Головна · Хвороби шлунка · Лікування як створити нову тему. Як утворюються інноваційні ліки. Молекулярні основи препаратів

Лікування як створити нову тему. Як утворюються інноваційні ліки. Молекулярні основи препаратів

Раціональна розробка нових ліків у промисловості, своєю чергою, полегшується, коли фундаментальна біохімічна природа нормальних і хворобливих процесів ширше, хоча й повністю, вивчена в академічних лабораторіях і стає зрозумілою

Найчастіше нові ліки створюються у промислових, а чи не в академічних лабораторіях. Ці два процеси доповнюють один інший, оскільки відрізняються різними підходами до вирішення однієї й тієї проблеми. Співробітники академічних лабораторій часто з великим інтересом використовують відкриття вчених індустріальних центрів як інструмент при з'ясуванні основних механізмів дії препаратів. Відкриття в галузі індустрії роблять великий внесок у фундаментальні дослідження в галузі фармакології: так були відкриті механізми дії, наприклад, таких препаратів, як ацетилсаліцилова кислота, циметидин. Раціональна розробка нових ліків у промисловості, своєю чергою, полегшується, коли фундаментальна біохімічна природа нормальних і хворобливих процесів ширше, хоча й повністю, вивчена в академічних лабораторіях і стає зрозумілою. Наприклад, створення блокаторів гістамінових рецепторів залежало від пізнання того, що гістамін вивільняється в організмі і служить медіатором при розвитку кропив'янки, сінної лихоманки, а також бере участь у нормальній секреції кислоти у шлунку. Ефективність алопуринолу при подагрі могла бути передбачена завдяки встановленим шляхам синтезу в організмі сечової кислоти.

Зцілення людини від раку, цілком імовірно, стане можливим, якщо стануть відомі деталі біохімічних процесів у злоякісних та інтактних клітинах, а не внаслідок емпіричного тестування десятків тисяч хімічних речовин, взятих випадково або тому, що вони стосуються наявних відносно неселективних та неефективних протиракових препаратів. Лікарські речовини тестуються на тваринах, у яких рак викликають штучно, або на лініях тварин, які були виведені спеціально для отримання цього захворювання з високою частотою, а також на культурах тканини (хоча в цих умовах клітини набувають нових властивостей). Найчастіше мета досліджень у фармацевтичній промисловості може бути сформульована просто: створення прибуткових ліків. Для того щоб препарат став прибутковим, він повинен бути корисним і безпечним, а ці його якості в кінцевому підсумку оцінюються клініцистом. Завдання фармаколога полягає у передбаченні цих властивостей за експериментальними даними на тваринах з урахуванням обмежень, можливостей факультетів та їх співробітників. Це завдання має бути виконано таким чином, щоб було зведено до мінімуму можливість пропуску корисної лікарської речовини; іншими словами, скринуючі програми повинні бути ефективними. Було відзначено, що творці ліків намагаються обмежитися «підробками», для того «щоб ввести в оману» організм хворого; і в цьому є частка істини. Найбільші труднощі експериментальної фармакології полягають у такій організації експериментів на тваринах, щоб можна було зібрати максимальну кількість інформації при використанні відносно малої кількості тварин і щоб ця інформація мала відношення до людської фізіології та патології. Наприклад, особливо важко спланувати експерименти на тварин для тестування ліків, якщо їх можлива ефективність спрямована на корекцію психічних порушень у людини, але відносно легко щодо антикоагулянтних ефектів, оскільки тромбоцити у тварин і людини мають подібні механізми і визначити здатність згортання крові нескладно.

Розробка ліків

Лікарські речовини можна планувати; ця мета може бути досягнута досить часто. Розрізняють чотири важливі підходи до розробки лікарських речовин.

  1. Синтез аналогів або антагоністів природних гормонів, аутакоїдів або медіаторних субстанцій, або молекул, що змінюють вивчені біохімічні процеси, дозволяє створити принципово нові засоби, що надають терапевтичну дію, наприклад, блокатори Н2-гістамінових рецепторів, дофамінові агоністи і антагоністи, блокатори кальцієвих каналів. Продуктивність такого підходу до вирішення проблеми створення нових ефективних ліків є вагомим аргументом на користь необхідності проведення фундаментальних наукових досліджень та всебічної їхньої підтримки з боку суспільства. Тільки розуміння сутності процесів, що відбуваються у здоровому організмі, та їх порушення при захворюванні дозволяє вирішити питання про шляхи впливу на організм для досягнення здоров'я та щастя людства (той факт, що цілком серйозні спроби вивчення можуть ні до чого не привести, лише доводить необхідність подальших і більш досконалих досліджень, а не відмова від них чи припинення їх).
  2. Зміна структури відомих ліків, ймовірно, дозволить створити масу препаратів, що мають подібні властивості, але принципово не відрізняються один від одного. Однак модифікація молекули, вироблена цілеспрямовано, може призвести до змін у структурі настільки важливим, що це дозволяє усунути в ліки одні властивості і надати йому абсолютно нову активність, що призводить до створення принципово нових лікарських засобів, наприклад сульфаніламідів (протибактеріальні), похідних сульфомочевини (гіпоглікемічні) ), тіазидних сполук (діуретики), діакарбу (інгібітор карбоангідрази), ацетазоламіду, що застосовується при глаукомі. Усі вони походять від перших сульфаніламідів, синтезованих у 30-ті роки.
  3. Рандомізований скринінг. Принципово нові хімічні речовини, синтезовані або отримані з природних джерел, піддаються скринуючому дослідженню на тварин за допомогою набору тестів, призначених для виконання ефектів, що цікавлять дослідника. Подібний скринінг в даний час є дуже складним дослідженням.
  4. Виявлення нових властивостей у ліків, які вже застосовуються в клініці, в результаті ретельного обстеження та спостереження за їх дією на різні системи організму. Наприклад, таким чином було встановлено гіпотензивну властивість бета-адреноблокаторів, протитромботичну активність у ацетилсаліцилової кислоти.

Процес створення нових ліків

Процес створення нових ліків можна представити в такий спосіб. A. Ідея чи гіпотеза. Б. Синтез речовин. B. Дослідження на тваринах [різні (миші, щури, морські свинки, кролики, кішки, собаки, мавпи) при дослідженні різних речовин]. I. Фармакологія. 1. Властивість, що лежить в основі передбачуваної терапевтичної дії. 2. Інші види дії: класифікація за основними фізіологічними системами. 3. Взаємодія з іншими лікарськими засобами, з якими надалі можливе поєднане використання (ці дослідження можна проводити на останніх етапах вивчення). 4. Фармакокінетика: токсикологічні дослідження не можуть проводитися достатньою мірою задовільно без даних про фармакокінетику речовини в організмі тих видів тварин, на яких проводять вивчення токсичності. ІІ. Токсикологічні методи дослідження. 1. Одноразове введення дози (гостра токсичність). 2. Повторне введення речовини (підгостра, проміжна та хронічна токсичність). 3. Звичайні дослідження з токсичності: а) принаймні використовують два види ссавців (тільки один з них відноситься до гризунів); б) принаймні два різні шляхи введення, з них один, яким передбачається користуватися при лікуванні людини; в) реєстрація ознак вияву токсичності з вивченням механізму розвитку смерті; визначають характер ураження (органів-мішеней), тобто недостатньо вказати, що доза, в 10 разів більша за ту, що запропонована для лікування хворого, не викликала пошкодження в організмі тварин. 4. Тривалість досліджень при повторному введенні препарату: 5. Вивчення токсичності на тваринах при повторному введенні лікарської речовини зазвичай поділяють на два періоди: короткочасний (2-4 тижні), при якому отримують орієнтовну інформацію для планування подальших дослідів, і тривалий: а) застосування трьох доз: мала, близька до передбачуваної терапевтичної людини, максимальна виявлення передбачуваної токсичності і проміжна; б) якщо лікарська речовина є попередником (проліками), тобто. у вихідному вигляді інертно і потрібно, щоб воно піддалося метаболічним перетворенням в організмі для переходу в активну форму, необхідно, щоб у кожного виду експериментальних тварин також було встановлено його перетворення на активну форму; в) препарат слід вводити тваринам протягом 7 днів. У минулому, однак, це відбувалося інакше. Очевидно, деяким фірмам було зручно прийняти як приклад для наслідування 5-денний робочий тиждень для людини як цілком придатний для проведення експериментів на тваринах тієї ж тривалості; г) контрольовані дослідження (моніторинг) на тварин повинні включати в себе наступне: визначення обсягу споживаного корму, маси тіла, зміни поведінкових реакцій та стану, дослідження крові, біохімічні показники та аналіз сечі (для визначення функції органу), а також інший контроль, зокрема візуальний за відповідними особливостями даного препарату або його прийомом тваринами; д) всім тваринам, що загинули під час дослідження, необхідно зробити аутопсію (слід пам'ятати про необхідність попередження канібалізму тварин), оскільки це може призвести до втрати потенційно цінних даних; е) після завершення періоду дослідження всіх тварин забивають, які органи піддають гістологічним дослідженням; перелік тканин, необхідні проведення дослідження (у Великобританії), становить 30 найменувань; ж) існують винятки для більшості або для перерахованого вище; наприклад, практично неможливо вивчити такий терапевтичний ефект, як розвиток гіпоглікемії, оскільки вона може бути спричинена застосуванням дуже високої дози препарату; не завжди можна вивчити токсичні зміни в органах-мішенях. ІІІ. Спеціальні токсикологічні методи дослідження. 1. Мутагенність. Бактеріологічні тести на мутагенність дозволяють визначити осередок мутації (парні в генах-регуляторах та пошкодження клітинних макромолекул). Їх потрібно проводити завжди. Недостатньо піддавати мікроорганізми впливу препаратів тільки в умовах in vitro, тому що в організмі тварин або людини можуть утворюватися метаболіти лікарської речовини, що мають мутагенні властивості. Необхідні тести, розроблені на тваринах, наприклад внутрішньочеревне введення мікроорганізмів.2. Проведення досліджень на канцерогенність не потрібно до початку ранніх фаз випробування на людині, якщо тільки відсутні серйозні підстави припускати ймовірність канцерогенної дії препарату: наприклад, при дослідженні на мутагенність отримано позитивний результат, структура препарату та його метаболітів у людини дозволяє припустити його канцерогенність або гістопатологічні зміни органах, отримані щодо хронічної токсичності, змушують підозрювати ймовірність мутацій. Якщо передбачається, що людина отримуватиме лікарський засіб більше року, тоді в експерименті дослідження на канцерогенність має проводитися в повному обсязі (протягом майже всього життя тварини). Вивчення канцерогенності (онкогенності) включає: а) дослідження на двох видах тварин з встановленою низькою частотою розвитку спонтанних пухлин; б) отримання необхідних даних про метаболізм лікарського засобу; в) використання трьох доз: високої, але з урахуванням мінімальної токсичної дії; низькою, що перевищує терапевтичну (фармакологічно ефективна доза) у 2-3 прийоми; проміжну (середня геометрична між високою та низькою дозами); г) тривалість дослідження у щурів – 24 міс (і додатково протягом 6 міс для оцінки результатів), у мишей та хом'яків – 18 міс, тобто протягом більшого періоду їхнього життя. У міру тривалості дослідження підвищується цінність тварин, тому що їх відмінок при епідеміях або з інших причин, що не мають відношення до дослідження, що викликає, викликає необхідність повторного вивчення; це може багато років затягнути програму випробувань на безпеку препарату; д) після завершення тестів, згідно з наявними інструкціями (у Великій Британії), має бути проведено гістологічне дослідження 30 видів тканин організму; однак цей список невичерпний і слід брати до уваги особливі обставини, що виникають під час дослідження; е) визначення: новоутворенням (пухлиною) вважають популяцію патологічних клітин з неконтрольованою зазвичай підвищеною проліферативною активністю та з іншими менш чіткими морфологічними та функціональними змінами; вони розвиваються незалежно від фактора, що індукував їх виникнення (за винятком індукованих вірусом пухлин); злоякісна пухлина проникає в навколишні тканини та/або метастазує; ж) інтерпретація одержаних результатів; найдостовірнішим методом, що доводить небезпеку вивчення канцерогенності речовини для людини, є епідеміологічне дослідження; незважаючи на те, що більшість речовин, канцерогенних для людини, виявилися канцерогенними і для тварин, все ж невідомо, наскільки речовини, канцерогенні для тварин, канцерогенні і для людини. "Екстраполяція на людину даних, отриманих в експерименті, - важка, а іноді і довільна процедура ..."

