання. Таким чином інтенсивність випромінювання може змінюватись від максимуму до гранично малих величин.

Ділильна пластина 4 відводить невелику частину променя (близько 5%) на фотодіод 5 для вимірювання та керування потужністю випромінювання.

Фазова пластина 6 перетворює плоскополяризований промінь лазерного випромінювання на промінь з круговою поляризацією. Це необхідно для переведення поляриметра в квазілінійний режим вимірювання фази.

Ділильна пластина 8 розщеплює вхідний промінь на два з однаковою інтенсивністю випромінювання. При цьому один промінь використовується для вимірювань, а другий може використовуватися для додаткового контролю потужності.

Блок, що складається з фазової пластини 9 та телецентричної системи лінз телескопа 14, призначений для розщеплення поляризованого по колу променя на два лінійно поляризованих зі схрещеними компонентами поляризації. При цьому за рахунок зовнішньої конічної рефракції фазової пластині 9 відбувається просторове зміщення незвичайного променя, що залежить від товщини пластини, її кутового положення, орієнтації оптичної осі і фокусної відстані лінз.

Телецентрична система лінз телескопа 15 переносить фокус кутової розгортки променя з точки, що лежить на осі дефлектора 10, точку, що лежить на осі дефлектора 11, залишаючи інші параметри променя незмінними.

Дефлектор 11 забезпечує відхилення променя в площині перпендикулярної площини кутової розгортки дефлектора 10, завершуючи таким чином формування кутового растру.

Таким чином, плоскопаралельний промінь з розщепленими компонентами поляризації віртуально випускається з заднього фокусу об'єктива 12 під різними кутами, що визначаються положеннями дефлекторів 10 і 11. Далі промінь фокусується на поверхні досліджуваного об'єкта, причому геометрично фокус незвичайного розщеплення у фазовій пластині 9.

Відбитий від об'єкта промінь проходить назад тим самим шляхом, що й вхідний промінь, аж до ділильної пластини, де він поділяється на два промені рівної потужності. Один із променів відхиляється на диференціальний фотоприймач, де відбувається вимір його параметрів.

Фотоприймач складається з призми Волластона 17, що розщеплює вхідний промінь на два зі схрещеними напрямками лінійної поляризації, та двох фотодіодів, що вимірюють інтенсивність цих компонентів. В залежності від кутової орієнтації фазової пластини 9 і взаємної орієнтації фазової пластини 9 і призми Волластона 17 реалізуються кілька способів отримання інформації про об'єкт, що досліджується, так званих контрастів.

Для здійснення амплітудного розмаїття фазова пластина 9 знаходиться в положенні, при якому розщеплення променя не відбувається, а сигнали фотодіодів складаються і сума передається системі побудови зображення.

Запропонований пристрій дозволяє здійснити диференціальний фазовий контраст і в результаті збільшити відношення сигнал/шум за рахунок інтегрування сигналів при побудові реального профілю об'єкта з диференціальних сигналів, що призводить також до підвищення чутливості до слабких перепадів оптичної густини об'єктів і збільшення лінійності вимірювання висоти профілю об'єкта, що досліджується.

1. Лазерний скануючий мікроскоп, що містить джерело лазерного випромінювання, на шляху прямування променя якого послідовно встановлені світлодільний елемент, скануюча система з двома дзеркальними дефлекторами і об'єктив, а на шляху прямування променя, відбитого від досліджуваного зразка і світлодільного елемента, розміщений приймач випромінювання сигналу, який відрізняється тим, що перед світлодільнім елементом встановлений перетворювач плоскополяризованого променя в промінь з круговою поляризацією, а між світлодіючим елементом і скануючою системою розміщений променеразводящий елемент, що перетворює вхідний пучок випромінювання в два пучка з ортогональними напрямками поляризації і просторів випромінювання застосований вимірювач потужності компонент схрещених поляризацій випромінювання.

2. Лазерний скануючий мікроскоп за п.1, який відрізняється тим, що перетворювачем поляризації випромінювання є чвертьхвильова пластина для довжини хвилі випромінювання, що використовується.

3. Лазерний скануючий мікроскоп за пп.1 і 2, який відрізняється тим, що перетворювач поляризації випромінювання розміщений у джерелі лазерного випромінювання.

4. Лазерний скануючий мікроскоп по п.1, який відрізняється тим, що променеразводящий елемент виконаний у вигляді пластини з двопроменеломлюючого матеріалу.

