Перегляд повної версії. Удосконалення ранньої діагностики туберкульозу тварин До здоров'я 1978 р. імунологічні дослідження лізис лейкоцитів

Дубовий Б.Л., Полякова О.М. ДНУ СКЗНИВИ, м. Новочеркаськ

Туберкульоз завдає величезних економічних збитків і становить велику небезпеку для здоров'я людей. Першорядним завданням у протитуберкульозних заходах є своєчасна діагностика, раніше виявлення джерела збудника інфекції.

Прижиттєва діагностика алергічними дослідженнями запізніла і виявляє тварин у перші дні, і навіть місяці після зараження. Тому потрібні більш чутливі методи, які дозволяють виявити етіологію алергічного процесу при туберкульозі.

Для диференціації неспецифічних туберкулінових реакцій використовують симультанну пробу з алергенами - ППД для ссавців і КАМ, виготовлених з декількох штамів атипових мікобактерій. Симультанну алергічну пробу застосовують при первинній постановці діагнозу на туберкулін у благополучних господарствах і у разі, якщо реакції на туберкулін зумовлені атиповими мікобактеріями та кислотостійкими сапрофітами. Також вдаються до комісійного контрольно-діагностичного забиття тварин з реакцією на внутрішньошкірне введення туберкуліну, для уточнення діагнозу патологоанатомічними, бактеріологічними дослідженнями та біопробою.

Однак власники високовдійних корів оскаржують правомірність контрольно-діагностичного забою тварин, що дали позитивну реакцію на туберкулінову пробу, і вимагають прижитих способів діагностики для додаткового дослідження високопродуктивних тварин на туберкульоз. Тому крім симультанної алергічної проби, патологоанатомічних оглядів і лабораторних досліджень, епізоотологічного обстеження господарств, аналізу динаміки прояву алергічних реакцій у різних груп тварин, для вивчення неспецифічних туберкулинових реакцій у великої рогатої худоби та диференціації їх від спец лімфоцитів та специфічного лізису лейкоцитів та інші реакції.

У нашому дослідженні для виявлення причин неспецифічних туберкулінових реакцій використовували реакцію специфічного лізису лейкоцитів у порівнянні з патологоанатомічними змінами.

Постановку РСЛ виконували в модифікації Б.Л. Дубове.

Метою досліджень було виявлення причин неспецифічних реакцій, пов'язаних з диференціальною діагностикою туберкульозу, викликаного різними видами мікобактерій, що має велике ветеринарно-санітарне, епізоотичне та господарське значення.

Виявлення інфікованих мікобактеріями і хворих на ту-беркульоз тварин реакцією специфічного лізису лейкоцитів (РСЛЛ) in vitro заснована на явищі негайно з'являється підвищеної чутливості лейкоцитів до повторного контакту з антигеном (алергеном) поза організмом.

У виробничих умовах випробування РСЛ для можливої ​​діагностики туберкульозу виконували в базових господарствах Ростовської області. Так на раніше благополучній фермі вісім корів реагували на туберкулін. Їх піддали контрольно-діагностичному забою. При ветеринарно-санітарній експертизі патологоанатомічних змін у внутрішніх органах та лімфатичних вузлах візуально не виявили. Бактеріологічні дослідження патматеріалу в Ростовській обласній лабораторії були негативними.

Перед убоєм у корів взяли кров щодо реакції специфічного лізису лейкоцитів (РСЛЛ). Результати досліджень за кількістю лейкоцитів та показниками РСЛЛ у пробах крові представлені в таблиці.

Таблиця. Кількість лейкоцитів, показники РОЛЛ і патологоанатомічні зміни у корів, що прореагували на туберкулін.

Як видно з таблиці, у всіх пробах крові з ППД-туберкуліном для ссавців реакція специфічного лізису лейкоцитів була негативною, що свідчить про відсутність інфікування їх M. bovis.

У пробах крові чотирьох вбитих корів реакція специфічного лізису лейкоцитів була позитивною з ППД-туберкуліном для птахів. Ліза лейкоцитів у пробах була 11%, 20%, 22%, 26%, що вказує на інфікування тварин M. avium.

У пробах крові чотирьох тварин отримано позитивний результат РСЛЛ з КАМ. Відсоток лізису лейкоцитів склав 11%, 13%, 15%, 20%, що пов'язано з інфікуванням тварин за життя атичними мікобактеріями.

Таким чином, виконані дослідження крові з туберкулінами поза організмом від тварин з позитивними туберкуліновими пробами дозволяють у короткі терміни виявити справжні причини, що викликали сенсибілізацію організму до туберкуліну, і, головне, уможливлюють виключити необґрунтований забій високопродуктивних тварин. Можливість застосування способу діагностики in vitro неспецифічно туберкулінових реакцій безпосередньо в умовах господарств сприятиме широкому застосуванню алергенів різної природи як засоби диференціальної діагностики специфічних і неспецифічних туберкулінових реакцій.

Пропонований спосіб діагностики неспецифічних туберкулі-нових реакцій рекомендуємо використовувати в бла-гополучних по туберкульозу господарствах. Для цього від усіх тварин, що дали позитивну реакцію на внутрішньошкірне введення туберкуліну, беруть кров і досліджують її поза організмом із наявними туберкулінами, що дозволяє виявити етіологію туберкулінових реакцій, спричинених мікобактеріями різних видів.

Список літератури

1. Верховський, О.А. Діагностичне значення реакцій клітинного імунітету при туберкульозі великої рогатої худоби / О.О. Верховський, А.Х. Найманов, О.А. Савицька // Актуальні проблеми інфекційної патології та імунології тварин-них. Матеріали міжнародної науково-практичної конференції Москва, 16-17 травня, 2006. – М.; Ізограф, 2006. - С.180-186.
2. Дубовий, Б.Л. Нове у диференціальній діагностиці туберкульозу сільськогосподарських тварин / Б.Л. Дубовий, О.М. Соловйова, Н.В. Улько // Збірник наукових праць "Діагностика, профілактика та лікування при інфекційних хворобах сільськогосподарських тварин". - Персіановський, 2000. - С.8-12.
3. Дубовий, Б.Л. Дослідження специфічності та активності РСЛЛ при діагностиці туберкульозу великої рогатої худоби / Б.Л. Ду-бовий, О.М. Полякова // Інноваційний шлях розвитку АПК-магістральний напрямок наукових досліджень для сільського господарства. – Персіановський, 2007. – С.67-69.
4. Найманов, А.Х. Диференціація алергічних реакцій на туберкулін/А.Х. Найманов / / Ветеринарія. - 2002. - N ° 3. - С.10-12.
5. Настанова щодо проведення симультанної проби із застосуванням туберкуліну комплексного алергену з атипових мікобактерій (КАМ) при діагностиці туберкульозу тварин. Ветеринарне законодавство. Т. 3, М.: "Колос", 1981. - С.220-224
6. Епізоотологічний контроль та постановка діагнозу на туберкульоз у тварин різних видів. Профілактика та боротьба із заразними хворобами, загальними для людини та тварин. Збірник санітарних та ветеринарних правил. Вид. Офіційний. Держкомсанепіднагляд Росії. Мінсільгосппром Росії. Москва, 1996. - З. 164 - 167.

Реферат

Потрібні чутливіші методи, які дозволяють виявити етіологію алергічного процесу при туберкульозі. Для визначення етіології неспецифічних туберкулінових реакцій у благополучних господарствах використовували ППД-туберкулін для птахів та КАМ поза організмом із кров'ю тварин, що реагують на тубер-кулін для ссавців. Показано, що РСЛ можна використовувати для диференціації специфічних і неспецифічних реакцій на туберкулін.

Ключові слова:діагностика, туберкульоз, реакція специфічного лізису лейкоцитів (РСЛЛ).

UDC 619.616.002.5

DIAGNOSTICS UNSPECIFIC REACTIONS TO TUBERCULINE CAUSED BY ATYPICAL AND AVIAN MYCOBACTERIES Dubovoi B.L., Polyakova O.N. Summary

Більше sensitive методів, які можуть визнати етіологію алергічних процесів в tuberculosis є необхідним. PPD-tuberculin для птахів і CAM всередині тіла з blood of animals, реагуючи на tuberculin for mammals, були використані для визначення етіології неконкретних tuberculin reactions в сучасних економіках. Це характеризується RSLL може бути використана для диференціації між конкретними і невизначеними реакціями на tuberculine.

Key words: diagnostics, tuberculosis, reaction of specific lysis of leucocytes (RSLL).

About the authors

Dubovoy Boris L. – D. Sc. у Veterinary Medicine, професор, чієф інфєктійних засобів сільськогосподарських статей і сільськогосподарських наук медичної академії "Новий Кавказький регіональний медичний інститут" з Російської академії сільськогосподарських наук; 6/4. Veterinarna st., Novocherkassk, Ростов регіон, 394400; Tel.89281360864.

Відповідний для відповідності з етериторією: Полякова Ольга Н.- по-студію школяра з державним національним становищем "Новій Кавказькій місцевий медичний інститут" з Російської академії сільськогосподарських наук; 28, Садовая st., Novocherkassk, Ростов регіон, 394406; Tel.89287549422

Дубовий Борис Лаврентійович, доктор ветеринарних наук, професор, завідувач лабораторії з вивчення інфекційних хвороб сільськогосподарських тварин та птиці ДНУ "Північно-Кавказький зональний науково-дослідний ветеринарний інститут" Російської академії сільськогосподарських наук; 394400, Ростовська область, м. Новочеркаськ, вул. Ветеринарна, буд.4, кв.6; тел.: 89281360864.

Відповідальний за листування з редакцією: Полякова Ольга Миколаївна, аспірант ДНУ "Північно-Кавказький зональний науково-дослідний ветеринарний інститут" Російської академії сільськогосподарських наук; 394406, Ростовська область, м. Новочеркаськ, вул. Садова, буд.28; тел.: 89287549422.

ВИМОГИ

ДО ПОСТАНОВКИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ З ОБГРУНТУВАННЯ гранично допустимих концентрацій промислових хімічних алергенів у повітрі робітничої зони і АТМОФ

МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ

МУ 1.1.578-96

1. Розроблено НДІ медицини праці РАМН (Дуєва Л.Л, Алексєєва О.Г.), НДІ екологія людини та гігієни навколишнього середовища РАМН (Пінігін М.А., Тепікіна Л.А), Інститутом імунології Мінздравмедпрому Росії (Чорноусов А.Д. .), Центральним шкірно-венерологічним інститутом МОЗ Росії (Умеров Ж.Г.), Санкт-Петербурзьким НДІ гігієни праці та профзахворювань МОЗ України (Сідорін Г.І., Мартінсон Т.Г.), Білоруським науково-дослідним санітарно-гігієнічним інститутом (Шевляков В.В.), Харківським НДІ гігієни праці та профзахворювань (Василенко Н.М.), Центральною науково-дослідною лабораторією Латвійської медичної Академії (Іванова І.О.).

2. Затверджено та введено в дію Першим заступником Голови Держкомсанепіднагляду Росії - заступником Головного державного санітарного лікаря Російської Федерації С. В. Семеновим 21 жовтня 1996 р.

3. Введено замість методичних рекомендацій "Постановка досліджень з гігієнічного нормування промислових алергенів у повітрі робочої зони" (1980) та на додаток до "Тимчасових методичних вказівок з обґрунтування гранично допустимих концентрацій забруднюючих речовин в атмосферному повітрі населених місць" (19).

^ 1. Область застосування

Методичні вказівки призначені для токсикологів, які обґрунтовують гігієнічні нормативи шкідливих речовин у повітрі робочої зони та атмосфери. Методичні вказівки присвячені встановленню гігієнічних нормативів промислових хімічних алергенів у повітрі робочої зони та атмосфери. Більш ніж десятирічна практика обґрунтування гігієнічних нормативів (ГДК та ВЗУТ) промислових алергенів у повітряному середовищі підтвердила ефективність цього заходу щодо профілактики розвитку алергічних захворювань у робочих алергонебезпечних виробництв та населення промислових регіонів. Ці методичні вказівки розроблені з урахуванням накопичених за ці роки даних з теорії та практики токсикологічної алергології. При цьому передбачено єдиний підхід до обґрунтування гігієнічних нормативів промислових хімічних алергенів у повітрі робочої зони та атмосфери.

Оцінка алергонебезпечності при встановленні гігієнічних нормативів хімічних сполук та складних продуктів на їх основі обов'язково проводиться у таких випадках:

При нормуванні нових хімічних сполук, що належать до хімічних класів, які не вивчені в алергологічному плані;

При нормуванні хімічних сполук та складних продуктів, що належать до хімічних класів, що містять вже відомі алергени, або мають хімічні аналоги, що мають сенсибілізуючу дію;

За наявності скарг алергічного характеру або клінічних ознак алергічних уражень у людей, які мають контакт із цією хімічною сполукою або продуктом.

^ 2. Схема постановки досліджень

Дослідження проводять у два етапи. Мета 1-го етапу - виявлення алергенних властивостей речовини, що вивчається, 2-го етапу - обґрунтування величини гігієнічного нормативу (див. схему).

На 1-му етапі досліджень використовують методи експрес-сенсибілізації морських свинок та мишей.

