Постановка нокаутуючого удару. Отримання мишей з нокаутом (knock-out) та нокіном (knockin) генів - метод спрямованого мутагенезу Метод генетичного нокауту вимоги до експерименту

Вступ

1.1 Особливості векторних конструкцій

1.2 Внесення вектора до ембріональних стовбурових клітин

2. Роль метилювання ДНК у контролі геному

3. "Програмований нокаут генів"

4. Лінії нокаутних мишей

4.1 ФНП/ЛТ панель

4.3 B6SJL-Tg(SOD1-G93A)dl1Gur/J

4.5 C57BL/6Kaiso

5.Приклади використання нокаутованих мишей для вивчення функцій генів та спадкових захворювань людини

Список літератури

Нокаут гена (gene knockout) - це метод молекулярної генетики, у якому з організму видаляють чи роблять непрацездатними задані гени. Таким чином одержують організм, нокаутний за непрацюючими генами. Нокаутні організми допомагають дізнатися про функції генів, нуклеотидна послідовність яких відома. Відмінності між нокаутним та нормальним організмом свідчать про функцію вимкненого гена.

Ця методика полягає у цілеспрямованому внесенні зміненого, мутованого гена у спадкову інформацію клітин. Новий ген вноситься в одержувані з ембріонів стовбурові клітини, а результат оцінюється у дорослій тварині, тому поки не йдеться про застосування цієї технології у людей: багато роботи зі стовбуровими клітинами людини майже повсюдно заборонені, та й вирощування мутантних особин Homo sapiens в експериментальних цілях є малореальним.

Стандартною біологічною моделлю, для якої розроблено методику, є лабораторні миші.

Вступ

З перших днів виникнення генетики як науки, вчені мріяли отримувати спрямовані мутації, що зачіпають гени ознак, що ними вивчаються. Першим кроком до здійснення цієї мрії було відкриття радіаційного та хімічного мутагенезу. Закінчення секвенування геному людини у 2001 р. вивело новий рівень дослідження виявлення нових генів і функціонально значимих послідовностей геному. В даний час біотехнологія та біоінформатика в комбінації з класичною біохімією та генетикою є потужним інструментом для аналізу вже наявної послідовності геному людини та модельних організмів. Але справжній прорив у галузі спрямованих мутацій був здійснений завдяки використанню феномену гомологічної рекомбінації між порівняно невеликою ділянкою екзогенної та клітинної ДНК. Цей метод отримав назву спрямованої інактивації гена чи нокаут гена (від англ. knockout, синонім – gene targeting). Знаючи послідовність гена людини, що вивчається, стало можливо за допомогою інактивації гомологічного гена у модельного організму визначити біохімічну і фізіологічну роль його продукту. Оскільки значна кількість хвороб людини у своїй основі має спадковий компонент, моделі захворювань, створені з використанням цієї стратегії, дозволяють розширити наше розуміння біохімії та фізіології спадкових патологій та призведуть до створення нових підходів до лікування.

Лауреатами Нобелівської премії 2007 року в галузі медицини та фізіології стали Маріо Капеккі, Олівер Смітіс та сер Мартін Еванс – розробники технології gene targeting – способу змінити окремі гени у ссавців. Йдеться про передній кордоні сучасної науки про живу, справжню генетичну інженерію, про яку мріяв ще Уеллс в "Острові доктора Моро".

1. Метод генетичного нокауту

Нокаут гена – це молекулярно-генетичний метод, у ході якого задумані дослідником зміни вносяться в нуклеотидну послідовність гена, що вивчається, або його регуляторних елементів. Миша є найбільш адекватною модельною твариною для використання технології інактивації генів. Це зумовлено такими причинами:

а) миша – добре вивчений та доступний об'єкт;

б) геном миші та людини містить приблизно однакову кількість генів;

в) подібність амінокислотних послідовностей всіх білків людини та миші становить близько 90%.

Однак основною причиною використання миші як модель для інактивації гена є можливість ізолювання ембріональних стовбурових клітин, в яких будь-який ген може бути модифікований. Клітинні лінії, що містять модифікований ген, можуть бути привнесені в зародок, що розвивається, що дозволяє отримати химерну тварину, що несе штучно створену мутацію (рис. 1).

Мал. 1. Стратегія отримання лінії нокаутованих мишей.

Молекулярно-генетичним механізмом, що дозволяє здійснювати інактивацію гена, є гомологічна рекомбінація між екзогенною ДНК, що несе задумані дослідником зміни, та геномної ДНК об'єкта.

Класична схема отримання нокаутованих мишей включає кілька етапів: отримання векторної конструкції з наступним внесенням її в культуру ембріональних стовбурових клітин (ЕСК) і відбір трансформантів. Трансформовані ЕСК вносять у зародок і отриманих химерних тварин схрещують для отримання лінії мишей, гомозиготних по отриманій мутації (див. рис. 1).

1.1 Особливості векторних конструкцій

Залежно від поставленої задачі використовуються два типи векторів: заміщаючий та вставний. Перший тип векторів дозволяє замінити ділянку гена мішені, тоді як другий інтегрує до послідовності, що досліджується. Будова обох типів векторів однакова, крім орієнтації фланкуючих послідовностей (рис. 2). Найчастіше використовуються заміщаючі вектори.

Мал. 2. Два типи векторів - заміщаючий (А) і вставний (Б) - та їх механізми інтеграції в геном.

Вектор для трансформації несе клоновану послідовність гена, що вивчається, з внесеними до неї необхідними змінами. Це може бути: внесення стоп-кодону, що веде до синтезу короткого неактивного пептиду; делеція одного або кількох екзонів; делеція промоторної області; вставка, що призводить до порушення нормального функціонування гена та будь-які інші зміни, що призводять до відсутності функціонального продукту гена, що вивчається, або значно знижують його активність. Також до цієї послідовності вноситься позитивний селективний маркер (МПС), яким є ген neo. Продукт цього гена дає його клітинам стійкість до антибіотиків неоміцину і канаміцину. Модифікована послідовність має бути фланкована незміненими ділянками, якими проходитиме рекомбінація. Ефективність рекомбінації залежить від довжини фланкуючих послідовностей, що у свою чергу залежить від можливостей вектора (рис. 3). За довжини гомологічного плеча близько 5 тис. п.н. відсоток рекомбінації складає 0,001.

Мал. 3. Залежність частоти інтеграції вектора від довжини гомологічних плечей.

Як вектор можна використовувати бактеріальні штучні хромосоми (BAC), зі вставками фрагментів геному миші. У цьому випадку розмір одного плеча може становити до 150 тис. п.н., а розмір делеції – до 25 тис. п.н. Найкращий відсоток рекомбінації (8,3%) одержано авторами з використанням довжини плеча 110 тис. п.н. .

Існує ймовірність, що рекомбінація пройде не по досліджуваних нами ділянках геному, а в будь-якій подібній області. При цьому ген neo (МПС) збережеться, і в відібраному пулі ЕСК будуть присутні рекомбінантні клітини, які не несуть необхідних змін. Ця проблема вирішується внесенням до векторної конструкції маркера негативної селекції (МОС). Їм може бути ген тимідин-кінази простого вірусу герпесу (HSV-tk) або ген дифтерійного токсину А (DT-A), продукти яких вбивають еукаріотичні клітини. Положення МОС із зовнішнього боку гомологічного плеча вектора дозволяє елімінувати його після проходження гомологічної рекомбінації (рис. 4). У разі негомологічної рекомбінації, МОС виявляється інтегрованим в геном трансформованої клітини, що призводить до її елімінації. Наявність двох маркерів селекції (позитивного та негативного) дозволяє швидко та ефективно проводити відбір потрібних трансформантів.

