Головна · Діагностика · L-форми бактерій. Регенерація клітинної стінки та реверсія до клітинних форм Особливості інфекції у дітей

L-форми бактерій. Регенерація клітинної стінки та реверсія до клітинних форм Особливості інфекції у дітей

"Внутрішнє середовище організму" - В організмі людини близько 20 літрів. Внутрішнє середовище організму Тканинна Кров Лімфа (міжклітинна) рідина. Взаємозв'язок компонентів внутрішнього середовища організму. Внутрішнє середовище організму. Внутрішнє середовище організму – сукупність рідин, що беруть участь у процесах обміну речовин та підтримки сталості внутрішнього середовища.

«Органи організму» - За хвилину серце людини робить у середньому 70 ударів. Бактерії. Які правила охорони органів чуття «зашифровані» у малюнках? 3. Яка наука вивчає рослини? Папороть. 7. Який вид рослин ніколи не цвіте? Легкі. Головний мозок. 3 клас "Ми і наше здоров'я. Здолала нас дрімота, Ворушитися не хочеться.

"Біологія Імунітет" - Обладнання: Закріплення знань. За бажанням приготувати повідомлення «З історії переливання крові». Схема "Види імунітету". Які види імунітету існують? Таблиця "Кров", портрети І.І.Мечникова, Л. Пастера. Особливо часто люди бувають носіями туберкульозної палички. Пасивний. Фагоцитоз та вироблення антитіл – єдиний захисний механізм, названий імунітетом.

«Пропорції людини» - Дані вікових змін пропорцій тіла у хлопчиків: Зазвичай артеріальний тиск вищий за норму. Брахіморфний тип. Пропорції тіла та вік людини. Серце розташоване поперечно завдяки діафрагмі, що високо стоїть. Підвищено ризик артеріальної гіпотонії. Вікові зміни пропорцій тіла. Доліхоморфний тип.

«Будова людина» - Як працює наш організм? Опускаємо руки ми за командою «два». Отже, ми розглянули будинок та літак. Серце. На зарядку сонечко піднімає нас, піднімайте руки за командою «раз». Без повітря людина може прожити недовго. Мозок. Перероблена їжа потрапляє у кишечник. Як влаштований будинок? У чому секрет нашого здоров'я?

«Стійкість внутрішнього середовища організму» - Стрічка з еритроцитів. Білі клітини крові. І.І. Мечніков. Плазма крові. тромбоцити. Кров. Поняття «внутрішнє середовище організму». Еритроцити. Гемоглобін. Лейкоцити. Рідини людини. Форменні елементи крові. Протромбін. Мікропрепарат крові людини. Тканинна рідина. компоненти. Внутрішнє середовище організму.

Персистенція Від латів. persisto - постійно перебувати, залишатися, тривале існування, наявність тривалого перебування інфекту в організмі тварин і людини або без клінічних патологічних проявів (латентний перебіг, ремісія інфекційного процесу), або здатних за певних умов (імунний дисбаланс та імунна недостатність різної етіології - стрес, переохолодження , інтеркурентна інфекція, загострення хронічного захворювання і т. д.) до активації з результатом захворювання (активний перебіг, загострення інфекційного процесу).

Механізми персистенції: - Освіта L-форм Антигенна мімікрія Імуноглобуліновий покрив Здатність секретувати речовини, що перешкоджають дії імунних факторів Сорбція білків господаря на поверхні клітини та екранування від імунної системи господаря Антифагоцитарні фактори: Капсули

Дія бактерій на цитокіни: Дія Руйнують цитокіни Бактерії Н. aeruginosa за допомогою ферментів L. pneumophila Зв'язують цитокіни Е. coli Пригнічують синтез Цитокінів S. typhimurium, S. flexneri ФНП M. tuberculosis ТРФ(3 M. avium ІЛ-6 L. monocytogenes ІЛ-3, КСФ-1 E. coli ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-5, ІФ-у Y. enterocolitica, B. suis, V. ФНВа cholerae, B. anthracis P. aeruginosa ФНПа, ІЛ-1, ІФ-у S. typhimurium ІЛ-2