«Ймовірність ризику канцерогенності у людини збільшується, якщо виявляють великий розмір злоякісних пухлин, що поширюються на специфічні тканини, при цьому тварина отримувала досліджувану речовину тим самим шляхом, яким її отримує і людина, а доза речовини дорівнює або менша від тієї, що викликає мінімальну токсичність. За інших обставин досліджувана речовина вважається слабким канцерогеном, і ризик його застосування зіставляється з його цінністю як лікарський засіб». з) існує нагальна потреба у розробці короткочасних тестів визначення канцерогенності досліджуваного речовини. Це важливо не тільки тому, що дозволить здешевити дослідження, але й прискорить їхнє виконання до початку введення препарату людині. Однак доступні в даний час короткочасні методи дослідження на мутагенність не можуть замінити офіційно необхідне вивчення канцерогенності на тваринах у тому обсязі, який дозволить встановити потенційну канцерогенність препарату. Позитивні результати, отримані при короткочасному дослідженні, завжди вимагають проведення дослідження у повному, офіційно необхідному обсязі. Якщо ж результати короткочасних спостережень були негативними і препарат не виявив мутагенних властивостей, це виключає необхідності виявлення його канцерогенності за програмою. Може виникнути питання: чому нове з'єднання можна призначити людині до завершення необхідних повних за обсягом досліджень канцерогенність. Відповіді бувають такими: досліди на тваринах мають невизначене передбачуване значення, обов'язкове завершення повних досліджень на канцерогенність зробило б розробку соціально бажаного препарату до надзвичайно дорогої і навіть призвело б до ризику припинення його розробки. Це могло б затримати розробку корисного лікарського препарату, а в той же час дедалі більше тестів було б проведено з речовинами, які зрештою були б заборонені з будь-яких інших причин. Все це може бути комусь правильним або неправильним, але така проблема, що існує насправді.

IV. Вплив на репродуктивні процеси. Проводиться з метою визначення токсичної дії на: чоловічі та жіночі гамети; внутрішньоматковий гомеостаз; ембріогенез; плід; метаболізм в організмі матері, що призводить до ураження плода; зростання та розвиток матки; пологи; постнатальний розвиток, смоктальний рефлекс новонародженого та лактацію; віддалені ефекти у потомства, наприклад, на поведінку, генеративну функцію; наступне покоління. При вивченні деяких ефектів необхідно проведення експерименту не менше ніж на двох видах тварин (наприклад, при дослідженні ембріотоксичності), в інших випадках достатньо одного виду (наприклад, щодо впливу на перинатальний розвиток, плодючість). Як правило, під час проведення експерименту використовують три дози. Дослідження фармакокінетики слід проводити на вагітних тваринах, а концентрацію лікарської речовини визначають як в організмі самки, так і її плоду. Результати аутопсії та гістологічного дослідження, передбачених щодо впливу на репродуктивну функцію, служать основним документом при лабораторних дослідженнях.

Етичні питання використання тварин під час створення ліків

Багато досліджень проводяться на анестезованих тварин, забитих «гуманними» методами, або ізольованих органах тварин. Проте нині немає іншої моделі, у якій поєднувалися б взаємозалежність системи функціонування різних органів прокуратури та метаболізм із заснуванням біологічно активних продуктів перетворення. Серйозні сумніви можуть виникати щодо токсикологічних дослідів, які завдають тварині багато страждань. Всі вони будуть абсолютно невиправданими, якщо в результаті не буде отримано дані, корисні для людини. У багатьох відношеннях функції тварин подібні до таких у людини, проте існують і помітні відмінності.

Статистична значимість

Якщо передбачається, що один метод лікування ефективніший за інший, то для того, щоб з'ясувати істину (в цьому лише дивовижність, що здається), слід почати з перевірки гіпотези про те, що методи однаково ефективні або ж неефективні. І тут можна говорити про гіпотезу відсутності відмінності (нульова гіпотеза). Так, якщо лікування проводилося у двох різних групах хворих (порівняння між хворими) або якщо кожен хворий пройшов курс лікування кожним із препаратів (порівняння на тих же хворих) і при цьому було виявлено, що один з методів лікування ефективніший за інший, то необхідно встановити, чи дійсно отримана різниця обумовлена ​​перевагою одного методу перед іншим. Статистичний тест на достовірність показує, як часто різниця у величинах могла б бути обумовлена ​​випадковістю (випадкові впливи), якщо насправді відсутня різниця між методами лікування. Якщо ж результати тесту такі, що отримана статистична відмінність все ж таки малоймовірна, оскільки насправді вона відсутня, то лікар може самостійно вирішити питання про те, чому слід довіряти, або принаймні вчинити так, якби було встановлено реальну перевагу одного з методів, і визнати це у практичній діяльності. Відмінності може бути статистично достовірними, але клінічно які мають великого значення.

Тест на статистичну достовірність у клінічному дослідженні

В рівній мірі виявлення відмінностей може показати їх відсутність в ефективності двох методів лікування, хоча все ж таки є шанс, що насправді воно все ж таки існує. При правильно спланованому клінічному дослідженні можливо обчислити ймовірність того, чи можна не помітити реальної відмінності за певної величини після завершення даного обсягу досліджень. У клінічній практиці слід мати на увазі, що якщо результати тесту на статистичну достовірністьправильності «нульової гіпотези» свідчать про відсутність відмінностей між методами лікування тільки в п'яти випадках при 100-кратному проведенні експерименту, то таку відмінність можна прийняти за достатній доказ того, що «нульова гіпотеза», ймовірно, неправомірна (але не неможлива), тоді як насправді реальна різниця між методами лікування є. Такий рівень ймовірності у терапевтичних випробуваннях виражається як статистично значущі відмінності або значущі при 5% рівні, або при р = 0,05 (р означає відсоток, поділений на 100, тобто випадкова пропорція). Статистична значимістьпросто означає невелику ймовірність відсутності різниці в ефективності двох методів лікування. Якщо при проведенні математичного аналізу виявляють, що гіпотеза відсутності відмінностей вірна для відхилень, що спостерігаються, або ще більше виражених тільки одного разу при 100-кратному повторенні експерименту, зазвичай вважають, що отримані результати статистично високодостовірні при 1% рівні, або при р=0,01. Статистичні тести не є доказами переваг того чи іншого методу, оскільки вони свідчать лише про ймовірність. Клініцист має право визнати результати випробування правильними за їх статистичної значимості(р=0,05), якщо він має досить доведене теоретичне обгрунтування у тому, щоб очікувати подібний результат. У той самий час лікар може відмовитися визнати висновок, отриманий виходячи з аналізу, якщо він теоретично неможливий чи суперечить його клінічному досвіду, як і раніше відмінність виявиться статистично високозначним (р=0,001). І це буде розсудливим. Важливо не опинитися в «тисках» статистичних показників, але важливо уникнути ігнорування очевидних даних. Статистику можна визначити як комплекс методів прийняття мудрого рішення перед невизначеності. Правильно використовується статистичний аналіз- Дуже цінний інструмент для вдосконалення методів лікування. Багато дослідників вважають, що статистично значущі результати дослідження- Це все, що необхідно отримати (редактори намагаються публікувати результати випробувань зі статистично значущими і відкидають зі статистично незначущими відмінностями, оскільки дослідження за відсутності відмінностей здаються їм нецікавими). Це не вірно. Слід оцінювати помилки терапевтичних експериментів двох типів. І тип – виявлення відмінностей у ефективності методів лікування, хоча насправді вони відсутні; ІІ тип – відмінність не виявлено, тоді як насправді вона є, причому настільки виражена, що у лікарів виникає питання: чим вона викликана? Клініцисту слід вирішити також питання про те, чи він приймає помилку II типу і з яким рівнем ймовірності, якщо він повинен використовувати дані досліджень для лікування хворих. Таким чином, тільки вказівку на статистичну значимістьРозбіжності у ефективності двох методів лікування неспроможна дати у відповідь питання виборі найефективнішого їх. Наприклад, результати досліджень свідчать, що статистична достовірністьвідмінностей відсутня. Це означає, що порівнювані між собою величини немає за даних умов відмінностей, але за інших умовах, наприклад зі збільшенням кількості спостережень, статистична достовірність міг би набути велику значимість, т. е. ймовірність стати статистично значимим, що є інтересам клініцистів, оскільки дозволяє довести перевагу методу, який видається більш цінним. Відсутність статистичної достовірності відмінностей по-різному інтерпретується залежно від кількості обстежених хворих, наприклад, 50 або 500. При збільшенні числа спостережень ймовірність достовірності збільшується. При невеликій кількості така можливість значно менша, хоча може бути важлива клінічно, незважаючи на те, що зміна реєстрованого показника реакції на лікування сама по собі невелика. Статистично недостовірний результат можна інтерпретувати як такий, що не має клінічного значення, якщо, за даними повідомлення, довірчий інтервал між отриманими результатами про відмінність методів лікування вузький. Клінічні випробування передбачають вимірювання таких показників, як біль, набряки, артеріальний тиск, частота нападів болю в серці. Вказівка ​​на 95% довірчий інтервал для середніх значень різницю між двома методами лікування означає: а) сумісність найменших і найбільших справжніх значень конкретних даних (наприклад, ефективність методу лікування) при 5% рівні достовірності; б) діапазон, всередині якого з визначеністю (95%) знаходяться справжні чи справді важливі значення, наприклад, різниці ефективності методу лікування. Довірчі інтервалисвідчать про точність проведеного дослідження, які великий діапазон – про недостатню інформативність незалежно від достовірності чи недостовірності зареєстрованого відмінності. Він попереджає не надавати великого значення чи довіри результатам невеликих за обсягом досліджень. Довірчі інтервали особливо корисні при інтерпретації цих досліджень, оскільки вони вказують на ступінь невизначеності отриманих результатів, наприклад при визначенні різниці між двома середніми величинами (є або відсутня статистична відмінність). Використання середніх даних у поєднанні з довірчим інтервалом дозволяє отримати правильну оцінку. Так, наприклад, якщо різниця в ефективності двох методів лікування статистично недостовірна, а довірчий інтервал для середніх значень широкий, то подібна різниця сумісна з правомочністю «нульової гіпотези», тобто відсутня реальна різниця між методами лікування або частота суттєвого небажаного або основного позитивного ефект, який видається дуже важливим. Така ситуація виникає лише при невеликій кількості спостережень, її можна уникнути, якщо заздалегідь розрахувати мінімальну кількість спостережень, необхідне встановлення з високою ймовірністю корисного ефекту, раніше визначеного клініцистом, або його відсутність. Результати дослідження, що не дозволяють дійти певного висновку, марні та неетичні, оскільки створюють ризик для хворих, займають у фахівців час і вимагають невиправданих фінансових витрат. Сплановане дослідження має бути інформативним (мати адекватну «силу»), наприклад, забезпечити принаймні 80% шансу виявлення бажаного ефекту при вузькому довірчому інтервалі та 5% статистичної достовірності (р=0,05). Марно починати дослідження з шансом забезпечити встановлення мети, що стоїть перед дослідниками менш ніж 50% випадків, т. е. якщо його передбачувана «сила» занадто мала. Однак такі невеликі за обсягом дослідження проводяться нерідко, а їх результати публікуються без вказівки довірчих інтервалів, що варіюють показників середніх, які б виявили їхню неспроможність. Під час проведення досліджень звіт має містити певні відомості.