5. Лазерний скануючий мікроскоп за п.1, який відрізняється тим, що вимірювач потужності складається з призми Волластона та двох фотоприймачів для роздільного вимірювання двох схрещених компонентів поляризації випромінювання.

6. Лазерний скануючий мікроскоп за п.1, який відрізняється тим, що між світлодіючим елементом і вимірювачем потужності розміщений телескоп з діафрагмою, що регулюється, встановленої в його внутрішньому фокусі.

NS-3500 є високошвидкісним конфокальним лазерним скануючим мікроскопом (CLSM) для проведення високоточних і надійних тривимірних вимірювань топографії поверхні. Отримання конфокального мікроскопічного зображення в реальному часі досягається за рахунок використання швидких оптичних модулюючих модулів і алгоритмів обробки даних.

Ця система є перспективним рішенням для вимірювання та перевірки тривимірних мікроскопічних структур, таких як напівпровідникові підкладки, FPD панелі, MEMS пристрої, скляні підкладки та просто різні поверхні. Мікроскоп NS-3500 дозволяє проводити вимірювання в різних областях (область сканування розміром до 10х10 мм) зразків з розмірами до 150х150 мм за рахунок великого діапазону переміщення предметного столика. Також є опціональна можливість розширення платформи до 200х200 мм.

При необхідності вимірювання різних точок/областей габаритніших зразків доступна модифікація вимірювальної головки промислового типу (див. NS-3800).

Оптичний 3D-контроль, що не руйнує, з високою роздільною здатністю
Отримання конфокального зображення у реальному часі
Різне оптичне збільшення для області, що спостерігається
Одночасна конфокальна мікроскопія та мікроскопія білого світла
Автоматичний пошук посилення для тонкого фокусування
Компенсація нахилу
Простота аналізу отриманих даних
Високоточний та високошвидкісний вимір висоти
Можливість якісного аналізу товщини напівпрозорих матеріалів
Відсутність пробопідготовки
Режим подвійного сканування вздовж вертикальної осі Z
Зшивання зображень для аналізу великих областей

Області застосування

Лазерний скануючий мікроскоп NS-3500 є ідеальним рішенням для вимірювання висоти, ширини, глибини, кутів, площі, а також об'ємної візуалізації мікроструктур, таких як:

Напівпровідники - IC підкладки, висота виступів/східців та дротяних петлів, аналіз дефектів, CPM процеси (хіміко-механічна планаризація)
Плоскопанельні дисплеї (FPD) - аналіз сенсорних панелей, ITO підкладок, висота розділової колони в РК-дисплеї
МЕМС пристрою - тривимірний профіль структури, шорсткість поверхні, підкладки
Скляні поверхні - тонкоплівкові сонячні елементи, текстура сонячного елемента, аналіз малюнка після лазерного впливу
Дослідження матеріалів - аналіз опорних поверхонь затискного пристрою, шорсткості та сколів.

Програмне забезпечення NSWorks & NSViewer

Просте та інтуїтивне керування навіть для нових користувачів
ПЗЗ зображення, конфокальне зображення, а також основна панель керування одночасно відображаються на одному екрані
Різні параметри налаштування призначені для передових програм
Побудова конфокального зображення в режимі реального часу забезпечує негайний зворотний зв'язок із обладнанням
Окреме вікно аналізу зі зручними графічними інструментами для створення звітності
Об'ємний графічний вигляд дозволяє користувачу легко розпізнати мікроскопічну структуру зразка

Зшивання зображення

При необхідності аналізу великої області сканування (до 15×15 мм макс.) доступний послідовний поточковий вимір дрібних областей з подальшим зшиванням. Ця особливість реалізована за рахунок використання моторизованого предметного столика та програмної утиліти NSMosaic. Після зшивання отримане зображення може бути проаналізоване як єдине ціле з усіма доступними функціями NSViewer.

Відео-огляд: Зшивання зображень на конфокальному лазерному сканувальному мікроскопі NS-3500

Приклади вимірювання за допомогою NS-3500

Вимірювання висоти стандарту VLSI	Аналіз виступаючої частини на OLED	Аналіз результатів лазерної обробки OLED
Кварцова підкладка	Поверхня діаманта	Дефект на металевому дзеркалі
Нерівність на опуклій поверхні	Графен	Підкладка оксиду індія та олова
Аналіз структури мікролінзи	Аналіз вузької області підкладки	Вид досліджуваного зразка при різному оптичному збільшенні
Постобробка зображення профілю поперечного перерізу	Зшивання зображення під час аналізу монети	Аналіз профілю поверхні краплі води

Конфокальний лазерний мікроскоп, що сканує, з унікальною оптичною схемою і системою детектування, які дозволяють отримувати оптичні зрізи з максимальною ефективністю. Ви можете працювати з мультиканальною флуоресценцією до десяти барвників і використовувати безперервну спектральну детекцію у всьому видимому діапазоні довжин хвиль.