Антилізоцимна та антилактоферинова активність: Мікроорганізми n Антилактоферинова активність, Антилізоцимна нг/мл активність, мкг/мл M±SD S. aureus S. haemolyticus S. epidermidis E. coli Klebsiella spp. 15 22, 72 ± 1, 88 10, 1 ± 2, 17* 16 20, 08 ± 1, 41 4, 40 ± 1, 12 15 11, 50 ± 1, 45* 9, 91 ± 0, 2 , 84 ± 1, 41 4, 19 ± 0, 61 12 7, 83 ± 1, 13* 8, 92 ± 2, 45* 15 5, 65 ± 0, 62 1, 24 ± 0, 25 12 23, 0, 67* 2, 58 ± 0, 27* 12 18, 17 ± 3, 20 1, 64 ± 0, 15 12 19, 40 ± 2, 47 3, 24 ± 0, 27* 14 18, 13 64 1, 83 ± 0, 28 Хворі на ревматичні захворювання Контроль *Статистично достовірно

Утворення L-форми - бактерії, частково або повністю позбавлені клітинної стінки, але зберегли здатність до розвитку. До виникнення L-форм приводить вплив агентів, що блокують вироблення клітинної стінки: 1. антибіотики (пеніциліни циклосерин, цефалоспорини, ванкоміцин), 2. ферменти (лізоцим, амідаза, ендопептидаза), 3. ультрафіолетові та рентгенівські ен.

Історія питання: Літера L - перша буква назви Лістерівського інституту в Лондоні, де вперше доктор наук Еммі Кляйнебергер-Нобель у 1935 році звернула увагу на розвиток морфологічно незвичайних клітин у культурі бактерій Streptobacillus moniliformis, виділеної з рідини вуха щура.

вакуолі L-форма Bacillus subtilis, масштаб – 500 нм. Різноманітність L-форм Bacillus subtilis, при масштабі 10 мкм.

L-форми Особливості L-форм: 1. Синтез повноцінної клітинної стінки неможливий Повернення у вегетативну форму при нормалізації факторів навколишнього середовища Повернення у вегетативну форму неможливе. Подальше існування як у мікоплазм Подібні культуральні властивості. 3. Поступове перетворення з грампозитивних на грамнегативні структури. Освіта стабільних та нестабільних Lформ. 5. Зміна антигенних властивостей (втрата К-і Оантігенів). Набуття здатності до персистенції. 6. Зниження вірулентності у зв'язку зі втратою різних факторів патогенності (адгезії, інвазії, ендотоксину і т. п) стабільні Система генетичного контролю синтезу клітинної стінки (пептидоглікан) гранулярних форм.

Механізм фагоцитозу: Хемостаксис Сили фізико-хімічної взаємодії Градієнт концентрації 2. Стадія адгезії Осонізація (АТ, С 3 b, фібронектин, сурфактан) Фізико-хімічна взаємодія 3. Ендоцитоз 4. Мікробоцидність Кисненезалежна киснева залежна

макроорганізм 1. Порушення злиття фагосоми з лізосомою (мікобактерії туберкульозу, найпростіші, токсоплазми) 2. Резистентність до лізосомальних ферментів (гонококи, стрептококи гр А, мікобактерії, ерсинії) 3. Тривала персисенція

Механізм персистенції хламідій Типові включення, що містять елементарні та ретикулярні тільця 48 годин після інкубації Патоморфологічна модель персистенції. Після перенесеного теплового шоку у включеннях менших розмірів містяться великі патологічні форми хламідій

Макрофаг не презентує основної АГ (MOMP) Експресія ранніх Генних продуктів лізосома Антигенне навантаження Гіперпродукція Ig A, G ГЗТ Антигенна мімікрія Сфінгомієлінсодержащіе екзоцитозні бульбашки, КГ hps 60 - білки теплового шоку Ліпополісахарид. Не експресується Стан між Ретикулярними та Елементарними тільцями MOMP- не експресується

+ Антифагоцитарна активність: 1. Щільна клітинна стінка елементарних тілець (дисульфідні зв'язки між структурами білка MOMP) 2. Міцність ретикулярних тілець (полісахаридна капсула) «неспроможність» Респіраторного вибуху Активація СПОЛ та пошкодження Мембран власних клітин

ФНПα γІФ ІЛ-1 1. Посилення експресії АГ Кліткових мембран (ГКС, Fc) Активація фібробластів та епітеліальних клітин (непрофесійні фагоцити) 2. Стимуляція ІЛ 1 та ІЛ 2 3. Активація фагоцитарної акт 4. Стимуляція вироблення Інк.