Мал. 4. Дія системи позитивної – негативної селекції: А) інтеграція вектора у необхідну ділянку геному, що веде до нокауту гена, Б) випадкова інтеграція (синтез тимидин-киназы і загибель клітин) .

1.2 Внесення вектора в ембріональні стовбурові клітини

Для трансформації використовують ембріональні стовбурові клітини мишей. Крім того, що культура клітин ЕС здатна рости in vitro, при пересадці в дорослу мишу або ембріон клітини мають властивість приживатися. ЕС клітини, на відміну спеціалізованих соматичних клітин, зберігають генетичні потенції без тканинної спеціалізації. Ці клітини мають "мінімальний" фенотип: мінімум рецепторів та програм для взаємодії з мікрооточенням, оскільки лише 5% з 500 генів транссигналізації експресовано в проліферуючих ЕСК. Другою найважливішою характеристикою ЕСК у культурі є практично необмежений потенціал проліферації, зумовлений особливостями фенотипу незрілих клітин. Третьою особливістю ЕСК є зростання суспензійними клонами без будь-якої домішки просунутих клітин, прикріплених до підкладки. Кожен клон у такій культурі є похідним однієї прабатьківської ЕСК.

Ембріональні стовбурові клітини миші вперше отримані в 1981 році, що дало можливість для розвитку робіт з інактивації генів. Внесення лінеалізованого вектора в ЕС клітини можливе декількома методами: мікроін'єкція, трансфекція (електропорація), трансдукція (вірусна інфекція). Перелічені методи мають свої переваги та недоліки.

Нобелівську премію з фізіології та медицини цього року отримають Маріо Капеккі, Олівер Смітіс та сер Мартін Еванс за «відкриття принципів введення специфічних генних модифікацій в організм мишей за допомогою ембріональних стовбурових клітин», тобто за винахід методу нокауту генів.

Днями було оголошено лауреатів Нобелівської премії з фізіології та медицини 2007 року. Премію цього року розділять Маріо Капеккі (Mario R. Capecchi) з Університету Юти (США), Олівер Смітіс (Oliver Smithies) з Університету Північної Кароліни та сер Мартін Еванс (Sir Martin J. Evans) з Кардіффського університету (Великобританія). Премія присуджена за «відкриття принципів введення специфічних генних модифікацій в організм мишей за допомогою ембріональних стовбурових клітин» (тобто за винахід методу нокауту генів ( gene knockout). Цей метод, розроблений лауреатами наприкінці вісімдесятих років, широко використовують у сучасних генетичних дослідженнях визначення функцій генів.

Маріо Капеккінародився 1937 року у Вероні (Італія). Його батько, льотчик, загинув на війні, а мати потрапила до німецького концтабору за антифашистську діяльність. У чотири роки Капеккі залишився безпритульним. На щастя йому вдалося вижити, а мати знайшла його після звільнення з концтабору. Незабаром він разом із матір'ю переїхав до Сполучених Штатів, де й здобув освіту. Дисертацію зі спеціальності «Біофізика» він підготував у Гарварді під керівництвом одного з першовідкривачів структури ДНК Джеймса Вотсона (James D. Watson). З 1973 року Капеккі працює в Університеті Юти.

Олівер Смітіснародився в Галіфаксі (Англія) у 1925 році. Він навчався в Оксфорді, де й захистив дисертацію за спеціальністю «Біохімія». У п'ятдесятих роках Смітіс мав намір емігрувати до США і працювати в Університеті Вісконсіна (де він і почав згодом досліди, які принесли йому світову славу), але через проблеми з візою (sic!) протягом семи років (1953-1960) жив у Канаді і працював у Торонтському університеті. У 1988 році Смітіс разом із дружиною, яка не змогла знайти собі позицію у Вісконсіні, переїхав до Північної Кароліни і почав працювати в Університеті Північної Кароліни, де співпрацює й досі. Смітіс - дальтонік, але незважаючи на це не тільки успішно займається біохімією, але й захоплюється планеризмом.

Мартін Еванснародився у Великій Британії в 1941 році і навчався в Кембриджі та в Університетському коледжі в Лондоні. Він працював в Університетському коледжі (1966-1978) та в Кембриджі (1978-1999), а з 1999 року працює в Кардіффському університеті в Уельсі. У 2004 році Мартін Еванс був присвячений королевою Єлизаветою II у лицарі за заслуги перед медициною.

Метод нокауту генів дозволяє отримувати лінії нокаутних мишей (knock-out mice, knockout mice) – мутантних мишей, у яких вимкнено певні гени. Цей метод дозволяє досліджувати роль кожного конкретного гена у розвитку організму та в його нормальній та патологічній роботі та вивчати різні людські хвороби, використовуючи мишей як модельні об'єкти. Вимкнений ген призводить до тих чи інших порушень. Характер цих порушень дозволяє будувати висновки про функції даного гена. З того часу, як ця методика була розроблена, її застосування дозволило створити тисячі різних ліній нокаутних мишей, з яких кілька сотень служать модельними об'єктами для вивчення людських хвороб, зокрема захворювань серцево-судинної та нервової систем та злоякісних пухлин.

В основі методу лежить явище гомологічної рекомбінації – обміну відповідними ділянками між парами гомологічних хромосом. Маріо Капеккі та Олівер Смітіс незалежно один від одного винайшли спосіб виключення (нокаутування) генів за рахунок гомологічної рекомбінації за участю штучно синтезованих фрагментів ДНК, що мають певну послідовність нуклеотидів, відповідну ділянці одного з генів, але певним чином видозмінену. Такі фрагменти вводять у клітини, що вирощуються в культурі (тобто в штучному середовищі окремо від організму) за допомогою електропорації — через пори в клітинній мембрані, створені штучно за допомогою електричного поля. За рахунок рекомбінації в деяких клітин культури введена послідовність впроваджується в хромосому на місце нормальної.

Якщо видозмінити впроваджувану послідовність певним чином, то на основі зіпсованого таким чином гена у клітин, які отримали цей ген, синтезуватиметься нефункціональний (не виконує своєї функції) білок, або взагалі не синтезуватиметься ніякого білка. Якщо видозмінити вихідну послідовність, не тільки зіпсувавши певний ген, але й додавши інший ген, не властивий мишачих клітин і робить їх стійкими до дії деякого антибіотика, рекомбінантні клітини можна легко відокремити від інших, подіявши на культуру даним антибіотиком, і отримати таким чином культуру рекомбінантних клітин. Капеккі та Смітіс навчилися вимикати за допомогою цього методу гени в культурах клітин, але розроблена ними технологія ще не дозволяла одержувати нокаутні багатоклітинні організми.

