Головна · Діарея · І оптимізація методів біохімічної та молекулярно-генетичної діагностики спадкових хвороб обміну речовин захарова Катерина Юріївна. Лабораторія спадкових хвороб обміну речовин Загальні принципи лабораторної діагностики спадкових хвороб

І оптимізація методів біохімічної та молекулярно-генетичної діагностики спадкових хвороб обміну речовин захарова Катерина Юріївна. Лабораторія спадкових хвороб обміну речовин Загальні принципи лабораторної діагностики спадкових хвороб

Керівник напрямку
„Онкогенетика“

Жусіна
Юлія Геннадіївна

Закінчила педіатричний факультет Воронезького державного медичного університету ім. Н.М. Бурденко у 2014 році.

2015 – інтернатура з терапії на базі кафедри факультетської терапії ВДМУ ім. Н.М. Бурденко.

2015 – сертифікаційний курс за спеціальністю «Гематологія» на базі Гематологічного наукового центру м. Москви.

2015-2016 – лікар терапевт ВДКБШМД №1.

2016 – затверджено тему дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук «вивчення клінічного перебігу захворювання та прогнозу у хворих на хронічну обструктивну хворобу легень з анемічним синдромом». Співавтор понад 10 друкованих праць. Учасник науково-практичних конференцій з генетики та онкології.

2017 - курс підвищення кваліфікації на тему: «інтерпретація результатів генетичних досліджень у хворих зі спадковими захворюваннями».

З 2017 року ординатура за спеціальністю «Генетика» на базі РМАНПО.

Керівник напрямку
„Генетика“

Канівець
Ілля В'ячеславович

Канівець Ілля В'ячеславович, лікар-генетик, кандидат медичних наук, керівник відділу генетики медико-генетичного центру Геномед. Асистент кафедри медичної генетики Російської медичної академії безперервної професійної освіти.

Закінчив лікувальний факультет Московського державного медико-стоматологічного університету у 2009 році, а у 2011 – ординатуру за спеціальністю «Генетика» на кафедрі Медичної генетики того ж університету. У 2017 році захистив дисертацію на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук на тему: Молекулярна діагностика варіацій кількості копій ділянок ДНК (CNVs) у дітей з вродженими вадами розвитку, аномаліями фенотипу та/або розумовою відсталістю при використанні SNP олігонуклеотидних мікроматриц високої

З 2011-2017 працював лікарем-генетиком у Дитячій клінічній лікарні ім. Н.Ф. Філатова, науково-консультативний відділ ФДБНУ «Медико-генетичний науковий центр». З 2014 року до цього часу керує відділом генетики МГЦ Геномед.

Основні напрямки діяльності: діагностика та ведення пацієнтів зі спадковими захворюваннями та вродженими вадами розвитку, епілепсією, медико-генетичне консультування сімей, у яких народилася дитина зі спадковою патологією чи вадами розвитку, пренатальна діагностика. У процесі консультації проводиться аналіз клінічних даних та генеалогії для визначення клінічної гіпотези та необхідного обсягу генетичного тестування. За результатами обстеження проводиться інтерпретація даних та роз'яснення отриманої інформації консультуючим.

Є одним із засновників проекту «Школа Генетики». Регулярно виступає із доповідями на конференціях. Читає лекції для лікарів генетиків, неврологів та акушерів-гінекологів, а також для батьків пацієнтів із спадковими захворюваннями. Є автором та співавтором понад 20 статей та оглядів у російських та зарубіжних журналах.

Область професійних інтересів – впровадження сучасних повногеномних досліджень у клінічну практику, інтерпретація їх результатів.

Час прийому: СР, ПТ 16-19

Керівник напрямку
„Неврологія“

Шарков
Артем Олексійович

Шарков Артем Олексійович– лікар-невролог, епілептолог

У 2012 році навчався за міжнародною програмою “Oriental medicine” в університеті Daegu Haanu у Південній Кореї.

З 2012 року – участь в організації бази даних та алгоритму для інтерпретації генетичних тестів xGenCloud (https://www.xgencloud.com/, Керівник проекту – Ігор Угаров)

2013 року закінчив Педіатричний факультет Російського національного дослідницького медичного університету імені М.І. Пирогова.

З 2013 по 2015 рік навчався у клінічній ординатурі з неврології у ФДБНУ «Науковий центр неврології».

З 2015 року працює неврологом, науковим співробітником у Науково-дослідному клінічному інституті педіатрії імені академіка Ю.Є. Вельтищева ДБОУ ВПО РНИМУ ім. Н.І. Пирогова. Також працює лікарем-неврологом та лікарем лабораторії відео-ЕЕГ моніторингу в клініках «Центр епілептології та неврології ім. А.А.Казаряна» та «Епілепсі-центр».

У 2015 році пройшов навчання в Італії на школі "2nd International Residential Course on Drug Resistant Epilepsies, ILAE, 2015".

У 2015 році підвищення кваліфікації – «Клінічна та молекулярна генетика для практикуючих лікарів», РДКБ, РОСНАНО.

У 2016 році підвищення кваліфікації – «Основи молекулярної генетики» під керівництвом біоінформатика, к.б.н. Коновалова Ф.А.

З 2016 року – керівник неврологічного напряму лабораторії "Геномед".

У 2016 році пройшов навчання в Італії на школі "San Servolo International Advanced course: Brain Exploration and Epilepsy Surger, ILAE, 2016".

У 2016 році підвищення кваліфікації – "Інноваційні генетичні технології для лікарів", "Інститут лабораторної медицини".

У 2017 році – школа «NGS у медичній генетиці 2017», МГНЦ

Нині проводить наукові дослідження у галузі генетики епілепсії під керівництвом професора, д.м.н. Білоусової О.Д. та професора, д.м.н. Дали Є.Л.

Затверджено тему дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук "Клініко-генетичні характеристики моногенних варіантів ранніх епілептичних енцефалопатій".

Основні напрямки діяльності – діагностика та лікування епілепсії у дітей та дорослих. Вузька спеціалізація – хірургічне лікування епілепсії, генетика епілепсії. Нейрогенетика.