Медіатори персистенції Chlamydia trachomatis Медіатор Ефект Низькі концентрації g-інтерферону Різке зниження кількості ендогенного триптофану (активація ферменту індоламін -2, 3-діоксигенази, що розщеплює триптофан до N-формілкінуреніна) ФНП-a Дефіцит енд внутрішньоклітинних мікроорганізмів шляхом посилення експресії мембранних білків клітин) Необхідний для побудови МОМР Дефіцит ц. ГМФ та висока кількість ц. АМФ Відсутність активації ферментів необхідних для диференціації РТ в ЕТ Дефіцит та/або дія антагоністів Са 2+ Порушення агрегації ендосомальних вакуолей

Медіатори персистенції Chlamydia trachomatis (продовження) L-ізолейцин Ефект може бути обумовлений включенням продукту метаболізму a-метилбутарила. З. А в синтез жирних кислот С. trachomatis з подальшим вбудовуванням "чужих" тригліцеридів у клітинну мембрану, призводячи до її дестабілізації. Дефіцит цистеїну. стінки.

«Генетичний дрейф», або антигенна мімікрія: Амінокислотна послідовність 264 -286 головного сигма-фактора РНК-полімерази хламідій (Chl. trachomatis). L 7 (пептид II), один з рибосомальних білків АТ Ревматичні аутоімунні захворювання

Персистенція Francisella tularensis цитохолазин-Позачутливий шлях Каспази 3 та 9 TNF, IL 1 23 -k. Da ендосоми

+Антилізоцимна Антилактоферинова Антикомпліментарна Активність ЛПС francisella tularentis S-ЛПС R-ЛПС Залишкова вірулентність вірулентні Низька Чутливість господаря LPS-binding protein – LBP Інертний ЛПС Швидка елімінація

Персистенція та адаптивний мутагенез у біоплівках: Стійкість біоплівок до зовнішніх впливів характеризують терміном “персистенція” (від англ. persistence – витривалість, живучість). Мертві клітини

Значення персистенції в біоплівках За даними Центру контролю захворювань (CDC USA), близько 65% всіх інфекцій обумовлено формуванням в макроорганізмі біоплівок Утворення біоплівок на всіх медичних пристроях, що вводяться в макроорганізм (катетори, протези, стенти і тд); Утворення біоплівок на медичному інструментарії.

бактерія + dna. J (синтез шаперону) у. E. coli pmr. C (синтез фосфоліпідів). S. typhimurium Несприятливі умови Експресія SOS-генів Ген rmf, інгібітор трансляції Гени теплового та холодового шоку rec. A, umu. DC, uvr. AB, sul. A Клітини-персистери htr. A, htp. X, csp. H, clp. B, cbp. AB Гени системи «токсинантитоксин» din. J/Yaf. Q, yef. M, rel. BE, maz. EF

Ген А Ген Т Ген Р антибіотик антитоксин рибосома Дефектний білок Нормальний білок Комплекс Т-А Нема синтезу білка персистенція

Основні токсини і місце їх застосування у E. Coli: токсин мішень активність Процес Ccd B ДНК-гіраза Дволанцюжкові розриви Реплікація Rel E Транслюючі рибосоми Розщеплення м. РНК Трансляція Maz F РНК Ендорибонуклеаза Трансляція Par E ДНК-церази РНК Трансляція Vap C РНК Ендорибонуклеаза Невідомо Ξ-токсин Невідомо Фосфотрансфераза Невідомо Hip A EF-TU Протеїнкіназа Трансляція Hip B Транслюючі рибосоми Розщеплення м. РНК Трансляція

Сигма-фактор РНК-полімерази RPO. Адаптивний мутагенез: ? "Адаптивними" називають мутації, які виникають у повільно розмножується або покояться популяції мікроорганізму в період тривалого стресу і які протидіють причинам, що викликає цей стрес. Veillonella parvula Streptococcus mutans Стійкість до антибіотиків

Lewis K. 2008 вважає, що головним способом боротьби з персистенцією в біоплівках є «розсіяність пацієнтів».