  1. Відмінність ефективності лікування, що спостерігається, у двох групах статистично недостовірна (р>0,05), але цей результат сумісний (95% довірчий інтервал) з існуючою реальною відмінністю в широкому діапазоні: від +30 до – 20% (т. е. при майже однаковій величиною значень протилежного знака); Широкий діапазон розкиду свідчить у тому, що результати досліджень виявилися марними, оскільки як діапазон коливань у відмінності ефекту широкий, а й отримані значення відмінності ефекту не відрізняються від нуля («крутяться» навколо нуля).
  2. Відмінна різниця між групами, що отримують різне лікування, статистично достовірно (р<0,05), но результат совместим с существующими различиями от 2 до 35% (в одном и том же направлении); при таком широком диапазоне различий можно не получить объективной оценки, так как клинически полезные различия в эффекте могут устанавливаться только в пределах 20%.

Якщо ж діапазон коливань вузький, наприклад 30-38% і значення вище за клінічно необхідну мінімальну величину (20%), що визнається клінічно важливим і статистично значущим, то можна визнати, що отримана надійна інформація, яку слід визнати цінною (якщо вона буде підтверджена даними інших досліджень) для обґрунтування рекомендацій щодо лікування хворих. Якщо всі повідомлення в журналах супроводжувалися подібною інформацією про статистичну достовірність та довірчі інтервали, у літературі було б менше марних і навіть дезорієнтуючих відомостей з терапевтичних випробувань, оскільки редактори відмовляли б у публікації матеріалів, які не містять цінних відомостей щодо оцінки самих авторів.

Обсяг терапевтичного дослідження, кількість учасників

На початок терапевтичного дослідження необхідно вирішити питання час його припинення. Необхідна кількість хворих, що беруть участь у ньому, залежить від відмінностей, які приймаються за клінічно важливі, які слід прагнути встановити заздалегідь. Якщо дослідник може попередньо визначити бажану відмінність в ефективності лікування (якби він вже завершив випробування та обговорює важливість отриманих результатів), то можна підрахувати кількість хворих, необхідну для того, щоб отримати клінічно значущу відмінність, якщо насправді вона реально може існувати. Це отримало назву концепції роздільної здатності (сили) клінічного дослідження (можливість визначення статистично значущої відмінності на користь більш відповідного методу лікування, коли відмінності рівні або перевищують клінічно корисні, у яких зацікавлені лікарі). Очевидно, що такий підрахунок слід зробити до початку випробування, а не після його завершення, коли виявиться, що його роздільна здатність занадто мала і що випробування виявилося марним. Зайва впевненість у можливості визначення дуже малих відмінностей здатна призвести до необхідності проведення неймовірно великих за обсягом досліджень. Часто необхідно йти на компроміс, беручи до уваги наявне у розпорядженні дослідників кількість хворих (що зазвичай завищується), здійсненність завдань та реальну оцінку дійсно має клінічне значення відмінності. Клініцист, який має намір використовувати в терапевтичних дослідженнях фіксовану групу хворих, зазвичай для вирішення питання про необхідну кількість учасників вдається до консультації статистика. Така оцінка може виявитися правильною, якщо лікар повідомить статистику про величину відмінностей, яку йому цікаво визначити, і про той допустимий ризик, який пов'язаний з помилками I та II типів, тобто помилками аналізу результатів, що виражаються у визнанні відмінності, коли вона відсутня (I тип), і для його невиявлення, коли воно існує (II тип). Результат такого підрахунку зазвичай викликає у клініциста шок, оскільки він має дуже невиразне уявлення про це і зазвичай сповнений ентузіазму щодо очікуваного лікувального ефекту. Він починає в таких випадках говорити про своє бажання насправді визначити «будь-яку» відмінність, хоча б і невелику, що буде «цілком доведено», щоб прийняти її за реально існуюче. Однак те, що лікареві може здатися цілком помірними вимогами, насправді призводить до необхідності включити у випробування неймовірно велику кількість хворих. Два моменти будуть цілком достатні. Якщо летальність становить 20% (наприклад, при правцях у деяких регіонах світу), то у випробуванні має брати участь близько 1000 хворих (подібні дослідження проводилися). Дослідження, в якому буде з 5% достовірністю встановлено перевагу одного з методів лікування (при цьому ефективність останнього збільшується з 75% до 85%), має бути проведено на 500 учасниках; у цьому випадку його роздільна здатність складе 80%. Зрозуміло, що чим більша відмінність очікується, тим менше знадобиться хворих, що у дослідженні, а що менше очікуване відмінність, тим більше їх (ці розрахунки очевидно показують, чому контрольовані методи оцінки лікувального ефекту лікарських засобів дедалі більше привертають увагу дослідників). Чітко проведене дослідження, що дозволяє отримати помірну міру ймовірності того, що його результати підтверджуються іншими дослідниками, слід віддати перевагу дослідженню, метою якого є визначення ефективності методу лікування з абсолютною надійністю. Подібне дослідження або критерій невдач через нудьгу та інші людські слабкості забезпечить отримання результатів, коли випробуваний лікарський засіб вже застаріє. Зазвичай сплановане дослідження проводиться з періодичним статистичним аналізом (щотижневим або щомісячним), і як тільки одержують статистично достовірні відмінності в ефективності лікування, його можна вважати завершеним. Однак, на жаль, неможливо проводити лікування одночасно і періодично проводити статистичну обробку одержуваних результатів з метою встановити «як ідуть справи» або для того, щоб перервати дослідження, коли різниця в результатах стане достовірною. Випробування має бути завершено з погляду як оцінки результатів, а й у часі, оскільки ситуація може змінюватися, у зв'язку з чим можуть змінюватися і статистичні дані; тому короткострокові дослідження може бути дезорієнтуючими і відповідати істинності порівнюваних коштів. Підтвердження результатів іншими дослідниками необхідне прогресу як терапії, а й науки взагалі. Нерозумно, досягнувши недостатнього рівня статистичної значущості відмінності(наприклад, р-0,06), прагнути отримати узгоджений рівень статистичної значущості (наприклад, р=0,05) за допомогою невеликого збільшення числа хворих, включених до дослідження, сподіваючись, що це дозволить отримати р=0,05 або менше. Не слід навмисне користуватися таким прийомом для отримання достовірної різниці. Тільки можливості самих методів лікування мають бути єдиними факторами, які зумовлюють отримання певних результатів. Однак це лише теоретичні міркування, а практично немає дослідника, який протягом багатьох місяців лікував би хворих, не переконавшись у тому, що відбувається в групах, що спостерігаються, з точки зору статистичних методів оцінки, і який не зазнав би при цьому впливу результатів статистичного аналізу на прийняття рішення про доцільність закінчення чи продовження дослідження. Строго кажучи, це не узгоджується зі статистичними принципами, але, безперечно, така поведінка клініцистів ще спостерігається. Це наводить на думку про те, що найпростішим рішенням було б залишити все як є, а більшість опублікованих значень подумки визнати за подвоєну величину (порівняно з тим, що є насправді). Єдиною абсолютно етичною та обґрунтованою альтернативою такому положенню було б залучення до досліджень кваліфікованого статистика, який зміг би щотижня піддавати дані комп'ютеризованого аналізу для послідовного планування. Послідовне планування.Цей вид планування був введений у практику у зв'язку з очевидною необхідністю додаткової корекції плану досліджень, яка б дозволила продовжити або припинити їх при отриманні статистично достовірних результатівабо за небажаності подальшого їх проведення. Істотна особливість такого планування полягає в тому, що випробування обмежують заздалегідь визначеним часом, тоді як досліднику, згідно з результатами, отриманими до певного моменту, слід було б самому вирішувати, що цей момент настав (багато хто з них може утриматися від самостійного вибору моменту, коли відмінність статистично Істотно, що неминуче призводить до отримання з великою частотою позитивних результатів). Метод послідовного аналізу дозволяє продовжити випробування, але він не позбавлений недоліків: наприклад, у вибраний момент необхідно отримати один певний кінцевий результат, хоча при багатьох випробуваннях, наприклад при оцінці протиревматичних засобів, потрібна оцінка багатьох показників. Було знайдено компромісний варіант між випробуванням на фіксованій групі хворих та випробуванням з послідовним плануванням. Це дозволяє проводити формальний статистичний аналіз у кілька заздалегідь визначених етапів та приймати рішення про продовження чи припинення дослідження. Проведення таких проміжних аналізів зменшує статистичну достовірність, але несуттєво, якщо їх проводити менше чотирьох разів протягом тривалого періоду (оскільки проміжний аналіз проводять з урахуванням більш високого, надлишкового рівня помилки І типу, тому загальний ризик її, прийнятий під час планування, до закінчення випробувань не збільшується). Таке модифіковане послідовне планування відображає реальні умови практичної медицини та забезпечує розумне поєднання вимог статистики та медицини. Консультація статистика під час планування дослідженнянеобхідна, оскільки після завершення вона не може підвищити його вирішальну можливість. Тест значущості відмінностей обґрунтовано може бути застосований тільки до експерименту, в якому єдиною змінною, що систематично розрізняється в групах, є ефект препарату, що вивчається. Похибки при відборі хворих, їх угрупованні, обстеженні та оцінці змін, що спостерігаються під впливом лікування, найважливіших показників призводять до безглуздості статистичної обробки результатів. Статистична обробка старих історій хвороби частіше веде до оман, ніж приносить користь, і не має наукового значення.

Чутливість клінічних методів досліджень

На жаль, клінічні дослідження не стосуються настільки чутливих методів, як того хотілося б клініцистам. Клінічні випробування, в яких порівнюють показник смертності в групах із співвідношенням 1:3 або більше, є високодостовірними, але при різниці у співвідношенні менше 2:3 ефективність препаратів встановлюється з великими труднощами. Ці сумарні співвідношення є дуже важливими, і всі організатори клінічних досліджень повинні їх враховувати. У зв'язку з цим найчастіша помилка полягає у спробі провести дослідження, при якому різниця у смертності у двох порівнюваних групах не перевищуватиме 2:3.