Мартін Еванс, який близько 1980 року одним із перших розробив спосіб вирощування в культурі ембріональних стовбурових (недиференційованих) клітин мишей, згодом винайшов метод, що дозволяє передавати певні гени потомству мишей, які цими генами не володіють. Він вводив стовбурові клітини, отримані з ембріонів мишей однієї лінії, в ембріони мишей іншої лінії і, використовуючи якусь мишу як сурогатну матір, що виношує ці ембріони, отримував химерних мишей (що складаються з клітин, отриманих від різних організмів). У деяких із них попередники гамет (статевих клітин) були нащадками ін'єктованих в ембріони стовбурових клітин. Нащадки таких химер діставалися гени тієї лінії, від якої було взято стовбурові клітини. Відбираючи нащадків химер, що володіють ознаками цієї лінії, Еванс отримав мишей, генетично ідентичних ін'єктованим раніше в ембріони стовбурових клітин.

Потім Еванс модифікував цей метод для отримання трансгенних мишей (тобто мишей зі штучно впровадженими генами), додаючи гени в хромосоми ін'єктованих стовбурових клітин за допомогою ретровірусів (вірусів, гени яких вбудовуються в хромосоми клітин господаря). Нащадки химер, отриманих у такий спосіб, якщо в цих химер попередники статевих клітин утворювалися з ін'єктованих в ембріон стовбурових клітин, виявлялися носіями впровадженого в стовбурові клітини гена.

Досягнення Еванса уможливили створення мишей, у яких певний ген був би виключений за допомогою нокаутування за рахунок гомологічної рекомбінації за участю штучно синтезованих фрагментів ДНК, тобто об'єднавши метод Еванса з методом Капекки і Смітіса — нокаутуючи гени в стволових клітин, що ін'єкуються в ембріон. Саме в лабораторіях Капеккі і Смітіса (знову незалежно, і в різних варіантах) подібний модифікований метод і був вперше застосований на практиці, започаткувавши безліч робіт з нокаутними мишами.

Застосування методу нокауту генів стало особливо актуальним останніми роками, після завершення секвенування (прочитання послідовності) повних геномів як людини (2003), так і миші (2002), а також інших видів тварин. Послідовно нокаутуючи різні гени не більше мишачого геному, дослідники з'ясовують функції кожного їх. Враховуючи, що в людини і миші дуже багато генів подібні і виконують ті самі функції, нокаутні миші надають дослідникам багатий матеріал для вивчення ролі генів у нормальному розвитку та житті людського організму та в патологічних процесах. Очевидно, рано чи пізно завдяки методу нокауту генів вдасться вивчити властивості всіх (кілька десятків тисяч) генів мишачого геному. Роботи у цьому напрямі ведуться у багатьох країнах світу, не виключаючи і Росію.

Метод нокауту генів можна застосовувати як на мишах, а й інших тварин. Проте саме нокаутні миші знайшли особливо широке застосування — у зв'язку з тим, що вони еволюційно (і, відповідно, генетично) досить близькі до людини, а отримати нокаутні лінії вони набагато простіше, ніж більшість інших лабораторних тварин. Зокрема, у щурів перші нокаутні лінії були отримані лише у 2003 році, через багато років після створення перших нокаутних мишей.

Церемонія нагородження Нобелівськими преміями відбудеться, як завжди, 10 грудня, у день смерті Альфреда Нобеля (1896), у Стокгольмі.

Минулого року Нобелівську премію з фізіології та медицини отримали Ендрю Файр (Andrew Z. Fire) та Крейг Мелло (Craig C. Mello) за відкриття іншого шляху виключення генів – РНК-інтерференції, яка може відбуватися навіть на пізніх стадіях розвитку організму під дією ділянки дволанцюгової РНК, послідовність нуклеотидів в якому відповідає фрагменту гена, що вимикається. У цьому виключення відбувається поза рахунок ушкодження самого гена в хромосомі, а й за рахунок приниження лічених нього матричних РНК. Їхнє знищення не дозволяє синтезувати білок, що кодується цим геном.

Вступ

1.1 Особливості векторних конструкцій

1.2 Внесення вектора до ембріональних стовбурових клітин

3. "Програмований нокаут генів"

4. Лінії нокаутних мишей

4.1 ФНП/ЛТ панель

4.3 B6SJL-Tg(SOD1-G93A)dl1Gur/J

4.5 C57BL/6Kaiso

5.Приклади використання нокаутованих мишей для вивчення функцій генів та спадкових захворювань людини

Список літератури

Стандартною біологічною моделлю, для якої розроблено методику, є лабораторні миші.

Вступ

1. Метод генетичного нокауту

а) миша – добре вивчений та доступний об'єкт;

б) геном миші та людини містить приблизно однакову кількість генів;

в) подібність амінокислотних послідовностей всіх білків людини та миші становить близько 90%.

Мал. 1. Стратегія отримання лінії нокаутованих мишей.

1.1 Особливості векторних конструкцій

Мал. 2. Два типи векторів - заміщаючий (А) і вставний (Б) - та їх механізми інтеграції в геном.

Мал. 3. Залежність частоти інтеграції вектора від довжини гомологічних плечей.

1.2 Внесення вектора в ембріональні стовбурові клітини

Мікроін'єкція дозволяє із частотою до 100 відсотків вносити екзогенну ДНК у клітину, а частота гомологічної рекомбінації становить близько 0,67%. Цей метод, безперечно, є найбільш ефективним. Однак для здійснення мікроін'єкції потрібно дороге обладнання та висока кваліфікація експериментатора. Крім цього, сам метод дуже трудомісткий і займає багато часу. Векторні конструкції мікроін'єкцією можна вносити і в зиготу, але відібрати потрібні трансформанти в цьому випадку неможливо.

Найбільш економічними та досить ефективними методами внесення екзогенної ДНК у клітину є електропорація та ретровірусна інфекція. До їх переваг, насамперед, слід віднести можливість одноразово обробити сотні тисяч клітин, які завдяки системі позитивно-негативної селекції досить швидко проходять відбір. Це значно спрощує і робить економічно вигідним, проти мікроін'єкцією, процедуру отримання трансформованих клітин. Обидва методи мають недоліки: більший відсоток негомологічної рекомбінації при внесенні векторних систем електропорацією проти іншими методами, обмежені розміри ретровірусних векторів тощо. . Найчастіше внесення векторів у клітину проводять за допомогою електропорації. У той же час ретровірусна інфекція дозволяє вносити екзогенну ДНК не тільки в клітини ЕС, але і в ембріони. Отже, лінія трансформованих клітин отримана та підтримується. Наступний етап – внесення клітин до ембріона миші (як правило, на стадії бластули). Химерний зародок підсаджують у матку помилково вагітної самки. Отриману таким чином химеру схрещують з нормальною твариною, яка має відмінності (наприклад, колір). Якщо отримані в першому поколінні миші мають фенотип лінії, з якої отримані клітини ЕС, то їх можна використовувати для насичуючого схрещування. Результатом буде отримання лінії тварин, гомозиготних за створеною мутацією.

2. Роль метилювання ДНК у контролі геному

Одним із способів видозміни гена є його заміна на безглузду послідовність ДНК - тоді ген "вимикається". Дослідники систематично "вимикають" гени та спостерігають, до яких наслідків на рівні організму наводить це "вимикання". Така методика називається "генетичний нокаут" (gene knockout).

Вона дозволяє докладно вивчити функцію конкретного гена під час ембріонального розвитку та після народження тварини. Можна простежити, як кожен ген впливає розвиток організму і виникнення тієї чи іншої патології. У зв'язку з цим метод ще отримав назву "генетичне планування". Наразі вже проведено досліди з "вимкнення" десяти тисяч генів миші, це половина всього мишачого геному.