Цілком або частково втратили клітинну стінку або попередників її біосинтезу, що ростуть у вигляді характерних дрібних колоній. Вперше відкриті 1935 р. Клінебергер (E. Klieneberger) у культурі Streptobacillus moniliformis, виділеної К. Левадіті зі співр. у 1932 р. із суглобової рідини хворого на епідемічну суглобову еритему. Streptobacillus moniliformis - грамнегативна, гемоглобінофільна паличка з чітко здутими на кінцях, добре росте на кров'яному (10-20%) агарі та згорнутій сироватці.

При вивченні експериментальної інфекції у щурів Клінебергер виділила кілька штамів, що містять, окрім типових бактеріальних форм, поліморфні мікроорганізми, дуже подібні за видом колоній та морфології з плевропневмонієподібними організмами – pleuropneumoniae like organism (P PL О). Ці мікроорганізми було названо на честь Ін-та ім. Лістера – L-формою.

Протягом багатьох років Клінебергер розглядала L-форми як представників PPLO-симбіонтів бактерій Streptobacillus moniliformis. Доказом симбіотичного існування двох різних мікроорганізмів була відсутність реверсії бактерій з L-форм протягом 13 років (350 пересівів).

Різноманітні експерименти Амер. дослідника Дайнеса (L. Dienes) та ін. довели хибність концепції Клінебергер. Було показано, що L-форми Streptobacillus moniliformis, Fusiformis necrophorus та інших бактерій здатні реверсувати у вихідний вид бактерій. Утворення L-форм бактерій описано під назвами "L-трансформація", "L-конверсія", "індукція L-форм".

В. Д. Тимакова і Г. Я. Каган були отримані L-форми багатьох видів бактерій, вивчені їх біол, властивості та роль у патології (ревмокардит, септичний ендокардит, менінгоенцефаліт, хрон, гонорея та ін.).

Перетворення на L-форму - властивість, ймовірно, властиве всім бактеріям. Препарати, що мають L-трансформуючу дію, або блокують певні ланки біосинтезу клітинних стінок, переважно пептидоглікану (муреїну), або їх руйнують. До препаратів, що індукують L-форми бактерій, відносять: 1) антибіотики відповідного спектра дії, наприклад, пеніцилін, циклосерин, лізостафін та ін; 2) муролітичні ферменти - лізоцим, ендоацетилгексозамінідазу фагоасоційованого лізину стрептокока групи С та ін; 3) деякі амінокислоти (гліцин та ін).

Індукція L-форм бактерій залежить від умов та середовищ культивування: необхідно створення фіз.-хім. оточення, що сприяє стабілізації осмотично крихкої мембрани бактерій та оберігає L-форми від загибелі.

Склад середовища та умови культивування варіюють залежно від виду бактерій, обов'язкові напівтверда та напіврідка концентрація агарового гелю, присутність нормальної кінської сироватки та підбір осмотичної концентрації солей, що сприяють збереженню цілісності цитоплазматичної мембрани L-форм бактерій.

Розрізняють нестабільні та стабільні L-форми бактерій. Нестабільні форми зберігають деякі елементи клітинної стінки або її попередників і при пасажах на середовищах без L-індукуючого агента реверсують у вихідний вид бактерій. Стабільні форми повністю втрачають компоненти клітинної стінки і не здатні її відновити, тому вони не реверсують у вихідний вид бактерій, навіть при багаторазовому пасеруванні на середовищах без індукуючого агента, а також на середовищах, що містять сукцинат натрію або желатину, що сприяють реверсії бактерій з L-форм .