Цілком очевидно, що результати одного дослідження рідко дозволяють отримати остаточну відповідь на поставлене лікарями питання. Підтверджуючі результати, отримані дослідниками інших центрів, відіграють основну роль встановленні дійсної ефективності лікарських засобів. Якщо під час проведення дослідження у численних групах результати варіюють, то намагаються зібрати всі матеріали разом і піддати дані відповідної статистичної обробки (але не можна просто підсумовувати групи). Узагальнений аналіз може бути повчальним. Однак при цьому обрані для аналізу результати мають бути високої якості, а з узагальненими результатами слід поводитися з обережністю.

Звичайно, певну частину накручує аптека, іншу візьме собі компанія – дистриб'ютор ліків, чимало витратить виробник на маркетинг – просування та рекламу препарату. Порахуйте реальні витрати виробника на розробку та виробництво препарату.

На питання, що викликає збільшення вартості лікарських препаратів, відповідає
Світлана Завидова, виконавчий директор Асоціації організацій із клінічних досліджень.

Але є найвагоміша стаття витрат, на якій заощаджуватиме - пацієнтові на шкоду. Це клінічні дослідження препаратів, які мають довести: ліки безпечні та ефективні.

У життєвого циклу ліки довгий і важкий шлях - від першої роботи вчених з підбору потрібної молекули речовини до виведення препарату ринку. 10 тисяч молекул-кандидатів беруть участь у скринінгу. І, нарешті, до фінішної стрічки доходить одна-єдина речовина, яка стане препаратом.

На першому етапі виробники препарату проводять доклінічні дослідження на лабораторних тваринах та спеціальних біологічних моделях. Тут головне - отримати правильну інформацію про безпеку речовини та оцінити її здатність надавати бажаний ефект. Якщо його немає, препарат на клінічні дослідження не потрапить. Але наскільки дієвий препарат, можна буде довести лише на наступному етапі - клінічних дослідженнях за участю людей. І уникнути такого довгого ланцюжка випробувань ніяк не можна, як показала сумна історія, що трапилася в Європі.

Талідомідова трагедія

Майже 60 років тому німецька фармацевтична компанія Chemie Grunenthal розробила препарат талідомід.

Спочатку його хотіли застосовувати як ліки проти судом. Але медиків вразила інша дія препарату – заспокійлива. Лікарі вважають винахід талідоміда серйозним проривом у лікуванні безсоння.

Було проведено досліди на гризунах. Передозування не вбивало лабораторних тварин, що дозволило вважати препарат безпечним. Однак седативного впливу ліки не чинили на мишей, тому представникам фармкомпанії довелося виготовити особливу клітину, яка використовувалася для вимірювання найменших рухів тварин. Незважаючи на те, що гризуни після прийому пігулок не спали, їх рухи сповільнювалися більшою мірою, ніж у тих тварин, яким вводили інші заспокійливі засоби. Комісія переконалася в ефективності та безпеці запропонованих таблеток та дала ліцензію на виробництво.

Через 2 роки після цього препарат був офіційно випущений у продаж у Європі та низці інших країн. Загалом талідомід продавався у 46 державах під 37 різними назвами. Жодних додаткових незалежних досліджень препарату в жодній країні не проводилось.

У 1958 році виробники, не провівши жодних досліджень, голослівно заявили, що талідомід – найкращий засіб для вагітних, схильних до розладів сну. І то було фатальною помилкою. Вже через 9 місяців у Європі почали народжуватися малюки з різними потворностями – відсутністю вушних раковин, верхніх чи нижніх кінцівок, дефектами очей та мімічної мускулатури. Крім того, талідомід впливав на формування внутрішніх органів, руйнівним чином діючи на серце, печінку, нирки, травну та сечостатеву системи немовляти, а також міг призводити до народження дітей з епілепсією, аутизмом.

За різними підрахунками жертвами стали від 8000 до 12 000 дітей, матері яких приймали препарати талідоміду під час вагітності. 7 тисяч немовлят померли у перші хвилини життя. Мабуть, це була одна з найскандальніших історій, пов'язаних із побічними ефектами від будь-якого препарату. Надалі виявилося, що у зародків мавп талідомід викликає такі самі потворності, що й у людини. Цей приклад ще раз доводить необхідність перевірки кожного нового ліки, навіть якщо дослідження – дуже тривалий та дорогий процес.

Як відбуваються клінічні дослідження

Під час реєстрації препарату фахівці повинні оцінити всі докази, що були здобуті на попередніх етапах дослідження. Клінічні випробування повинні в першу чергу підтвердити безпеку застосування препарату у людини, а потім ефективність того, як препарат впливає конкретного хворого.

Причому першу фазу клінічних досліджень залучаються 20-100 здорових добровольців. На них перевіряються переносимість препарату, фармакокінетика (хімічні перетворення ліків в організмі), фармакодинаміка (механізм дії ліків на організм).

У другій фазі ліки випробовуються вже на 100-500 пацієнтів, що дозволяє підібрати дозування, продумати схеми прийому препаратів, оцінити ефективність нових ліків, перевірити перші гіпотези.

Як правило, на цій стадії вже проводяться міжнародні дослідження, тому що завдання фармкомпанії якнайшвидше вивести препарат на ринок і набрати необхідний пул пацієнтів, для яких розробляється препарат. Найшвидше це можна зробити, якщо залучити різні країни. Для виробника це необхідний заділ на те, щоб потім не зволікаючи вийти на міжнародний ринок.

До 3000 пацієнтів і більше може бути залучено до третьої, наймасовішої фази досліджень, коли підтверджується ефективність препарату для певного показання певної популяції.

Після реєстрації відбувається четверта фаза досліджень. Коло пацієнтів розширюється, фармкомпанії можуть зібрати додаткову інформацію щодо безпеки препарату, простежити взаємодію його з іншими ліками. Компанія, що поважає себе, як, наприклад, вітчизняна «НУО Петровакс Фарм», продовжуватиме проводити післяреєстраційні клінічні та спостережні дослідження, незважаючи на накопичений досвід застосування препаратів на ринку, щоб оцінити ефективність та безпеку в різних групах пацієнтів, порівняти з існуючими аналогами, вивчити можливість розширення показань до застосування.

20 років на все про все

Якщо препарат, який тільки з'явився на ринку, винайдено та синтезовано вперше, він називається оригінальним. Протягом 20 років він захищений патентом - інші виробники не можуть випускати та продавати ліки з тією ж чинною речовиною. Після цього часу хімічна формула ліків може копіюватися іншими виробниками. Вони реєструють препарат із тією ж діючою речовиною, але вже під іншою торговельною назвою. Так з'являються ліки-дженерики.

Завдання виробника оригінального препарату - якнайшвидше вийти на ринок, адже у нього всього 20 років на все про все. Але перший етап - дослідження та реєстрація - займає до 10, а іноді й більше років. У час, що залишився до закінчення патенту, виробнику оригінального препарату необхідно окупити витрати на етапі розробки (від пошуку діючої молекули до завершення клінічних випробувань). А вони, за даними Асоціації американських фармвиробників, можуть становити астрономічні суми – 1,8-2,4 млрд доларів. Саме тому розробкою нових препаратів займаються лише найбільші компанії – дрібним це просто не по кишені.

Щодо дженериків, то, звичайно, їх простіше виводити на ринок. Хоча клінічні дослідження проводяться, але йдуть вони за спрощеною схемою: вже не перевіряється весь процес ефективності, завдання - подивитися, як швидко речовина потрапляє в системний кровотік, з тією ж швидкістю, як у оригінального препарату, або повільніше, як воно потім виводиться. Механізм простішого виведення дженерика на ринок виправданий, оскільки держава зацікавлена ​​в отриманні дешевих препаратів та підвищенні їхньої доступності на ринку. І при дотриманні належних умов контролю за якістю дженерик стає абсолютно нормальними ліками, часом у кілька разів дешевшими від оригінального.

Міф про «піддослідних кроликів»

У нас поширена хибна думка, що Росія використовується як полігон для випробування нових препаратів. Якщо подивитися на цифри, то це зовсім не так. Частка участі нашої країни у міжнародних клінічних дослідженнях становить лише 1%. Тут лідирують інші країни – Бельгія, Швейцарія, Ізраїль, Швеція, США. Найчастіше Росія бере участь у дослідженні препаратів для лікування онкологічних, неврологічних, ревматологічних, інфекційних та пульмонологічних захворювань.

Як уже пояснювалося, участь нашої країни у клінічних дослідженнях – шанс для неї отримати необхідні інноваційні препарати однією з перших. Потенціал можливостей провести клінічні випробування на території нашої країни є величезним. Але закордонні компанії стикаються з бюрократичними перешкодами при отриманні документів. І якщо фармкомпанії потрібно набрати 1000 пацієнтів для другої фази досліджень, то часто до моменту, коли нарешті в Росії видається довгоочікуване дозвіл, виявляється, вже набрано потрібну кількість хворих в інших країнах.

Як вирішити проблему дорожнечі ліків

Але як зробити, щоб людині були доступні хороші інноваційні препарати? Тут турботу про своїх громадян має виявити держава. Воно має брати участь у ціноутворенні на ліки, оскільки їх доступність населення є складовою соціальної політики та охорони здоров'я.

Держава, намагаючись стабілізувати та регулювати ціни на певні препарати, створила так званий Перелік життєво необхідних та найважливіших лікарських препаратів (ЖНВЛП). Але часом цей перелік у Росії існує лише на папері, на практиці виявляючись марним, тому що бюджету на його реалізацію не закладено. Ліки, внесені до цього переліку, становлять чи не третину всіх коштів, що звертаються на ринку. Однак серед них є неефективні та марні, які ніяк не можна назвати життєво важливими.

В ідеальному варіанті держава має скласти список ліків, вартість яких вона готова відшкодовувати покупцям у межах компенсації вартості лікування. А поки що похід в аптеку стає руйнуванням для кишень більшості росіян.

Чи можна довіряти дженерикам чи оригінальні препарати завжди краще? Розберемося, як влаштовано виробництво ліків у нашій країні та в усьому світі. Наш експерт – голова координаційної ради Національної асоціації виробників фармацевтичної продукції та медичних виробів, заслужений працівник охорони здоров'я РФ Надія Дараган.

Новий чи наступний?

Щоб зрозуміти, як створюються нові ліки, спочатку варто розібратися з термінами. Під інноваційним препаратом розуміється така собі субстанція, якої раніше не існувало. Її розробка починається з докладного вивчення хвороби та виявлення невідомих досі шляхів її розвитку. Потім на підставі отриманих даних вчені визначають, яким чином можна вплинути на ці шляхи, щоб зупинити хворобу або звернути її назад. І вже після цього можна приступати до створення молекул або біологічних структур, які ляжуть в основу нових ліків.

Зовсім інша справа – це ліки наступного покоління. В основі таких препаратів теж лежать нові молекули або біологічні структури, але діють вони на добре вивчені ланки розвитку хвороби та відомі клітини-мішені. Зрозуміло, що етапи створення інноваційних ліків і препаратів наступного покоління відрізняються і за часом, і за вартістю.

Від пробірки до пігулки

Отже, попередні дослідження проведені, мішені, на які може вплинути інноваційний препарат, виявлено, тепер саме час приступати, власне, до створення ліків. На першому етапі встановлюється формула препарату, на другому отримані речовини випробовуються в різних умовах на клітинах, тканинах та тваринах. Якщо препарат показав себе безпечним, ефективним та нетоксичним, починається найскладніший та найдовший етап – клінічні випробування, коли дію препарату перевіряють на людях. І лише після цього інноваційний препарат виходить на ринок.