Для розвитку організму достатньо однієї клітини з одиничною (звичайно ж, диплоїдною) копією ДНК, яка при розподілі точно відтворюється від клітини до клітини. Це стосується практично всіх живих багатоклітинних істот. У людини усі його клітини містять ідентичну ДНК. Клітини крові, печінки, мозку, стовбурові клітини – всі вони однакові за ДНК. Чим визначається різноманіття наявних у людини високоспеціалізованих клітин і тканин? Це досягається за рахунок включення чи виключення генів, відповідальних за спеціалізацію клітини. Саме механізми контролю роботи, або як заведено говорити, експресії генів є основною темою досліджень нашої групи. Одним з таких механізмів є метилювання генів - ковалентне приєднання метильної групи в положенні 5 піримідинового кільця цитозину. ДНК, що містить метильовані цитозини, є транскрипційно неактивною, і гени, що знаходяться поблизу метильованих районів, мовчать.

Роль метилювання ДНК та механізм його негативного впливу на роботу генів у процесі життєдіяльності хребетних організмів (на моделях жаби, миші та клітинних ліній людини).

Метилювання ДНК у хребетних набуває смислового навантаження у вигляді придушення транскрипції прилеглих генів двома основними способами: (А) за рахунок прямого впливу на ДНК, у складі якої метильований цитозин пригнічує зв'язування транскрипційного фактора зі своєю ділянкою, та (Б) за рахунок специфічного зв'язування з метилованим районом спеціалізованих метил-ДНК білків, що впізнають, які, у свою чергу, залучають складні механізми придушення транскрипції шляхом модифікації прилеглих гістонів.

Як приклад охарактеризовано білок Каізо. Каізо, з одного боку, зв'язується з катеніном р120, а з іншого - здатний пригнічувати транскрипційну активність метильованих генів. Каізо має доменну структуру і складається з N-кінцевого BTB/POZ домену та C-кінцевих цинкових пальців типу C2H2. Цинкові пальці специфічно пов'язують 5-метил цитозин, що містить ДНК.

Нокаут гена Каізо призводить до часткової резистентності тварин до раку кишківника. Крива виживання тварин із нокаутом гена Каізо (червона лінія) у моделі спонтанного раку кишечника APC(Min). Чорною лінією показано криву виживання контрольних тварин

Проведено генетичний нокаут гена Каізо у мишей. Показано, що тварини без Каізо (Каізо-КО) розвиваються нормально та не мають виражених патологій. При перекладі Каізо-КО тварин на генетичне тло з високим відсотком спонтанних пухлин кишечника відбувається збільшення терміну життя тварин, зменшується середній розмір поліпів у кишечнику. Таким чином, встановлено, що без Каізо відбувається уповільнення росту пухлин кишечника в APC(Min) моделях. На відміну від миші ген Каізо є необхідним для життєдіяльності земноводних. Ці дані були підтверджені і на рибах Danio Rerio. Отримано лінії клітин з множинними генетичними нокаутами генів MBD2, MeCP2 та Каізо. Показано, що білки MBD2, MeCP2 і Каізо мають синергетичну дію (репресують) метильований промотор гена Xist. Показано, що мутації в гені Каізо не є ключовими в ініціювання синдрому Ретта (нейродегенративне захворювання у дівчаток), хоча інший метил ДНК, що зв'язує білок MeCP2, безпосередньо залучений до цієї патології.

У геномі хребетних знайдено та охарактеризовано два гени, що кодують білки ZBTB4 та ZBTB38, які за своєю амінокислотною послідовністю та розташуванням консервативних доменів є родичами Каізо. Показано, що ці два білки є метилом ДНК залежними транскрипційними репресорами.

Каізо подібний білок ZBTB4 розташований у метильованих ділянках гетерохроматину. Клітини без метилювання - мишачі ембріональні фібробласти з генетичною делецією генів dnmt1-/- та p53-/-. Клітини з нормальним рівнем метилювання - мишачі ембріональні фібробласти p53-/-. У разі dnmt1-/-p53-/- клітин видно відсутність кореляції між локалізацією ZBTB4 в гетерохроматині (DAPI), у той час, як у p53-/- клітинах видно повну ко-локалізацію ZBTB4 і гетерохроматину.

3. "Програмований нокаут генів"

Слід зазначити, що не гени можна інактивувати на стадії зародка. І, природно, не можна отримати клітини чи тварин, нокаутованих за так званими генами домашнього господарства. Однак для генів, що беруть участь в ембріональному розвитку, розроблено підхід, що дозволяє проводити їхню інактивацію після розвитку організму. Ця стратегія дозволяє "вимикати" гени в певних умовах ("програмований нокаут генів", англ. conditional knockout), а саме у необхідній досліднику тканини або групі клітин та/або під впливом індукуючої речовини.

Це можна здійснити за допомогою методики, що поєднує гомологічну рекомбінацію, як у випадку класичного нокауту генів, та системи сайт-специфічної рекомбінації. Сайт-специфічні рекомбінази – це ферменти, які впізнають особливі ділянки ДНК і обмін між ними. Найчастіше використовуються Cre рекомбіназа бактеріофага P1 та Flp рекомбіназу (фліпазу) дріжджів. Ці ферменти розпізнають нуклеотидні послідовності 34 основи, звані, відповідно, loxP і frt сайти . Якщо ці послідовності розташовані в одній орієнтації, рекомбінація по них призведе до делеції фланкованої ділянки. Якщо ж орієнтація послідовностей різна, це призведе до інверсії фрагмента з-поміж них (рис. 5).

Мал. 5. Схема механізму сайт-специфічної рекомбінації. Залежно від орієнтації loxP-сайтів відбувається або делеція, або інверсія фланкованого фрагмента.

Використання стратегії "програмованого нокауту гена" вимагає створення двох ліній мишей. Лінія А несе інтегровану в геном послідовність гена Cre під контролем тканинно-специфічного або індуцибельного промотора. Лінія містить два loxP сайту, фланкирующих підлягає видаленню послідовність досліджуваного гена (екзон, промотор і т.д.) . Слід зазначити, що вставки в геномну послідовність сайтів loxP і гена Cre здійснюються з використанням тих же прийомів, що і при класичному нокауті генів, але не повинні зачіпати функціональні послідовності (рис. 6).

Мал. 6. Схема використання тканинно-специфічної Cre-loxP рекомбінації для отримання мишей з програмованим нокаутом гена.

Отримані таким чином гомозиготні лінії мишей схрещують. У нащадків від цього схрещування досліджуваний ген інактивується в тканині або групі клітин, де буде активний промотор, що контролює активність гена Cre . Використовуючи стратегію "програмованої інактивації гена", можна досягти результатів, недоступних під час використання стандартної процедури нокауту генів.

4. Лінії нок-аутних мишей

4.1 ФНП/ЛТ панель

Забарвлення вовни: чорні.

Походження: лінії виведені у лабораторії молекулярної імунології ІМБ ім. В. А. Енгельгардта РАН методом генетичного нокауту та переведені на генетичну основу C57BL/6 шляхом зворотного схрещування. Панель містить лінії мишей з модифікованим геном фактора некрозу пухлин (ФНП) і лімфотоксину (ЛТ), підготовлені до тканеспецифічної делеції гена, а також лінії мишей з делецією гена ФНП або ЛТ специфічно в макрофагах/нейтрофілах, або Т- або В-лімфоцитах, або у клітинах зародкової лінії.