L-форми бактерій ростуть у вигляді двох типів колоній - А. та В. Колонії типу А частіше притаманні стабільним L-формам бактерій, вони дуже дрібні (50-100 мкм), вростають у агар, добре ростуть групами, поодинокі колонії часто не дають зростання. Мінімальні елементи колоній типу А, що репродукуються, повністю позбавлені клітинної стінки, не мають фагосприйнятливих рецепторів. Колонії типу В частіше притаманні нестабільним L-формам бактерій, вони більші, розміром 0,5-2 мм, з ніжним мереживним краєм і центром, що вростає в середу. У колоніях переважають кулясті тіла різної оптичної щільності; субмікроскопічних елементів у них менше, ніж у колоніях типу А. Вони зберігають деякі елементи клітинної стінки, фагосприйнятливі рецептори і можуть аглютинуватися сироваткою вихідного виду.

Диференціація колоній на типи А і В умовна, як і явище стабілізації L-форм. У культурах стабільних L-форм бактерій можуть міститися колонії типу В, а в культурах нестабільних L-форм- колонії типу А.

У складі колоній L-форм бактерій містяться: 1) сферичні тіла різної оптичної густини та розмірів; 2) елементарні тільця або гранули, що розташовуються групами, а також інтрацелюлярно у великих сферичних утвореннях або вакуолях; 3) погано контуровані, безформні тіла, що постійно ростуть; 4) звивисті форми; 5) великі тіла із включеннями у вигляді вакуолей. L-форми бактерій відрізняються поліморфізмом (рис. 1, 1-6) і водночас принципово однакові в різних видів бактерій/ що дозволяє диференціювати їх за морфол, ознакою.

Поряд із втратою клітинної стінки у L-форм бактерій втрачаються мезосоми, що призводить до безпосереднього прикріплення цитоплазматичної мембрани до нуклеоїду; відновлення мезосом у процесі реверсії немає.

Відсутність клітинної стінки обумовлює дезорганізацію поділу та множинність морфол, проявів при відтворенні L-форм бактерій. Розмножуються L-форми бактерій розподілом, брунькуванням або дезінтеграцією клітини на дрібні гранули.

Фізіол., Антигенні та патогенні особливості цих форм детерміновані структурою їх цитоплазматичної мембрани, і, можливо, цитоплазми.

L-форми бактерій утворюються не тільки in vitro, а й in vivo, вони можуть зберігатися в організмі та реверсувати у вихідну бактеріальну форму.

На малюнку 2 наведено результати отримання L-форм S. typhi in vivo під впливом пеніциліну. Бактерії та антибіотик вводили одночасно інтраперитонеально мишам. При введенні 100 ОД пеніциліну на 1 г ваги утворювалися нестабільні L-форми, що реверсують у вихідні бактеріальні форми через 24-48 год., які викликали загибель тварин. При введенні 2000 ОД пеніциліну на 1 г ваги протягом 24-48 год. утворювалися стабільні L-форми, які піддавалися фагоцитозу; загибелі тварин у найближчі 5 діб. не спостерігалося. Аналогічні дані отримані щодо індукції in vivo L-форм інших бактерій.

Розроблено оригінальну схему виділення L-форм з патол, матеріалу, яка дозволила виділити та ідентифікувати L-форми бактерій з цереброспінальної рідини хворих на гнійний менінгіт і ревмокардит.

На малюнку 3 представлені мікрофотографії L-форм, виділених з крові хворого на ревмокардит, та їх ревертантів, що утворилися в результаті реверсії в стрептококи, згодом ідентифіковані як Streptococcus hemolyticus групи А.

Антитіла до стабільних L-форм Streptococcus hemolyticus виявлені у 87,9% хворих на ревматизм, у 77% хворих на інфекційно-алергічний міокардит і всього лише у 11% здорових людей (В. Д. Тімаков, Г. Я. Каган, 1973). L-форми різних видів бактерій виявляються при хроні, бактеріурії, пієлонефритах, абактеріальних формах туберкульозу, ревмокардиті та ін.