Весь цей процес займає не один рік, і дуже залежить від того, які ліки планується випустити на ринок. Якщо засіб призначений для лікування болю в суглобах або розробка може займати від року до п'яти років, а якщо йдеться про препарат проти раку, генетичних або орфанних захворювань, на його випуск йдуть десятиліття. Що стосується вартості, то технологія може оцінюватися від кількох десятків до сотень мільйонів рублів.

Håkan Dahlström Follow/Flickr.com/CC BY 2.0

І ось тут і криється відповідь на запитання: чому в Росії так мало нових ліків? Вкласти в розробку нового кошту сотні мільйонів рублів без гарантії, що цей препарат колись з'явиться на ринку (щось може піти не так на будь-якому етапі створення ліків) або що продаж нового засобу принесе прибуток, можуть дозволити собі тільки дуже великі та багаті фармацевтичні компанії. Адже основні фінансові витрати на розробку нових ліків зазнають фармкомпанії, не держава.

Можливо, ситуація зміниться, якщо держава почне активно стимулювати фармкомпанії до випуску та розробки нових ліків та ліків наступного покоління. Саме на це спрямована федеральна цільова програма «Фарма-2020» і Стратегія розвитку фармацевтичної промисловості, що розробляється в даний час в Російській Федерації на період до 2030 року.

Світовий тренд

Втім, не можна сказати, що в питанні створення нових ліків ми дуже сильно відрізняємося від інших країн. На Заході кількість інноваційних препаратів і препаратів наступного покоління, що випускаються, теж повільно знижується з кожним роком. І справа не лише в грошах, хоча витрати на розробку – один із ключових моментів, який гальмує випуск нових ліків. Справа ще й у підході, що змінився, до оцінки ефективності та безпеки нових лікарських засобів. За останні 20-30 років контроль став набагато суворішим, і багато розробок так і залишаються на стадії розробки.


mararie/Flickr.com/CCBY-SA 2.0

Тому і в нас, і в усьому світі перед фармкомпаніями часто ставиться зовсім інше завдання. Потрібно не створити нові ліки, а зробити існуючі препарати доступнішими. Саме тому більшість фармацевтичних компаній у всьому світі націлена на випуск дженериків – дешевших аналогів оригінальних препаратів. Серед експертів є думка, що американські, європейські та транснаціональні фармацевтичні компанії давно закуповують понад 80% фармацевтичних субстанцій, що використовуються в Індії та Китаї.

Дешевше – значить гірше?

А у нас у країні дженерики часто називають «ліками другого сорту» і вважається, що якщо є можливість вибору, то завжди краще віддати перевагу оригінальному препарату. Але такий підхід хоч і вигідний аптечним установам, які одержують більше прибутку від дорогих препаратів, вірний далеко не завжди. Адже дженерики дешевші за оригінали не тому, що на їх виробництві економлять (випускають їх на поганому устаткуванні, не контролюють якість), а лише тому, що на розробку дженерика витрачається менше грошей і часу.

В основі дженерика лежить та сама фармацевтична субстанція, що і в основі оригінального препарату. Тому головне завдання розробників дженериків – показати, що діюча речовина доходить до потрібного місця в організмі та діє аналогічно до оригінального препарату. Тому сказати, що дженерик завжди гірший за оригінал, не можна.

А якщо так, при виборі препарату не можна орієнтуватися лише на його ціну. Якщо перед вами два засоби з однією і тією ж діючою речовиною, далеко не завжди дешеве виявиться гірше дорогого. Тому єдиний орієнтир при виборі препарату – рекомендації лікаря.

Спрямовану розробку нових лікарських препаратів із заздалегідь заданими властивостями через відсутність короткого і зручного російського терміна називають драг-дизайном (drug - ліки, design - проектування, конструювання).

Редакція ПМ


Процес розробки нових ліків займає від 5 до 16 років. Витрати на клінічне тестування одного з'єднання-кандидата становлять понад 100 мільйонів доларів США


Сумарна вартість розробки, з урахуванням препаратів, що не досягли ринку, часто перевищує 1 мільярд доларів

Скринінг - лабораторний (in vitro) або комп'ютерний (in silico) - найбільш ресурсомістка процедура вибору з бібліотек доступних сполук прототипів для створення ліків. Позитивні результати скринінгу є відправною точкою для подальшого процесу розробки ліків

На початку 1870-х років німецький студент-медик Пауль Ерліх, який вивчав методи вибіркового фарбування зрізів тканин, висунув гіпотезу про існування хеморецепторів — спеціальних тканинних структур, що специфічно взаємодіють з хімічними речовинами, і припустив, що це можна використовувати для лікування різних захворювань. У 1905 році відомий англійський фізіолог і гістолог Джон Ленглі запропонував концепцію клітинних рецепторів - білків, що під дією різних речовин змінюють свій стан і за рахунок цього керують роботою клітини.

Одним із найістотніших успіхів Ерліха (на той час нобелівського лауреата) було відкриття сальварсану — засоби проти сифілісу і трипаносомозу, незмірно ефективнішого і набагато менш токсичного, ніж неорганічні сполуки ртуті, що застосовувалися до того. Після тривалого перебору органічних сполук миш'яку, що здавались перспективними, ефективним виявився «ароманізатор 606», що увійшов в історію.

З цього почався розвиток хіміотерапії. Успіхи біохімії дозволили передбачати вдалі мішені для терапевтичного впливу, а також модифікації ліків, що дають нові сполуки з новими властивостями. Так, вивчення властивостей та клітинних мішеней антибактеріального препарату сульфаніламіду дозволило розробити цілі сімейства сечогінних засобів та препаратів для зниження артеріального тиску та рівня цукру в крові. Однак мрія Ерліха про «чарівну кулю» — ідеальні ліки, що вражають тільки збудника хвороби і не зачіпають організм в цілому, залишалася лише мрією. Драг-дизайн піднявся на новий рівень у другій половині ХХ століття, коли розробка ліків стала не просто результатом роботи уяви, а результатом наукового діалогу між біологами та хіміками.

Прорив був пов'язаний з розвитком геноміки, що дозволила виділяти гени, що кодують терапевтично важливі біологічні мішені, та напрацьовувати достатню для досліджень кількість цих білків за допомогою генетично модифікованих мікроорганізмів.

На молекулярному рівні будь-яка хвороба — це порушення роботи білків та/або генів, що їх кодують, в одній або декількох тканинах організму. Геном людини містить 12-14 тисяч генів, що кодують білки. Сьогодні відомо близько 500 фармакологічних мішеней - білків (а останніми роками і генів), на які спрямована дія ліків. Ймовірно, їх більше: на які саме молекули в організмі діє багато препаратів, лікарі та фармацевти просто не знають. Клітинну мету простого аспірину виявили зовсім недавно - після 100 років його застосування! До того ж багато захворювань обумовлені порушенням функцій не одного, а як мінімум 5-10 пов'язаних між собою білків і генів, що кодують.

Пошук мішені

Основні поняття драг-дизайну - мета і ліки. Мета - це біологічна макромолекула, пов'язана з певною функцією, порушення якої призводить до захворювання. Найчастіше мішенями є білки - рецептори та ферменти. Ліки - це хімічна сполука (як правило, низькомолекулярна), що специфічно взаємодіє зі своєю мішенню і тим самим впливає на процеси всередині клітини.

Початковий етап драг-дизайну - вибір мішені, дія на яку регулює одні біохімічні процеси, не торкаючись інших. Це не завжди можливо, оскільки далеко не всі захворювання спричинені неправильною роботою лише одного білка чи гена. Останніми роками для ідентифікації мішеней дедалі частіше використовують дані порівняльної геноміки — у «тексті» ДНК людини виявляють гени, споріднені з генами з відомими функціями інших організмах. Втім, потрібна експериментальна перевірка того, що вплив саме на цю мету дасть результат. Один із способів – «вимкнути» ген мішені в генетично модифікованому організмі чи клітині та подивитися, що з ними стане. При пошуку мішені не слід забувати про поліморфізм: будь-який ген може існувати в кількох випадках, що кодують білки, які різняться за властивостями, не виходячи за межі норми. В результаті один і той же ліки по-різному діє залежно від індивідуальних особливостей і тим більше - на представників різних популяцій і рас.

Вибір зброї

Дослідження всіх можливих речовин неможливо: існує щонайменше 1040 лігандів — малих молекул, здатних вибірково зв'язатися з будь-якою ділянкою однієї з білків і змінити його функцію. Простий перебір варіантів, навіть на суперкомп'ютері (і за наявності повної інформації про будову всіх білків - а до того ох як далеко!) зайняв би більше часу, ніж минуло від початку світобудови. Тому на структуру потенційних лігандів накладають низку обмежень, які суттєво звужують «хімічний простір». На практиці можна використовувати умови схожості з ліками (drug-likeness), що визначають оптимальну кількість донорів та акцепторів водневого зв'язку, молекулярну вагу та ліпофільність сполуки. Як відправна точка при пошуку лігандів, здатних зв'язуватися із заданою мішенню, зазвичай використовують бібліотеки з'єднань, або створені спеціалізованою фірмою за умовами, заданими розробником, або наявні в арсеналі фармацевтичної компанії. Такі бібліотеки "на всі випадки життя" можуть містити мільйони речовин.

З тисяч доступних речовин із більш-менш певними властивостями необхідно вибрати сотні молекул, здатних після подальшої модифікації та випробувань на бактеріях чи культурах клітин дати десятки так званих кандидатних сполук, призначених для доклінічних досліджень, включаючи тестування на тваринах. Після цього етапу відсіву на стадію клінічних випробувань на людях залишається у кращому разі 1-3 препарати. А всі випробування витримує приблизно одну з десяти речовин. Щоб зменшити кількість невдач, важливо не помилитися на початку роботи.

Скринінг: відокремимо зерна від полови

Принцип скринінгу простий: на особливе предметне скло — плашки, що містять у тисячах мікролітрових лунок тестову систему, наприклад молекули білка-мішені або цілі клітини (при необхідності — генетично модифіковані), — робот розкопує з піпеток досліджувані речовини, дотримуючись заданої програми. Потім відбувається зчитування даних, що говорить про те, в якій лунці виявлено біологічну активність. Детектор може визначати її за радіоактивним сигналом, флюоресценцією, поляризацією світла та багатьма іншими параметрами.

В результаті скринінгу кількість сполук, що тестуються, скорочується на три-чотири порядку і виявляються активні молекули, звані прототипами. Однак такі удачі ще дуже далекі від кінцевих ліків. Лише ті з них, які зберігають свою активність у модельних системах та підходять під безліч додаткових критеріїв, дають попередників ліків для подальших досліджень. Прототипи, отримані в результаті скринінгу, піддають різноманітним оптимізаціям. Для цього потрібна тісна співпраця між різними групами дослідників: молекулярними біологами, фармакологами, молекулярними біофізиками та медичними хіміками. З кожним оборотом такого «фармакологічного циклу» прототип наближається до попередника ліки, який тестується на тваринах, а потім і на людях (передусім на безпеку).

Не нашкодь!

Розробка нових лікарських препаратів — галузь медицини, у якій у жодному разі слід поспішати. Досить згадати історію з талідомідом, застосування якого призводило до народження дітей із вродженими вадами кінцівок, аж до їхньої повної відсутності. Через недостатньо ретельного та акуратного тестування цей побічний ефект не був виявлений під час клінічних досліджень.