Наукові публікації

Шарков А., Шаркова І., Головтеєв А., Угаров І. "Оптимізація диференціальної діагностики та інтерпретації результатів генетичного тестування експертною системою XGenCloud при деяких формах епілепсій". Медична генетика, №4, 2015, с. 41.
*
Шарков А.А., Воробйов А.М., Троїцький А.А., Савкіна І.С., Дорофєєва М.Ю., Мелікян А.Г., Головтєєв А.Л. Хірургія епілепсії при багатоосередковому ураженні головного мозку у дітей з туберозним склерозом. Тези XIV Російського Конгресу «ІННОВАЦІЙНІ ТЕХНОЛОГІЇ У ПЕДІАТРІЇ І ДИТЯЧІЙ ХІРУРГІЇ». Російський Вісник Перинатології та Педіатрії, 4, 2015. – с.226-227.
*
Дадали Є.Л., Білоусова О.Д., Шарков А.А. "Молекулярно-генетичні підходи до діагностики моногенних ідіопатичних та симптоматичних епілепсій". Теза XIV Російського Конгресу «ІННОВАЦІЙНІ ТЕХНОЛОГІЇ У ПЕДІАТРІЇ І ДИТЯЧІЙ ХІРУРГІЇ». Російський Вісник Перинатології та Педіатрії, 4, 2015. – с.221.
*
Шарков А.А., Дадалі Є.Л., Шаркова І.В. «Рідкісний варіант ранньої епілептичної енцефалопатії 2 типу, обумовленої мутаціями в гені CDKL5 у хворої чоловічої статі». Конференція "Епілептологія в системі нейронаук". Збірник матеріалів конференції: / За редакцією: проф. Незнанова Н.Г., проф. Михайлова В.А. СПб.: 2015. - с. 210-212.
*
Дадали Є.Л., Шарков А.А., Канівець І.В., Гундорова П., Фоміних В.В., Шаркова І,В,. Троїцький А.А., Головтєєв А.Л., Поляков А.В. Новий алельний варіант міоклонус-епілепсії 3 типу, обумовлений мутаціями в гені KCTD7// Медична генетика.-2015.- т.14.-№9.- с.
*
Дадали Є.Л., Шаркова І.В., Шарков А.А., Акімова І.А. «Клініко-генетичні особливості та сучасні способи діагностики спадкових епілепсій». Збірник матеріалів «Молекулярно-біологічні технології у медичній практиці» / За ред. чл.-кор. РАЄН А.Б. Масленнікова.- Вип. 24.- Новосибірськ: Академіздат, 2016.- 262: с. 52-63
*
Білоусова Є.Д., Дорофєєва М.Ю., Шарков А.А. Епілепсія при туберозному склерозі. У "Хвороби мозку, медичні та соціальні аспекти" за редакцією Гусєва Є.І., Гехт А.Б., Москва; 2016; стор.391-399
*
Дадали Є.Л., Шарков А.А., Шаркова І.В., Канівець І.В., Коновалов Ф.А., Акімова І.А. Спадкові захворювання та синдроми, що супроводжуються фебрильними судомами: клініко-генетичні характеристики та способи діагностики. //Російський Журнал Дитячої Неврології.- Т. 11.- №2, с. 33-41. doi: 10.17650/2073-8803-2016-11-2-33-41
*
Шарков А.А., Коновалов Ф.А., Шаркова І.В., Білоусова О.Д., Дадалі Є.Л. Молекулярно-генетичні підходи до діагностики епілептичних енцефалопатій Збірник тез «VI БАЛТІЙСЬКИЙ КОНГРЕС ПО ДИТЯЧІЙ НЕВРОЛОГІЇ» / За редакцією професора Гузєвої В.І. Санкт-Петербург, 2016, с. 391
*
Гемісферотомія при фармакорезистентній епілепсії у дітей з білатеральним ураженням головного мозку Зубкова Н.С., Алтуніна Г.Є., Землянський М.Ю., Троїцький А.А., Шарков А.А., Головтеєв А.Л. Збірник тез «VI БАЛТІЙСЬКИЙ КОНГРЕС ПО ДИТЯЧІЙ НЕВРОЛОГІЇ» / За редакцією професора Гузєвої В.І. Санкт-Петербург, 2016, с. 157.
*
*
Стаття: Генетика та диференційоване лікування ранніх епілептичних енцефалопатій. А.А. Шарков*, І.В. Шаркова, О.Д. Білоусова, Є.Л. Дали. Журнал неврології та психіатрії, 9, 2016; Вип. 2doi: 10.17116/jnevro 20161169267-73
*
Головтєєв А.Л., Шарков А.А., Троїцький А.А., Алтуніна Г.Є., Землянський М.Ю., Копачов Д.М., Дорофєєва М.Ю. "Хірургічне лікування епілепсії при туберозному склерозі" за редакцією Дорофєєвої М.Ю., Москва; 2017; стор.274
*
Нові міжнародні класифікації епілепсій та епілептичних нападів Міжнародної Ліги боротьби з епілепсією. Журнал неврології та психіатрії ім. C.C. Корсакова. 2017. Т. 117. № 7. С. 99-106

Керівник напрямку
"Пренатальна діагностика"

Київська
Юлія Кирилівна

2011 року Закінчила Московський Державний Медико-Стоматологічний Університет ім. А.І. Євдокимова за спеціальністю «Лікувальна справа» Навчалася в ординатурі на кафедрі Медичної генетики того ж університету за спеціальністю «Генетика»

У 2015 році закінчила інтернатуру за спеціальністю Акушерство та Гінекологія у Медичному інституті удосконалення лікарів ФДБОУ ВПО «МГУВП»

З 2013 року веде консультативний прийом до ГБУЗ «Центр Планування Сім'ї та Репродукції» ДЗМ

З 2017 року є керівником напряму «Пренатальна діагностика» лабораторії Геномед

Регулярно виступає з доповідями на конференціях та семінарах. Читає лекції для лікарів різних спеціальної в галузі репродуції та пренатальної діагностики

Проводить медико-генетичне консультування вагітних з питань пренатальної діагностики з метою попередження народження дітей з вродженими вадами розвитку, а також сімей із імовірно спадковою або вродженою патологією. Проводить інтерпретацію одержаних результатів ДНК-діагностики.

ФАХІВЦІ

Латипов
Артур Шамилевич

Латипов Артур Шамилевич – лікар генетик найвищої кваліфікаційної категорії.

Після закінчення в 1976 лікувального факультету Казанського державного медичного інституту протягом багатьох працював спочатку лікарем кабінету медичної генетики, потім завідувачем медико-генетичним центром Республіканської лікарні Татарстану, головним спеціалістом міністерства охорони здоров'я Республіки Татарстан, викладачем кафедр Казанського медуніверс.

Автор понад 20 наукових праць з проблем репродукційної та біохімічної генетики, учасник багатьох вітчизняних та міжнародних з'їздів та конференцій з проблем медичної генетики. Впровадив у практичну роботу центру методи масового скринінгу вагітних та новонароджених на спадкові захворювання, провів тисячі інвазивних процедур за підозри на спадкові захворювання плода на різних термінах вагітності.

З 2012 року працює на кафедрі медичної генетики із курсом пренатальної діагностики Російської академії післядипломної освіти.

Область наукових інтересів – метаболічні хвороби у дітей, допологова діагностика.

Час прийому: СР 12-15, СБ 10-14

Прийом лікарів здійснюється за попереднім записом.

Лікар-генетик

Габелко
Денис Ігорович

2009 року закінчив лікувальний факультет КДМУ ім. С. В. Курашова (спеціальність «Лікувальна справа»).

Інтернатура в Санкт-Петербурзькій медичній академії післядипломної освіти Федерального агентства з охорони здоров'я та соціального розвитку (спеціальність "Генетика").

Інтернатура з терапії. Первинна перепідготовка за спеціальністю "Ультразвукова діагностика". З 2016 року є співробітником кафедри фундаментальних засад клінічної медицини інституту фундаментальної медицини та біології.

Сфера професійних інтересів: пренатальна діагностика, застосування сучасних скринінгових та діагностичних методів для виявлення генетичної патології плода. Визначення ризику повторного виникнення спадкових хвороб у ній.

Учасник науково-практичних конференцій з генетики та акушерства та гінекології.

Стаж роботи: 5 років.

Консультація з попереднього запису

Прийом лікарів здійснюється за попереднім записом.

Лікар-генетик

Гришина
Христина Олександрівна

Закінчила 2015 року Московський Державний Медико-Стоматологічний Університет за спеціальністю «Лікувальна справа». У тому ж році вступила до ординатури за спеціальністю 30.08.30 «Генетика» у ФДБНУ «Медико-генетичний науковий центр».
Прийнято на роботу до лабораторії молекулярної генетики складно успадкованих захворювань (завідувач – д.б.н. Карпухін А.В.) у березні 2015 року на посаду лаборанта-дослідника. З вересня 2015 року переведено на посаду наукового співробітника. Є автором і співавтором більше 10 статей і тез клінічної генетики, онкогенетики та молекулярної онкології в російських і зарубіжних журналах. Постійний учасник конференцій з медичної генетики.

Область науково-практичних інтересів: медико-генетичне консультування хворих із спадковою синдромальною та мультифакторіальною патологією.


Консультація лікаря-генетика дозволяє відповісти на запитання:

чи є симптоми у дитини ознаками спадкового захворювання яке дослідження необхідне виявлення причини визначення точного прогнозу рекомендації щодо проведення та оцінка результатів пренатальної діагностики все, що потрібно знати під час планування сім'ї консультація під час планування ЕКЗ виїзні та онлайн консультації

брала участь у науково-практичній школі "Інноваційні генетичні технології для лікарів: застосування в клінічній практиці", конференції Європейського товариства генетики людини (ESHG) та інших конференціях, присвячених генетиці людини.

Проводить медико-генетичне консультування сімей з ймовірно спадковою або вродженою патологією, включаючи моногенні захворювання та хромосомні аномалії, визначає показання до проведення лабораторних генетичних досліджень, проводить інтерпретацію отриманих результатів ДНК-діагностики. Консультує вагітних з питань пренатальної діагностики з метою попередження народження дітей із вродженими вадами розвитку.

Лікар-генетик, лікар акушер-гінеколог, кандидат медичних наук

Кудрявцева
Олена Володимирівна

Лікар-генетик, лікар-акушер-гінеколог, кандидат медичних наук.

Фахівець у галузі репродуктивного консультування та спадкової патології.

Закінчила Уральську державну медичну академію у 2005 році.