LSM 710на інвертованому штативі мікроскопа Axio Observe Z1– це неперевершений конфокальний мікроскоп для клітинної біології та біології розвитку. Спільно із прямим штативом AxioImagerабо AxioEmainer - LSM 710перетворюється на інструмент для роботи в нейробіології, фізіології та вивченні біовзаємодії в найширшому спектрі експериментів.

Оптична схема передбачає використання до восьми лазерних портів та будь-яку комбінацію лазерних ліній від близького УФ спектру до ІЧ. 34-канальний модуль детекції QUASARдозволяє оптимальну стратегію захоплення для різних спектрів випромінювання, без прив'язки до фільтрів та дихроічним дзеркалам. Ви завжди можете направити будь-яку частину спектра сигналу на будь-який обраний детектор.

Спектральне сканування передбачає експерименти з високою роздільною здатністю та виявленням до 10 каналів одночасно.

У скануючому модулі LSM 710використовується передове технічне рішення: зворотний контур спектральної переробки (Spectral Recycling Loop), що забезпечує посилення сигналу за рахунок багаторазового повторного пропускання через спектральну решітку всіх нерозділених частин флуоресцентного сигналу. Корекція поверхні поляризації частини флуоресценції збільшує сумарний емісійний сигнал в середньому на 15 -17 %!

Модифікація LSM 710 NLO- це лазерний мікроскоп, що сканує мікроскоп, оснащений фемтосекундним мультифотонним лазером, що генерує випромінювання високої щільності в інфрачервоній області 680-1080 нм. Завдяки властивостям такого лазера ми можемо проникати на глибину до 500 мкм, при цьому збудження відбувається тільки всередині фокального мікрооб'єму, менше 0,1 мкм 3 що дозволяє дбайливо впливати на живу тканину.

Технічні характеристики:

Скануючий модуль із двома, трьома одноканальними високочутливими детекторами або з 34-х канальним спектральним детектором для швидкого паралельного захоплення повного емісійного профілю;
Довільний вибір спектрального діапазону реєстрації сигналу з роздільною здатністю до 3 нм (послідовне сканування) та 10 нм (паралельне сканування);
Детектор світла, що проходить;
Незалежні гальванометричні скануючі дзеркала Два;
Роздільна здатність від 4 х 1 до 6144 х 6144 пікселів;
Швидкість сканування – 14 х 2 швидкостей сканування; 5 рамок/сек при 512 х 512 пікселів; 0.38 мсек/лінію з 512 пікселів (2619 ліній/сек);
Скануюче збільшення ZOOM від 0.6 до 40х з кроком 0.1х;
Вільне обертання на 360 ° скануючої рамки;
Конфокальний pinhole - моторизований конфокальний pinhole плавним регулюванням діаметра та координат;
Розрядність даних – 8, 12 або 16 біт;
Лазерні лінії – 355, 405, 458, 488, 514, 543, 561, 594, 633; перебудовується 488-640;
Варіанти штативів – інвертований AxioObserver; прямий AxioImager; прямий з фіксованим столиком AxioExaminer.

Розвиток генної інженерії, протеоміки, біотехнології, сучасної фармацевтики та біомедицини сприяло швидкому впровадженню нових методів конфокальної мікроскопії, і в даний час вони широко використовуються в клітинній біології.