^ Схема постановки досліджень

I етап – виявлення алергенних властивостей

II етап – обґрунтування величини санітарного стандарту

А. Нормування за аналогією

^ Б. Нормування за прискореною та повною схемою

При вивченні простих хімічних сполук рекомендується застосування методу сенсибілізації морських свинок внутрішньошкірно у зону вуха та/або відтворення гіперчутливості уповільненого типу (далі – ГЗТ) на мишах.

Сенсибілізація морських свинок як найбільш чутливого виду лабораторних тварин до дії хімічних алергенів дозволяє оцінити алергенну активність речовини, що вивчається. З цією метою тварин сенсибілізують введенням у зону вуха двох доз речовини: 50 та 200 мкг/тварину. Відтворення ГЗТ на мишах дозволяє виявити алергенні властивості не тільки розчинних, але також нерозчинних у воді твердих і пастоподібних речовин, що мають сильну або помірну алергенну активність. Оскільки введення мишам слабких алергенів не проявляється розвитком чітко вираженої ГЗТ, при негативному чи сумнівному результаті даного експерименту на мишах слід додатково провести сенсибілізацію морських свинок у дозі 200 мкг/тварину. При цьому, а також для речовин з передбачуваною слабкою алергенною активністю не виключається використання ще більш високої дози, що сенсибілізує, - 500 мкг/тварини. При вивченні складних за складом та незатверджених полімерних продуктів здійснюють комбіновану сенсибілізацію морських свинок (у шкіру вуха та додатково епікутанно) та/або застосовують метод відтворення ГЗТ на мишах.

На додаток до цих обов'язкових прийомів досліджень І-го етапу за відповідними показаннями можуть бути використані також інші способи сенсибілізації тварин. Так, при дослідженні хімічних сполук та продуктів, особливо пастоподібних та в'язких, що забруднюють шкірні покриви робітників, доцільною є перевірка можливості розвитку контактної алергії методом багаторазових епікутанних аплікацій на морських свинках. Для водонерозчинних промислових пилів вже на першому етапі дослідження може бути використаний метод внутрішньотрахеальної сенсибілізації білих щурів.

Якщо на I-му етапі дослідження алергенні властивості у речовини, що вивчається, не виявлені, то його нормують як речовина загальнотоксичної дії. Якщо хоча б один із прийомів сенсибілізації дозволив виявити алергенні властивості досліджуваної речовини, то обов'язково проводять другий етап досліджень.

Другий етап досліджень, залежно від прийому нормування (за аналогією, прискореною або повною схемою), включає наступні токсиколого-алергологічні експерименти.

При нормуванні за аналогією проводять порівняння вираженості та частоти сенсибілізації у тварин, викликаних введенням референс-алергену та речовини, що вивчається, використовуючи методи експрес-сенсибілізації I-го етапу. При нормуванні нерозчинних пилів можливе застосування внутрішньотрахеальної сенсибілізації білих щурів. Для простих хімічних сполук референс-алергеном є нормована речовина, подібна за своєю хімічною структурою і містить однакові відповідальні за розвиток сенсибілізації активні хімічні групи. Референс-алергеном для складної композиції служить нормована композиція, близька за складом і містить однаковий відповідальний за розвиток сенсибілізації інгредієнт.

За відсутності референс-алергену ІІ-й етап досліджень включає експериментальне визначення порогів сенсибілізації: при одноразовій інгаляції речовини - Lim sens ас, при багаторазових інгаляціях - Lim sens ch. Порівняння величин Lim sens асі Lim sens chз Lim асі Lim ch, встановлених у токсикологічних експериментах за інтегральними та специфічними ефектами, дозволяє визначити, чи є сенсибілізуюча дія, що лімітує. З огляду на ці дані обґрунтовують величину гігієнічного нормативу (див. розділ 6).

При нормуванні складних хімічних продуктів сенсибілізацію тварин обох етапах дослідження здійснюють цілісним продуктом; при виявленні сенсибілізації для тестування застосовують усі основні інгредієнти у чистому вигляді, а при невідомому складі – цілісний продукт або витяжку з нього (див. розділ 5.3).

^ 3. Постановка досліджень щодо виявлення алергенних властивостей

3.1. Внутрішньошкірна сенсибілізація морських свинок

В експерименті використовують молодих морських свинок масою 250 - 300 г, розділених на 2 дослідних та одну загальну контрольну групи по 8 - 10 тварин у кожній. Тварин дослідних груп сенсибілізують, вводячи одноразово в шкіру зовнішньої поверхні вуха ближче до його основи 50 (1-а дослідна група) і 200 мкг на тварину (2-а дослідна група) речовина, що вивчається в обсязі 0,02 - 0,1 мл. Як розчинники застосовують дистильовану воду, фізіологічний розчин, ацетон, спирт, твін-80, диметилсульфоксид та ін. При вивченні маслоподібних продуктів використовують водні емульсії, а для затверділих полімерів - витяжки (див. розділ 5.3). Контрольним тваринам вводять у тому ж обсязі розчинник, емульгатор або рідину, що екстрагує.

Виявлення сенсибілізації (див. Розділ 5) проводять через 8 - 10 днів. Сильні алергени в обох дозах викликають у морських свинок виражену сенсибілізацію: середньогруповий показник алергологічних тестів статистично достовірно відрізняється від контрольних тварин. Помірні алергени виражену сенсибілізацію викликають лише при введенні в дозі 200 мкг на тварину, а при введенні 50 мкг на тварину - слабку, при якій сенсибілізація виявляється у 1/3 - 1/2 частини тварин, а середньогрупові показники алергологічних тестів можуть не відрізнятися від таких у контрольних тварин. Слабкі алергени викликають слабку сенсибілізацію лише при введенні речовини у дозі 200 мкг на тварину, при цьому позитивними можуть бути лише тести із клітинами крові, а шкірні проби – негативними.

^ 3.2. Комбінована сенсибілізація морських свинок

Складні продукти та підтверджені полімери можуть дуже погано всмоктуватися, і в цьому випадку сенсибілізація у свинок не настає навіть при введенні в шкіру вуха 200 мкг/жив. Для остаточного вирішення наявності алергенних властивостей при негативних результатах алергологічного тестування тварин наступного дня починають епікутовані аплікації речовини. Після 7 аплікації повторно проводять тестування морських свинок.

Концентрацію речовини для епікутанних аплікацій підбирають у процесі вивчення подразнюючої шкіру дії або в спеціальному експерименті: 6 - 8 морським свинкам масою 250 - 300 г протягом 7 - 10 днів (по 5 разів на тиждень) наносять по 3 краплі речовини, що вивчається, і його розведень. :2, 1:10 і 1:100 на вистрижені "віконця" бічної поверхні тулуба розміром 2 х 2 см. Як розчинник зручно використовувати летючий розчинник, що не подразнює шкіру (ацетон, 70°-ний спирт, диметилсульфоксид). Якщо утворюється плівка, її через 4 години змивають, в інших випадках шкіру нічим не обробляють. З нерозчинних речовин готують мазі (краще на ланолін, а не на вазеліні), які розподіляють очною лопаткою по поверхні "віконця". Для сенсибілізації вибирають максимальну концентрацію, що не спричинила розвитку контактного дерматиту.

^ 3.3. Визначення ГЗТ на мишах

У дослідну та контрольну групи беруть по 10 мишей чистої лінії (BALB/C, СА-1, ДВА/2) або по 16 - 20 білих безпородних мишей масою 18 - 20 г. Тварин сенсибілізують 10 мМ або 100 мкг речовини, що вивчається, одноразово всередині шкіри основа хвоста. Сенсибілізуюча доза речовини емульгується 60 мкл суміші повного ад'юванту Фрейнда (ПАФ) і розчину Хенкса рН 7,5, приготовленої у співвідношенні 1:1. Склад ПАФ: 1 мл ланоліну, 3 мл вазелінової олії, 5 мг вбитої нагріванням вакцини БЦЖ. У цей обсяг ПАФ додають 50 мкл твіна-20 та 0,5 мл дистильованої води. Суміш автоклавують. Контрольним тваринам вводять 60 мкл цієї суміші без додавання речовини, що вивчається.

Для виявлення сенсибілізації через 5 діб у подушечку задньої лапи мишей вводять таку ж, як і при сенсибілізації, кількість речовини, що вивчається (10 мМ або 100 мкг), розчиненого (зваженого) в розчині Хенкса. Через 24 години вимірюють інженерним мікрометром МК-0-25 товщину обох задніх лап мм. Про величину набряку, тобто. про розвиток ГЗТ судять з різниці у товщині обох задніх лап (показник ГЗТ). У контрольних тварин вона зазвичай становить 0,04 - 0,09 мм. Статистично достовірне перевищення середньогрупового показника ГЗТ досвідчених тварин порівняно з контрольними свідчить про наявність виражених або помірних сенсибілізуючих властивостей сполуки, що вивчається.

^ 3.4. Багаторазові епікутовані аплікації на морських свинках

Підбір сенсибілізуючої концентрації здійснюють також як при комбінованій сенсибілізації (див. розділ 3.2). Епікутані аплікації проводять по 5 разів на тиждень протягом 4 тижнів (загалом 20 аплікацій). Якщо на 2 - 3-му тижні досвіду у морських свинок з'являються ознаки контактного дерматиту, то аплікації, що сенсибілізують, продовжують на іншій ділянці шкіри. Виявлення сенсибілізації проводять через 1 – 2 доби після останньої аплікації. При цьому краплинну шкірну пробу ставлять на протилежному боці.

^ 4. Постановка досліджень щодо обґрунтування величини гігієнічних нормативів

4.1. Інтратрахеальна сенсибілізація білих щурів

Двом групам білих щурів вводять одноразово в трахею 0,5 - 1,0 мл суспензії максимально подрібненого пилу, що вивчається в дозах по 50 і 10 мг на підігрітому до 37 °С фізіологічному розчині. Тварини контрольної групи вводять по 1 мл підігрітого до 37 °С фізіологічного розчину.

Процедуру введення краще здійснювати без наркозу. Для цього щура фіксують у вертикальному положенні, вводять у ротову порожнину металевий зонд, закріплений на шприці з відповідною дозою суспензії, проводять його по передній стінці гортані через голосову щілину (виникає відчуття перешкоди) до упору в біфуркацію трахеї, злегка. Після введення тварину продовжують тримати, у вертикальному положенні протягом кількох дихальних рухів. При цьому хрипи та хлюпаючий звук підтверджують проникнення суспензії у легені.

Тестування тварин усіх груп проводять через 5 діб після інтрарахеального введення.

^ 4.2. Одноразова інгаляційна дія

Одноразові інгаляції речовини з метою визначення величини Lim sens асдоцільно проводити на морських свинках чи білих щурах після знаходження величини Lim ас. Для слабких і помірних алергенів зазвичай достатньо проводити інгаляції речовини, що вивчається в концентраціях на рівні діючої, порогової і на порядок нижче такої за загальнотоксичним ефектом. При вивченні сильних алергенів доводиться проводити інгаляції в менших концентраціях. Тривалість кожної інгаляції становить при встановленні нормативів повітря робочої зони 4 години, для атмосферного повітря - 24 години. Число тварин у групі має бути не менше 10.

Одноразові інгаляції слід проводити на щурах для того, щоб можна було порівняти величини Lim sens асі Lim асотримані на одному виді тварин. Однак, якщо на щурах одноразова інгаляція не викликає сенсибілізації, її треба повторити на морських свинках.

Виявлення сенсибілізації здійснюють через тиждень після інгаляції.

За Lim sens асприймають концентрацію речовини, одноразова інгаляція якої викликає сенсибілізацію у 2 - 5 із 10 тварин, що проявляється позитивними лабораторними тестами та/або провокаційними пробами. При цьому середньогрупові значення показників сенсибілізації можуть статистично достовірно не відрізнятись від контрольних.

^ 4.3. Багаторазова інгаляційна дія

Багаторазові інгаляції проводять на тваринах того ж виду, на яких встановили Lim sens ас. Тривалість впливу становить: при встановленні ГДК у повітрі робочої зони 4 години щодня 5 разів на тиждень протягом 2-х тижнів, для ГДК в атмосферному повітрі 14 діб безперервного (цілодобового) впливу. Відповідно, через 2 тижні проводять перше тестування тварин. При негативному або сумнівному результаті інгаляції продовжують ще 2 тижні і тому ж режимі і проводять повторне тестування. При встановленні ГДК у повітрі робочої зони загальна тривалість впливу не повинна перевищувати одного місяця, а для атмосферного повітря досвід може бути продовжений до 2 місяців. Більше тривалий вплив недоцільно, оскільки він веде до посилення сенсибилизирующего ефекту. Більше того, подальші інгаляції можуть призвести до послаблення ефекту через розвиток компенсаторних імунних процесів та суттєво ускладнять визначення порогової концентрації. Таким чином, 2 - 4-тижневий експеримент за своїм ефектом у принципі рівнозначний хронічному токсикологічному експерименту, що дозволяє проводити порівняння величин Lim chі Lim sens ch .

Визначення порогової концентрації за сенсибілізуючим ефектом ( Lim sens ch) проводять за тими ж принципами, що і при одноразовому інгаляційному впливі.