В даний час клінічні випробування нових препаратів – це тривала, складна та дорога процедура (два-сім років багатоетапних перевірок та від $100 млн. на одну сполуку-кандидат). На стадії преклінічних випробувань препарати досліджують на токсичність і канцерогенність, спочатку у стандартному тесті на личинках дрозофіл, а потім, як мінімум, на двох видах лабораторних тварин. Токсичні препарати, природно, в клініку не потрапляють, за винятком тих випадків, коли вони призначені для терапії особливо важких захворювань і не мають менш шкідливих аналогів.

Крім вивчення фармакодинаміки - механізмів дії препарату, у тому числі побічних ефектів, - досліджують його фармакокінетику: швидкість всмоктування в кров, розподіл по організму, хімічні перетворення (і дія сполук, що утворилися), виведення з організму та біодоступність - ступінь втрати препаратом біологічних властивостей при введенні в організм.

Процес клінічних досліджень нових препаратів має дуже багато нюансів і потребує величезної кількості супровідної документації (кілька тисяч сторінок), дозволів, сертифікатів тощо. Крім того, багато формальних процедур у різних країнах помітно різняться. Для вирішення цих численних питань існують спеціальні компанії, які приймають від фармацевтичних гігантів замовлення на проведення клінічних випробувань та перенаправляють їх у конкретні клініки, супроводжуючи весь процес та стежачи, щоб жодні формальності не були порушені.

Роблять роботи, а не людина

У драг-дизайні, як і більшості інших наукомістких областей, продовжує збільшуватися роль обчислювальної техніки. Слід одразу зазначити, що розробити новий лікарський препарат, використовуючи лише комп'ютери, неможливо. Основні переваги, які дають обчислювальні методи в даному випадку, - це скорочення часу випуску нових ліків на ринок та зниження вартості розробки.

Основні комп'ютерні методи, що використовуються в драг-дизайні, це, по-перше, передбачення просторової структури білка-мішені та механізм його взаємодії з ліками; по-друге, віртуальний скринінг (комп'ютерне сканування баз хімічних сполук); і, нарешті, оцінка «схожості на ліки» та інших фізико-хімічних характеристик.

Дуже часто про тривимірну структуру білка-мішені розробникам нічого не відомо. У цьому випадку нові сполуки конструюють, виходячи з інформації про структуру відомих активних лігандів.

Загальноприйнята в біології та хімії парадигма свідчить: "структура визначає властивості". Аналізуючи зв'язки між структурою та властивостями відомих сполук, можна передбачити хімічну структуру нової молекули, яка має бажані властивості. Цей підхід використовується і при модифікації відомих речовин з метою покращення їх властивостей, і при пошуку в хімічних бібліотеках лігандів до певного білка, і при складанні технічних завдань фірмам, що спеціалізуються на такому синтезі.

Достовірність моделювання, як і ефективність всього процесу конструювання нових ліків, можна суттєво підвищити, якщо враховувати дані не лише про структуру лігандів, а й про структуру білка-мішені. Такий підхід називають структурно-підкріпленим драг-дизайном (Structure-Based Drug Design).

Іноді тривимірну будову мішені можна встановити експериментально, наприклад, за допомогою рентгеноструктурного аналізу. Якщо структура мішені все ж таки недоступна, її можна змоделювати на комп'ютері, використовуючи інформацію про будову споріднених білків.

Для віртуального скринінгу не потрібні ні бібліотека з мільйона з'єднань, ні дорогий робот — достатньо створити бібліотеку віртуальних прототипів ліків. Зі збільшенням комп'ютерних потужностей та вдосконаленням алгоритмів програми краще оцінюватимуть спорідненість ліганду до білка, почнуть враховувати рухливість білкових ланцюгів та вплив розчинника.

Однак, незважаючи на всі свої переваги, комп'ютерні методи мають низку обмежень. Насамперед результати, отримані in silico, обов'язково повинні бути перевірені in vitro. Крім того, ніяке моделювання не може врахувати всі можливі впливи лікарського препарату на організм в цілому, тому комп'ютери не в змозі ні скасувати, ні навіть суттєво скоротити преклінічний тестування і тим більше клінічні випробування, що займають основну частку часу та засобів у розробці нового препарату.

Перспективи драг-дизайну

Очевидно, що драг-дизайн – це майбутнє фармакологічної промисловості. У міру розвитку геноміки, а також протеоміки (науки про функції білків), метаболоміки, що вивчає обмін речовин на всіх рівнях, від клітини до цілого організму, та інших «омік» кількість потенційних мішеней має збільшитися у багато разів. Наприклад, мішенями для антимікробних та антивірусних препаратів є білки патогенних бактерій та вірусів, які також необхідно активно досліджувати. Це додатково розширює сферу діяльності «мисливців за ліками». Знання структури білків дозволить знаходити та синтезувати на замовлення низькомолекулярні ліганди, що специфічно зв'язуються з певними ділянками мішеней.

Спрямоване конструювання нових лікарських засобів вже зараз стало найважливішою частиною фармакології. У недалекому майбутньому розробка ліків стане точною наукою, що дозволяє не лише перемогти багато невиліковних нині захворювань, але й здійснити давню мрію про «золоту кулю» — ліки, які з мінімальною побічною дією ефективно усувають причину хвороби.

Стаття дає базове уявлення про те, як у світі створюються ліки. Розглянуто історію драг-дизайну, основні поняття, терміни та технології, що застосовуються у цій сфері. Особливу увагу приділено ролі обчислювальної техніки у цьому наукомісткому процесі. Описано методи пошуку та валідації біологічних мішеней для лікарських препаратів, високопродуктивний скринінг, процеси клінічних та доклінічних випробувань ліків, а також застосування комп'ютерних алгоритмів.

Драг-дизайн: історія

Індустрія спрямованого конструювання нових лікарських препаратів, або, як цей процес називають, калькуючи з англійської через відсутність такого ж короткого і зручного російського терміна, драг-дизайн ( drug- лікарський засіб, design- проектування, конструювання) - порівняно молода дисципліна, але все ж таки не настільки молода, як це прийнято вважати.

Рисунок 1. Пауль Ерліх, який вперше висунув гіпотезу про існування хеморецепторів та їх можливого використання в медицині.

Національна бібліотека медицини США

До кінця дев'ятнадцятого століття хімія досягла значної міри зрілості. Було відкрито таблицю Менделєєва, розроблено теорію хімічної валентності, теорію кислот і основ, теорію ароматичних сполук. Цей безперечний прогрес дав поштовх і медицині. Нові хімічні продукти - синтетичні фарби, похідні смол почали використовуватися в медицині для диференціального фарбування біологічних тканин. У 1872–1874 роках у Страсбурзі, в лабораторії відомого анатома Вільгельма Валдеєра, студент-медик Пауль Ерліх (рис. 1), який вивчав селективне забарвлення тканин, вперше висунув гіпотезу про існування хеморецепторів - спеціальних тканинних структур, спеціалізованих тканин. можливість використання цього феномена у терапії різних захворювань. Пізніше, в 1905 році, цю концепцію було розширено Дж. Ленглі, який запропонував модель рецептора як генератора внутрішньоклітинних біологічних імпульсів, який активується агоністами та інактивується антагоністами.

Цей момент можна вважати народженням хемотерапії та новим витком у фармакології, і в 20 столітті це призвело до безпрецедентного успіху в клінічній медицині. Одним із найгучніших досягнень фармакологічної промисловості 20-го століття можна по праву назвати пеніцилін, антибіотик, відкритий в 1929 Олександром Флемінгом і досліджений згодом Чейном і Флорі. Пеніцилін, який має антибактеріальну дію, послужив людству незамінну службу в роки Другої світової війни, зберігши життя мільйонам поранених.

Вражені успіхом пеніциліну, багато фармацевтичних компаній відкрили власні мікробіологічні підрозділи, покладаючи на них надії щодо відкриття нових антибіотиків та інших ліків. Успіхи біохімії призвели до того, що стало можливим теоретично передбачати вдалі мішені для терапевтичного впливу, а також модифікації хімічних структур ліків, що дають нові сполуки з новими властивостями. Так, антибіотик сульфаніламід в результаті низки досліджень дав початок цілим сімействам гіпоглікемічних, діуретичних та антигіпертензивних препаратів. Драг-дизайн піднявся на якісно новий рівень, коли розробка нових лікарських сполук стала не просто результатом роботи уяви хіміків, а результатом наукового діалогу між біологами та хіміками.

Новий прорив був пов'язаний з розвитком молекулярної біології, що дозволила залучити до розробок інформацію про геном, клонувати гени, що кодують терапевтично важливі біологічні мішені та експресувати їх білкові продукти.

Завершення проекту «геном людини», що ознаменував початок нового тисячоліття, в результаті якого була прочитана повна інформація, що міститься в ДНК людини, стало справжнім тріумфом розділу біологічної науки, що отримала назву «геноміка». Геноміка дає новий підхід до пошуку нових терапевтично важливих мішеней, дозволяючи шукати їх у нуклеотидному тексті геному.

Геном людини містить 12000-14000 генів, що кодують білки, що секретуються. На даний момент у фармацевтичній промисловості використовується не більше 500 мішеней. Існують дослідження, які говорять, що багато захворювань є «мультифакторними», тобто обумовлюються дисфункцією не одного білка або гена, а 5–10 пов'язаних між собою білків і генів, що кодують. Виходячи з цих міркувань можна зробити висновок, що кількість досліджуваних мішеней має збільшитися мінімум у 5 разів.

Біохімічна класифікація біологічних мішеней, що досліджуються в даний час, і їх чисельне співвідношення представлені на малюнку 2. Особливо слід зазначити, що більшу (>60%) частку рецепторів складають мембранні G-білок сполучені рецептори ( GPCR, G-proteín coupled receptors), а сумарний обсяг продажів ліків, спрямованих на взаємодію з ними, дорівнює 65 млрд. дол. щорічно, і продовжує зростати.

Основні поняття

Рисунок 3. Три типи впливу лігандів на клітинну відповідь:збільшення відповіді ( позитивний агонгіст), сталість відповіді, але конкурування за зв'язування з іншими лігандами ( нейтральний агоніст) та зменшення відповіді ( антагоніст).

Основні поняття, що використовуються в драг-дизайні - це Метаі ліки. Мета - це макромолекулярна біологічна структура, імовірно пов'язана з певною функцією, порушення якої призводить до захворювання і яку необхідно зробити певний вплив. Найпоширеніші мішені - це рецептори і ферменти. Ліки - це хімічна сполука (як правило, низькомолекулярна), що специфічно взаємодіє з мішенню і тим чи іншим чином модифікує клітинну відповідь, що створюється мішенню.

Якщо в якості мішені виступає рецептор, то ліки буде, швидше за все, його лігандом, тобто з'єднанням, що специфічним чином взаємодіє з активним сайтом рецептора. За відсутності ліганду рецептор характеризується власним рівнем клітинної відповіді – так званою базальною активністю.

За типом модифікації клітинної відповіді ліганди ділять на три групи (рис. 3):

  1. Агоністи збільшують клітинну відповідь.
  2. Нейтральні агоністи зв'язуються з рецептором, але не змінюють клітинну відповідь порівняно з базальним рівнем.
  3. Зворотні агоністи, або антагоністи знижують відповідь клітини.