Патогенність L-форм бактерій доведена експериментально, відомі хрон, артрити, викликані інтраартикулярним введенням L-форм Streptococcus hemolyticus, ангіна мавп, ускладнена інтерстиціальним міокардитом, індукована внутрішньовенним введенням L-форм Streptococcus hemolytic і Streptococcus faecalis, менінгоенцефаліт кроликів, пов'язаний з L-формами менінгококу, та листериоз овець та кроликів, викликаний введенням L-форм Listeria monocytogenes. Патол, процеси, обумовлені L-формами бактерій, відрізняються поступовим розвитком патол. явищ, пролонгованим перебігом та персистенцією збудника в L-формі, що підтримує перехід захворювання на хрон, форму. Персистенція L-форм бактерій встановлена ​​експериментально на L-формах Mycobacterium tuberculosis та Streptococcus hemolyticus.

При одноразовому внутрішньочеревному зараженні білих мишей стабільними L-формами Streptococcus hemolyticus та подальшому спостереженні протягом року антиген L-форм зберігається у всіх внутрішніх органах. На малюнку 4, 1 наведено приклад локалізації L-форм Streptococcus hemolyticus у селезінці через 3 тижні. після інфікування, малюнку 4, 2 - через 27 тиж. Тривала персистенція L-форм в організмі супроводжується наростанням шкідливого ефекту; розвитком інтерстиціального міокардиту та тяжкого гломерулонефриту.

Утворення L-форм бактерій in vivo, їх зв'язок з багатьма хронічно протікають процесами, можливість реверсії бактеріальних форм з відновленням їх вірулентності і виникнення рецидивів, що внаслідок цього не піддаються ефективної терапії поставили перед мед. мікробіологією проблему дослідження методів боротьби з варіантами мікроорганізмів, що втратили клітинну стінку (сферопласти, протопласти, L-форми). Пошуки ведуться з двох діаметрально протилежних позицій: 1) запобігання можливості індукції L-форм in vivo (шлях, що важко контролюється); 2) використання засобів, що індукують утворення L-форм, з подальшим застосуванням інших препаратів, недієвих щодо інтактних клітин, але проникають внутрішньоклітинно лише в L-форми бактерій і руйнують їх. Цей шлях найперспективніший. Є дані про ефективність комбінацій пеніциліну та канаміцину, які використовуються для терапії пієлонефритів. Пеніцилін індукує утворення L-форм бактерій, які руйнуються внутрішньоклітинним проникненням канаміцину, що не діє на інтактні бактерії.

Бібліогр.:Пєшков М. А. Цитологія бактерій, с. 151, М.-Л., 1955; Тімаков В.Д, і Каган Г. Я. L-форми бактерій та сімейство mycoplasmataceae у патології, М., 1973, бібліогр.; вони ж, L-форми бактерій, сімейство mycoplasmataceae і проблема мікробного персистування, Журн, мікро., епід, та імун., № 4, с. 3, 1977, бібліогр.; Di enes L. Morphology of Li of Klieneberger і його відносини до streptobacillus monoli-formis, J. Bact., v. 54, p. 231, 1947; D i e-nes L. a. Weinberger H. The L-forms of bacteria, Bact. Rev., v. 15, p. 245, 1951; Клієнбергер Е. Натуральний випадок pleuropneumonialike organisms, його apparent symbiosis with streptobacillus moniliformis і інші bacteria, J. Path. Bact., v. 40, p. 93, 1935; K li eneb erger-N obel E. Pleuropneumonia-like organisms (PPLO) mycoplasmataceae, L.- N. Y., 1962; Microbial protoplasts, spheroplasts and L-forms, ed. by L. B. Guze, Baltimore, 1968.

В. Д. Тімаков, Г. Я. Каган.

Вступ

Протягом багатьох століть вчені досліджували мікробні популяції та механізми їх формування, і лише наприкінці минулого століття зіткнулися з особливою формою організації бактеріальних культур – спільнотою мікроорганізмів, здатних колонізувати об'єкти довкілля та існувати не лише у вигляді мікропланктону, а й специфічно організованих біоплівок. Біоплівки - рухливі гетерогенні спільноти, що постійно змінюються (Чеботар, 2012), які можуть бути утворені бактеріями одного або декількох видів і складатися як з активно функціонуючих клітин, так і з тих, що покоюються або некультивуються. Формування подібних високоспеціалізованих угруповань - одна з основних стратегій виживання бактеріальних культур не тільки в навколишньому середовищі, а й в організмі людини. В цілому, біоплівки є групою мікробних клітин, оточених товстим, що складається з високомолекулярних речовин слизовим шаром.