^ 5. Методи виявлення сенсибілізації

У цьому документі рекомендовані широко апробовані в токсикологічній практиці прийоми виявлення сенсибілізації до хімічних сполук та продуктів: шкірні провокаційні проби та лабораторні специфічні алерготести, що ґрунтуються на реакції клітин крові на алерген in vitro. Ці тести дозволяють виявити алергічні реакції різного типу: уповільнені (провокаційна краплинна шкірна проба), негайні реагінового типу (тести з опасистими клітинами), а також опосередковані імунними комплексами (лізис лейкоцитів та тести з нейтрофілами крові). Рекомендовані тести не повинні обмежувати ініціативу дослідження, тому що правомірне використання та інших методів як специфічної алергодіагностики, так і неспецифічних, що свідчать про розвиток сенсибілізації у піддослідних тварин (імунологічними, біохімічними, імуноморфологічними та ін.).

^ 5.1. Провокаційна шкірна краплинна проба на морських свинках

Для проведення шкірної краплинної проби (далі - КП) попередньо проводять підбір тестуючої концентрації та речовини, що вивчається на групі інтактних морських свинок (6 - 8 особин). Для цього на бічних поверхнях тулуба тварини вистригають шерсть на 4 - 8 ділянках розміром 1 х 1 см, розділених смужками вовни. На відповідну ділянку наносять по 1 - 3 краплі речовини у певній концентрації. Зазвичай відчувають речовину в нативному вигляді та її двократні або десятикратні розведення. Як розчинник (розріджувач) використовують воду, 70°-ний спирт, ацетон, диметилсульфоксид. При цьому одна з ділянок шкіри повинна бути контрольною, на яку наносять відповідний розчинник (розріджувач). Реакцію враховують візуально через 24 години.

Як тестуючу концентрацію вибирають максимальну, нанесення якої на шкіру інтактних морських свинок не викликає через 24 години реакцію подразнення (еритеми, набрякання).

Постановка КП. На позбавлену вовни шкіру бока морських свинок (досвідчених і контрольних) наносять по 1 краплі речовини, що вивчається в тестуючій концентрації. Реакцію візуально оцінюють через 24 години за наступною шкалою:

0 балів – видимої реакції немає;

1 бал – слабо-рожева еритема по всій ділянці або по периферії;

2 бали – яскраво-рожева еритема по всій ділянці або по периферії;

3 бали – яскраво-червона еритема по всій ділянці;

4 бали - набрякання шкіри з еритемою або без неї;

5 балів - виражене набрякання, осередкові виразки, геморагії.

^ 5.2. Провокаційний тест набрякання вуха

Підбір тестуючої концентрації для ТОУ в принципі не відрізняється від такого для КП: використовуються самі розчинники (ацетон, 70°-ний спирт) і розведення речовини (від 0,1 до 20%, рідше 50% або нерозведений продукт). Однак загальну кількість тварин збільшують, тому що на одній тварині можна відчувати лише дві концентрації (по одній на кожне вухо).

Постановка ТОУ: попередньо вимірюють мікрометром мм товщину середньої частини вушної раковини, потім на обидві поверхні середньої третини розправленого і фіксованого пінцетом вушка наносять по 25 мкл випробуваної речовини в робочій концентрації. Через 24 години повторно заміряють товщину вушка і обчислюють показник ТОУ за товщиною відмінності до і після аплікації. ТОУ вважають позитивним у морських свинок і щурів за показника 0,03 мм і більше, у мишей - 0,01 мм і більше. У морських свинок ТОУ можна враховувати в балах за наступною шкалою:

0 балів – до 0,03 мм;

1 бал – 0,03 – 0,07 мм;

2 бали – 0,08 – 0,12 мм;

3 бали – 0,13 – 0,17 мм;

4 бали – 0,18 – 0,22 мм;

5 балів – 0,23 мм і більше.

^ 5.3. Підбір робочих доз речовини для постановки специфічних алерготестів із клітинами крові тварин

Специфічні алерготести з клітинами крові, як правило, виконують з 0,1 - 0,01% розчинами (на фізіологічному розчині), тому в них можна використовувати малорозчинні речовини. Для речовин, які не розчиняються у воді навіть у таких концентраціях, слід підібрати водорозчинну речовину, що має групову антигенну детермінанту: наприклад, для полімерних продуктів, що містять формальдегід, - розчини формальдегіду; для полімерних продуктів, що містять епоксигрупи - епіхлоргідрин; всім сполук хрому – CrCl 3 ; для металу Ве та його сполук - сульфат берилію і т.д. При вивченні затверділих полімерів використовують витяжку: речовина, що вивчається, і фізіологічний розчин у співвідношенні 1:1 для полімеризаційних і 1:10 для поліконденсаційних продуктів при інкубації при 37 °С протягом 3 - 5 діб.

Розчини бажано готувати не з технічних продуктів, та якщо з хімічно чистих речовин. Оскільки кисле або лужне середовище може спричинити пошкодження клітин крові, слід стежити, щоб рН робочого розчину була нейтральною або слаболужною (рН 7,2 - 7,4). Якщо речовина утворює нестійкий розчин, робочі розчини потрібно готувати кожного досвіду. Стійкі розчини можна зберігати в холодильнику і протягом місяця, проте при цьому слід стежити за їхньою стерильністю і у разі помутніння або утворення плівки розчин використовувати не можна.

Робочі дози (концентрації розчинів) досліджуваних речовин підбирають шляхом постановки тесту з кров'ю інтактних тварин, використовуючи кілька розведень. Для виявлення сенсибілізації вибирають максимальну концентрацію розчину, що не викликає збільшення лізису або інших відповідних тесту змін клітин крові порівняно з контрольною пробою з додаванням лише антикоагулянту.

^ 5.4. Реакція специфічного лізису лейкоцитів крові

Варіант 1. У першу пробірку або лунку планшета вносять 0,1 мл фізіологічного розчину (контрольна проба), у другу - 0,1 мл фізіологічного розчину, в якому попередньо розчинена робоча доза випробуваної речовини (дослідна проба). Потім обидві пробірки додають по 0,1 мл досліджуваної крові. Реагують перемішують струшуванням і інкубують протягом 2 годин при 37 °С. З кожної проби кров переносять по 0,02 мл відповідно у дві пробірки або лунки планшета, що містять для руйнування еритроцитів по 0,4 мл 3% водного розчину оцтової кислоти.

Варіант 2. У два меланжери до мітки 0,5 набирають кров експериментальних тварин, потім перший меланжер до мітки 1 додають 5%-ный розчин лимоннокислого натрію, приготовлений на фізіологічному розчині (контрольна проба), в другий (до тієї ж мітки I) - 5% розчин лимоннокислого натрію, в якому попередньо розчинена робоча доза випробуваної речовини (дослідна проба). Меланжери струшують та інкубують при 37 °С протягом 2-х годин. Потім обидва меланжери до мітки II набирають 3 - 5%-ний водний розчин оцтової кислоти, підфарбований метиленовим синім.

Підрахунок абсолютної кількості лейкоцитів проводять у лічильній камері крові або на пікаскелі. При використанні меланжерів до наповнення камери попередньо зливають 3 - 4 краплі.

Показник РСЛЛ розраховують за такою формулою:

Реакцію розцінюють як позитивну за показником лізису лейкоцитів 10% і вище. Показник РСЛ вище 20% свідчить про високий рівень сенсибілізації тварин.

Робочі концентрації хімічних алергенів не повинні викликати лізис більше 9% лейкоцитів інтактних тварин і найчастіше відповідають 0,5 - 0,05% розведенням на фізіологічному розчині; вищого розведення вимагають речовини, що мають виражену дратівливу, а отже, цитотоксичну дію на клітини крові.

^ 5.5. Реакція специфічного ушкодження нейтрофілів

Для постановки реакції специфічного пошкодження нейтрофілів (далі - тест ППН) як антикоагулянт застосовують 5%-ний водний розчин цитрату натрію або 1,5%-ний розчин ЕДТА (Хелатон-3), приготований на фізіологічному розчині (стежити за рН розчину).

Робочу концентрацію речовини, що вивчається, готують на тому ж антикоагулянті, який додають до крові. Робоча концентрація не повинна викликати пошкодження більш ніж 4% нейтрофілів інтактних тварин у 1 варіанті тесту ППН і 7% у 2 варіанті.

Постановка тесту ППН. У першу силіконовану центрифужну пробірку (дослідна проба) вносять 0,1 - 0,2 мл розчину речовини, що вивчається в робочій концентрації, в другу (контрольна проба) - такий же обсяг тільки антикоагулянту. Потім обидві пробірки додають такий же об'єм крові обстежуваної тварини, після чого пробірки обережно перемішують і витримують протягом 1 год при кімнатній температурі.

Варіант 1. Після закінчення інкубації з обох пробірок готують на предметному склі мазки середньої товщини, які фіксують та фарбують методом, який використовується при фарбуванні мазків для підрахунку лейкоцитарної формули. Під імерсією прораховують 100 нейтрофілів, враховуючи кількість клітин із виразним хроматинолізом, пікнозом, фрагментацією ядер, гіперхроматозом або каріолізис.

Варіант 2. Після закінчення інкубації обережно знову перемішують і додають в обидві пробірки по 0,02 мл робочого водного розчину акридину помаранчевого (1:20000). Цей розчин зберігають у холодильнику трохи більше 2-х тижнів. Для його приготування використовують йодний розчин помаранчевого акридину в розведенні 1:100, який можна зберігати в темному флаконі в холодильнику кілька місяців. Через 5 хвилин по 1 краплі вмісту з кожної пробірки переносять на два предметні стекла, накривають покривним склом і через 3 - 5 хвилин досліджують у ЛЮМАМ з імерсією. Підраховують 100 нейтрофілів, які добре визначаються завдяки великій кількості рубінових гранул на тлі тьмяного зеленого свічення цитоплазми.

Нормальні непошкоджені нейтрофіли мають овальну або круглу форму. Пошкоджені нейтрофіли розпізнають за характерними амебоїдними випинаннями (збільшення рухливості клітин) і морфологічними змінами (нерівні "розірвані" краї з розрідженням цитоплазми, що починається, по краях клітини, вакуолізація цитоплазми, дегрануляція, огрублення хрома.

Показник реакції вираховують шляхом розподілу на 100 різниці у числі пошкоджених нейтрофілів у дослідній та контрольній пробах. Величина показника 0,05 і більше у першому варіанті та 0,08 і більше у другому варіанті свідчить про сенсибілізацію тварини.

^ 5.6. Реакція специфічної дегрануляції опасистих клітин

Дослідження виконують під наркозом або одразу після декапітації тварини. Для цього ножицями розкривають черевну стінку по середній лінії і обережно (краще пальцями в гумових напальчниках, а не пінцетом) витягають назовні найдовшу петлю перистальтуючого кишечника (5 см або трохи довше). Розкладають петлю на підставлене предметне скло так, щоб розкрилися 3 великі сегменти брижі. Після цього відсікають із двох сторін ділянку петлі кишечника, краї якого повинні на 0,5 см звисати за край скла. Потім на кожен сегмент першого контрольного препарату наносять по 40 мкл фізіологічного розчину, а на кожен сегмент другого дослідного препарату наносять по 20 мкл свіжої автосироватки (приготовленої в день дослідження з крові, взятої з під'язикової вени) і по 20 мкл речовини, що вивчається, в робочій концентрації, приготовленої на фізіологічному розчині. Обидва препарати інкубують 5 хвилин при 37 °С, видаляють рідку фазу шляхом промокання фільтрувальним папером краю нахиленого скла і при необхідності ще раз обережно розправляють брижу. Відразу роблять забарвлення препаратів, заливаючи їх на 1 - 1,5 хвилини 1% розчином на метиловому спирті еозинметиленового барвника (по Май-Грюнвальду). Фарбу видаляють промиванням трохи нахиленого препарату водою з піпетки і залишають до повного просушування на повітрі (зазвичай 24 години). На висушеному препараті скальпелем видаляють всю ділянку кишечника та перегородки між секторами брижі.

Мікроскопують препарати з імерсією (збільшення 10 х 80), прораховують по діагоналі 50 опасистих клітин, враховуючи серед них пошкоджені форми. Пошкодженими слід вважати огрядні клітини з порушеною мембраною та виходом гранул за її межі (дегрануляція), а також повністю пошкоджені. Розраховують показник РДТК за такою формулою:

Реакцію розцінюють як позитивну за показником 1,31 і вище.

Робочі концентрації хімічних речовин для РДТК найчастіше відповідають 0,01 - 0,001%-ним розведенням на фізіологічному розчині, при дії яких у контрольних тварин показник ДТК не повинен перевищувати 1,00,3.

^ 5.7. Реакція непрямої дегрануляції опасистих клітин

Даний тест (далі - РНТДК) заснований на реакції клітин-мішеней (огрядні клітини білих щурів) на вплив на них in vitro алергічних антитіл, що містяться в сироватці крові піддослідних тварин, і речовини, що вивчається (алергену).