Характеристика лінії:

у мишей з повною делецією гена ФНП порушено захист від низки патогенів;

у мишей з повною делецією гена ЛТ-бета порушена структура вторинних лімфоїдних органів та антиген-специфічна продукція деяких класів імуноглобулінів.

Дані миші є унікальною панель для вивчення ролі тканеспецифічної продукції цитокінів сімейства ФНП при вродженому та набутій імунодефіциті.

Ключові публікації:

Tumanov та ін. Розрізняють роль кадру lymphotoxin expressed by B cells в організації secondary lymphoid tissues. Immunity. 2002 Sep;17(3):239-50.

Grivennikov et al. Розрізняють і нелегальні функції в TNF виробляються з ними клітинами і макроскопіями/неутрофілами: сприятливими і deleterious ефектами. Immunity. 2005 Jan; 22 (1): 93-104.

4.2 BALB/cMBD2

Забарвлення вовни: білі.

Походження лінії лінія отримана в Единбурзькому Університеті (Великобританія) в лабораторії Едріана Берда (Adrian Bird) шляхом генетичного нокауту гена MBD2 в мишах лінії BALB/c.

Характеристика лінії:

Особи жіночої статі мають ослаблений материнський інстикт. У мишей спостерігається акселерація у розвитку у ранньому віці без акселерації у наборі маси тіла. При переведенні мутантного MBD2 локусу на генетичний фон Min(APC) мишачої моделі раку кишечника у тварин виникає резистентність до злоякісної трансформації епітеліальних клітин.

Основні галузі використання:

вивчення розвитку пухлин кишківника;

модель материнської поведінки.

Лінія BALB/cMBD2 використовується в дослідженнях, які проводяться спільними зусиллями Единбурзького Університету та центру "Біоінженерія" РАН.

4.3 B6SJL-Tg(SOD1-G93A)dl1Gur/J

Забарвлення вовни: різне: біле, коричневе, чорне.

Лінія створена в лабораторії Mark E. Gurney при Північно-Західному університеті США (Northwestern University, USA).

Метод модифікації: Трансгеноз. Трансгенні миші G93A експресують мутантний людський ген Cu/Zn-супероксиддисмутазу SOD1 (Gly93/Ala; гліцин заміщений на аланін у позиції 93).

Характеристика лінії: Трансгенні миші G93A, що експресують мутантний SOD1, характеризуються прогресуючою дегенерацією мотонейронів, як при бічному аміотрофічному склерозі людини. Миші стають паралізованими однією чи більше кінцівок віком 6-7 місяців. З огляду на прогресування паралічу скелетних м'язів тварини помирають через 4-6 тижнів після появи перших клінічних ознак захворювання.

Основні галузі використання:

Бічний аміотрофічний склероз

Нейропротекція

Подробиці про цю лінію тварин: Gurney ME, Pu H, Chiu AY, Daly Canto MC, Polchow CY, Alexander DD, Caliente J, Hentati A, Kwon YW, Deng HX, et al. 1994. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science 264:1772-5.

4.4 C 57 BL / MUC 2

Забарвлення вовни: C57BL/MUC2

Походження: лінію отримано в Коледжі ім. Альберта Ейнштейна (Нью-Йорк, США) у групі Анни Велчич (Anna Velcich) шляхом генетичного нокауту гена Mucin2 у мишах лінії C57BL/6. До Розплідника "Пущино" лінія надійшла у 2006 році.

Характеристика: У мишах цієї лінії порушено морфологію кишкових криптів. Протягом 10 місяців після народження у мишей розвиваються аденоми тонкого кишечника, які прогресують потім у злоякісні аденокарциноми.

Подробиці: Velcich et al., Colorectal cancer in mice genetically deficient in the mucin Muc2. Science. 2002 Mar 1; 295 (5560): 1726-9.

Основні сфери використання: вивчення розвитку пухлин кишечника

4.5 C57BL/6Kaiso

Забарвлення шерсті: чорне.

Походження лінії: лінію отримано в Единбурзькому Університеті (Великобританія) у групі Єгора Прохорчука шляхом генетичного нокауту гена Kaiso у мишах лінії C57BL/6.

Характеристика лінії:

При переведенні мутантного Kaiso локусу на генетичний фон Min(APC) мишачої моделі раку кишечника у тварин виникає резистентність до злоякісної трансформації епітеліальних клітин.

Основні галузі використання:

вивчення розвитку пухлин кишечника

5. Приклади використання нокаутованих мишей для вивчення функцій генів та спадкових захворювань людини

Існує багато прикладів використання класичного нокауту генів вивчення біологічних функцій індивідуальних генів чи сімейств генів. Розглянемо лише деякі з них.

Вивчення функцій генів.

1) Ген Nuk, член сімейства рецепторів тиронінкінази, який був вивчений за допомогою делецій та модифікацій. У мишей з відсутністю препарату цього гена порушувався контроль проростання нейронів до клітини-мішені. Проте білок Nuk – трансмембранний білок. Щоб диференціювати роль внутрішньоклітинних та позаклітинних доменів у міграції аксонів були модифіковані ділянки гена, що кодують обидва типи доменів. В результаті цієї роботи було показано, що в проростанні аксонів до цілей основну роль відіграє внутрішньоклітинний домен білка Nuk.

2) Для вивчення процесів дозрівання лімфоцитів було внесено точкову мутацію (стоп-кодон) у ген α-ланцюга рецептора імуноглобуліну. Мутантні миші мали незначні дефекти в ранньому розвитку В-лімфоцитів, але сильні відхилення у дозріванні та функціях зрілих лімфоцитів.

3) Метод класичного нокауту гена був використаний і для одержання партеногенетичних мишей. Гени Igf2 і H19 – одні з основних імпринтованих генів ссавців, що діють у цис-положенні та відіграють ключову роль у розвитку організму. При цьому для розвитку необхідно наявність як батьківського, і материнського набору хромосом. При розвитку партеногенетичних зародків, які одержали обидві хромосоми від матері, ген Igf2 виявляється неактивним, що призводить до термінації розвитку. Делеція гена H19 в одній хромосомі дозволила активувати ген Igf2 і отримати умовно партеногенетичну тварину.

Моделі генетичних порушень та захворювань людини, створені з використанням технології нокауту генів.

1) Мутації гена TnI були виявлені у пацієнтів із гіпертрофічною кардіоміопатією. Щоб вивчити вплив мутації в даному гені на розвиток захворювання, були створені миші з нокаутом за геном TnI. Гомозиготні нокаутовані тварини помирали через 18 днів після народження внаслідок кардіоміопатії. Таким чином було доведено безпосередній зв'язок мутації гена TnI з цим захворюванням.

2) Для вивчення генетичних основ розвитку алкоголізму було інактивовано 18 генів (альдегіддегідрогеназу, рецептори дофаміну, ГАМК-рецептори, нейропептид Y та ін), які, ймовірно, беруть участь у цьому процесі. Всі мутанти були охарактеризовані за поведінковими та фармакологічними тестами, що дозволило оцінити внесок генів, що вивчаються, у розвиток захворювання.