Конфокальну флуоресцентну мікроскопію можна розглядати як різновид традиційної флуоресцентної мікроскопії, яка дозволяє досліджувати внутрішню мікроструктуру клітин, причому не лише фіксованих, а й живих, ідентифікувати мікроорганізми, структури клітини та окремі молекули, спостерігати динамічні процеси у клітинах. Конфокальна флуоресцентна мікроскопія на додаток до цього забезпечила можливість тривимірного субмікронного дозволу об'єкта та суттєво розширила можливість неруйнівного аналізу прозорих зразків. Підвищення роздільної здатності досягається завдяки використанню в конфокальних мікроскопах лазерів як джерела світла та конфокальної діафрагми для фільтрації позафокусної флуоресценції. Перевага лазерів у порівнянні з ртутними або ксеноновими лампами полягає в монохроматичності і високій паралельності пучка світла, що випускається. Ці властивості лазерного випромінювання забезпечують ефективнішу роботу оптичної системи мікроскопа, зменшують кількість відблисків, покращують точність фокусування пучка світла. На зразку лазер висвітлює не все поле зору, як у флуоресцентному ламповому мікроскопі, а фокусується в точку. Звичайно, при цьому лазерний промінь збуджує флуоресценцію як у точці фокусу, так і у всіх шарах зразка, через які проходить. І якщо ця позафокусна флуоресценція, що випромінюється шарами, розташованими вище і нижче фокальної площини, реєструється разом з основним сигналом з фокусу об'єктива, це погіршує роздільну здатність оптичної системи. Позбутися позафокусної флуоресценції дозволяє конфокальна діафрагма. Змінюючи діаметр конфокальної діафрагми, можна визначати товщину оптичного шару поблизу фокусу лазерного променя, тому флуоресценція, що випускається вище і нижче фокусу, виявляється дефокусованою на конфокальній діафрагмі і не реєструється. Завдяки цьому конфокальна мікроскопія забезпечує поліпшену роздільну здатність, в першу чергу вздовж осі Z.

Сучасна конфокальна мікроскопія дозволяє вирішувати три основні завдання: вивчення тонкої структури клітини, колоколізації (просторового взаєморозташування) у клітині двох або більше речовин, а також дослідження динамічних процесів, що протікають у живих клітинах.

Завдяки покращеній роздільній здатності, особливо підвищеній роздільній здатності по осі Z, та можливості створювати серії «оптичних» зрізів, конфокальний мікроскоп дозволяє досліджувати тонку структуру об'єкта в тривимірному просторі. Спеціальні програми дозволяють створити з серії оптичних зрізів об'ємне зображення об'єкта (3D) і як би розглядати його під різними кутами зору, що може дати цінну інформацію про форму клітин, цитоскелет, структуру ядра, хромосоми і навіть локалізації в них окремих генів, а так само про взаєморозташування цих елементів.

Використання мультиспектрального (з декількома флуорохромами) режиму роботи лазерного скануючого конфокального мікроскопа дозволяє досліджувати колоколізацію (просторове взаєморозташування) у клітині двох або більше різних речовин, наприклад, білків, помічених різними флуоресцентними барвниками. Досліджуючи такі препарати у звичайному флуоресцентному мікроскопі, не можна з упевненістю стверджувати, чи знаходяться ці речовини поряд або одна під одною. За допомогою методу оптичних зрізів та подальшої 3D-реконструкції об'єкта можна відтворити об'ємний розподіл речовин. Мультиспектральний режим дозволяє проводити на конфокальном мікроскопі дослідження методом FISH.

Можливість отримувати тимчасові серії зображень з високою просторовою роздільною здатністю дозволяє досліджувати зміни, що відбуваються у клітинах та їх структурах у часі (4D реконструкція). Крім того, завдяки наявності лазерів і системи сканування можна здійснювати не тільки реєстрацію тимчасових змін, але і впливати на клітинні структури лазерним випромінюванням з одночасним спостереженням процесів, що протікають.

Нові методи лазерної скануючої конфокальної мікроскопії набули широкого поширення в фундаментальних науках, а також все ширше застосовуються в практичних дослідженнях та діагностичній медицині.

Методи конфокальної мікроскопії дозволяють виявити здатність речовин накопичуватися в цитоплазмі, ядрі або інших структурах клітини, зареєструвати утворення метаболітів, виміряти кінетику накопичення та метаболізму речовин у клітині, швидкість виведення речовин із клітини, порівняти інтенсивність метаболізму в різних клітинних лініях та в різних умовах. Ці методи все ширше застосовуються в дослідженнях механізмів дії як канцерогенів, так і лікарських препаратів та протипухлинних сполук, що дозволяють розраховувати їх ефективні концентрації.

Аналіз інтенсивності та форми спектрів власної флуоресценції дозволяє розпізнавати нормальні та запалені клітини, і такий метод, зокрема, запропонований як новий спосіб ранньої діагностики шийки матки.

Підібравши комбінацію фільтрів для кількох типів власної флуоресценції, можливо без проведення гістохімічного фарбування та трудомісткого отримання та дослідження безлічі зрізів розрізняти злоякісні та нормальні тканинні структури у біопсійних пробах лімфовузлів пацієнтів із лімфоаденопатією різного походження.

Методи конфокальної мікроскопії широко застосовуються в ембріології та гідробіології, ботаніці, зоології щодо структури гамет, розвитку та формування організмів.