Для отримання пулу опасистих клітин інтактним білим щурам під ефірним наркозом вводять внутрішньочеревно 6 - 10 мл підігрітого до 37 ° С фізіологічного розчину, змішаного з 0,5 мл гепарину. Після легкого масажу черевної стінки ножицями роблять розріз довжиною 1,5 - 2,2 см по середній лінії живота, перевертають тушку розрізом вниз і збирають ексудат, що стікає з петель кишечника, центрифужну пробірку, змочену гепарином. Ексудат центрифугують протягом 5 хв. при 1500 об./хв., надосад зливають, а осад для отримання суспензії опасистих клітин перемішують.

Для виконання РНДТК в 2 лунки планшета або 2 пробірки вносять по 0,05 мл суспензії опасистих клітин і 0,05 мл сироватки обстежуваної тварини. Потім в 1 пробу (контрольну) додають 0,05 мл фізіологічного розчину, в 2 пробу (дослідну) - 0,05 мл фізіологічного розчину, в якому розчинена робоча доза речовини, що вивчається (0,01 - 0,001%-ні розчини , які не повинні спричинити спонтанного пошкодження більше 5% клітин-мішеней). Потім на одне знежирене предметне скло, попередньо забарвлене на 2-х кінцях скла у вигляді квадратів, 0,3%-ним спиртовим розчином нейтрального червоного та висушеного при кімнатній температурі, наносять по краплині з кожної проби. Кожну краплю накривають покривним склом, краї якого змащені вазеліном, і інкубують при 37 ° С протягом 15 хв.

Препарати мікроскопують зі збільшенням 20 x 80. У кожному препараті підраховують 50 опасистих клітин. Обчислення показника РНДТК та її оцінку проводять як й у розділі 5.6 під час постановки РДТК.

^ 5.8. Оцінка результатів виявлення сенсибілізації

При проведенні досліджень I етапу оцінюють частоту розвитку сенсибілізації та її інтенсивність за середньогруповими показниками всіх використаних провокаційних та специфічних алергологічних тестів. Клас алергенної активності речовини, що вивчається, визначають за табл. 1: до 1-го класу відносять сильні, до 2-го – помірні та до 3-го – слабкі алергени. У разі відмінності ефекту за частотою прояву сенсибілізації та величинами середньогрупових показників різних провокаційних та/або специфічних алергологічних тестів алергенну активність речовини оцінюють за найбільш вираженим показником.

Таблиця 1

^ КЛАСИФІКАЦІЯ РЕЧОВИН ЗА СИЛОЮ АЛЕРГЕННОЇ АКТИВНОСТІ

При проведенні інгаляційних експериментів ІІ етапу досліджень за діючу концентрацію приймають таку, при дії якої сенсибілізація розвивається більш ніж у половини тварин, а середньогрупові показники алергологічних тестів статистично достовірно відрізняються від контрольних тварин. За пороги гострої та хронічної сенсибілізуючої дії приймають концентрації, при дії яких (одно-або багаторазово відповідно) сенсибілізація розвивається у 2 - 5 із 10 тварин, причому середньогрупові показники суттєво не відрізняються від таких у контрольних тварин.

^ 6. Обґрунтування величини гігієнічних нормативів

Обґрунтування величини санітарного стандарту промислового хімічного алергену під час проведення повної схеми досліджень починають із порівняння Lim sens chз Lim ch. Залежно від їх співвідношення визначають прийом обґрунтування ГДК та наявність позначки А (алерген).

При встановленні ГДК у повітрі робочої зони керуються такими положеннями.

Якщо лімітуючим критерієм є токсичність, тобто. величини порогів сенсибілізації вище величин порогів токсичності, то речовина практично не становить небезпеки як алерген, і його нормують як таке, що володіє загальнотоксичною дією; при цьому позначка А (алерген) не ставиться.

Якщо порогові величини загальнотоксичної та сенсибілізуючої дії суттєво не відрізняються або рівні, то речовину слід розглядати як потенційно небезпечну в плані розвитку токсикоалергічних уражень та її нормують за загальнотоксичною дією, супроводжуючи позначкою А (алерген).

Якщо лімітуючим критерієм є сенсибілізація, тобто. величини порогів сенсибілізації нижчі від порогових величин токсичності, то речовина становить небезпеку як етіологічний фактор алергічних захворювань, її розцінюють як промисловий хімічний алерген і нормують за сенсибілізуючою дією з позначкою А (алерген). У цьому коефіцієнт запасу хімічного алергену визначають по табл. 2.

Таблиця 2

^ КОЕФІЦІЄНТИ ЗАПИСУ ДОLim sens chПРИ ВСТАНОВЛЕННІ ГДК У ПОВІТРІ РОБОЧОЇ ЗОНИ

При встановленні ГДК шкідливих речовин, що мають сенсибілізуючу дію, в атмосферному повітрі рекомендуються більш суворі критерії, враховуючи, що впливають діти, люди похилого віку та особи, що мають різні захворювання. В цьому випадку враховують не тільки величину порога хронічної сенсибілізуючої дії, але також зону хронічної сенсибілізуючої дії, що визначається за формулою:

.

Далі відповідно до величини Z sens chвизначають коефіцієнт запасу до Lim sens chза табл. 3 Отриману величину ГДК за сенсибілізуючим ефектом порівнюють з ГДК за загальнотоксичною дією і як гігієнічний норматив вибирають найменшу величину ГДК. Позначку А (алерген) ставлять відповідно до принципів обґрунтування ГДК у повітрі робочої зони.

Таблиця 3

^ КОЕФІЦІЄНТИ ЗАПИСУ ДОLim sens chПРИ ВСТАНОВЛЕННІ ГДК В АТМОСФЕРНОМ ПОВІТРІ

Так, якщо величини порогів хронічного, токсичного і сенсибілізуючого збігаються і становлять 0,01 мг/м 3 то Z sens chдорівнюватиме 1,0. І тут відповідно до табл. 3 коефіцієнт запасу по сенсибілізуючому дії може бути менше 3,0, а величина ГДК складе 0,003 мг/м 3 . Якщо токсичності покладено коефіцієнт запасу, рівний 2,0, тобто. величина ГДК становитиме 0,005 мг/м 3 , рекомендується найменша величина ГДК, тобто. 0,003 мг/м 3 . Але якщо в прикладі коефіцієнт запасу по токсичності повинен бути не менше 5,0, тобто. певна за цим ефектом величина буде ще меншою (0,002 мг/м 3 ), вибирається вона.

При обгрунтуванні ВЗУТ прискореним шляхом, тобто. за величиною розраховують зону сенсибілізуючої дії речовини за наведеною нижче формулою і зменшують величину ВЗУТ, розраховану за загальнотоксичною дією, у стільки разів, скільки складає Z sensас .

.

Так, якщо розрахунковим шляхом за токсичністю визначено величину ВЗУТ як 0,2 мг/м 3 , а Z sens асдорівнює 4, то ВЗУТ випробуваної речовини з урахуванням сенсибілізуючої дії складе 0,05 мг/м 3 (0,2:4). Позначку А (алерген) ставлять відповідно до принципів, що використовуються при обґрунтуванні ГДК.

При нормуванні за аналогією у разі збігу частоти та інтенсивності сенсибілізації, викликаної речовиною, з такими від впливу референс-алергену, ГДК або ВЗУТ встановлюють на рівні величини нормативу референс-алергену з позначкою А (алерген). При суттєвому відхиленні частоти та інтенсивності сенсибілізації порівняно з такими від впливу референс-алергену проводять II етап досліджень та керуються вищевикладеними положеннями обґрунтування величини ГДК або ВЗУТ.

Клас небезпеки визначають за загальноприйнятими у профілактичній токсикології правилам.

Клініко-гігієнічну перевірку безпеки величини ГДК, встановленої в експерименті на тваринах, здійснюють шляхом порівняння умов праці та стану здоров'я працюючих з використанням загальноприйнятих у профілактичній токсикології прийомів, а також на підставі епідеміолого-алергологічного обстеження працюючих, включаючи вибіркове специфічне імуноалергологічне тестування та вираженості сенсибілізації до цього виробничого алергену.

додаток

(Довідкова)

^ БІБЛІОГРАФІЧНІ ВІДОМОСТІ

1. Постановка досліджень з гігієнічного нормування промислових алергенів у повітрі робочої зони. Методичні рекомендації №2121-80 від 23.01.1980. МОЗ СРСР. Рига, 1980.

2. Тимчасові методичні вказівки щодо обґрунтування гранично допустимих концентрацій забруднюючих речовин у атмосферному повітрі населених місць № 4681-88. МОЗ СРСР. М, 1989.

3. Методи лабораторної специфічної діагностики професійних алергічних захворювань хімічної етіології. Методичні рекомендації № 10-8/94 від 25.12.1979 МОЗ СРСР. М, 1980.

4. Алексєєва О.Г., Дуєва Л.А. Алергія до промислових хімічних сполук. М.: Медицина, 1978. – 242 с.

5. Дуєва Л.А., Коган В.Ю., Суворов С.В., Штеренгарц Р.Я. Промислові алергени. М. Центр Міжнародних проектів Держкомприроди СРСР. М., 1989. – 203 с.

Доброго вам дня! Мене звуть Ельвіра. Основна проблема у ліках. Наприклад, парацетамол, приймаю при температурі – починається набряк Квінке, перший раз подумала помилка, пробувала при подальшій хворобі без додаткових ліків та провокаційної їжі (мед, малина тощо) – результат той же набряк. Роблю аналіз на алерген - результат від'ємний, а здаю аналіци на лізис лейкоцитів - перевищує норму вдвічі-втричі (20-30% замість ... до 10%). І так з величезним списком ліків починаючи з вітамінів, антибіотиків, знеболювальних та заспокійливих у тому цислі. Якщо вводять ліки реакції завжди різні від нудоти до непритомності та низькому тиску 80/40. Поясніть, будь ласка, у чому різниця між аналізами на алерген та лізисом?! Я майже у розпачі, у сина така сама ситуація. Ми вже відчули на собі всі можливі побічні ефекти, починаючи з легких нездужань та кропив'янки, закінчуючи анафелактичним шоком (дякую Преднізалону – завжди рятує). Вболіваємо давно вже таким чином: саме пройде або до лікарні з нашим обмеженим списком дозволених аналізами препаратів. Але він настільки обмежений, що лікарі губляться, а пояснити різницю між двома аналізами мені не можуть. Якщо напишіть відповідь, я буду дуже вдячна або посилання на енциклопедію, де можна знайти відповідь. Навіть була думка пробувати дози менше, ніж належить.

Полякова Ольга Миколаївна

ВДОСКОНАЛЕННЯ РАННІЙ ДІАГНОСТИКИ

ТУБЕРКУЛЬОЗУ ТВАРИН

06.02.02 – ветеринарна мікробіологія, вірусологія, епізоотологія,

Мікологія з мікотоксикологією та імунологія

АВТОРЕФЕРАТ

Кандидат ветеринарних наук

Новочеркаськ - 2011

Робота виконана у Державній науковій установі

Північно-Кавказький зональний науково-дослідний ветеринарний

Інститут Російської академії сільськогосподарських наук

Науковий керівник:Доктор ветеринарних наук, професор

Дубовий Борис Лаврентійович

Офіційні опоненти:Лікар ветеринарних наук Попов М.А.

Лікар ветеринарних наук,

Доцент Хабузов І.П.

Провідна організація: ДНУ Прикаспійський зональний науково-

Дослідницький ветеринарний інститут

Россільгоспакадемія

На засіданні спеціалізованої вченої ради Д 006.106.01 при Державній науковій установі Північно-Кавказький зональний науково-дослідний ветеринарний інститут Російської академії сільськогосподарських наук.

346421, Ростовська область, м. Новочеркаськ, Ростовське шосе, 0

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДНУ Північно-Кавказький зональний Науково-дослідний ветеринарний інститут Россільгоспакадемії – 346421, Ростовська область, м. Новочеркаськ, Ростовське шосе, 0.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради, д.б.н. А.М. Єрмаков

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми.Боротьба з туберкульозом тварин – найважливіша проблема. Ліквідація туберкульозу тварин має не тільки ветеринарне, а й економічне та епідеміологічне значення.

Найбільш важливим у системі протитуберкульозних заходів є своєчасне виявлення заражених тварин та видалення їх із стада як джерела збудника туберкульозу.

У зв'язку з цим при постановці діагнозу на туберкульоз особливо важливою є диференціація специфічних і неспецифічних реакцій на внутрішньошкірне введення туберкульу.

Одним із найважливіших завдань профілактики туберкульозу сільськогосподарських тварин є вдосконалення діагностики, оскільки існуючі методи не забезпечують виявлення хворих тварин у початковій стадії хвороби.

Проблема вдосконалення діагностики туберкульозу тварин має на меті пошук способу ранньої доклінічної діагностики хвороби та вирішення низки завдань, пов'язаних з диференціальною діагностикою туберкульозу, туберкулінових реакцій, викликаних сенсибілізацією організму атиповими мікобактеріями та пташиним видом. Тому необхідний спосіб діагностики, який у найкоротший термін допоможе виявити інфіковану та хвору тварину та запобігти невиправданому та необґрунтованому забиття високопродуктивних тварин.