Ординатура за спеціальністю «Акушерство та гінекологія»

Інтернатура за спеціальністю «Генетика»

Професійна перепідготовка за спеціальністю "Ультразвукова діагностика"

Напрямки діяльності:

  • Безпліддя та невиношування вагітності
    • Василиса Юріївна

    Є випускницею Нижегородської державної медичної академії, лікувального факультету (спеціальність «Лікувальна справа»). Закінчила клінічну ординатуру ФБДНУ «МГНЦ» за спеціальністю «Генетика». У 2014 році проходило стажування у клініці материнства та дитинства (IRCCS materno infantile Burlo Garofolo, Trieste, Italy).

    З 2016 року працює на посаді лікаря-консультанта у ТОВ «Геномед».

    Регулярно бере участь у науково-практичних конференціях з генетики.

    Основні напрямки діяльності: Консультування з питань клінічної та лабораторної діагностики генетичних захворювань та інтерпретація результатів. Ведення пацієнтів та їх сімей із ймовірно спадковою патологією. Консультування при плануванні вагітності, а також при вагітності з питань пренатальної діагностики з метою попередження народження дітей з вродженою патологією.

Загальні засади лабораторної діагностики спадкових хвороб обміну речовин

На клінічному рівні діагноз НБО може лише запідозрений, і подальша діагностика цілком залежить від застосування надзвичайно широкого спектра біохімічних і молекулярно-генетичних методів. Найчастіше лише поєднана інтерпретація всіх отриманих результатів дає можливість точно визначити форму захворювання.

Стратегія достовірної діагностики НБО включає кілька етапів: 1. Виявлення дефектної ланки метаболічного шляху за допомогою аналізу (кількісного, напівкількісного чи якісного) відповідних метаболітів; 2. Виявлення дисфункції білка за допомогою оцінки його кількості та/або активності; 3. З'ясування природи мутації, тобто. характеристика мутантного алелю лише на рівні гена.

Така стратегія використовується не тільки для вирішення наукових проблем щодо вивчення нормального метаболізму, молекулярних механізмів патогенезу НБО, виявлення гено-фенотипічних кореляцій, вона необхідна насамперед для практичної діагностики НБО. Верифікувати діагноз на рівні білка та мутантного гена необхідно як для проведення пренатальної діагностики, медико-генетичного консультування обтяжених сімей, так і у ряді випадків для призначення адекватної терапії. Наприклад, при недостатності дигідроптеридинредуктази клінічний фенотип та рівні фенілаланіну будуть не відрізняються від класичної форми ФКУ, але підходи до терапії цих захворювань принципово відрізняються. Важливість локусної диференціації НБО для медико-генетичного консультування може бути продемонстрована з прикладу мукополісахаридозу II типу (хвороба Хантера). За спектром екскретованих глікозаміногліканів неможливо диференціювати між собою мукополісахаридози II, I і VII типів, але з цих захворювань тільки хвороба Хантера успадковується за Х-зчепленим рецесивним типом, що має принципове значення для прогнозу потомства в обтяженій сім'ї. Безумовна пріоритетність молекулярно-генетичних методів при встановленні гетерозиготного носійства, а також пренатальної діагностики захворювань, при яких мутантний фермент не експресується в клітинах ворсин хоріону.

Етап дослідження метаболітів

Оцінка метаболітів у біологічних рідинах – необхідний етап діагностики аміноацидопатій, органічних ацидурій, мукополісахаридозів, мітохондріальних та пероксисомних хвороб, дефектів метаболізму пуринів та піримідинів тощо. Хроматографічні методи аналізу відіграють найважливішу роль діагностиці НБО. Це зумовлено тим, що сучасний арсенал хроматографічних технологій є надзвичайно широким і дозволяє ефективно та інформативно розділяти складні багатокомпонентні суміші, до яких у тому числі відноситься і біологічний матеріал. Для селективного скринінгу НБО успішно використовується тонкошарова хроматографія, що дозволяє отримувати інформацію на якісному рівні. Цей метод хроматографії застосовується для поділу амінокислот, пуринів та піримідинів, вуглеводів, олігосахаридів. Для кількісного аналізу маркерів-метаболітів НБО успішно застосовуються такі хроматографічні методи як газова та високоефективна рідинна хроматографії, а також хроматомас-спектрометрія (ГХ, ВЕРХ та ХМС відповідно). ГХ та ВЕРХ є універсальними методами поділу складних сумішей сполук, що відрізняються високою чутливістю та відтворюваністю. В обох випадках поділ здійснюється в результаті різної взаємодії компонентів суміші з нерухомою та рухомою фазами хроматографічної колонки. Для ГХ рухомий фазою є газ-носій, для ВЕРХ - рідина (елюенти). Вихід кожного з'єднання фіксується детектором приладу, сигнал якого перетворюється на піки на хроматограмі. Кожен пік характеризується часом утримання та площею. Слід зазначити, що ГХ проводиться зазвичай при високотемпературному режимі, тому обмеженням для її застосування є термічна нестійкість сполук. Для ВЕРХ немає таких обмежень, т.к. у цьому випадку аналіз проводиться у м'яких умовах. ХМС є комбінованою системою ГХ чи ВЕРХ з мас-селективним детектором, що дозволяє отримувати як кількісну, а й якісну інформацію, тобто. додатково визначається структура сполук аналізованої суміші.

Одним із перспективних напрямків у розвитку програм діагностики НБО є застосування методів, що дозволяють кількісно визначати множину метаболітів, які є маркерами різних груп НБО. До таких методів належить тандемна мас-спектрометрія (ТМС). ТМС дозволяє охарактеризувати структуру, молекулярну масу та провести кількісну оцінку 3000 сполук одночасно. У цьому не потрібно тривалої підготовки проб щодо аналізу (як, наприклад, для ГХ), а час дослідження займає кілька секунд.

Етап дослідження мутантних білків

Дослідження мутантних білків може проводитись за допомогою різних методів:

  1. Визначення активності ферменту із застосуванням природних субстратів;
  2. визначення активності ферменту з використанням штучних субстратів;
  3. Навантаження культивованих фібробластів субстратами, що накопичуються;
  4. Вимірювання концентрації білка за допомогою імунохімічних методів.

Матеріалом для вимірювання активності ферментів при НБО є насамперед лейкоцити периферичної крові: практично при всіх лізосомних хворобах накопичення, метилмалонової ацидурії, деяких глікогенозах. Для діагностики GM2-гангліозидозів, недостатності біотинідази використовують плазму або сироватку крові. У деяких випадках об'єктами дослідження є м'язова або печінкова тканина: ферменти дихального ланцюга мітохондрій, глікогеноз. Також широко використовується для діагностики культура шкірних фібробластів.

Етап дослідження мутантних генів

Розвиток методів молекулярної біології стало справжньою революцією у сфері клінічної біохімії. Розробка стандартних протоколів молекулярних досліджень та автоматизація використовуваних методів є сьогодні закінченим комплексом діагностичних підходів і стають поряд із біохімічними методами рутинною процедурою у клінічних лабораторіях. Швидкий розвиток досліджень у галузі розшифрування геному людини та визначення ДНК-послідовності генів робить зараз можливим ДНК-діагностику різних спадкових захворювань. Методи ДНК-діагностики та аналізу структури нормальних генів та їх мутантних аналогів при спадкових хворобах обміну почали використовуватися протягом останнього десятиліття.

Для ДНК-діагностики спадкових захворювань використовуються два основні підходи - пряма та непряма ДНК-діагностика. Пряма ДНК-діагностика є дослідженням первинної структури пошкодженого гена і виділення мутацій, що ведуть до захворювання. Для детекції молекулярних ушкоджень у генах, що зумовлюють спадкові хвороби, використовується стандартний арсенал методів молекулярної біології. Залежно від характеристики та типів мутацій, частот їх народження при різних спадкових захворюваннях, ті чи інші методи є найкращими.

Для діагностики НБО у тих випадках, коли біохімічний дефект точно відомий, легко та достовірно визначаємо з використанням біохімічних методик, ДНК-методи навряд чи займуть пріоритетне місце. У цих випадках застосування ДНК-аналізу є скоріше науково-дослідним, а не діагностичним підходом. Однак після точно встановленого діагнозу методи ДНК-аналізу будуть корисними для подальшої пренатальної діагностики, ідентифікації гетерозиготних носіїв у сім'ї та прогнозу захворювання у гомозигот, а також для відбору хворих з метою проведення казуальної терапії в майбутньому (фермент-замісної та генотерапії). Також у випадках, коли біохімічний дефект точно не відомий, біохімічна діагностика утруднена, недостатньо достовірна або потребує інвазивних методів дослідження, методи ДНК-діагностики є єдиними та незамінними для точної постановки діагнозу.