Ступінь взаємодії ліганду з метою вимірюють афінністю, або спорідненістю. Афінність дорівнює концентрації ліганду, коли половина мішеней пов'язані з лігандом. Біологічною ж характеристикою ліганду є його активність, тобто та концентрація ліганду, коли він клітинна відповідь дорівнює половині максимального.

Визначення та валідація мішені

Один з найбільш ранніх і найважливіших етапів драг-дизайну - вибрати правильну мету, впливаючи на яку можна специфічним чином регулювати одні біохімічні процеси, по можливості не торкаючись при цьому інших. Однак, як уже було сказано, таке не завжди можливе: далеко не всі захворювання є наслідком дисфункції лише одного гена або білка.

З настанням постгеномної ери визначення мішеней відбувається з використанням методів порівняльної та функціональної геноміки. На підставі філогенетичного аналізу в геномі людини виявляються гени, споріднені з генами, функції чиїх білкових продуктів вже відомі, і ці гени можуть бути клоновані для подальшого дослідження.

Однак мішені, чиї функції визначені лише гіпотетично, не можуть бути відправною точкою для подальших досліджень. Необхідна багатоступінчаста експериментальна валідація, в результаті якої може бути зрозуміла конкретна біологічна функція мішені стосовно фенотипічних проявів досліджуваної хвороби.

Існує кілька методів експериментальної валідації мішеней:

  • геномні методи полягають у придушенні синтезу мішені в тестовій системі шляхом отримання мутантів з генним нокаутом (у яких ген мішені просто відсутній) або використання РНК-антисмислових послідовностей, що «вимикають» той чи інший ген;
  • мішені можна інактивувати за допомогою моноклональних антитіл або опромінюючи мішень, модифіковану хромофором, лазерним випромінюванням;
  • мішені можна інактивувати за допомогою низькомолекулярних лігандів-інгібіторів;
  • також можна безпосередньо проводити валідацію мішені, встановлюючи її взаємодію з тією чи іншою сполукою методом плазмонного резонансу.

Рівень валідації мішені підвищується з числом модельних тварин (спеціальних генетичних ліній лабораторних тварин), де модифікація мішені призводить до бажаного фенотипному прояву. Вищим рівнем валідації є, безперечно, демонстрація того, що модифікація мішені (наприклад, блокування або нокаут рецептора або інгібування ферменту) призводить до клінічно ідентифікованих та відтворюваних симптомів у людини, однак, зрозуміло, таке можна спостерігати досить рідко.

Крім того, при виборі мішені не слід забувати про таке явище, як поліморфізм, тобто про те, що ген може існувати в різних ізоформах у різних популяцій або рас людей, що призведе до різного ефекту ліків на різних хворих.

Коли мета вже знайдено і перевірено на валідність, починаються безпосередні дослідження, результатом яких є численні структури хімічних сполук, лише з яких судилося стати лекарствами.

Дослідження всіх можливих з хімічної точки зору лігандів («хімічний простір») неможливе: проста прикидка показує, що можливо не менше 10 40 різних лігандів, тоді як з моменту виникнення всесвіту пройшло лише 10 17 секунд. Тому на можливу структуру лігандів накладається низка обмежень, які суттєво звужують хімічний простір (залишаючи його, проте, абсолютно неосяжним). Зокрема, для звуження хімічного простору накладаються умови подібності до ліків ( drug-likeness), які у простому випадку можна висловити правилом п'яти Липинського, згідно з яким з'єднання, щоб «бути схожим» на ліки, має:

  • мати менше п'яти атомів-донорів водневого зв'язку;
  • мати молекулярну вагу менше 500;
  • мати ліпофільність (log P – коефіцієнт розподілу речовини на межі розділу вода-октанол) менше 5;
  • мати сумарно трохи більше 10 атомів азоту і кисню (груба оцінка кількості акцепторів водневого зв'язку).

В якості стартового набору лігандів, що досліджуються на здатність зв'язуватися з мішенню, зазвичай використовують так звані бібліотеки з'єднань, що поставляються на комерційній основі спеціалізуються на цьому компаніями, або фармацевтичної компанії, що містяться в арсеналі, що проводить розробку нових ліків або замовила його у сторонньої фірми. Такі бібліотеки містять тисячі та мільйони з'єднань. Цього, звичайно, зовсім недостатньо для тестування всіх можливих варіантів, але цього, як правило, не потрібно. Завданням цьому етапі дослідження є виявлення сполук, здатних після подальшої модифікації, оптимізації і тестування дати «кандидат» - з'єднання, призначене для тестування на тварин (доклінічні дослідження) і людях (клінічні дослідження).

Цей етап здійснюється за допомогою високопродуктивного скринінгу ( in vitro) або його комп'ютерного ( in silico) аналізу - високопродуктивного докінгу.

Комбінаторна хімія та високопродуктивний скринінг

Скринінгом називається оптимізована конвеєризована процедура, в результаті якої велика кількість хімічних сполук (>10 000) перевіряється на афінність або активність по відношенню до спеціальної тестової системи, що імітує біологічну. За продуктивністю розрізняють різні види скринінгу:

  • низькопродуктивний (10000-50000 зразків);
  • середньопродуктивний (50000-100000 зразків);
  • високопродуктивний (100000-5000000 + зразків).

Для скринінгу як для «промислової» процедури дуже критична ефективність, вартість та час, витрачений на операцію. Як правило, скринінг проводиться на роботизованих установках, здатних працювати в цілодобовому та цілорічному режимі (рис. 4).

Малюнок 4. Апаратура, що використовується для високопродуктивного скринінгу. А - Роботизована піпетка, що в автоматичному високопродуктивному режимі наносить зразки тестованих з'єднань у плашку із системою для скринінгу. Типова кількість заглиблень на плашці – тисячі. Об'єм системи в одній лунці – мікролітри. Обсяг зразка, що вноситься - нанолітри. Б - Установка для високопродуктивного скринінгу та зчитування флуоресцентного сигналу Mark II Scarina. Працює з плашками, що містять 2048 заглиблень (NanoCarrier). Повністю автоматична (працює у цілодобовому режимі). Продуктивність – понад 100 000 лунок (зразків) на день.

Принцип скринінгу досить простий: у плашки, що містять тестову систему (наприклад, іммобілізована мішень або спеціальним чином модифіковані цілі клітини), робот розкопує з піпетки досліджувані речовини (або суміш речовин), дотримуючись заданої програми. Причому на одному плашку можуть знаходитися тисячі «лунок» з тестовою системою, і обсяг такої лунки може бути дуже малий, так само як і обсяг проби, що вноситься (мікро- або навіть нанолітри).

Потім відбувається зчитування даних з плашки, що говорить про те, в якій лунці виявлено біологічну активність, а в якій - ні. Залежно від використовуваної технології, детектор може зчитувати радіоактивний сигнал, флюоресценцію (якщо система побудована з використанням флуоресцентних білків), біолюмінесценцію (якщо використовується люциферин-люциферазна система або її аналоги), поляризацію випромінювання та багато інших параметрів.

Зазвичай в результаті скринінгу кількість сполук, що тестуються, скорочується на 3–4 порядки. Сполуки, котрим у процесі скринінгу виявлено активність вище заданого значення, називаються прототипами. Проте слід розуміти, що такі «удачі» ще дуже далекі від кінцевих ліків. Лише ті з них, які зберігають свою активність у модельних системах та задовольняють цілу низку критеріїв, дають попередників ліків, які використовуються для подальших досліджень.

Як уже було сказано, навіть бібліотеки, що містять більше мільйона сполук, не в змозі уявити весь можливий хімічний простір лігандів. Тому при проведенні скринінгу можна вибрати дві різні стратегії: диверсифікаційний скринінг та сфокусований скринінг. Відмінність між ними полягає у складі використовуваних бібліотек сполук: у диверсифікаційному варіанті використовують якомога несхожі одна на одну ліганди з метою охопити якомога більшу область хімічного простору, при сфокусованому ж, навпаки, використовують бібліотеки споріднених сполук, отриманих методами комбінаторної хімії, що дозволяє знаючи приблизну структуру ліганду, вибрати оптимальний його варіант. Здоровий глузд підказує, що в масштабному проекті створення нового лікарського препарату слід використовувати обидва ці підходи послідовно - спочатку диверсифікаційний, з метою визначення максимально різних класів вдалих сполук, а потім - сфокусований, з метою оптимізації структури цих сполук і отримання робочих прототипів.

Якщо для мішені відомий так званий біологічний простір, тобто якісь характеристики лігандів (розмір, гідрофобність тощо), які можуть з нею зв'язуватися, то при складанні бібліотеки сполук, що тестуються, вибирають ліганди, що потрапляють у «перетин» біологічного та хімічного. просторів, оскільки це свідомо підвищує ефективність процедури.

Структури прототипів, отримані в результаті скринінгу, далі піддаються різноманітним оптимізаціям, що проводяться в сучасних дослідженнях, як правило, у тісній співпраці між різними групами дослідників: молекулярними біологами, фармакологами, моделістами та медичними хіміками (рис. 5).

Малюнок 5. Фармакологічний цикл.Група молекулярної біології відповідає за отримання мутантних мішеней, група фармакології - за вимірювання даних по активності та афінності синтезованих лігандів на мішенях дикого типу та мутантних, група моделювання - за побудову моделей мішеней, передбачення їх мутацій та передбачення структур лігандів, група медичної лігандів.

З кожним оборотом такого «фармакологічного циклу» прототип наближається до попередника і потім до кандидата, який вже тестується безпосередньо на тваринах (доклінічні випробування) та на людях – у процесі клінічних випробувань.

Таким чином, роль скринінгу полягає у суттєвому скороченні (на кілька порядків) вибірки прототипів (рис. 6).

Рисунок 6. Роль високопродуктивного скринінгу у створенні нового лікарського препарату.Скринінг, будь то його лабораторний ( in vitro) або комп'ютерний ( in silico) варіант, - головна та найбільш ресурсомістка процедура щодо вибору стартових структур ліків (прототипів) з бібліотек доступних сполук. Вихідні дані скринінгу часто є відправною точкою для подальшого процесу розробки ліків.

Клінічні дослідження

Медицина - це область, в якій не слід поспішати. Особливо якщо йдеться про розробку нових лікарських препаратів. Досить згадати історію з препаратом Талідамідом, розробленим наприкінці 50-х у Німеччині, застосування якого вагітними жінками призводило до народження дітей із вродженими вадами кінцівок, аж до їхньої повної відсутності. Цей побічний ефект не був вчасно виявлений під час клінічних досліджень через недостатньо ретельного та акуратного тестування.

Тому в даний час процедура тестування ліків досить складна, дорога і потребує значного часу (2–7 років тестування в клініці та від 100 мільйонів доларів на одну сполуку-кандидат). див.Рис. 7).

Рисунок 7. Процес розробки нових ліків займає від 5 до 16 років.Витрати на клінічне тестування одного з'єднання-кандидата становлять понад 100 мільйонів доларів США. Сумарна вартість розробки з урахуванням препаратів, що не досягли ринку, часто перевищує 1 мільярд доларів.

Насамперед, ще до вступу до клініки, препарати досліджуються на токсичність та канцерогенність, причому дослідження мають проводитися, крім систем in vitroяк мінімум на двох видах лабораторних тварин. Токсичні препарати, само собою, в клініку не потрапляють, за винятком тих випадків, коли вони призначені для терапії особливо тяжких захворювань і поки що не мають менш токсичних аналогів.