Мета дослідження -розробити спосіб ранньої діагностики туберкульозу тварин та диференціації специфічних та неспецифічних реакцій на внутрішньошкірне введення туберкуліну.

Досягнення поставленої мети здійснювалося вирішенням наступних завдань:

1) визначити робочу дозу алергену;

2) вивчити специфічність та активність реакції лізису лейкоцитів (РСЛЛ) in vitro з алергенами: ППД-туберкуліном для ссавців, ППД-туберкуліном для птахів та КАМ;

3) дослідити можливість використання реакції специфічного лізису лейкоцитів (РСЛЛ) для диференціації специфічних і неспецифічних реакцій у корів, що позитивно реагували на туберкулін.

Наукова новизна.Розроблено спосіб ранньої діагностики туберкульозу, що дозволяє протягом доби після зараження виявити інфіковану тварину та диференціювати туберкулінові специфічні реакції від неспецифічних. Використання реакції специфічного лізису лейкоцитів з ППД-туберкуліном для ссавців, ППД-туберкуліном для птахів та КАМ дозволило виявити неспецифічну сенсибілізацію організму, спричинену атиповими мікобактеріями.

Наукова новизна підтверджена патентом на винахід №2366454 «Спосіб ранньої діагностики туберкульозу тварин».

Основні положення, що виносяться на захист:

1. Рання діагностика туберкульозу тварин.

2. Диференціація туберкулінових реакцій.

Апробація роботи.Основні матеріали дисертації доповідають та обговорено на щорічних науково-практичних конференціях ФГЗУ ВПО «Донський державний аграрний університет», ДНУ Північно-Кавказький зональний науково-дослідний ветеринарний інститут РАСГН у 2006-2010 рр. і на всеросійських та міжнародній науково-практичних конференціях мм. Махачкала, Казань, Новочеркаськ.

Реалізація результатів досліджень.Результати досліджень використовуються при читанні лекцій та проведенні лабораторно-практичних занять з епізоотології у ФГОУ ВПО «Донський державний аграрний університет», проходять апробацію в обласній ветеринарній лабораторії, СББЗ м. Новочеркаська, СВК «Світанок», Матвєєво-Курганського району , Сальського району та СВК «Совєтинський», Неклинівського району, Ростовської області.

Публікації на тему.За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 15 наукових праць, три з них - у виданні, що рецензується, рекомендованому ВАК РФ і патент РФ на спосіб діагностики.

Практична значимість.Отриманий науковий матеріал дозволяє виявити інфіковану тварину в першу добу після зараження та відрізнити позитивні неспецифічні туберкулінові реакції, викликані атиповими та пташиними мікобактеріями від специфічних, що має важливе практичне значення для збереження тварин з неспецифічними туберкуліновими реакціями. РСЛЛ рекомендується застосовувати при ретроспективній діагностиці туберкульозу та диференційній діагностиці специфічних та неспецифічних реакцій на введення ППД-туберкуліну для ссавців при внутрішньошкірній туберкуліновій пробі.

Структура та обсяг роботи.Дисертацію викладено на 153 сторінках комп'ютерного тексту, складається із вступу, огляду літератури, власних досліджень та їх обговорення, висновків, практичних пропозицій та списку літератури. У дисертації наведено 28 таблиць. Список літератури містить 264 джерела, у тому числі 58 іноземних авторів.

2. ВЛАСНІ ДОСЛІДЖЕННЯ

Матеріали та методи досліджень.Роботу проводили на кафедрі епізоотології ФГОУ ВПО «Донський державний аграрний університет», в учгоспі «Донське» (ДонДАУ, сел. Персіановський), в лабораторії ДНУ СКЗНИВІ, у промисловому районі міста Новочеркаська, у господарствах Матвєєво-Курганського, Неклинівського та Сальського районів .

Для проведення дослідів відібрали тварин (велику рогату худобу, свиней, собак та кроликів), у яких фізіологічні та гематологічні показники перебували в межах норми. Було сформовано п'ять досвідчених та одна контрольна група тварин. Контрольну групу сформували для порівняння з дослідною для доказу специфічності реакції. Кожна дослідна та контрольна група складалася з п'яти тварин.

У процесі виконання роботи вивчали гематологічні показники свіжої крові (кількість лейкоцитів) та реакцію специфічного лізису лейкоцитів великої рогатої худоби, свиней, собак, кроликів.

Тварин дослідних груп розділили на п'ять груп залежно від дози вакцини, що вводиться, щоб визначити інтенсивність реакції. Після введення тваринам дослідних груп живих мікобактерій вакцини БЦЖ, а тварин контрольних груп вакцини проти бруцельозу шт.82 брали кров. Кров від тварин при кожному паркані ділили на дослідні та контрольні проби. Контрольні проби - кров з додаванням 3,8% розчин цитрату натрію та фізіологічним розчином, досвідчені проби – кров з додаванням 3,8% розчину цитрату натрію з ППД-туберкуліном для ссавців, ППД-туберкуліном для птахів та КАМ.

У дослідних та контрольних пробах підраховували кількість лейкоцитів, щоб у подальшому визначити відсоток лізису лейкоцитів за формулою.

Підбір робочої дози алергенів виконували з кров'ю тварин, у яких фізіологічні та гематологічні показники знаходилися в межах норми, вибираючи дозу, при якій відсоток лізису лейкоцитів був не більше 10. Приблизний пошук алергену знаходився у дозі від 0,05 до 0,15 мл.

Для постановки реакції специфічного лізису лейкоцитів використовували існуючу методику визначення кількості лейкоцитів у крові. Підраховували кількість лейкоцитів у дослідних та контрольних пробах, розраховували відсоток лізису лейкоцитів за формулою.

У дослідну лунку планшета, що містить 0,05 мл 3,8%-ного розчину цитрату натрію вносили 0,1 мл досліджуваної крові та робочу дозу алергену 0,05мл. Контрольну лунку з кров'ю заповнювали у тому обсязі, але з фізіологічним розчином замість алергену.

Проби крові з туберкулінами, КАМ та фізіологічним розчином інкубували в термостаті протягом 2 годин при +37°С, періодично легко струшуючи. Потім для руйнування еритроцитів з контрольної та трьох дослідних лунок брали по 0,02 мл крові і переносили в лунки планшета, що містять 0,4 мл рідини Тюрка. Підраховували кількість лейкоцитів (у камері Горяєва) у всіх пробах.

Потім розраховували відсоток лізису лейкоцитів за формулою:

РСЛЛ = Лк-Ло * 100%

Де Лк і Ло - абсолютна кількість лейкоцитів у контрольній та дослідній пробі крові при одноразовому заборі.

РСЛЛ вважали позитивною за показника 10% і більше.

При моделюванні туберкульозного процесу для визначення активності та специфічності реакції було сформовано шість груп тварин: п'ять дослідних та одна контрольна.

Кожній дослідній групі було введено певну дозу живих мікобактерій вакцини БЦЖ. Тваринам контрольної групи було введено одну дозу протибруцельозної вакцини шт. 82. У момент введення та через кожні 24 години від тварин брали кров, ділили її на проби з додаванням до неї 3,8% розчину цитрату натрію та діагностикумів для визначення відсотка лізису лейкоцитів, дослідження чутливості, активності та специфічності реакції.

У господарствах від корів, що реагували на туберкулін, досліджували кров реакцією специфічного лізису лейкоцитів. Взяту кров ділили на дослідні проби з додаванням ППД-туберкуліну для ссавців, ППД-туберкуліну для птахів, КАМ та контрольну пробу з фізіологічним розчином. Підрахували кількість лейкоцитів у всіх пробах та розрахували показник РСЛЛ.

Після дослідження реакції специфічного лізису лейкоцитів був проведений контрольно-діагностичний забій корів, що позитивно реагували на туберкулін і післязабійна ветеринарно-санітарна експертиза туш і внутрішніх органів для виявлення патологоанатомічних змін, характерних при захворюванні і для вивчення етіології викликають позитивні реакції туберкулін.

Враховували яка частка позитивних туберкулінових проб збігається з результатами РСЛЛ, з патологоанатомічними змінами, характерними для туберкульозу. Яка частка становить збіг позитивних туберкулінових проб, РСЛ та патологоанатомічних змін, невластивих туберкульозу. Скільки позитивних туберкулінових проб збігається в РСЛЛ з ППД-туберкуліном для ссавців, з ППД-туберкуліном для птахів та КАМ. Скільки позитивних туберкулінових проб збігається з ехінококозом, встановленим при патологоанатолічному дослідженні туш убитих з діагностичною метою корів.

3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

3.1. Визначення робочої дози ППД–туберкуліну для ссавців, ППД-туберкуліну для птахів та КАМ

Робочу дозу діагностичних алергенів відпрацьовували на цитратній крові тварин, у яких фізіологічні та гематологічні показники перебували в межах норми. Алерген використовували в дозі 0,05 мл, 0,1 мл і 0,15 мл і в таких же обсягах брали фізіологічний розчин.

Робоча доза не повинна викликати руйнування лейкоцитів та сенсибілізацію до алергену, антигену та діагностичних препаратів.

У таблиці показано об'ємне співвідношення туберкулінів та КАМ з кров'ю та 3,8% розчином цитрату натрію.

У дослідних та контрольних пробах підраховували кількість лейкоцитів і за формулою розраховували відсоток лізису лейкоцитів.

Реакція специфічного лізису лейкоцитів (РСЛЛ) у всіх пробах крові з алергенами у великої рогатої худоби, свиней та кроликів доходила до 3%, у собак – до 7%. Тому економніше як робочу дозу використовувати дозу 0,05 мл алергену (туберкуліну або КАМ), т.к. РСЛЛ у неї виявилася нижчою, ніж при дозі 0,15 мл. І величина її була практично однаковою для ППД – туберкуліну для ссавців, ППД – туберкуліну для птахів та КАМ.

Робоча доза туберкулінів та КАМ для РСЛЛ була взята 0,05 мл, оскільки вона виявилася економічною і не викликала руйнування лейкоцитів.

Таблиця 1.

Визначення робочої дози туберкулінів та КАМ.

3.2. Вивчення специфічності та активності реакції специфічного

лізису лейкоцитів

3.2.1. Вивчення специфічності та активності РСЛЛ крові великого

рогатої худоби

Досвід проводили в учгоспі "Донське", Жовтневого району Ростовської області.

Для досліджень відібрали тридцять голів молодняку ​​великої рогатої худоби у віці чотирьох – шести місяців.

Було сформовано п'ять досвідчених та одна контрольна група тварин. У кожну групу взяли по п'ятьох тварин.

Тваринам досвідчених груп вводили живі мікобактерії вакцинного штаму БЦЖ в дозах щеплення: одна, три, п'ять, сім, десять. Бичкам контрольної групи було введено одну дозу вакцини проти бруцельозу зі шт. 82. Потім усіх тварин брали кров на дослідження реакцією специфічного лізису лейкоцитів (РСЛЛ).

Сенсибілізовані мікобактеріями вакцини БЦЖ в організмі лейкоцити набувають підвищеної чутливості до антигену і при зустрічі поза організмом (in vitro) з подібним алергеном лізуються.

У день введення тваринам вакцини БЦЖ кількість лейкоцитів (в середньому по групі) поза організмом у пробах крові при взаємодії з ППД-туберкуліном для ссавців, ППД-туберкуліном для птахів і КАМ була практично однаковою, що свідчить про відсутність сенсибілізованих лейкоцитів мікобактеріями.

Через 24 години після введення вакцини БЦЖ кількість лейкоцитів (в середньому по групі) у пробах крові поза організмом з ППД-туберкуліном для ссавців зменшувалась внаслідок їх лізису, викликаного взаємодією сенсибілізованих клітин з алергеном. При введенні бичкам однієї імунної дози вакцини БЦЖ кількість лейкоцитів становила 9,0 · 10 9 /л (табл. №2), трьох доз - 8,6 · 10 9 /л, п'яти доз - 8,7 · 10 9 /л, семи доз - 8,6 · 10 9 /л, десяти доз - 7,1 · 10 9 /л (Р
У пробах крові з фізіологічним розчином, ППД-туберкуліном для птахів та КАМ кількість лейкоцитів через 24 години збільшувалася під впливом вакцини БЦЖ на організм. При дослідженні проб крові з фізіологічним розчином поза організмом від тварин, яким ін'єктували по одній дозі вакцини БЦЖ, кількість лейкоцитів (в середньому по групі) склала 10,5·10. 9 /л, трьох доз - 10,2 · 10 9 /л, п'яти доз - 10,9 · 10 9 /л, семи доз - 12,0 · 10 9 /л, десять доз - 12,0 · 10 9 / л. Відсоток лізису лейкоцитів у пробах крові з ППД-туберкуліном для птахів та КАМ був відсутній. Збільшення пов'язане з реакцією організму на введену вакцину та супроводжується лейкоцитозом. Сенсибілізовані БЦЖ лейкоцити не вступають in vitro у взаємодію з неспорідненим алергеном. Це свідчить про специфічність РСЛЛ.