3) Велика робота з використанням методики нокауту генів проводилася для вивчення функції опіоїдної системи мозку. В оглядах проаналізовано результати робіт з інактивації μ, δ і κ - опіоїдних рецепторів, а також опіоїдних пептидів (β-ендорфін, препроенкефалін та препродинорфін).

4) Інактивація гена FMR-1 миші дозволила створити модель синдрому ламкої Х хромосоми та вивчити відхилення у поведінці тварин та молекулярні механізми захворювання.

5) За допомогою нокауту була показана роль рецептора інсуліну та внутрішньоклітинних білків-месенджерів у розвитку діабету другого типу, роль цитокінів та хемокінів у розвитку астми та ін респіраторних захворювань. Також показано участь генетичних факторів у розвитку деяких інфекційних захворювань, участь NO синтази у розвитку атеросклерозу, вплив продукту гена, що кодує VI-a рецептор вазопресину, на формування соціальної поведінки та поведінки занепокоєння у мишей.

Насамперед вчені могли просто виявляти ті чи інші зміни в генетичному матеріалі тварин і намагатися за допомогою відбору виділити "чисті лінії" тих, що мають ті чи інші особливості мишей. Цей пасивний шлях не давав і дещиці тієї свободи, яку дослідники здобули, навчившись безпосередньо впливати на необхідний ген.

Найпродуктивніше використання цієї технології - "вимикати" ті чи інші гени і дивитися, який вплив вплинуло на організм тварини. Таким чином можна точно встановити функцію кожного гена, а значить, зрозуміти механізми нормального розвитку організму та формування зумовлених спадковістю захворювань – раку, діабету, хвороб серця тощо.

Це "вимикання" отримало назву "генетичного нокауту" (gene knockout). У спадковому матеріалі мишей, за сучасними уявленнями, функціонує близько двадцяти тисяч генів, кожен з яких, спрощено кажучи, відповідає за будь-яку ознаку в організмі тварини. На момент присудження Капеккі, Смітісу та Евансу нобелівської премії вченим вдалося дослідити наслідки виключення половини з них, тобто десяти тисяч. Як йдеться у повідомленні Нобелівського комітету, найближчим часом генетики сподіваються провести послідовний нокаут кожного з мишачих генів.

Нокаут, таким чином, дає можливість "препарувати" кожне генетичне захворювання і кожен аспект нормального розвитку живої істоти, що робить його універсальним методом, який можна застосувати практично в будь-якій сфері досліджень.

Список літератури

1. Рєпін В.С. Ембріональна стовбурова клітина: від фундаментальної біології до медицини // Успіхи фізіологічних наук. – 2001. – Т. 32, №1. - С. 3-18

2. Тронько М.Д., Пушкарьов В.М. Механізм дії таксолу та перспективи його використання для лікування злоякісних опухолів щитоподібної залози // Ендокринологія. - 2003. - 8, № 2. - С. 228-243.

3. Пушкарьов В.М., Ковзун О. I., Тронько М.Д. та ін. Участь фосфоінозитидів, протеїнкіназ С та А передачі регуляторного сигналу К+ в адренокортикальних клітинах людини // Укр. бiохiм. журн. -2005. - 77, № 1. - С. 65-71.

4. Копнін Б.П. Мішені дії онкогенів та пухлинних супресорів: ключ до розуміння базових механізмів канцрогенезу // Біохімія. - 2000. - 65, № 1. - С. 5-33.

5. Тронько М.Д., Левчук М.І., Попадюк І.Д. та ін. Дія протиопухлинного препарату таксолу на клітиніанапластичного раку щитовидної залози // Дод. НАН України. - 2006. - № 8. - С. 204-206.

6. Філяк Є., Філяк О., Афанасьєв С., Стійка Р. Дефіцит гену білока секурину (PTTG) знижує рівень активації Т лімфоцитів, індукованої лектином // Експерим. та клин. фізіологія та біохімія. - 2006. - № 4. - С. 18-24.

7. Фiляк Є., Держко I., Фiляк О., Стійка Р. Втрата гену білок секурину (PTTG) веде до пригнiчення активацiї Т-лiмфоцитiв // Мед. хімія. - 2007. - № 1. - С. 11-19.

8. Анісімов В.М. Чинник часу у багатостадійному канцерогенезі // Вопр.онкол.- 1990.- T. 36.- C. 771-784.

9. Анісімов В.М. Канцерогенез та онтогенез: основні напрями та результати досліджень // Зап. онкології. – 1997. – Т. 43, N 1. – С. 88- 94.

10. Анісімов В.М. Роль індукованої 5-бромодезоксиуридином нестабільності геному в механізмах прискореного старіння і канцерогенезу // Успіхи геронтології. - 1997. - Т. 1. - С. 50-56.

11. Бауер Е.С. Теоретична біологія. - М.; Л.: Изд.-во Всесоюзного інституту експериментальної медицини, 1935. – 206 с.

12. Газієв А.І., Підлуцький А.Я. Бредбері Р. Збільшення з віком частоти спонтанних та індукованих g-радіацією hprt-мутацій у лімфоцитах селезінки мишей // Докл. РАН. – 1994. – Т. 339. – С. 276-278.

14. Bardoni B., Mandel JL, Fisch G.S. FMR1 gene і fragile X syndrome // Am. J. Med. Genet. – 2000. – Vol. 97 №2. – P. 153-163.

15. Bielsky I.F., Hu S.B., Szegda K.L., Westphal H., Young L.J. Професійний розвиток в соціальній рекогніції і зменшення в anxiety-like behavior в vasopressin V1a receptor knockout mice // Neuropsychopharmacology. – 2004. – Vol. 29 №3. – P. 483-493.

16. Capecchi M.R. Зміна genome з homologous recombination // Science. – 1989. – Vol. 244. – P. 1288-1292.

17. Chen L., Toth M. Fragile X mice develop sensory hyperreactivity to auditory stimuli // Neuroscience. – 2001. – Vol. 103 №4. – P. 1043-1050.

18. Evans MJ, Kaufman MH. Застосування в культурі pluripotential cells from mouse embryos // Nature. – 1981. – Vol. 292 №5819. – P. 154-156.

19. Frankland P.W., Wang Y., Rosner B., Shimizu T., Balleine B.W., Dykens E.M., Ornitz E.M., Silva A.J. Sensorimotor gating abnormalities в молодих людей з фрагільним X syndrome and Fmr1-knockout mice // Mol. Psychiatry. – 2004. – Vol. 9. – P. 417-425.

20. Henkemeyer M., Orioli D., Henderson J.T., Saxton T.M., Roder J., Pawson T., Klein R. Nuk керує засобами, що беруть участь у громадських законах в мамамалії центральної нервової системи // Cell. – 1996. – Vol. 86. – P. 35-46.

21. Kawashima S., Yokoyama M. Dysfunction of endothelial nitric oxide synthase and atherosclerosis // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2004. – Vol. 24 №6. – P. 998-1005

22. Kieffer B.L., Gaveriaux-Ruff C. Exploring opioid system by gene knockout // Prog. Neurobiol. – 2002. – Vol. 66 №5. – P. 285-306.

23. Kilby NJ, Snaith MR, Murray J.A.H. Site-specific recombinases: tools for genome engineering // Trends Genet. – 1993. – Vol. 9. – P.413-421.