Крім того, препарати піддаються фармакокінетичним дослідженням, тобто тестуються на такі фізіологічні та біохімічні характеристики, як поглинання, розподіл, метаболізм та виведення (англійською мовою позначається абревіатурою ADME - Absorption, Distribution, Metabolism and Extraction). Біодоступність, наприклад, є підхарактеристикою введення препарату в організм, що характеризує ступінь втрати біологічних властивостей при введенні в організм. Так, інсулін, який приймається перорально (через рот), має низьку біодоступність, оскільки, будучи білком, розщеплюється шлунковими ферментами. Тому інсулін вводять або підшкірно або внутрішньом'язово. З цієї причини часто розробляють препарати, що діють аналогічно своїм природним прототипам, але мають небілкову природу.

Юридично процес клінічних досліджень нових препаратів має дуже багато нюансів, оскільки вони вимагають величезної кількості супровідної документації (у сумі кілька тисяч сторінок), дозволів, сертифікацій тощо. Крім того, багато формальних процедур сильно відрізняються в різних країнах через різне законодавство. Тому для вирішення цих численних питань існують спеціальні компанії, які приймають від великих фармацевтичних компаній замовлення на проведення клінічних випробувань і перенаправляють їх у конкретні клініки, супроводжуючи весь процес повною документацією і стежачи, щоб ніякі формальності не були порушені.

Роль обчислювальної техніки у драг-дизайні

В даний час у драг-дизайні, як і в більшості інших наукомістких областей, продовжує збільшуватися роль обчислювальної техніки. Слід одразу зазначити, що сучасний рівень розвитку комп'ютерних методик не дозволяє розробити новий лікарський препарат, використовуючи лише комп'ютери. Основні переваги, які дають обчислювальні методи в даному випадку – це скорочення часу випуску нових ліків на ринок та зниження вартості розробки.

Основні комп'ютерні методи, що використовуються в драг-дизайні, це:

  • молекулярне моделювання (ММ);
  • віртуальний скринінг;
  • дизайн нових лікарських препаратів de novo;
  • оцінка властивостей «подібності до ліків»;
  • моделювання зв'язування ліганд-мішень.

Методи ММ, що ґрунтуються на структурі ліганду

У випадку, якщо нічого не відомо про тривимірну структуру мішені (що трапляється досить часто), вдаються до методик створення нових сполук, виходячи з інформації про структуру вже відомих лігандів та даних щодо їх активності.

Підхід ґрунтується на загальноприйнятій у хімії та біології парадигмі, що свідчить, що структура визначає властивості. Грунтуючись на аналізі кореляцій між структурою відомих сполук та їх властивостями, можна передбачити структуру нової сполуки, яка має бажані властивості (або ж, навпаки, для відомої структури передбачити властивості). Причому цей підхід використовується як при модифікації відомих структур з метою покращення їх властивостей, так і при пошуку нових з'єднань використовуючи скринінг бібліотек з'єднань.

Методи визначення схожості молекул (або методи відбитків пальців) полягають у дискретному обліку певних властивостей молекули, які називаються дескрипторами (наприклад, кількість донорів водневого зв'язку, кількість бензольних кілець, наявність певного заступника в певному положенні тощо) та порівнювання «відбитка», що вийшов. з відбитком молекули з відомими властивостями (що використовується як зразок). Ступінь схожості виражається коефіцієнтом Танімото, що змінюється в діапазоні 0-1. Висока схожість передбачає близькість властивостей порівнюваних молекул і навпаки.

Методи, що ґрунтуються на відомих координатах атомів ліганду, називаються методами кількісного зв'язку між структурою та активністю ( QSAR, Quantitative Structure-Activity Relationship). Один із найбільш використовуваних методів цієї групи - метод порівняльного аналізу молекулярних полів. CoMFA, Comparative Molecular Field Analysis). Цей метод полягає у наближенні тривимірної структури ліганду набором молекулярних полів, що окремо характеризують його стеричні, електростатичні, донорно-акцепторні та інші властивості. CoMFA модель будується на підставі множинного регресійного аналізу лігандів з відомою активністю і описує ліганд, який повинен добре зв'язуватися з мішенню, що досліджується, в термінах молекулярних полів. Отриманий набір полів говорить, де у ліганда може бути об'ємний заступник, а якому - маленький, у якому полярний, а якому - немає, у якому донор водневого зв'язку, а якому - акцептор, тощо.

Модель може використовуватись у завданнях віртуального скринінгу бібліотек з'єднань, виступаючи в даному випадку аналогом фармакофора. Найголовнішим недоліком цього є те, що він має високої передбачувальної силою лише з близьких класах сполук; при спробі ж передбачити активність сполуки іншої хімічної природи, ніж ліганди, що використовуються для побудови моделі, результат може виявитися недостатньо достовірним.

Схема можливого процесу створення нових ліків, що ґрунтується на структурі ліганду, наведено на малюнку 8.

Рисунок 8. Приклад молекулярного моделювання, що ґрунтується на структурі ліганду.Для циклічного пептиду уротензину II ( внизу зліва) визначено тривимірну структуру методом ЯМР спектроскопії водного розчину ( вгорі зліва). Просторове взаєморозташування амінокислотних залишків мотиву ТРП-ЛІЗ-ТІР, що є важливим для біологічної функції, було використане для побудови моделі фармакофора ( зверху праворуч). В результаті віртуального скринінгу знайдено нову сполуку, що демонструє біологічну активність ( внизу праворуч).

Очевидно, що достовірність моделювання, як і ефективність процесу конструювання нових ліків, можна істотно підвищити, якщо враховувати дані не тільки про структуру лігандів, але і про структуру білка-мішені. Методи, що враховують ці дані, звуться «драг-дизайн, що ґрунтується на структурній інформації» ( SBDD, Structure-Based Drug Design).

Методи ММ, що ґрунтуються на структурі білка

У зв'язку з зростаючим потенціалом структурної біології все частіше можна встановити експериментальну тривимірну структуру мішені, або побудувати її молекулярну модель, ґрунтуючись на гомології з білком, чия тривимірна структура вже визначена.

Найчастіше використовувані методи визначення тривимірної структури біомакромолекул з високою роздільною здатністю (Часто, коли експериментальна структура мішені все ж таки недоступна, вдаються до моделювання на підставі гомології - методу, для якого показано, що побудована ним модель має досить високу якість, якщо гомологія між структурним шаблоном і моделюється білком не нижче 40%.

Особливо часто до моделювання по гомології вдаються при розробці ліків, спрямованих на G-білок сполучені рецептори, оскільки вони, будучи мембранними білками, дуже погано кристалізуються, а методу ЯМР поки недоступні такі великі білки. Для цього сімейства рецепторів відома структура тільки одного білка - бичачого родопсину, отримана в 2000 р. в Стенфорді, яка і використовується як структурний шаблон у переважній кількості досліджень.

Зазвичай при дослідженні, що базується на структурних даних, враховують дані по мутагенезу мішені, щоб встановити, які амінокислотні залишки найбільш важливі для функціонування білка і зв'язування лігандів. Ці відомості особливо цінні при оптимізації побудованої моделі, яка, будучи лише похідною від структури білка-шаблону, не може враховувати всієї біологічної специфіки об'єкта, що моделюється.

Тривимірна структура мішені, крім того, що може пояснити молекулярний механізм взаємодії ліганду з білком, використовується в задачах молекулярного докінгу, або комп'ютерне моделювання взаємодії ліганду з білком. Докінг використовує як стартову інформацію тривимірну структуру білка (на даному етапі розвитку технології, як правило, конформаційно нерухому), і структуру ліганду, конформаційна рухливість та взаєморозташування з рецептором якого моделюється в процесі докінгу. Результатом докінгу є конформація ліганду, що найкраще взаємодіє з білковим сайтом зв'язування, з погляду оцінної функції докінгу, що наближає вільну енергію зв'язування ліганду. Реально, через безліч наближень, оцінна функція далеко не завжди корелює з відповідною експериментальною енергією зв'язування.

Докінг дозволяє скоротити витрати коштів та часу за рахунок проведення процедури, аналогічної до високопродуктивного скринінгу, на комп'ютерних комплексах. Ця процедура називається віртуальним скринінгом, і основною її перевагою є те, що для реальних фармакологічних випробувань потрібно набувати не цілу бібліотеку, що складається з мільйона сполук, а лише «віртуальні прототипи». Зазвичай, з метою уникнення помилок, скринінг та докінг використовуються одночасно, взаємно доповнюючи один одного (рис. 9).

Малюнок 9. Два варіанти спільного використання високопродуктивного скринінгу та молекулярного моделювання. Зверху:послідовний ітеративний скринінг. На кожному етапі процедури використовується порівняно невеликий набір лігандів; за результатами скринінгу будується модель, що пояснює зв'язок між структурою та активністю. Модель використовується для вибору наступного набору для тестування лігандів. Знизу:"разовий" скринінг. На кожному кроці модель будується за навчальною вибіркою та використовується для передбачень на тестовій вибірці.

Зі збільшенням комп'ютерних потужностей та появою більш коректних та фізичних алгоритмів, докінг краще оцінюватиме енергію зв'язування білка з лігандом, почне враховувати рухливість білкових ланцюгів та вплив розчинника. Однак, невідомо, чи зможе віртуальний скринінг будь-коли повністюзамінити реальний біохімічний експеримент; якщо так - то для цього необхідний, очевидно, якісно новий рівень алгоритмів, нездатних на сьогоднішній день абсолютно коректно описати взаємодію ліганду з білком.

Одне з явищ, що ілюструють недосконалість алгоритмів докінгу - парадокс схожості. Цей феномен полягає в тому, що сполуки, що структурно зовсім небагато розрізняються, можуть мати драматично різну активність, і в той же час з точки зору алгоритмів докінгу бути практично невиразними.

Прототипи ліків можна отримувати не тільки вибираючи з підготовленої бази даних сполук. Якщо є структура мішені (або хоча б тривимірна модель фармакофора), можлива побудова лігандів de novo, використовуючи загальні принципи міжмолекулярної взаємодії. При цьому підході до сайту зв'язування ліганду міститься один або кілька базових молекулярних фрагментів, і ліганд послідовно «нарощується» у сайті зв'язування, оптимізуючи на кожному кроці алгоритму. Отримані структури, як і, при докинге, оцінюються з допомогою емпіричних оцінних функцій.

Обмеження застосування комп'ютерних методів

Незважаючи на всю свою перспективність, комп'ютерні методи мають ряд обмежень, які необхідно мати на увазі, щоб правильно уявляти можливості цих методів.

Насамперед, хоча ідеологія in silicoпередбачає проведення повноцінних комп'ютерних експериментів, тобто експериментів, результати яких цінні і достовірні власними силами, необхідна обов'язкова експериментальна перевірка отриманих результатів. Тобто мається на увазі тісне співробітництво наукових груп, які проводять комп'ютерний експеримент, з іншими експериментальними групами (рис. 5).

Крім того, комп'ютерні методи поки не в змозі врахувати всієї різноманітності впливу лікарського препарату на організм людини, тому ці методи не в змозі ні скасувати, ні навіть суттєво скоротити клінічне тестування, що займає основну частку часу у розробці нового препарату.

Таким чином, на сьогоднішній день роль комп'ютерних методів у драг-дизайні зводиться до прискорення та здешевлення досліджень, що передують клінічним випробуванням.

Перспектива драг-дизайну