У всіх дослідних групах тварин кількість лейкоцитів у пробах крові з фізіологічним розчином, ППД-туберкуліном для птахів та КАМ через 48 годин досягала максимального рівня. Число лейкоцитів (в середньому по групі) у пробах, що містять фізіологічний розчин, ППД-туберкулін для птахів і КАМ склало при введенні однієї імунної дози БЦЖ 11,3 · 10 9 /л, трьох доз - 11,6 · 10 9 /л, п'яти доз - 12,1 · 10 9 /л, семи доз - 13,3 · 10 9 /л, десяти доз - 14,5 · 10 9 / л. І після 72 години повільно починало знижуватися.

Таблиця 2.

Кількість лейкоцитів та показники РСЛЛ у крові у великої рогатої худоби сенсибілізували 1 дозою вакцини БЦЖ.

Зі збільшенням імунної дози БЦЖ кількість сенсибілізованих лейкоцитів у пробах крові зростає і при взаємодії їх in vitro з ППД-туберкуліном для ссавців вони руйнуються, в результаті відсоток лізису лейкоцитів збільшується.

Через 48 годин in vitro у пробах крові з ППД-туберкуліном для ссавців внаслідок лізису відбувалося зниження кількості лейкоцитів. При введенні однієї імунної дози БЦЖ тваринам кількість лейкоцитів при повторній зустрічі з алергеном in vitro (в середньому за групою) становила 8,2 · 10 9 /л, трьох доз - 8,0 · 10 9 /л, п'яти доз - 7,9 · 10 9 /л, семи доз - 7,7 · 10 9 /л, десяти доз - 7,5 · 10 9 / л. Реакція специфічного лізису лейкоцитів in vitro визначалася для однієї імунної дози на тварину – 27%, трьох доз – 31%, п'яти доз – 35%, семи доз – 42%, десяти доз – 48%. Через 72 години лізис лейкоцитів досягав за однієї імунної дози на тварину - 23%, трьох доз - 28%, п'яти доз - 31%, семи доз - 37%, десяти доз - 41%.

Після 72 години реакція специфічного лізису лейкоцитів знижувалася у всіх піддослідних групах тварин.

Кількість лейкоцитів у крові великої рогатої худоби в наступні дні (3-7-й день) знижувалася і приходила до початкової величини (зазначеної в день вакцинації вакциною БЦЖ) при введенні однієї, трьох доз на 6-й день (144 години), п'яти, семи доз – 7-й день (168 годин) та десяти доз на 8-й день (192 години).

У пробах крові бичків, що містять ППД-туберкулін для птахів та КАМ показники РСЛЛ у всі дні дослідів були негативними, лізис лейкоцитів був відсутній. Результати свідчать про специфічність реакції.

Великий відсоток лізису лейкоцитів спостерігається в пробах крові тварин, що містять ППД-туберкулін для ссавців, а відсоток лізису лейкоцитів у пробах крові, що містять ППД-туберкулін для птахів і КАМ не перевищував 3%, тобто був нижчим за врахований поріг. Оскільки лейкоцити, сенсибілізовані мікобактеріями БЦЖ, in vitro під впливом специфічного спорідненого алергену руйнуються.

Активність РСЛЛ характеризується тим, що з підвищення дози живих мікобактерій вакцинного прим. БЦЖ від 0,05 мг до 0,50 мг на тварину, збільшується кількість сенсибілізованих лейкоцитів та зростає відсоток лізису лейкоцитів.

Зі збільшенням відсотка лізису лейкоцитів залежно від введеної дози щеплення вакцини БЦЖ спостерігається підвищена інтенсивність і тривалість реакції специфічного лізису лейкоцитів.

Виконані дослідження із запровадженням живих мікобактерій вакцинного шт. БЦЖ бичкам, дозволили встановити специфічність та активність реакції специфічного лізису лейкоцитів, що необхідно для диференціальної діагностики специфічних реакцій та до іншого алергену, реакція специфічного лізису лейкоцитів з ППД–туберкуліном для ссавців у дослідних пробах крові з туберкулінами та КАМ, а також у контрольних пробах з фізіологічним розчином було практично однаковим.

Відсутність реакції лізису лейкоцитів у вакцинованих тварин вакциною проти бруцельозу шт.82 з ППД–туберкуліном для ссавців також свідчить про специфічність реакції лізису лейкоцитів, оскільки у пробах крові перебувають лейкоцити, сенсибілізовані іншим неспорідненим алергеном.

3.2.2. Вивчення специфічності та активності РСЛЛ крові свиней

при введенні живих мікобактерій вакцини БЦЖ

Для досвіду було відібрано 30 голів поросят тримісячного віку, які належать громадянам міста Новочеркаська.

Поросят розділили на п'ять груп по 5 голів у кожній, яким підшкірно ін'єктували по одній, дві, три, чотири та п'ять щеплених доз вакцини БЦЖ.

Кількість лейкоцитів (у середньому по групі) у свиней у день введення мікобактерій вакцини БЦЖ у всіх пробах коливалося від 10,7 до 10,9 · 10 9 / л, тобто. було у фізіологічних межах.

Через 24 години після введення вакцини в пробах крові з фізіологічним розчином, ППД-туберкуліном для птахів та КАМ кількість лейкоцитів була приблизно однаковою. При введенні однієї імунної дози 11,8 - 11,9 · 10 9 , двох доз 13,2 · 10 9 , трьох доз 14,8 - 14,9 · 10 9 , чотири дози 15,4 - 15,5·10 9 , п'яти доз 15,8 - 15,9 · 10 9 , т.к. сенсибілізовані лейкоцити в реакцію з фізіологічним розчином та неспорідненими алергенами не вступають, і лізис лейкоцитів відсутня.

У пробах крові від вакцинованих БЦЖ поросят, незважаючи на лейкоцитоз в організмі, in vitro у пробах крові при взаємодії з ППД-туберкуліном для ссавців кількість лейкоцитів почала зменшуватися через 24 години в результаті лізису сенсибілізованих клітин при зустрічі з родинним алергеном. При введенні поросятам однієї імунної дози вакцини БЦЖ кількість лейкоцитів in vitro (в середньому по групі) дорівнювала 10,5·10 9 /л, двох, трьох, чотирьох доз - 10,0 · 10 9 /л, п'яти доз - 9,9 · 10 9 /л (Р
Через 48 годин кількість лейкоцитів у пробах крові з ППД-туберкуліном для ссавців in vitro досягла мінімального значення. Потім кількість лейкоцитів зростала. Ліза лейкоцитів склала відповідно введеним дозам 33%, 41%, 47%, 52%, 55%. Через 48 годин відзначався найбільший відсоток лізису лейкоцитів у дослідних пробах.

У пробах крові, що містять фізіологічний розчин, ППД-туберкулін для птахів та КАМ, кількість лейкоцитів підвищувалася і досягла свого максимального значення через 48 годин з моменту введення поросятам вакцини БЦЖ. Зі збільшенням дози введеної вакцини БЦЖ збільшувалася кількість лейкоцитів у пробах крові, що містять фізіологічний розчин, ППД–туберкулін для птахів та КАМ, тобто зростання дози мікобактерій БЦЖ супроводжувалося збільшенням лейкоцитозу в організмі, отже, підвищувалася кількість лейкоцитів у пробах крові. проби) та з фізіологічним розчином (контрольна проба). Потім (через 72 години) спостерігали зниження кількості лейкоцитів у цих пробах крові.

У вакцинованих свиней позитивні показники РСЛЛ у пробах крові з ППД-туберкуліном для ссавців виявляли через 24 - 120 годин після введення однієї, двох, трьох, чотирьох доз і через 24-144 години при п'яти дозах щеплення вакцини БЦЖ.

У дослідах, проведених на поросятах, кількість лейкоцитів у пробах крові, що містять ППД-туберкулін для птахів та КАМ, була аналогічною, як у пробах з фізіологічним розчином. РСЛЛ у пробах крові з ППД-туберкуліном для птахів і КАМ була негативною, що підтверджує специфічність РСЛЛ з ППД-туберкуліном для ссавців.

У свиней, вакцинованих вакциною проти бруцельозу шт. 82, кількість лейкоцитів у пробах крові з туберкуліном та фізіологічним розчином було практично однаковим, отже, РСЛЛ з ППД – туберкуліном для ссавців, ППД – туберкуліном для птахів та КАМ була негативною, т.к. лейкоцити, сенсибілізовані іншим алергеном у реакцію з фізіологічним розчином та неспорідненими алергенами не вступають і лізис лейкоцитів відсутня. Це свідчить про специфічність реакції.

3.2.3. Вивчення специфічності та активності РСЛЛ крові собак

при введенні живих мікобактерій вакцини БЦЖ

Досліди проводили на собаках, що належать громадянам міста Новочеркаська Ростовської області.

Сформували п'ять дослідних та одну контрольну групу тварин. У кожній групі було по 5 собак.

Для проведення досліджень собакам підшкірно ін'єктували одну (0,05 мл), дві (0,1 мл), три (0,15 мл), чотири (0,2 мл) і п'ять (0,25 мл) щеплених доз вакцини БЦЖ. Тварини контрольної групи вводили одну дозу вакцини проти бруцельозу шт. 82.

У день введення вакцини БЦЖ кількість лейкоцитів у всіх пробах крові за групами in vitro була практично однаковою.

Через 24 години після введення тваринам мікобактерій БЦЖ при взаємодії крові з фізіологічним розчином поза організмом кількість лейкоцитів (в середньому по групі) склала при введенні однієї щеплення вакцини БЦЖ - 6,1·10 9 /л, двох доз - 6,9·10 9/л, трьох доз - 7,4 10 9 /л, чотирьох доз - 7,7 10 9 /л, п'яти доз - 8,3 10 9 /л. У пробах крові з ППД-туберкуліном для птахів та КАМ були отримані дані, близькі до таких у пробах крові з фізіологічним розчином. Виявляли лейкоцитоз, оскільки організм реагує на введення вакцини БЦЖ, сенсибілізовані лейкоцити не вступають у взаємодію з неспорідненими антигенами.

При подальшому дослідженні виявили, що через 48 годин кількість лейкоцитів (в середньому по групі) у пробах крові in vitro, що містять фізіологічний розчин, досягла максимального рівня, при введенні однієї імунної дози вакцини - 6,2 · 109/л; двох доз - 7,4 · 109/л; трьох доз - 8,5 · 109/л; чотирьох доз - 9,5 · 109/л; п'яти доз - 10,8 · 109/л. Кількість лейкоцитів у пробах крові, що містять фізіологічний розчин, було більшим у два і більше разів порівняно з кількістю лейкоцитів у день введення вакцини. Потім кількість лейкоцитів починало підвищуватись. Згасання реакції пов'язане з формуванням імунної системи нормальних антитіл.

У середньому по групі число лейкоцитів у пробах крові з ППД-туберкуліном для ссавців зменшується і досягає мінімуму через 48 годин при введенні однієї дози БЦЖ - 4,6 · 109/л; двох доз - 3,8 · 109/л; трьох доз - 3,4 · 109/л; чотирьох доз - 3,3 · 109/л; п'яти доз - 3,1 · 109/л. Ліза лейкоцитів у пробах крові з ППД-туберкуліном для ссавців була найбільшою і склала при введенні однієї дози БЦЖ - 26%, двох доз - 49%, трьох доз - 60%, чотирьох доз - 65%, п'яти доз - 71%. Чим вища доза введеної вакцини БЦЖ, тим більший відсоток лізису лейкоцитів. При введенні великих доз збудника в організмі настає сильна алергія і більше сенсибілізованих лейкоцитів руйнується при зустрічі із спорідненим (специфічним) антигеном, що видно з дослідів у РСЛ поза організмом.

Встановлено, що через 72 години кількість лейкоцитів (в середньому по групі) у пробах крові з ППД-туберкуліном для ссавців збільшувалася, а в пробах з фізіологічним розчином з ППД-туберкуліном для птахів та КАМ зменшувалась. Відсоток лізису лейкоцитів через 72 години в пробах крові з ППД-туберкуліном для ссавців дорівнює при введенні однієї імунної дози 23%, двох доз - 39%, трьох доз - 50%, чотирьох доз - 60%, п'яти доз - 64%.

Позитивні показники реакції специфічного лізису лейкоцитів (РСЛЛ) у пробах крові, що містять ППД-туберкулін для ссавців, відзначали при введенні однієї дози вакцини БЦЖ через 24 - 96 годин, двох доз - через 24 -120 годин, трьох доз - 24 чотирьох доз 24-168 годин, п'яти доз 24-240 годин.

Активність реакції специфічного лізису лейкоцитів характеризується тим, що з підвищенням дози введеної живих мікобактерій вакцинного шт. БЦЖ тварині зростає показник РСЛЛ та тривалість сенсибілізації лейкоцитів.

Реакція специфічного лізису лейкоцитів у пробах крові дослідних груп, що містять ППД-туберкулін для птахів та КАМ, була негативною та коливалася до 3%.

У вакцинованих собак однією дозою протибруцельозної вакцини реакція специфічного лізису лейкоцитів у пробах крові з ППД-туберкуліном для ссавців, ППД-туберкуліном для птахів та КАМ була негативною. Кількість лейкоцитів у дослідних та контрольних пробах крові з туберкулінами, КАМ та фізіологічним розчином було практично однаковим, що вказує на специфічність реакції лізису лейкоцитів, тому що у пробах крові сенсибілізовані лейкоцити не вступають у взаємодію з неспорідненими антигенами.