Механізм формування біоплівок

Зазвичай мікроорганізми існують у вигляді вільно плаваючих мас або одиничних колоній, але деякі представники бактеріального царства прагнуть прикріпитися до певного субстрату-поверхні та утворити біоплівку, механізм утворення якої складний, суворо регулюємо і включає чотири послідовні стадії.

1 етап: оборотне (первинне) прикріплення до поверхні. Перший етап формування біоплівки характеризується оборотною адгезією, пов'язаною з дією неспецифічних фізико-хімічних сил між молекулами і структурами на поверхні мікроорганізмів (елементами клітинної стінки, джгутиків, пилок) і твердого субстрату за рахунок різних взаємодій: Ван-дер-Вальсових, гідрофоб електростатичних;

2 етап: незворотне прикріплення до поверхні. Після адсорбції бактеріальна клітина переміщається вздовж поверхні субстрату, міцно зв'язуючись з ним за допомогою факторів адгезії, а також за допомогою неполімерних адгезинів, що розрізняють структурні елементи поверхонь тканин господаря – колаген, еластин, глікопротеїни, гіалуронову кислоту. На цьому етапі, крім міцного прикріплення до субстрату, відбуваються: втрата бактеріями рухливості, міжклітинні взаємодії, обмін генами між мікроорганізмами як одного, і різних видів.

3 етап: дозрівання - maturation 1 . Після міцного прикріплення до субстрату і обміну генами бактерії, що прикріпилися, починають синтезувати екзополісахаридний навколишній матрикс, відомий як позаклітинна полімерна речовина ( extracellular polymeric substance), який є запобіжним «слизом» і становить 85% усієї зрілої біоплівки (Чеботар, 2012; Фролова, 2015). Цей матрикс сприяє утворенню початкової біоплівки із дрібних колоній бактерій. Компоненти екзополісахариду варіюють залежно від того, які мікроорганізми є його частиною.

4 етап: зростання - maturation 2 . На даному етапі утворюється зріла біоплівка, після чого настає пора вторинних колонізаторів, тобто клітин, які прикріплюються до бактерій, які вже локалізовані на поверхні (Афіногенова, 2011).

Зрілі біоплівки здатні втрачати поодинокі фрагменти, які, поширюючись макроорганізмом, прикріплюються до субстратів і утворюють нові біоплівки. Крім того, у зрілих біоплівках бактерії не діляться, тому що оточені щільним матриксом, і зберігають високу життєздатність.

Формування біоплівки відбувається досить швидко. Приєднання бактерій один до одного відбувається за кілька хвилин, міцно зв'язані колонії утворюються за 2-4 години, а вироблення позаклітинної полімерної речовини відбувається протягом 6-12 годин, після чого бактерії, що утворюють біоплівку, стають значною мірою толерантними до антибіотиків, дезінфікуючих речовин , антисептикам. Крім того, біоплівки швидко відновлюються після механічної дії (Чеботар, 2012).

Ультраструктура біоплівок

Ультраструктура біоплівок встановлена ​​за допомогою конфокальної скануючої лазерної мікроскопії. Позаклітинний матрикс мікробних клітин має специфічну будову та утворений тривимірними грибоподібними або колоноподібними структурами. Виділяється на етапі дозрівання біоплівок екзополісахарид представлений двошаровим гетерополісахаридом, універсальним для кожного виду мікроорганізмів. Його зовнішній шар містить полісахариди в гідратованому стані (декстран, гіалуронову кислоту, целюлозу), а внутрішній наповнений мембранними везикулами, які здатні виступати в ролі факторів патогенності (такі везикули містять лужну фосфатазу, протеази, лізоцим). Речовини везикул також виконують функцію лізису ослаблених бактеріальних клітин, фрагменти яких надалі є ростовим фактором та джерелом живлення для інших членів біоплівки.