Загалом тактика проведення діагностики НБО в кожному конкретному випадку повинна плануватися спільно з лікарем-біохіміком і лікарем-генетиком. Необхідними умовами успішної та швидкої діагностики є розуміння етіології, механізмів патогенезу захворювання, знання специфічних біохімічних маркерів.

Спадкові хвороби обміну речовин - великий клас спадкових захворювань людини, що включає понад 600 різних форм. Кількість нових форм хвороб обміну речовин і навіть класів зростає з кожним роком, експоненційно зростає кількість публікацій, пов'язаних із можливостями діагностики, профілактики та, що важливо, лікування хвороб обміну речовин. Окремі форми хвороб обміну речовин зустрічаються рідко або вкрай рідко, проте їхня сумарна частота досить висока і становить 1:3000-1:5000 живих новонароджених. Характерною властивістю цих захворювань є виражені біохімічні зміни, що виявляються на початок перших клінічних симптомів.

Згідно з біохімічною класифікацією, хвороби обміну речовин розділені на 22 групи залежно від типу пошкодженого метаболічного шляху (аміноацидопатії, порушення вуглеводного обміну тощо) або залежно від його локалізації в межах певного компонента клітини (лізосомні, пероксисомні та мітохондріальні хвороби).

Біохімічна класифікація хвороб обміну речовин має такий вигляд.
Лізосомні хвороби накопичення.
Мітохондріальні хвороби.
Пероксисомні захворювання.
Вроджені порушення глікозилювання.
Порушення обміну креатиніну.
Порушення обміну холестерину.
Порушення синтезу цитокінів та інших імуномодуляторів.
Порушення обміну амінокислот/органічних кислот.
Порушення мітохондріального b-окислення.
Порушення обміну кетонових тел.
Порушення обміну жирів та жирних кислот, ліпопротеїнів.
Порушення обміну вуглеводів та глікогену.
Порушення транспорту глюкози.
Порушення обміну гліцерину.
Порушення обміну вітамінів.
Порушення обміну металів та аніонів.
Порушення обміну жовчних кислот.
Порушення обміну нейротрансмітерів.
Порушення обміну стероїдів та інших гормонів.
Порушення обміну гема та порфіринів.
Порушення обміну пуринів/піримідинів.
Порушення обміну білірубіну.

Основні механізми патогенезу хвороб обміну речовин
НАКОПЛЕННЯ СУБСТРАТУ
Накопичення субстрату блокованої ферментної реакції є одним із основних механізмів патогенезу при переважній більшості хвороб обміну речовин.

Насамперед це стосується порушення катаболічних реакцій, таких як розщеплення великих макромолекул, амінокислот, органічних кислот тощо. буд. (Органічні кислоти при органічних ацидуріях), відбуватиметься його накопичення в різних тканинах (гомогентизиновая кислота при алкаптонурії). У ряді випадків субстрат створює конкуренцію подібним сполукам при транспорті через гематоенцефалічний бар'єр, що призводить до їх виснаження в мозку (аміноацидопатії). Якщо субстрат, що накопичується, поганорозчинний, відбувається його накопичення всередині клітини, що запускає механізми апоптотичної загибелі. Одним із додаткових наслідків накопичення субстрату може бути активація мінорних метаболічних шляхів, чия питома вага при нормальному метаболізмі незначна.

Такий механізм, наприклад, лежить в основі накопичення фенілпіро-виноградної кислоти при фенілкетонурії.

Метаболіти, що накопичуються, мають важливе діагностичне значення, у ряді випадків їх кількісний або напівкількісний аналіз дозволяє точно встановити форму захворювання. При органічних ацидуріях та аміноацидопатіях накопичення у великих кількостях водорозчинних сполук у плазмі крові та сечі дозволяє швидко провести їх кількісне чи якісне визначення за допомогою хроматографічних методів аналізу.

НЕДОСТАТНІСТЬ ПРОДУКТІВ РЕАКЦІЇ
Недостатність продуктів реакції – другий основний механізм патогенезу хвороб обміну речовин. Причиною патологічних змін може бути безпосередньо недостатність препарату блокованої реакції. Наприклад, при дефекті біотинідази порушується відщеплення біотину від дієтарних білків і клінічні прояви хвороби пов'язані з нестачею цього вітаміну.

Недостатність продуктів реакції у циклічному процесі сечовини створює чудову метаболічну ситуацію - деякі амінокислоти із замінних переходять у категорію незамінних. Так, при аргінін-бурштинової ацидурії спостерігається порушення утворення аргініну з аргінін-бурштинової кислоти, що призводить до недостатності аргініну та орнітину. У ряді випадків може виникати недостатність більш віддаленого в даному метаболічному ланцюгу продукту, наприклад альдостерону та кортизолу, при адреногенітальному синдромі,

МЕТАБОЛІЧНА ІЗОЛЯЦІЯ
В окрему групу необхідно виділити захворювання, пов'язані з метаболічною ізоляцією препарату реакції. Це основний механізм патогенезу при порушеннях білків-переносників, які є ферментами, але беруть участь у регуляції певної біохімічної реакції. Каскад метаболічних подій, який запускається при цих хворобах, має схожі для організму та клітини наслідки. Синдром гіперорнітінемія – гіперамоніємія – гомоцитрулінурія (акронім від трьох основних біохімічних маркерів – Hyperammonemia, Hyperornithinemia, Homocitrullinemia) пов'язаний з порушенням транспорту орнітину. В результаті спостерігається недостатність орнітину всередині мітохондрій, що призводить до накопичення карбамоілфосфату та амонію.

Виділити єдиний провідний механізм патогенезу практично неможливо, оскільки метаболічні процеси тісно взаємопов'язані. Як правило, спостерігається поєднання всіх описаних механізмів, і при кожному з ферментативних блоків відбуваються значні зміни у всій метаболічній мережі клітини.

Лабораторна діагностика спадкових хвороб обміну речовин
Диференціальна діагностика спадкових хвороб обміну речовин цілком залежить від застосування надзвичайно широкого спектру біохімічних, фізико-хімічних та молекулярно-генетичних методів. Найчастіше лише поєднана інтерпретація всіх отриманих результатів дає можливість точно визначити форму захворювання. Зазвичай, загальна стратегія діагностики спадкових хвороб обміну речовин включає кілька етапів.

I - виявлення дефектної ланки метаболічного шляху за допомогою аналізу (кількісного, напівкількісного чи якісного) метаболітів.
II - виявлення дисфункції білка визначенням його кількості та/або активності.
III - з'ясування природи мутації, т. е. характеристика мутантного аллеля лише на рівні гена.

Таку стратегію застосовують як вирішення проблем, що стосуються вивчення молекулярних механізмів патогенезу спадкових хвороб обміну речовин, виявлення генофенотипических кореляцій, вона необхідна насамперед для практичної діагностики спадкових хвороб обміну речовин.

Верифікувати діагноз на рівні білка та мутантного гена необхідно як для проведення пренатальної діагностики, медико-генетичного консультування обтяжених сімей, так і у ряді випадків для призначення адекватної терапії. Наприклад, при недостатності дегідроптеридинредуктази клінічний фенотип та рівні фенілаланіну будуть не відрізняються від класичної форми фенілкетонурії, але підходи до терапії цих захворювань принципово відрізняються. Важливість локусної диференціації спадкових хвороб обміну речовин для медико-генетичного консультування може бути проілюстрована з прикладу мукополісахаридозу II типу (хвороби Хантера). За спектром екскретованих глікозаміногліканів неможливо розрізнити мукополісахаридози I, II і VII типу, але з цих захворювань тільки хвороба Хантера успадковується за Х-зчепленим рецесивним типом, що має принципове значення для прогнозу потомства в сім'ї з обтяженим анамнезом. Що стосується пренатальної діагностики, то, маючи дані про форму мукополісахаридозу (це може бути встановлено тільки при дослідженні активності ферментів), можливе проведення пренатальної діагностики вже на 8-11 тижні вагітності, якщо ж форма не уточнена, то тільки на 20-й Тижня. Безумовна пріоритетність молекулярно-генетичних методів при встановленні гетерозиготного носійства, а також у пренатальній діагностиці захворювань, при яких мутантний фермент не експресується у клітинах ворсин хоріону, наприклад, при фенілкетонурії, деяких глікогенозах, дефектах мітохондріального р-окислення.