3.2.4. Вивчення специфічності та активності РСЛЛ крові кроликів

при введенні живих мікобактерій вакцини БЦЖ

Для поведінки дослідів відібрали 15 кролів та розділили їх на три групи.

Після введення п'яти, десяти доз вакцини мікобактерій БЦЖ кроликам дослідних груп і однієї дози вакцини протибруцельозної шт. 82 тварин контрольної групи, була взята кров і поділена на проби.

При дослідженні встановлено, що у день введення вакцини кількість лейкоцитів переважають у всіх групах становило 7,9– 8,8·10 9 /л.

У пробах крові від кроликів, вакцинованих п'ятьма дозами живих мікобактерій вакцини БЦЖ, з фізіологічним розчином у момент введення вакцини, кількість лейкоцитів у середньому по групі була 8,8 10 9 /л. Потім кількість лейкоцитів збільшується і через 24 години становило 11,3 10 9 /л, а через 48 годин досягає максимального рівня - 16,1 10 9 /л. Це з посиленням функціональної діяльності кровотворних органів, викликаної що надходять до організму антигенами - мікобактеріями БЦЖ.

При взаємодії крові поза організмом з ППД-туберкуліном для ссавців через 24 години спостерігали найнижчий вміст лейкоцитів. Реакція специфічного лізису лейкоцитів через 24 години дорівнює 58%, через 48 годин – 71,4%, 72 години – 70,5%. Максимальний відсоток лізису лейкоцитів було зареєстровано через 48 годин, потім відсоток лізису лейкоцитів зменшувався. Позитивна РСЛ з ППД-туберкуліном для ссавців спостерігалася через 24 - 96 годин.

Кількість лейкоцитів у пробах крові з ППД-туберкуліном для птахів та КАМ була аналогічною, як і в пробах крові з фізіологічним розчином. Реакція специфічного лізису лейкоцитів з ППД-туберкуліном для птахів і КАМ була негативною (від -1% до 1%), що свідчить про специфічність реакції, оскільки сенсибілізовані лейкоцити не вступають у взаємодію з чужорідними алергенами.

Дослідженнями встановлено, що при введенні десяти доз живих мікобактерій вакцини БЦЖ через 24 та 48 годин найменша кількість лейкоцитів in vitro була в пробах крові з ППД-туберкуліном для ссавців. Зменшення кількості лейкоцитів у пробах крові з однорідним антигеном ППД-туберкуліном для ссавців не можна віднести до лейкопенії, оскільки по суті лізис лейкоцитів стався поза організмом і лейколіз викликаний посиленим руйнуванням сенсибілізованих лейкоцитів при дії специфічного алергену.

Визначено, що при взаємодії крові з ППД-туберкуліном для ссавців відсоток лізису лейкоцитів через 24 години становив 56%, через 48 годин – 72%, через 72 години – 41%.

Потім кількість лейкоцитів починало підвищуватись і відповідало нормі через 672 години.

У пробах крові з фізіологічним розчином при введенні десяти доз вакцини БЦЖ кількість лейкоцитів почала підвищуватися через 24 години. Найбільше лейкоцитів in vitro зафіксували через 96 годин після введення вакцини БЦЖ. Потім кількість лейкоцитів повільно знижувалася та відповідала нормі (число лейкоцитів у день введення вакцини) через 672 години.

При збільшенні дози живих мікобактерій вакцинного шт. БЦЖ, збільшується кількість сенсибілізованих лейкоцитів, зростає відсоток лізису лейкоцитів та тривалість реакції, цим характеризується активність реакції специфічного лізису лейкоцитів.

Результати в пробах крові з ППД-туберкуліном для птахів та КАМ були практично однаковими з пробами крові, що містять фізіологічний розчин, отже, РСЛЛ була відсутня, що свідчить про специфічність реакції, оскільки лейкоцити не вступають у реакцію з чужорідними алергенами.

Вакциновані однією дозою протибруцельозної вакцини шт. 82 кроликів РСЛЛ з ППД-туберкуліном для ссавців, ППД-туберкуліном для птахів, КАМ була негативною, тому що в крові були відсутні сенсибілізовані лейкоцити до цих алергенів - діагностикумів. Кількість лейкоцитів у пробах крові, що містять туберкулін та фізіологічний розчин, у тварин було практично однаковим.

Відсутність реакції лізису лейкоцитів у пробах крові у вакцинованих тварин вакциною протибруцельозною шт. 82 , що містять ППД-туберкулін для ссавців вказує на специфічність реакції, так як діагностикуми – алергени не вступають у реакцію із сенсибілізованими лейкоцитами іншого алергену.

3.3. Дослідження можливості використання РСЛ для диференціації неспецифічних реакцій у корів, що позитивно реагували

на туберкулін

3.3.1. Дослідження РСЛЛ крові у корів, що позитивно реагували

на туберкулін у Матвєєво-Курганському районі

Діагностику туберкульозу реакцією специфічного лізису лейкоцитів (РСЛЛ) у виробничих умовах виконували у СВК «Світанок» Матвєєво-Курганського району, Ростовській області.

27 листопада 2006 р. на бійні СВК «Світанок» було проведено комісійний контрольно-діагностичний забій семи корів, що реагують на туберкулін, з подальшим проведенням післязабійної ветеринарно-санітарної експертизи.

Перед убоєм у корів взяли кров на дослідження реакції специфічного лізису лейкоцитів (РСЛЛ).

При дослідженні встановлено, що в трьох (43%) корів реакція специфічного лізису лейкоцитів з ППД-туберкуліном для ссавців, ППД-туберкуліном для птахів та КАМ була негативною, тобто. відсоток лізису лейкоцитів дорівнював 1% - 4%.

У чотирьох корів (57%) лізис лейкоцитів у пробах крові з ППД-туберкуліном для ссавців становив 27%, 29%, 36%, 71%, тоді як РСЛЛ з ППД-туберкуліном для птахів та з КАМ була негативною.

При проведенні післязабійної ветеринарно-санітарної експертизи семи корів, що реагують на туберкулін, тільки у чотирьох (57%) були позитивними показниками РСЛЛ у пробах крові з ППД–туберкуліном для ссавців. У двох (29%) з них виявлено зміни в лімфатичних вузлах, характерні для туберкульозу: у однієї в підщелепному, у другої в надартеріальному лімфатичних вузлах. У тушах двох убитих корів (29%) з позитивною реакцією на туберкулінову пробу та позитивними показниками РСЛЛ, патологоанатомічних змін, характерних для туберкульозу, у внутрішніх органах та лімфатичних вузлах візуально не виявлено. Це пов'язано з нещодавнім інфікуванням тварин збудником туберкульозу, тому патологоанатомічні зміни ще не встигли сформуватися. Крім цього встановлено, що позитивні реакції на внутрішньошкірне введення туберкуліну з негативними показниками РСЛЛ у пробах крові з ППД-туберкуліном для ссавців були у двох (29%) глибокостельних (7 – 8,5 міс. вагітності) корів та у однієї (14%) - із гострим ендометритом.

У семи корів (100%) з позитивною туберкулінової пробою, РСЛЛ у пробах з ППД-туберкуліном для птахів та КАМ негативна, т.к. сенсибілізація не викликана пташиними та атиповими мікобактеріями.

3.3.2. Дослідження реакцією специфічного лізису лейкоцитів крові

у корів у Сальському районі, які позитивно реагували на туберкулін

У виробничих умовах діагностику туберкульозу РСЛЛ виконували у ВАТ «Південне», Сальського району, Ростовській області.

24 серпня 2009 р. на м'ясокомбінаті Піщанокопського району було проведено комісійний контрольно-діагностичний забій 32 корів, які реагували на туберкулін, з подальшою ветеринарно-санітарною експертизою.

Перед убоєм у корів було взято кров на дослідження у реакції специфічного лізису лейкоцитів (РСЛЛ). Результати досліджень щодо кількості лейкоцитів та показників РСЛЛ у корів, з вираженою реакцією на туберкулін представлені в таблиці №3.

З 32 корів, що реагували на внутрішньошкірне введення туберкуліну, тільки у восьми (25%) РСЛЛ була позитивна при взаємодії проб крові з ППД – туберкуліном для ссавців. Відсоток лізису становив корів 19%, 20%, 23,1%, 23,8%, 24,5%, 30,2%, 31%, 32,7%.

Дослідженнями встановлено, що у пробах з ППД–туберкуліном для птахів у восьми (25%) тварин лізис лейкоцитів становив 14,3%, 15,8%, 20,1%, 21%, 23,1%, 23,8%, 27,3%, 34,5%.

У семи (22%) корів позитивна РСЛЛ була з КАМ. РСЛЛ становила 19%, 20%, 23,2%, 23,8%, 24,6%, 28,6%, 33,3%.

З них у шести (19%) корів позитивна РСЛЛ спостерігалася як з ППД-туберкуліном для ссавців, так і з ППД-туберкуліном для птахів. У двох корів (6,3%) позитивна реакція була на ППД-туберкулін для ссавців, ППД-туберкулін для птахів та КАМ. У вісімнадцяти (56%) тварин, які реагували на внутрішньошкірне введення туберкуліну, реакція специфічного лізису лейкоцитів була негативною у всіх пробах крові.

Післязабійний огляд туш і внутрішніх органів 32 корів, що реагують на туберкулін, показав, що з восьми (25%) корів з позитивними показниками РСЛЛ у пробах крові з ППД-туберкуліном для ссавців, тільки у однієї (3%) виявлено в загальних лімфатичних вузлах зміни , характерні для туберкульозу, у двох (6%) – ехінокок у печінці, у трьох (9%) – тільність, у двох (6%) – тільність та ехінокок у печінці.

З 32 корів, що реагують на внутрішньошкірне введення туберкуліну, у 14 (44%) були виявлені ехінококові бульбашки в печінці та у однієї (3%) - у легенях. В одному випадку (3%) було виявлено гнійний абсцес у печінці. Двадцять голів (63%) були тільні, з них чотири (13%) корови були хворі на ехінококоз, а в однієї (3%) виявлені туберкульозні зміни в заглоточних лімфатичних вузлах.

Таблиця 3.

Кількість лейкоцитів, показники РСЛЛ та патологоанатомічні зміни у корів у Сальському районі, що позитивно прореагували на туберкулін.

У семи (21%) із 32 корів, що реагували на туберкулін, позитивна реакція була в пробах крові з КАМ, що пов'язано з інфікуванням організму атиповими мікобактеріями.

Позитивна реакція в пробах крові з ППД-туберкуліном для птахів спостерігалася у восьми (25%) убитих тварин, це пояснюється інфікуванням корів мікобактеріями пташиного виду (M. avium).

Виявлено тварин з позитивною пробою на туберкулін, які заражені кількома видами мікобактерій. Так, у чотирьох (12,5%) корів позитивна реакція була в пробах з ППД-туберкуліном для ссавців та ППД-туберкуліном для птахів, у однієї (3,1%) - з ППД-туберкуліном для птахів та КАМ, у двох ( 6,3%) - з ППД-туберкуліном для ссавців, ППД-туберкуліном для птахів та КАМ.

З 32 корів, що позитивно реагували на внутрішньошкірне введення туберкуліну, у 18 корів (56%) РСЛЛ у пробах з ППД-туберкуліном для ссавців, ППД-туберкуліном для птахів і КАМ була негативною, що пов'язано з іншими захворюваннями (ехінококозом і т.д.). ) та тільністю.

Бактеріологічні дослідження патматеріалу на туберкульоз дали негативні наслідки.

3.3.3. Дослідження РСЛЛ крові корів у Неклінівському районі,

Ті, що позитивно реагували на туберкулін

У виробничих умовах діагностику туберкульозу реакцією специфічного лізису лейкоцитів виконували у СВК «Совєтинський», Неклинівського району, Ростовській області.

Вісім корів на благополучній фермі позитивно реагували на туберкулін.

6 вересня 2009р. був проведений контрольно-діагностичний забій корів, що позитивно реагують на туберкулін. При післязабійному огляді патологоанатомічних змін у внутрішніх органах та лімфатичних вузлах візуально не виявлено. Бактеріологічні дослідження патматеріалу на туберкульоз у Ростовській обласній лабораторії дали негативні результати.

Перед убоєм, у корів, що реагували на туберкулін, взяли кров для проведення реакції специфічного лізису лейкоцитів (РСЛЛ).

Встановлено, що з восьми корів з позитивними туберкуліновими пробами тільки у двох РСЛЛ була позитивна при взаємодії проб крові з ППД-туберкуліном для ссавців. Відсоток лізису лейкоцитів у корів дорівнює 10% та 16%.

У трьох корів реакція специфічного лізису лейкоцитів була позитивна з ППД-туберкуліном для птахів. Ліза лейкоцитів у тварин була 26%, 20%, 20%.

У пробах крові, що містять КАМ, було отримано негативні результати РСЛЛ. Відсоток лізису лейкоцитів становив від 0% до 2%.

У трьох корів (37,5%), що реагували на туберкулін, РСЛЛ у всіх пробах була негативною.