24. Kono T., Obata Y., Wu Q., Niwa K., Ono Y., Yamamoto Y., Park E.S., Seo JS. – 2004. – Vol. 428 №6985. – P. 860-864.

25. Loebel DA, Tam P.P. Genomic imprinting: mice without a father // Nature. – 2004. – Vol. 428 №6985. – P. 809-811.

26. Mansour S.L., Thomas K.R., Capecchi M.R. Відхилення proto-oncogene int-2 в способі embryo-derived stem cells: як загальною strategy for targeting mutations до non-selectable genes // Nature. – 1988. – Vol. 336 №6197. – P. 348-352.

27. Reeves R.H. Exploring development and disease germ-line genetic engineering in the mouse // Anat. Rec. – 1998. – Vol. 253 №1. – P. 19-23.

28. Thomas K.R., Capecchi M.R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells // Cell. – 1987. – Vol. 51 №3. – P. 503-512.

29. Vasquez Y.R., Spina D. What have transgenic and knockout animals thought us about respiratory disease? // Respir. Res. – 2000. – Vol. 1 №2. – P. 82-86.

30. Volarevic S., Pende M., Pullen N. Manipulation mammalian genome by gene targeting // Croat. Med. J. – 1999. – Vol. 40 №3. – P. 368-374.

* Газієв А.І., Підлуцький А.Я. Бредбері Р. Збільшення з віком частоти спонтанних та індукованих g-радіацією hprt-мутацій у лімфоцитах селезінки мишей // Докл. РАН. – 1994. – Т. 339. – С. 276-278.

В даний час біотехнологія та біоінформатика в комбінації з класичною біохімією та генетикою є потужним інструментом для аналізу вже наявної послідовності геному людини та модельних організмів. Але справжній прорив у галузі спрямованих мутацій був здійснений завдяки використанню феномену гомологічної рекомбінації між порівняно невеликою ділянкою екзогенної та клітинної ДНК. Цей метод отримав назву спрямованої інактивації гена чи нокаут гена (від англ. knockout, синонім – gene targeting). Знаючи послідовність гена людини, що вивчається, стало можливо за допомогою інактивації гомологічного гена у модельного організму визначити біохімічну і фізіологічну роль його продукту. Оскільки значна кількість хвороб людини у своїй основі має спадковий компонент, моделі захворювань, створені з використанням цієї стратегії, дозволяють розширити наше розуміння біохімії та фізіології спадкових патологій та призведуть до створення нових підходів до лікування.

Метод генетичного нокауту

а) миша – добре вивчений та доступний об'єкт;

б) геном миші та людини містить приблизно однакову кількість генів;

в) подібність амінокислотних послідовностей всіх білків людини та миші становить близько 90%.

Мал. 1.Стратегія отримання лінії нокаутованих мишей
(за книгою Тронько М.Д., Левчук М.І., Попадюк I.Д. та ін. Дія протиопухлинного препарату таксолу на клітиніанапластичного раку щитовидної залози // Дод. НАН України. - 2006. - № 8. - С. 204-206.).

Метод нокауту/нокіна генів (тобто видалення чи додавання певного гена чи генів в геном організму) - це метод отримання клітин чи цілих організмів (мишей), у яких цілеспрямовано зруйнований певний ген чи вбудований додатковий ген. Для здійснення подібного необхідно мати:

клонований заданий ген;
два «методичні» гени для селекції шуканих клітин з вдало інактивованим геном та відповідне селективне середовище культивування;
особливу унікальну лінію перевивних стовбурових ембріональних мишачих клітин - ES (embryonic stem cell line), що зберігають здатність диференціюватися в належних умовах у всі типи клітин організму миші, включаючи гамети;
здорових мишей та працьовитість приблизно на рік наполегливої роботи.

Еванс, Кауфман та співавт. опублікували в «Nature» роботу про виведення перевивається (трансформованої) лінії ембріональних стовбурових клітин - ES (embryonic stem cells). Незалежно від них аналогічну роботу виконав G. Martin і опублікував її в тому ж 1981 в PNAS. Ці перевивні лінії клітин автори отримали з ембріонів мишей на ранніх стадіях розвитку - стадіях бластули, виводячи їх у культуру на підшар фідерних клітин - ембріональних фібробластів у присутності факторів, що пригнічують диференціювання (наприклад, L1F - leukemia inhibitory factor).
Пізніше різні автори вивели кілька ліній та субліній ES (D3, СЕ, АВ-1, E14TG2a, Л, R1, НМ-1 та ін.). Дані клітини використовують для створення мутантних мишей - з відсутністю певного гена (генетичний нокаут) або запровадженням зайвого гена (генетичний накін) у дослідницьких цілях. Масовий характер роботи з генетичного нокауту прийняли з 1991 р. Роботи з виведення ембріональних стовбурових клітин людини мають місце, але нині такі роботи «не приймають» у відповідальному науковому співтоваристві з двох причин:

завжди підозрюється трансформованість клітин, що перевиваються in vitro, тобто. можливість їх пухлинного переродження, що для переважної більшості біологів та медиків є абсолютною забороною застосування ембріональних стовбурових клітин у людей;
в даний час немає розсудливих аргументів для виправдання робіт зі створення запланованих будь-ким людей-мутантів, аналогічних мишам з генетичним нокаутом або нокіном.

Методики видалення/вбудовування генів ґрунтуються на природному феномені гомологічної рекомбінації. При статевому розмноженні живих організмів природа «передбачила» мейоз та кросинговер у мейозі, при якому відбуваються фізичне зближення гомологічних генів у гомологічних хромосомах та обмін ділянками ДНК між гомологічними генами. Виявляється, якщо в клітину ввести окремий ген, то він теж може знайти в хромосомах гомологічний собі ген (одноіменний) і вступити з ним в гомологічну рекомбінацію, тобто. провести обмін ділянками ДНК. Для спрямованого мутагенезу (або нокауту) заданого гена клітину вводять не інтактний гомологічний ген, а навмисне пошкоджений. Далі все відбувається за природними механізмами: пошкоджений, але гомологічний екзоген знаходить однойменний інтактний клітинний ген, вступає з ним у гомологічну рекомбінацію, і в результаті в хромосомі на місці колишнього інтактного гена з'являється пошкоджена «підробка». Мета досягнута.
Враховуючи визначні можливості цієї методики, опишемо її докладніше. Як «методичні» гени використовують зазвичай два - ген резистентності до неоміцину пеог і ген вірусної тимідинкінази з вірусу простого герпесу HSV-tk. Якщо в якійсь клітині є ген пео, то така клітина здатна жити в присутності препарату - аналога неоміцину G418. Клітини, які мають гена пео\ гинуть у присутності G418. Якщо в клітині є вірусний ген HSV-tk, така клітина загине при додаванні в середу культивування противірусного препарату ганцикловіру. Кліткам, які не мають гена HSV-tk, ганцикловір не страшний.
Спочатку в ДНК препарату заданого гена (тобто in vitro), приблизно в середину послідовності, вбудовують ген пео \ Збоку на деякій відстані поміщають ген HSV-tk. Це і є екзогенетична конструкція, необхідна та достатня для спроби спрямованого мутагенезу у будь-якій клітині. Для створення цілої миші без заданого гена використовують клітини лінії ES. У них трансфікують описану вище генетичну конструкцію, клітини поміщають у селективне культуральне середовище, що містить G418 та ганцикловір.
Можливі 3 варіанти внутрішньоклітинної «долі» екзогенетичної конструкції:

вона не вбудовується в хромосоми і безвісти втрачається при розподілі клітини; такі клітини, просто ES, гинуть у селективному середовищі від отруєння препаратом G418;
екзогенетична конструкція вбудовується на випадкові місця у геномі; вона, як правило, зберігає свою цілісність, несе і ген пео і ген HSV-tk такі клітини теж гинуть у селективному середовищі, але під дією ганцикловіру;
екзогенетична конструкція знаходить гомологічний клітинний ген і вступає з ним у гомологічну рекомбінацію: ці клітини і шукані; «хвіст» з геном HSV-tk (він поза гомологічною ділянкою) височується і втрачається при розподілі клітини; ген пео\ оскільки він розташований в середині гомологічної послідовності ДНК, якраз виявляється вбудованим у хромосому; в результаті шукані клітини несуть ген пеот, але не несуть ген HSV-tk і тому здатні жити і ділитися в селективному середовищі, що містить G418, і ганцикловір; такі клітини виділяють із маси інших.

В описаному варіанті спрямований мутагенез, або нокаут гена, стався на одній із гомологічних хромосом. Його можна виконати і на обох гомологічних хромосомах, для чого потрібні ще два інші «методичні» гени для селекції. Але мишей з нокаутом гена можна отримати і у випадку нокауту одного з гомологічних генів у ES клітинах наступним чином. Від «свіжозахінілої» миші виділяють ембріони на стадії бластули або морули (або проводять запліднення in vitro). У ці ранні ембріони ін'єктують одноматовані клітини ES і імплантують їх у матку підготовленої псевдовагітної самки. З такої сконструйованої бластули розвиваються здорові (за мишачими мірками) ембріони, народжуються мишенята-мозаїки, частина клітин яких у всіх тканинах, включаючи статеві клітини, походить з одноготованих клітин ES. Оскільки статеві клітини гаплоїдні, частина з них несе в «чистому вигляді» нокаутований ген.
Подібних мишенят використовують для інбредного розмноження, і в потомстві другого покоління якась частина мишенят обов'язково виходить гомозиготною за нокаутованим (зіпсованим) геном. Це і є кінцевою метою роботи. Щоб переконатися у правильності отриманого результату, виконують контрольну ПЛР ген пеот.
Таких мишей розмножують інбридингом і отримують необхідну і достатню для запланованої роботи число особин із заданим генетичним нокаутом (тобто відсутність функціонально дієздатного гена).
Генетичний нокаут можливий лише щодо генів, відсутність яких дозволяє організму розвинутися, народитися та почати жити. Якщо якийсь ген абсолютно необхідний для реалізації онтогенезу організму, то нокаут по даному гену здійснимо в клітинах, що перевиваються in vitro, і в якійсь мірі на моделях in vitro досліджувані наслідки відсутності гена для життєдіяльності клітини.
Вищепереліченим потенціал методу не вичерпується. Можна отримати бібліотеку екзогенів, в яких «методичний» ген (а саме його впровадження і порушує генетичний код, тобто є фактором, що мутує) пошкоджує різні ділянки досліджуваного гена. Одним із генів бібліотеки виробляють нокаут. Потім окремі «нокаутовані» клітини трансфікують інтактний ген (якщо відбувається реставрація експресії відповідного білка, вона доводить «від неприємного»: початково зроблений нокаут був істинним), і навіть (по одному) різні гени з бібліотеки пошкоджених генів. Аналізують, чи не станеться реставрація експресії продукту у разі ретрансфекції якихось генів із пошкоджених. Таким чином, вдається встановити функціональне навантаження різних ділянок одного гена.
Суттєві вдосконалення методи генетичного нокауту внесли роботи У. Sauer (1993), N.J. Kilby та співавт. (1993), Н. Gu та К. Rajewsky (1993) та інших дослідників, першими використовували сайт специфічну рекомбіназу Cre (Causes recombination), виділену Sauer з бактеріофага Р1. Якщо в геном миші ввести раніше описаним методом «ліворуч» і «праворуч» від гена, що цікавить сайти, специфічні для Сге, то вирізання гена (точніше, його інверсію і як наслідок втрату функції) можна здійснити не в клітинах ES, а в будь-який момент онтогенезу , тобто. у мишей у будь-якому віці. Послідовність нуклеотидів, пізнавана Сге, зветься LoxP (locus of X-over PI) і складається з 34 пар основ, що включають 13 пар інвертованих повторів по краях: ATAACTTGGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT.
Систему LoxP-Сге використовують і в моделі трансгенних мишей. Таким чином, існують способи тканеспецифічного вимкнення заданого гена в заданий момент онтогенезу. Це дуже трудомісткі роботи, але їхня пізнавальна цінність сьогодні здається величезною.
Трансгенна миша є миша, у чий геном введений сторонній ген (екзоген). Щоб «зробити» трансгенну мишу, необхідно мати як препарат чисту ДНК, що суворо відтворює послідовність нуклеотидів заданого екзогену (як мінімум). Зазвичай до ДНК екзогену з певним змістом пристосовують ще регуляторні послідовності ДНК-промотори та енхансери. Отримують вектор експресії як кільцевої ДНК (фактично - штучний вірус).
"Готують" мишу-самку: їй вводять фолікулостимулюючий гормон і хоріонічний гонадотропін для індукції суперовуляції. Таку самку спарюють із самцем, після чого у самки швидко витягають запліднені яйцеклітини. Мікроманіпулятором в чоловічий пронуклеус ін'єктують ДНК екзогену в дозі кілька сотень копій, і такі яйцеклітини імплантують в матку або яйцеводи іншої підготовленої псевдовагітної самки. І чекають від неї потомства. Досвід показує, що приблизно 25% новонароджених мишенят несуть

екзоген (тепер уже трансген) у своєму геномі. Екзогени ковалентно вбудовуються (інтегруються) в одне або кілька десятків місць власного геному миші (до речі, як ретровіруси типу ВІЛ). Якщо у власному геном немає генів, гомологічних екзогену, то вбудовування екзогену відбувається у випадкові місця геному.
Вбудовування здійснюється дуже швидко після введення екзогенної ДНК в пронуклеус - до першої реплікації ДНК зиготи, оскільки більшість мишей, які отримали екзоген (75%), мають його в кожній клітині свого тіла, включаючи гамети. Цікаво, але факт: вбудовування чужорідної ДНК у геном у більшості випадків допускає нормальний розвиток та народження організму, зрозуміло, якщо трансген не кодує синтез токсичного для організму білка. У першому поколінні мишей трансген знаходиться у гетерозиготному стані. Таких мишей спарюють, і в другому поколінні відбирають гомозигот трансгеном. Ось вони вже є повноцінні трансгенні миші.
Доповнення трансгену тканеспецифічними та/або індуцибельними промоторами дозволяє маніпулювати експресією трансгену на розсуд експериментатора (не у всіх клітинах; а тільки, наприклад, у Т-лімфоцитах або тільки в р-клітинах острівців Лангерганса, не завжди, а тільки після введення в організм індуктора). Таким чином, можна вивчати як відбуватимуться розвиток та життєдіяльність організму при зайвій експресії певного гена (overexpression).