ВИЯВ ДЕФЕКТНОЇ ланки МЕТАБОЛІЧНОГО ШЛЯХУ
Аналіз метаболітів є найважливішим етапом у діагностиці багатьох захворювань із класу спадкових хвороб обміну речовин. Насамперед це стосується порушень проміжного обміну амінокислот і органічних кислот. За більшості цих захворювань кількісне визначення метаболітів у біологічних рідинах дозволяє точно встановити діагноз. Для цих цілей застосовують методи якісного хімічного аналізу, спектрофотометричні методи кількісної оцінки сполук, а також різні види хроматографії (тонкошарова, високоефективна рідинна, газова, тандемна мас-спектрометрія). Біологічним матеріалом для цих досліджень зазвичай є плазма або сироватка крові та зразки сечі.

При таких спадкових хворобах обміну речовин, як порушення енергетичного обміну, обміну вуглеводів та амінокислот, аналіз сполук загальних для багатьох метаболічних шляхів (ключових метаболітів) дозволяє проводити диференціальну діагностику захворювань та планувати подальшу тактику обстеження. Для багатьох груп спадкових хвороб обміну речовин з метою визначення концентрації метаболітів використовують напівкількісний аналіз. Іноді якісний аналіз є першим етапом діагностичного пошуку і дозволяє з високою достовірністю запідозрити певну нозологічну форму захворювання або групу хвороб.

ЯКІСНІ ТА ПОЛУКІЛЬНІ ТЕСТИ З СЕЧЕЮ
Оскільки при багатьох спадкових хворобах обміну речовин відбувається накопичення субстратів блокованої ферментної реакції або їх похідних, надмірні концентрації цих метаболітів можна виявити за допомогою хімічних тестів якісного аналізу. Ці тести чутливі, прості у застосуванні, відрізняються низькою собівартістю і не дають помилково-негативних результатів, а інформація, отримана при їх застосуванні, дозволяє з високою ймовірністю запідозрити спадкові хвороби обміну речовин у пацієнта. Необхідно враховувати, що на результати цих тестів впливають лікарські препарати, харчові добавки та їх метаболіти. Тести якісного аналізу застосовують у програмах селективного скринінгу.

Якісні тести
Колір та запах: лейциноз, тирозинемія, ізовалеріанова ацидемія, фенілкетонурія, алкаптонурія, цистинурія, З-гідрокси-З-метилглутарова ацидурія.
Тест Бенедикта (галактоземія, уроджена непереносимість фруктози, алкаптонурія). Також позитивний при синдромі Фанконі, цукровому діабеті, лактазної недостатності, прийомі антибіотиків.
Тест із хлоридом заліза (фенілкетонурія, лейциноз, гіпергліцинемія, алкаптонурія, тирозинемія, гістидинемія). Також позитивний при цирозі печінки, плеохромацитомі, гіпербілірубінемії, лактат-ацидозі, кетоацидозі, меланомі.
Тест з динітрофенілгідразином (фенілкетонурія, лейциноз, гіпергліцинемія, алкаптонурія). Також позитивний при глікогенозу, лактат-ацидозі.
Тест із п-нітроаніліном: метилмалонова ацидурія.
Сульфітний тест: недостатність кофактору молібдену.
Тест на гомогентизинову кислоту: алкаптонурія.
Тест із нітрозонафтолом: тирозинемія. Також позитивний при фруктоземії та галактоземії.

КЛЮЧОВІ МЕТАБОЛІТИ
Для багатьох груп спадкових хвороб обміну речовин важливим етапом диференціальної лабораторної діагностики є вимірювання концентрації певних метаболітів у різних біологічних рідинах (крові, плазмі, цереброспінальній рідині та сечі). До цих сполук відносять глюкозу, молочну кислоту (лактат), піровиноградну кислоту (піруват), амоній, кетонові тіла b-гідроксибутират та ацетоацетат), сечову кислоту. Концентрація цих сполук змінюється за багатьох спадкових хвороб обміну речовин, та його комплексна оцінка дозволяє розробити алгоритми подальшої лабораторної діагностики.

Лактат та піруват
Концентрації лактату, пірувату, а також кетонових тіл є найважливішими показниками порушень енергетичного обміну. Відомо близько 25 нозологічних форм спадкових хвороб обміну речовин, за яких спостерігається підвищення рівня лактату в крові (лактат-ацидоз).

Лактат-ацидоз – стан, при якому рівень молочної кислоти перевищує 2,1 мм. Первинний лактат-ацидоз може бути пов'язаний з недостатністю піруватдегідрогенази (піруватдегідрогеназного комплексу), порушеннями дихального ланцюга мітохондрій (переважна більшість форм), глюконеогенезу, обміну глікогену. Вторинний лактат-ацидоз спостерігається при деяких органічних ацидуріях, порушення мітохондріального р-окислення, дефектах циклу сечовини. Концентрація цих метаболітів багато в чому залежить від фізіологічного статусу (до або після харчового навантаження), також на рівень лактату впливають фізичне навантаження і навіть стрес, пов'язаний з процедурою взяття крові, особливо у дітей раннього віку. Все це необхідно враховувати під час інтерпретації біохімічних даних. Співвідношення концентрації лактат/піруват у крові є важливим диференційно-діагностичним критерієм. Біохімічно це співвідношення відображає співвідношення між відновленою та окисленою формою нікотинаміддинуклеотидів у цитоплазмі – так званий окисний статус цитоплазми.

Кетонові тіла
Кетонові тіла утворюються у печінці, їх основним джерелом є b-окислення жирних кислот. Потім вони переносяться у різні тканини організму. Співвідношення кетонових тіл 3-гідроксибутират/ацетоацетат відображає окислювально-відновний статус мітохондрій, оскільки їх співвідношення пов'язане виключно з мітохондріальним пулом нікотинаміддинуклеотидів. b-гідроксибутират у плазмі крові відносно стабільний, на відміну від ацетоацетату, який швидко розпадається. Багато дефектів мітохондріального b-окислення характеризуються низьким рівнем кетонових тіл навіть після тривалого голодування, що пов'язано зі виснаженням продукції ацетил-КоА, що є основним попередником кетонових тіл. При мітохондріальних хворобах, пов'язаних з дефектами дихального ланцюга мітохондрій, спостерігається парадоксальна гіперкетонемія - рівень кетонових тіл після харчового навантаження значно підвищується (у нормі спостерігається підвищення концентрації кетонових тіл після тривалого голодування).

Амоній
При спадкових хворобах обміну речовин, що протікають на кшталт гострої метаболічної декомпенсації, важливе значення має визначення рівня амонію в крові. Значне підвищення амонію у крові спостерігається при спадкових хворобах обміну речовин, зумовлених порушеннями циклу сечовини та обміну органічних кислот. При цих захворюваннях концентрація амонію збільшується від 200 до 1000 мкм. Гіпераммоніємія є не тільки важливою диференціально-діагностичною ознакою, але й вимагає невідкладних терапевтичних заходів, оскільки швидко призводить до тяжкого ураження головного мозку. Важливо диференціювати цей стан від транзиторної гіперамоніємії новонароджених, яка зустрічається у недоношених новонароджених з високими ростомасовими показниками та клінічними симптомами ураження легень. Рівень амонію у цьому стані вбирається у 200 мкм. Концентрація амонію в крові може підвищуватись при тяжкому ураженні печінки. Нормальні значення концентрації амонію в крові: у неонатальний період – менше 110 мкм, у дітей старшого віку – менше 100 мкм.