Конфокальна мікроскопія постійно розвивається, і в практику впроваджуються нові методи досліджень для вивчення механізмів функціонування організмів на клітинному, субклітинному і молекулярному рівнях, які з кожним днем стають все більш затребуваними в прикладних дослідженнях і діагностиці. Поява персонального конфокального лазерного скануючого мікроскопа FV10iдозволяє розширити межі застосування конфокальних методик. Мікроскоп FV10iвиконує ті ж функції, що і високотехнологічні дослідні конфокальні системи сканування FV1000. У компактний корпус інтегровані всі основні компоненти: 4 діодні лазери, спектральний детектор, що сканує, інтуїтивно зрозуміле програмне забезпечення, інкубатор, моторизований столик, антивібраційна платформа і навіть «темна кімната». Цей мікроскоп ідеальний для тих, хто тільки починає працювати з конфокальними методиками, для тих, хто хотів би звільнити дослідні конфокальні мікроскопи від рутинних завдань, для діагностичних лабораторій, лабораторій з обмеженим бюджетом, для навчальних завдань та випадків проведення досліджень в умовах обмеженого комфорту, наприклад на біологічних станціях.

Двофотонний мікроскоп є різновидом мультифотонного флуоресцентного мікроскопа. Його переваги в порівнянні з конфокальним мікроскопом- Велика проникаюча здатність та низький ступінь фототоксичності.

Двофотонний мікроскоп було вперше сконструйовано Вінфредом Денкомв лабораторії В. В. Вебба в Корнеллському університеті. Він скомбінував ідею двофотонного збудження із лазерним скануванням.

Процес двофотонного збудження відбувається так: два фотона, які мають низьку енергію, збуджують флюорофор(здатну до флюоресценції молекулу або частину молекули) протягом однієї квантової події. Результатом цього збудження є подальше випромінювання збудженими молекулами флюоресцентного фотона. Енергія флуоресцентного фотона більше енергії збудливих фотонів.

Імовірність того, що обидва фотони збудження будуть поглинені однією молекулою, дуже мала. Тому необхідний великий потік збудливих фотонів, який можна отримати за допомогою лазера, що випромінює фотони з великою частотою імпульсів (80 МГц). Флюорофори, що найчастіше використовуються, мають спектр збудження в проміжку 400-500 нм, у той час як довжина хвилі збуджуючого лазера знаходиться в проміжку 700-1000 нм (область інфрачервоних хвиль). Якщо флюорофор поглине одночасно два фотони, то він отримає достатньо енергії, щоб перейти у збуджений стан. Далі збуджений флюорофор випустить один фотон (у видимій частині спектра), довжина хвилі якого залежить від флюорофору.

Оскільки для того, щоб флюорофор перейшов у збуджений стан, необхідно поглинання двох фотонів, ймовірність випромінювання флюорофором вторинного фотона пропорційна квадрату інтенсивності збудження. Тому флуоресценція буде сильнішою у разі, коли промінь лазера чітко сфокусований, а не розсіяний. Максимальна флуоресценція спостерігається у фокальному обсязі (обсязі, де сфокусовано промінь лазера) і демонструє різке зменшення в області поза фокусом.

Конструкція

У двофотонному мікроскопі промінь інфрачервоного лазера сфокусовано за допомогою лінзи, що збирає. об'єктиву. Зазвичай використовується високочастотний 80 МГц сапфіровий лазер, що випромінює імпульс з тривалістю 100 фемтосекунд, що забезпечує високу щільність фотонного потоку, яка необхідна для двофотонного поглинання.

Світло, що випускається флюоресцентним зразком, посилюється за допомогою високочутливого фотопомножувача. Оскільки приймач світла є одноканальним, інтенсивність світла, що спостерігається в даному фокальному обсязі, формує один пікселзображення. Для того, щоб отримати двовимірне піксельне зображення, проводиться скануванняв фокальної площинизразка.

Переваги і недоліки

Використання інфрачервоного світла для збудження флюорофору в досліджуваних тканинах має свої переваги:

Довгі хвилі розсіюються менше, ніж короткі, що забезпечує високу просторову роздільну здатність.
Збудливі фотони мають невелику енергію, отже, вони менш руйнівні для тканин (що продовжує життя досліджуваної тканини).

Але є й деякі недоліки:

Для роботи лазера потрібні дорогі оптичні прилади для забезпечення інтенсивності імпульсу.
Двофотонний спектр поглинання флюорофору може сильно змінюватись на відміну від однофотонного спектра поглинання.
Промінь із довжиною хвилі понад 1400 нм значно поглинається водою у живих тканинах.