У двох убитих корів (25%) з позитивною туберкуліновою пробою і дали позитивну РСЛЛ у пробах крові з ППД–туберкуліном для ссавців, патологоанатомічних змін у внутрішніх органах та лімфатичних вузлах не виявлено, це пов'язано з нещодавнім інфікуванням тварин збудником туберкуліном. Патолоанатомічні зміни ще не встигли сформуватися.

Позитивна реакція в пробах крові з ППД-туберкуліном для птахів спостерігалася у трьох тварин (37,5%), які позитивно реагували на внутрішньошкірне введення туберкуліну, у яких патологоанатомічні зміни характерні для туберкульозу не виявлені, що можна пояснити інфікуванням корів мікобактеріями пташиного виду. avium).

Якщо сенсибілізація викликана не туберкульозними мікобактеріями, тобто етіологія сенсибілізації інша, то результати РСЛ у пробах крові з ППД-туберкуліном для ссавців будуть негативними.

Можливість застосування способу ранньої діагностики туберкульозу in vitro на клітинах крові безпосередньо в практичних умовах господарств сприятиме широкому застосуванню алергенів різної природи як засоби диференціальної діагностики специфічних та неспецифічних туберкулінових реакцій.

4. ВИСНОВКИ

1. Робоча доза для реакції специфічного лізису лейкоцитів у пробі 0,1 мл досліджуваної крові та 0,05 мл 3,8%-ного розчину цитрату натрію становить 0,05 мл для ППД-туберкулінів та КАМ.

2. У сенсибілізованих тварин шляхом введення в організм тварин живих мікобактерій вакцини БЦЖ позитивна РСЛ поза організмом виявлена ​​через 24 години після введенням вакцини з алергенами - ППД-туберкуліном для ссавців.

3. Підвищення дози живих мікобактерій вакцинного штаму БЦЖ тварині супроводжується збільшенням показника РСЛЛ та тривалості реакції, що свідчить про зростання сенсибілізованих лейкоцитів та активність реакції специфічного лізису лейкоцитів.

4. У пробах крові з фізіологічним розчином, ППД–туберкуліном для птахів та КАМ у вакцинованих тварин живими мікобактеріями вакцини БЦЖ та у пробах крові з фізіологічним розчином, ППД–туберкуліном для ссавців, ППД–туберкуліном для птахів та КАМ вакцин лейкоцитів було однаковим, тобто отримана негативна РСЛЛ, що свідчить про специфічність реакції, оскільки сенсибілізовані лейкоцити вступають у реакцію з чужорідними алергенами.

5. У реакції специфічного лізису лейкоцитів можна використовувати багато алергенів, що дозволяє диференціювати неспецифічні реакції на туберкулін.

6. Пропонований нами спосіб РСЛЛ доповнює та вдосконалює комплекс існуючої діагностики та диференціальної діагностики туберкульозу тварин.

5. ПРАКТИЧНІ ПРОПОЗИЦІЇ

1. Реакція специфічного лізису лейкоцитів дозволяє виявити інфіковану тварину у першу добу після зараження, тому має велике практичне значення для ранньої діагностики туберкульозу.

2. Рекомендуємо для прижиттєвої диференціальної діагностики специфічних та неспецифічних реакцій на введення ППД-туберкуліну для ссавців застосовувати реакцію специфічного лізису лейкоцитів, що дозволить уточнити діагноз на туберкульоз та запобігти невиправданим і необґрунтованим.

1. Дубовий, Б.Л. Нове у диференціальній діагностиці туберкульозу сільськогосподарських тварин / Б.Л. Дубовий, О.М. Соловйова, Н.В. Улько // Збірник наукових праць «Діагностика, профілактика та лікування при інфекційних хворобах сільськогосподарських тварин». – Персіановський, 2000. – С.8-12.

2. Дубовий, Б.Л. Метод ранньої діагностики туберкульозу великої рогатої худоби РСЛЛ/Б.Л. Дубовий, О.М. Полякова // Ветеринарна медицина свійських тварин.-Казань.-№3, 2006.-С. 54-56.

3. Дубовий, Б.Л. Пошук ранньої діагностики туберкульозу тварин/Б.Л. Дубовий, О.М. Полякова// Міжнародна науково-практична конференція «Основні проблеми, тенденції та перспективи сталого розвитку сільськогосподарського виробництва».-Махачкала.-Т.2, 2006.-С.68-69.

4. Дубовий, Б.Л. Дослідження специфічності та активності РСЛЛ при діагностиці туберкульозу великої рогатої худоби / Б.Л. Дубовий, О.М. Полякова // Інноваційний шлях розвитку АПК-магістральний напрямок наукових досліджень для сільського господарства.-Персіановський.-2007.-С.67-69.

5. Полякова, О.М. Рання діагностика туберкульозу свиней/Полякова О.М., Дубовий Б.Л.// Матеріали міжрегіональної конференції «Інтенсивні технології у свинарстві: проблеми та шляхи вирішення».- Персіановський.-2007.-С.124-125.

6. Полякова, О.М. РСЛЛ у двічі позитивно прореагували корів на внутрішньошкірну туберкулінову пробу / О.М. Полякова, Б.Л. Дубовий, Н.А. Соловйов// Матеріали Всеросійська науково-практична конференція «Актуальні проблеми функціональної та морфофункціональної діагностики хвороб тварин».-Новочеркаськ.-2007.-С.179-180.

7. Полякова, О.М. Вивчення змін активності туберкуліну-ППД для ссавців РСЛЛ/О.М. Полякова, Б.Л. Дубовий // Матеріали Всеросійська науково-практична конференція «Актуальні проблеми патології морфології та онкології тварин». - Новочеркаськ.-2007.-С.74-75.

8. Полякова, О.М. Реакція специфічного лізису лейкоцитів під час діагностики туберкульозу тварин / О.М. Полякова // Матеріали Всеросійська науково-практична конференція «Проблеми, завдання та шляхи наукового забезпечення пріоритетного національного проекту «Розвиток АПК».-Новочеркаськ.-2008.-С.18-19.

9. Полякова, О.М. Вивчення неспецифічних реакцій на туберкулін у великої рогатої худоби/О.М. Полякова // Вісник Саратовського держагроуніверситету ім.М.І.Вавілова.-№6, 2008.-С.50-53.

10. Дубовий, Б.Л. Диференціальна діагностика туберкульозу великої рогатої худоби реакцією специфічного лізису лейкоцитів/Б.Л. Дубовий, О.М. Полякова // Матеріали Всеросійської науково-практичної конференції «Підвищення продуктивності сільськогосподарських тварин та птиці на основі інноваційних досягнень».-Новочеркаськ.-2009.-С.3-7.

11. Дубовий Б.Л. Спосіб ранньої діагностики туберкульозу тварин/Б.Л. Дубовий, О.М. Полякова, А.І. Клименко, О.В. Коваленко, Л.П. Миронова // Винаходи. Корисні моделі. Офіційний бюлетень №25, 2009.-С.2.

12. Полякова, О.М. Диференціальна діагностика внутрішньошкірних реакцій на ППД-туберкулін для ссавців (ТМЛ) у корів / О.М. Полякова, Б.Л. Дубовий, В.В. Мосейчук // Матеріали Міжнародної науково-практичної конференції «Інтеграція науки, освіти продовольчої безпеки Російської Федерації».-Персіановський.-Т.№3,2010.-С.177-180.

13. Дубовий, Б.Л. Діагностика туберкульозу диференціацією позитивних внутрішньошкірних туберкулінових реакцій у великої рогатої худоби / Б.Л. Дубовий, О.М. Полякова, В.І. Добрелін, В.В. Мосейчук, Г.В. Горячова// Матеріали Всеросійської науково-практичної конференції «Актуальні проблеми ветеринарного забезпечення Російського тваринництва».-Новочеркаськ.-2010.-С.10-13.

14. Полякова, О.М. Реакція специфічного лізису лейкоцитів під час постановки диференціального діагнозу на туберкульоз / О.М. Полякова, Б.Л. Дубовий // Матеріали Всеросійської науково-практичної конференції «Актуальні проблеми ветеринарного забезпечення Російського тваринництва». - Новочеркаськ.-2010.-С.8-9.

15. Дубовий, Б.Л. Діагностика неспецифічних туберкулінових реакцій, спричинених атиповими та пташиними мікобактеріями /Б.Л. Дубовий, О.Н.Полякова // Ветеринарія Кубані. - Краснодар. - № 1, 2011. - С. 21-23.

16. Полякова, О.Н.Визначення причин неспецифічних туберкулінових реакцій ППД-туберкуліном для птахів та КАМ поза організмом /О.М. Полякова, Б.Л. Дубовий / / Ветеринарія Кубані. - Краснодар. - № 1, 2011. - С. 8-10.

Список скорочень:

1. 
   БЦЖ – суха вакцина БЦЖ є висушеними живими мікобактеріями туберкульозу вакцинного штаму БЦЖ.
2. 
   КАМ – комплекс атипових мікобактерій.
3. 
   ППД для мол. – протеїн пурипід дериват для ссавців, являє собою очищену білкову фракцію, виділену з культуральної рідини збудника туберкульозу відповідно бичачого виду, вирощеного на синтетичному поживному середовищі.
4. 
   ППД для пункту. – протеїн пурифієд дериват для птахів, являє собою очищену білкову фракцію, виділену з культуральної рідини збудника туберкульозу відповідно до пташиного виду, вирощеного на синтетичному поживному середовищі.
5. 
   РСЛЛ – реакція специфічного лізису лейкоцитів.

Полякова Ольга Миколаївна

Вдосконалення ранньої діагностики туберкульозу тварин.

АВТОРЕФЕРАТ

Дисертації на здобуття наукового ступеня

Кандидат ветеринарних наук

Підписано до друку 14.01.11 Друк оперативний

Об'єм 1 ум.печ.аркуш. Замовлення №198/1 Тираж 100 прим.

Видавничо-поліграфічне підприємство

ТОВ "МП Книга", м. Ростов-на-Дону,

Таганрозьке шосе, 106

18.01.2009, 17:36

Вітаю!
Прошу порекомендувати вирішення наступної ситуації. У мене проблеми з лікуванням зубів були завжди, недавно мені потрібно було видалити кілька зубів. Для знеболювання використали септонест. Після його введення піднявся тиск до 190 та почалася тахікардія 150 уд/хв. (Мій тиск 110) Після уколу тавегілу, тиск став нормалізуватися. Наступного дня спостерігалася осиплість голосу. Лікар вважає, що мені протипоказані анестетики: убестезин, ультракаїн, септонест.
Бо зуби лікувати все одно треба, як мені вчинити?

19.01.2009, 00:06

До цього ви вже лікували зуби з анестезією? Попередні введення анестетика теж супроводжувалися такою реакцією чи це вперше? Також цікавить яка саме робилася анестезія та концентрація адреналіну у використаному анестетику та наявність захворювань серцево-судинної системи.
Подібна реакція може бути пов'язана з попаданням анестетика в кровоносну судину (при деяких видах анестезії існує можливість потрапити в кровоносну судину). Також такі симптоми можуть бути реакцією на адреналін, що входить до складу анестетика.
У нас пацієнтів з непереносимістю місцевих анестетиків направляють до відділення хіургічної стоматології стаціонару, де обстежують та лікують під місцевою анестезією чи наркозом.

19.01.2009, 09:51

Спасибі за швидку відповідь! До цього під час невеликих втручань застосовувався лідокаїн, яка нещодавно видаляла родимку на обличчі з його застосуванням. Перенесла добре, але й дозування, мабуть, було невелике.
Септонест застосовувався двічі, другий я вам описала, а перший теж у стоматології, після чого був підвищеним тиском до 140 і протягом 5-6 годин не могла зупинити кровотечу із зуба.
Із серцево-судинних захворювань є екстрасистолічна аритмія.
Лікар мені написала протипоказання: розчин убестезин 4 у, р-р ультракаїн 2 у, р-р септонест. За концентрацією адреналіну, на жаль, не можу відповісти.

18.02.2009, 18:33

Вітаю,
зробила імунологічний аналіз на анестетики і такі результати вийшли:

1. Ультракаїн Д-С – 81 (11%)
2. Ультракаїн Д-С форте – 61 (32%)
3. Анреналін – 64 (29%)
4. Лідокаїн – 58 (36%)
5. Скандонест – 76 (16%)
6. Убестезин форте – 58 (36%)
7. Септанест з андреналіном – 65 (28%)
За рівнем активності:

Виходить, що ці препарати застосовувати не можна (всі >10%) при анестезії стоматології. І що тепер можна зробити?

18.02.2009, 21:12

Я Вам натякну щодо цінності проведеного аналізу:

"Реакція специфічного лейкоцитолізу показала зміну кількості лейкоцитів по відношенню до контролю 91 (100%) з препаратами:
...
4. Лідокаїн – 58 (36%)
...
лізис до 11% – слабопозитивний
лізис до 21%-40% - помірнопозитивний
лізис до 41% -100% - різкопозитивний

До цього під час невеликих втручань застосовувався лідокаїн, яка нещодавно видаляла родимку на обличчі з його застосуванням. Перенесла добре