Глюкоза
Зниження рівня глюкози в крові може спостерігатися при низці спадкових хвороб обміну речовин. Насамперед це стосується порушень обміну глікогену та дефектів мітохондріального р-окислення, при яких гіпоглікемія може бути єдиною біохімічною зміною, що виявляється при стандартних лабораторних дослідженнях. Фізіологічна відповідь на зниження рівня глюкози в крові – скасування викиду інсуліну, вироблення глюкагону та інших регуляторних гормонів. Це призводить до утворення глюкози з глікогену в печінці та перетворення білків на глюкозу в ланцюгу глюконеогенезу. Також активується ліполіз, що призводить до утворення гліцерину та вільних жирних кислот. Жирні кислоти транспортуються в мітохондрії печінки, де відбувається їх р-окислення і утворюються кетонові тіла, а гліцерин перетворюється на глюкозу в ланцюзі глюконеогенезу. Діти мають набагато більшу потребу в глюкозі, ніж дорослі. Вважають, що це пов'язано з тим, що співвідношення розміру головного мозку до тіла у дітей є вищим, а головний мозок є основним споживачем глюкози.

Крім того, мозок дорослої людини більш пристосований до використання кетонових тіл як джерело енергії, ніж мозок дитини. Саме з цих причин діти чутливіші до гіпоглікемічних станів, ніж дорослі. При порушеннях обміну глікогену гіпоглікемія пов'язана з неможливістю утворення глюкози з глікогену, тому більш виражена в періоди тривалого голодування.

Більшість захворювань групи дефектів мітохондріального b-окислення також супроводжуються зниженням рівня глюкози. Ця група хвороб належить до найпоширеніших спадкових хвороб обміну речовин. Причина гіпоглікемії пов'язана з неможливістю використовувати накопичені жири в період голодування та виснаженням накопиченого глікогену, який стає єдиним джерелом глюкози та відповідно метаболічної енергії. Гіпоглікемія при дефектах мітохондріального b-окислення, на відміну глікогенозів, не супроводжується гиперкетонемией. Гіпоглікемія також може зустрічатися при галактоземії типу I, спадковій непереносимості фруктози, недостатності фруктозо-1,6-біфосфатази.

Метаболічний ацидоз
Метаболічний ацидоз – одне з частих ускладнень при інфекційних захворюваннях, тяжкій гіпоксії, дегідратації та інтоксикації. Спадкові хвороби обміну речовин, що маніфестують у ранньому дитячому віці, також нерідко супроводжуються метаболічним ацидозом з дефіцитом основ.

Найважливішим критерієм у диференціальній діагностиці метаболічного ацидозу є рівень кетонових тіл у крові та сечі, а також концентрація глюкози. Якщо метаболічний ацидоз супроводжується кетонурією, це вказує на порушення метаболізму пірувату, розгалужених амінокислот, порушення обміну глікогену. Дефекти мітохондріального р-окислення, кетогенезу та деякі порушення глюконеогенезу не супроводжуються підвищенням рівня кетонових тіл у крові та сечі. Найбільш часті спадкові хвороби обміну речовин, що протікають з вираженим метаболічним ацидозом, - пропіонова, метилмалонова та ізовалеріанова ацидемії. Порушення метаболізму пірувату та дихального ланцюга мітохондрій, що маніфестують у ранньому віці, як правило, призводять до вираженого метаболічного ацидозу.

Сечова кислота
Сечова кислота – кінцевий продукт метаболізму пуринів. Пуринові основи – аденін, гуанін, гіпоксантин та ксантин – окислюються до сечової кислоти. Сечова кислота синтезується переважно в печінці, в кровоносному руслі не пов'язана з білками, тому практично вся фільтрується в нирках. Підвищення концентрації сечової кислоти у сечі суворо корелює зі збільшенням її рівня у плазмі крові.

Підвищена продукція та екскреція сечової кислоти (гіперурикемія та гіпер- урикозурія) виникають внаслідок гіперактивності (унікальне явище серед спадкових хвороб обміну речовин) або недостатності ферментів, що беруть участь у синтезі пуринів de novo, що зберігають шляхи їх метаболізму, або обумовлена ​​порушеннями освіти та цикл пуринових нуклеотидів. Вторинна гіперурикемія також спостерігається при спадковій непереносимості фруктози, недостатності фруктозо-1,6-дефосфатази, глікогенозах I, III, V, VII типу, недостатності середньоланцюжкової ацетил-КоА-дегідрогенази жирних кислот.

АНАЛІЗ МЕТАБОЛІТІВ З ДОПОМОГЮ СПЕЦІАЛЬНИХ МЕТОДІВ КІЛЬКІСНОГО АНАЛІЗУ
Хроматографічні методи аналізу відіграють найважливішу роль діагностиці спадкових хвороб обміну речовин. Сучасний арсенал хроматографічних технологій є надзвичайно широким, що дозволяє ефективно та інформативно розділяти складні, багатокомпонентні суміші, до яких належить і біологічний матеріал. Для кількісного аналізу метаболітів при спадкових хворобах обміну речовин успішно застосовують такі хроматографічні методи, як газова та високоефективна рідинна хроматографія, хроматомас-спектрометрія. Газова хроматографія та високоефективна газова хроматографія - найуніверсальніші методи поділу складних сумішей сполук, що відрізняються високою чутливістю та відтворюваністю. В обох випадках поділ здійснюється в результаті різної взаємодії компонентів суміші з нерухомою та рухомою фазами хроматографічної колонки. Для газової хроматографії рухомий фазою є газносій, для високоефективної газової хроматографії - рідина (елюенти). Вихід кожного з'єднання фіксується детектором приладу, сигнал якого перетворюється на піки на хроматограмі. Кожен пік характеризується часом утримання та площею. Слід зазначити, що газова хроматографія проводять, як правило, при високотемпературному режимі, тому обмеженням її застосування є термічна нестійкість сполук. Для високоефективної газової хроматографії немає таких обмежень, оскільки у разі аналіз проводять у м'яких умовах. Хроматомас-спектрометрія являє собою комбіновану систему газової хроматографії або високоефективної газової хроматографії з мас-селективним детектором, що дозволяє отримувати не тільки кількісну, але і якісну інформацію, тобто додатково визначається структура сполук аналізованої суміші.

Органічні кислоти
У біохімічній генетиці термін «органічні кислоти» відноситься до невеликих (молекулярна маса - менше 300 кДа), розчинних у воді карбонових кислот, які є проміжними або кінцевими продуктами метаболізму амінокислот, вуглеводів, ліпідів та біогенних амінів.

Для визначення органічних кислот застосовують різноманітні хроматографічні методи: високоефективну рідинну хроматографію, хроматомас-спектрометрію та високоефективну газову хроматографію з наступною тандемною мас-спектрометрією. Більше 250 різних органічних кислот та гліцинових кон'югатів можна виявити у зразку сечі. Їхня концентрація залежить від дієти, прийому лікарських препаратів та деяких інших фізіологічних причин. Відомо близько 65 спадкових хвороб обміну речовин, що характеризуються специфічним профілем органічних кислот. Відносно невелика кількість органічних кислот є високоспецифічною, наявність їх у великих концентраціях у сечі дозволяє точно встановити діагноз: сукцинілацетон при тирозинемії типу I, N-ацетилапартат при хворобі Канавана, мевалонова кислота при мевалоновій ацидурії. У переважній більшості випадків діагноз спадкових хвороб обміну речовин на підставі аналізу органічних кислот сечі встановити досить важко, тому потрібна додаткова, що підтверджує діагностика.

Інтерпретація результатів аналізу органічних кислот сечі представляє певні проблеми як через велику кількість екскретованих кислот та їх похідних, так і через накладання профілів деяких лікарських метаболітів. Для точної діагностики дані, отримані при аналізі органічних кислот, повинні корелювати з клінічною характеристикою захворювання та бути підтверджені результатами інших лабораторних методів аналізу (аналізу амінокислот, лактату, пірувату, ацилкарнітинів у крові, активності ферментів та молекулярно-генетичних даних).

Концентрація органічних кислот при спадкових хворобах обміну речовин характеризується досить широким діапазоном - від підвищення рівня в кілька сотень разів до незначного перевищення, близького до нормального. Наприклад, при глутарової ацидурії типу I рівень глутарової кислоти у деяких хворих може перебувати в межах норми; при недостатності середньоланцюгової ацетил-КоА-дегідрогенази жирних кислот концентрація адипінової, себацинової та суберинової кислот може бути в межах норми. Виявити аномальний профіль органічних кислот сечі іноді буває можливим лише у пацієнтів у стадії метаболічної декомпенсації. Особливо це притаманно доброякісних, м'яких форм захворювань, які, зазвичай, пізно маніфестують.

Амінокислоти та ацилкарнітини
Визначення концентрації амінокислот та ацилкарнітинів проводять методом тандемної мас-спектрометрії. Мас-спектрометрія - аналітичний метод, з допомогою якого можна отримувати як якісну (структура), і кількісну (молекулярна маса чи концентрація) інформацію аналізованих молекул після їх перетворення на іони. Істотна відмінність мас-спектрометрії з інших аналітичних фізико-хімічних методів у тому, що у мас-спектрометрі визначається безпосередньо маса молекул та його фрагментів. Результати надаються графічно (так званий мас-спектр). Іноді неможливо аналізувати багатокомпонентні, складні суміші молекул без попереднього поділу. Розділити молекули можна або хроматографічно, або використовувати два послідовно з'єднані мас-спектрометри - тандемна мас-спектрометрія. Метод тандемної мас-спектрометрії вперше був застосований у 70-х роках. минулого століття і знайшов застосування у хімії, біології та медицині. Цей метод застосовують для з'ясування структури невідомих речовин, а також аналізу комплексних сумішей з мінімальним очищенням зразків.

Перед мас-спектрометричним аналізом необхідно перетворення нейтральних частинок речовини на заряджені іони, а також переведення їх з рідкого стану на газоподібний. Для цієї мети спочатку застосовували метод іонізації бомбардуванням швидкими атомами, останнім часом перевага надається методу іонізації в електроспреї. З появою нових методів іонізації застосування тандемної мас-спектрометрії в галузі аналітичної біохімії стало доступнішим. Вперше аналіз ацилкарнітинів за допомогою тандемної мас-спектрометрії виконали Девід Міллінгтон та співавт., що застосували хімічну дериватизацію біологічних зразків для утворення бутилових ефірів ацилкарнітинів. У 1993 р. Дональд Чейз та співавт. адаптували цей метод для аналізу амінокислот у висушених плямах крові, сформувавши таким чином основу для скринінгу безлічі компонентів при спадкових хворобах обміну речовин. Надалі метод було адаптовано до проведення великомасштабних аналізів, необхідні неонатального скринінгу.

Тандемна мас-спектрометрія-аналіз найбільш ефективний для сполук, що мають подібні дочірні іони або нейтральні молекули, наприклад, для аналізу амінокислот і ацилкарнітинів. Необхідно також наголосити на можливості МС/МС-аналізу різних хімічних груп в одному аналізі за дуже короткий час (~2 хв). Це забезпечує широкий спектр аналізів та високу пропускну спроможність, що економічно вигідно для скринінгу на велику кількість захворювань. На підставі підвищення концентрації певних ацилкарнітинів можна запідозрити захворювання із групи порушень мітохондріального р-окислення щодо зміни профілю амінокислот – аміноацидопатії. За допомогою тандемної мас-спектрометрії можна детектувати сторонні метаболіти жовчних кислот, що з'являються при порушеннях холестеринового метаболізму і ліпідів, жовчних кислот, а також при дефектах біогенезу пероксисом. При различных холестатических гепатобилиарных нарушениях (хроническом заболевании печени неизвестной этиологии, синдроме Цельвегера, недостаточности пероксисомного бифункционального белка, тирозинемии типа I, билиарной атрезии, прогрессивном фамильном внутрипеченочном холестазе неопределенного типа) с помощью тандемной масс-спектрометрии можно определять концентрации конъюгированных желчных кислот в различных биологических жидкостях .

Описано методи визначення дуже довголанцюгових жирних кислот: ейкозанової (С20:0), докозанової (С22:0), тетракозанової (С24:0), гексакозанової (С26:0), а також фітанової та пристанови кислот - за допомогою тандемної мас-спектрометрії плазмі та плямах крові, потенційно придатні для скринінгу багатьох пероксисомних хвороб.

Діагностика порушень метаболізму пуринів і піримідинів (недостатності пуриннуклеозидфосфорілази, орнітинтранскарбамілази, молібденового кофактора, аденілосукцинази, дегідропіримідиндегідрогенази) заснована на присутності аномальних метаболітів або відсутності нормальних метаболітів. Так, розроблено швидкі методи тандемної мас-спектрометрії, що дозволяють кількісно визначати від 17 до 24 пуринів та піримідинів у сечі в одному аналізі.

Тандемну мас-спектрометрію можна також використовувати для дослідження інших класів метаболітів. Так, розроблено новий метод тандемної мас-спектрометрії вимірювання тотального гексозмонофосфату в плямах крові, маркера галактозо-1-фосфату, який можна використовувати при скринінгу на галактоземію.

Визначення катехоламінів у сечі є важливим для діагностики порушення метаболізму катехоламінів та нейротрансмітерів. Значними недоліками існуючих методів є тривалий час аналізу та можлива інтерференція ліків та їх метаболітів, що структурно схожі з катехоламінами. Нові методи в комбінації з пробопідготовкою, специфічною до сполук, що містять катехольні групи, дозволяє швидко діагностувати цю групу захворювань, за винятком недоліків ВЕРХ-методів.

Дослідження білків
Переважна більшість спадкових хвороб обміну речовин обумовлена ​​порушенням активності ферментів, тому в діагностиці цих захворювань виявлення зниження активності специфічних ферментів є найважливішим, а іноді й єдиним надійним методом підтвердження діагнозу.

ВИЗНАЧЕННЯ АКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТІВ
В даний час пост-і пренатальна діагностика багатьох спадкових хвороб обміну речовин (насамперед це стосується лізосомних хвороб накопичення) здійснюється за допомогою методів аналізу ферментативної активності. Матеріалом для вимірювання активності ферментів при спадкових хворобах обміну речовин є насамперед лейкоцити периферичної крові: практично при всіх лізосомних хворобах накопичення, метилмалонової ацидурії, деяких глікогенозів. Для діагностики GM2- гангліозидозів, недостатності біотинідази використовують плазму або сироватку крові. У деяких випадках об'єктами дослідження є м'язова чи печінкова тканина, культура шкірних фібробластів.

Субстрати для ферментів можуть бути хромогенними, флюорогенними, містять радіоактивну мітку. Для вимірювання активності ферментів застосовують спектрофотометричний, флюориметричний та методи вимірювання радіоактивності. Загальний принцип застосування флюорогенних субстратів полягає в тому, що субстрат є хімічним похідним флюорохрому, нездатним до флюоресценції у вихідному стані, але під дією молекул відповідних ферментів субстрат каталітично розщеплюється з вивільненням флюорохрому, флюоресценцію якого можна виміряти. Спектрофотометричні методи дозволяють вимірювати поглинання продуктами ферментативної реакції, одержаними після внесення хромогенних субстратів. Для багатьох ферментів (наприклад, дегідрогеназ) продукти реакції, що утворюються, можуть бути хромогенними. Є досить багато флюорогенних субстратів для дослідження різних ферментів: естераз різної специфічності, пероксидаз, пептидаз, фосфатаз, сульфатаз, ліпаз та ін.

Для кожної ферментативної реакції необхідні певні умови: pH і склад буферної суміші, специфічний субстрат(-и), наявність активаторів та кофакторів, температурний режим і т. д. Практично кожна клітина містить свій набір ферментів, тому їх розподіл у тканинах значно варіює. Багато ферментів представлені у тканинах різними формами (ізоферментами). У більшості випадків це пов'язано з наявністю поліпептидних субодиниць, які, поєднуючись, формують різні ізоферменти. Розподіл ізоферментів може варіювати від тканини до тканини. Деякі ферменти зустрічаються лише у певному органі чи тканині.

Лізосомні хвороби накопичення
Визначення активності ферментів є «золотим стандартом», що підтверджує діагностику лізосомних хвороб накопичення. Для аналізу активності ферментів використовують хромогенні та флюорогенні субстрати. Флюорогенні субстрати на основі 4-метилумберифелону завжди дуже чутливі; з їх допомогою можна визначати активність ферментів навіть у мікрокількості біологічного матеріалу (плямах висушеної крові). Як правило, активність ферментів у пацієнтів з лізосомними хворобами накопичення становить менше 10% норми, і при біохімічному тестуванні постановка точного діагнозу не становить значних труднощів. Існує низка факторів, що ускладнюють інтерпретацію біохімічних досліджень. Один з них – наявність алелів «псевдонедостатності», які призводять до змін структури ферменту і не дозволяють білку адекватно розщеплювати штучний субстрат in vitro, при цьому з природним субстратом фермент не показує зниження активності. Це явище описано для арилсульфатази А, р-галактозидази, p-глюкоронідази, а-ідуронідази, а-галактозидази, галактоцереброзідази.

Дослідження мутантних генів
Розвиток методів молекулярної біології стало справжньою революцією у сфері клінічної біохімії. Розробка стандартних протоколів молекулярних досліджень та автоматизація використовуваних методів сьогодні – закінчений комплекс діагностичних підходів, який може стати рутинною процедурою у клінічних лабораторіях. Швидкий розвиток досліджень у галузі розшифрування геному людини та визначення ДНК-послідовності генів уможливлює ДНК-діагностику різних спадкових захворювань. Методи ДНК-діагностики, аналізу структури нормальних генів та їх мутантних аналогів за спадкових хвороб обміну почали використовувати протягом останнього десятиліття.

Для ДНК-діагностики спадкових захворювань використовують два основних підходи - пряму та непряму ДНК-діагностику. Пряма ДНК-діагностика є дослідженням первинної структури пошкодженого гена і виділення мутацій, що ведуть до захворювання. Для детекції молекулярних ушкоджень у генах, що зумовлюють спадкові хвороби, використовують стандартний арсенал методів молекулярної біології. Залежно від характеристики та типів мутацій, поширеності при різних спадкових захворюваннях ті чи інші методи є кращими.

Для діагностики спадкових хвороб обміну речовин у тих випадках, коли біохімічний дефект точно відомий, легко та достовірно визначаємо з використанням біохімічних методик, ДНК-методи навряд чи займуть пріоритетне місце. У цих випадках застосування ДНК-аналізу є скоріше науково-дослідним, а не діагностичним підходом. Після точно встановленого діагнозу методи ДНК-аналізу будуть корисними для подальшої пренатальної діагностики, ідентифікації гетерозиготних носіїв у сім'ї та прогнозу захворювання у гомозигот, а також для відбору хворих з метою проведення казуальної терапії в майбутньому (ферментозамінної та генотерапії). Також у випадках, коли біохімічний дефект точно не відомий, біохімічна діагностика утруднена, недостатньо достовірна або потребує інвазивних методів дослідження, метод ДНК-діагностики – єдиний та незамінний для точної постановки діагнозу.

У загальному вигляді тактика проведення діагностики спадкових хвороб обміну речовин у кожному конкретному випадку має плануватися спільно з лікарем-біохіміком та лікарем-генетиком. Необхідними умовами успішної та швидкої діагностики є розуміння етіології, механізмів патогенезу захворювання, знання специфічних біохімічних маркерів.

Лабораторний контроль якості
Одна з найважливіших складових будь-якої лабораторної діагностики - постійний контроль якості досліджень, що проводяться. У такій складній і багатогранній області, як спадкові хвороби обміну речовин, зовнішній і внутрішній контроль якості набуває особливого значення. Це пов'язано з тим, що лабораторія має справу з рідкісними захворюваннями, і, як правило, набути досвіду з діагностики кожної з хвороб у достатній кількості неможливо. Крім того, лабораторне обладнання та методичні підходи можуть різнитися між різними лабораторіями.

Надаючи медичні послуги, лікарі мають насамперед залишатися людьми. Знайшовши лабораторію спадкових хвороб обміну у нас, не забувайте залишати думки.

Лікування має бути професійним, Лабораторія спадкових хвороб обміну речовин – тут лікарі нададуть якісні послуги та лікування без наслідків. Запис на прийом за лічені хвилини, свіжі відгуки.

У вашому місті є Лабораторія спадкових хвороб обміну речовин відгуки, користуйтеся послугами лікарень та клінік, лікарів за перевіреними даними. Запис на прийом до лікарів із Лабораторія спадкових хвороб обміну речовин Москва, через наш сайт стала ще простіше!

Медико-генетичний науковий центр РАМН. Сайт лабораторії спадкових хвороб обміну містить інформацію про лабораторну діагностику рідкісних спадкових захворювань, їх клінічні прояви та можливості лікування. На сайті: тандемна мас-спектрометрія / захворювання, що виявляються за допомогою ТМС / показання для проведення аналізу ТМС / лізосомні хвороби накопичення / правила забору крові / прейскурант / зразок направлення на аналіз

Як доїхати

Допоможемо знайти найкращі медичні пропозиції і в яку лікарню москви везуть із захворюванням хпн2 з адреси катукова19 для своїх рідних та близьких.

Схема проїзду до аналіз ТМС без пробок, на метро чи власному автомобілі.

Відгуки та питання

Ганна Мігненко, 01.09.2015

Вітаю. Ми із Ставрополя. Дитині 3,5 роки. Зверталися за консультацією до генетика в СКККДЦ з приводу затримки психомоторного розвитку зі втратою раніше набутих навичок неясного генезу та атаксії неясного генезу.
Було проведено слід. обстеження:
-цитогенетичне дослідження (каріотип): 46, ХХ
-аналіз крові на ФА – 0,7 мг%
-ТСХ амінокислот та вуглеводів крові - без патології
-ТСХ амінокислот у сечі: генералізована гіпераміноацидурія!
-Уріналізіс: лейкоцити ++; тест на ксантуренову кислоту – слабопозитивний.
В умовах лабораторії НБО виконано:
- аналіз крові методом ТМС – даних за спадкові аміноацидопатії, органічні ацидурії та дефекти мітохондріального бета-окислення не виявлено;
- ензімодіагностика на 6 хвороб накопичення - відхилень не виявлено.
Нам було рекомендовано консультацію Захарової Катерини Юріївни. Підкажіть, будь ласка, як ми можемо з нею зв'язатися та записатися на прийом?

Лабораторія спадкових хвороб обміну речовинбула створена у Медико-генетичному науковому Центрі понад 30 років тому. Перші роботи в лабораторії були пов'язані з розробкою тестів для виявлення фенілкетонурії та програм селективного скринінгу спадкових хвороб обміну речовин (НБО). Поступово лабораторія перейшла до застосування складних біохімічних та молекулярно-генетичних методів точної діагностики спадкових захворювань. Саме тут під керівництвом професора Ксенії Дмитрівни Краснопільської було розроблено підходи до біохімічної діагностики хвороб клітинних органел. Сьогодні це єдина в Росії лабораторія, де проводиться постнатальна та пренатальна діагностика переважної більшості захворювань із цієї групи.

Одним із наукових напрямів роботи підрозділу є пошук нових біохімічних маркерів для спадкових хвороб, розробка нових методів їхньої ефективної діагностики.

Спектр біохімічних методів, що використовуються в лабораторії, винятково широкий і включає: електорофорез глікозаміногліканів сечі, ізоелектрофокусування трансферинів, хромато-мас-спектрометрію, високоефективну рідинну хроматографію, аналіз активності лізосомних і мітохондріохромних ферментів. Деякі з форм НБО, які раніше не виявляються в нашій країні, в лабораторії були діагностовані вперше.

Істотним проривом у діагностиці НБО стало впровадження методу тандемної мас-спектрометрії, який дозволяє в мікрокількостях біологічного матеріалу (плями висушеної крові або плазми) виявляти близько 30 форм спадкових захворювань із груп найпоширеніших НБО: аміноацидопатій, органічних ацидурій та дефектів мітохондрі.

Останні роки в лабораторії активно розвиваються імолекулярно-генетичні методи. Для деяких захворювань із групи НБО створено протоколи ДНК-діагностики, що дозволяють скоротити час встановлення діагнозу та уникнути застосування трудомістких та інвазивних біохімічних методів. З 2015 року в лабораторії застосовують секвеніювання нового покоління для одночасного аналізу множини генів. Такі панелі розроблені для мітохондріальних захворювань, спадкових хвороб із переважним ураженням печінки, лейкодистрофій/лейкоенцефалопатій.

На сьогоднішній день біохімічні та молекулярно-генетичні методи, що використовуються, дозволяють діагностувати понад 200 різних форм спадкових хвороб обміну речовин.

В лабораторії ведеться робота з характеристики спектру та частоти мутацій при спадкових мукополісахаридозах, сфінголіпідозах, нейрональних цероїдних ліпофусцинозах, розробляються алгоритми діагностики захворювань, що протікають з ураженням білої речовини головного мозку, а також інших спадкових нейрометаболічних порушень.