Усі складові матриксу розділені каналами, якими здійснюється транспорт поживних речовин, кисню, і навіть виділення кінцевих продуктів метаболізму бактеріальних клітин. За утворення та збереження таких транспортних каналів несуть відповідальність поверхневі структури – рамноліпіди, що складаються із суміші полісахаридів, білків, нуклеїнових кислот та інших речовин.

У матриксі біоплівки також знаходиться екстрацелюлярна ДНК, яка бере участь у процесах адгезії, міжклітинних взаємодіях та зумовлює специфіку існування біоплівкових угруповань (Тет, 2012).

Морфологія клітин, що входять до складу біоплівки

За допомогою електронної мікроскопії встановлено, що на початкових етапах формування біоплівки морфологія мікроорганізмів не змінюється (Фролова, 2015). На наступних, пізніших етапах, бактеріальні структури набувають морфологічної специфіки, пов'язаної з прикріпленим станом та колективним співіснуванням. Крім того, у клітин у складі біоплівки відбувається заміна поверхневих структур, збільшується частота обміну генетичним матеріалом між особами у співтоваристві, деформується ультраструктурна організація.

Властивості та роль у захисті бактеріальних популяцій

Біоплівки є одним із найбільш значущих факторів захисту, суттєво підвищуючи толерантність бактерій до стресових ситуацій (нестача кисню та поживних речовин в умовах голодування), до факторів імунної системи людського організму, до дії зовнішніх умов (антибіотики, дезінфектори, стерилізація). Така толерантність сприяє набуттю абсолютної резистентності до факторів, які могли б знищити бактерій, перебуваючи вони у вільному стані.

Захисна роль біоплівок полягає в наступних властивостях:

  1. Властивість бар'єру. Біопленки запобігають глибокому проникненню в їх матрикс великих молекул і клітин, що викликають запалення, і служать дифузним бар'єром для маленьких антимікробних агентів;
  2. Сукупні захисні властивості. Бактерії (як одного, і різних видів) здатні обмінюватися чинниками захисту (продуктами метаболізму чи генами), тобто здійснювати взаємозахист. Так, бактерії одного виду, резистентні до дії антибіотиків, можуть передавати гени, відповідальні за резистентність, бактеріям іншого виду, до даного антибіотику чутливим, забезпечуючи таким чином підвищення їхньої стійкості до дії фактора;
  3. Властивість обміну, що забезпечує передачу між мікроорганізмами, що входять до складу однієї біоплівки, генів та продуктів життєдіяльності (Чеботар, 2012; Тец, 2012);
  4. Властивість бездіяльності, тобто утворення нерухомих (неактивних, неметаболізуючих, сплячих) субпопуляцій – ключова властивість, властива виключно біоплівкам. Для того, щоб антибіотик подіяв на мікроорганізм, він повинен бути метаболічно активним. Тому неактивні бактерії в біоплівках є найбільш стійкими до таких впливів (Тец, 2012; Фролова, 2015).

Різноманітність систем регуляції біоплівкоутворення

Клітини у складі міжклітинного матриксу мають « почуттям кворуму» ( quorum sensing) - здатністю передавати інформацію та регулювати свою поведінку за рахунок секреції сигнальних молекул. Іншими словами, це система регуляції, що знаходиться всередині біоплівки. Відомо три системи, які відрізняються одна від одної природою аутоіндукторів:

  1. Використовується переважно грамнегативними бактеріями, а як сигнальні молекули виступають ацильований лактон гомосерину, який зв'язується з білком-регулятором, що взаємодіє з двома регуляторними ферментами - люциферазою і гомосерин-лактоно-синтазою. Активація регуляторних білків індукує створення мікробами кластерів біоплівки (Тец, 2012; Туркутюков, 2013).
  2. Характерна для грампозитивних бактерій і функціонує з використанням лінійних та циклічних форм пептидів, фуранів, лактонів, їх похідних, що секретуються у зовнішнє середовище. Одні з них взаємодіють з мембранозв'язуючими сенсорними кіназами, які проводять сигнал через мембрану, інші транспортуються в клітину за допомогою пермеаз, де зв'язуються із внутрішньоклітинними рецепторами. Сигнальним механізмом таких систем є каскад фосфорилювання-дефосфорилування. Інформаційні молекули взаємодіють із двокомпонентними системами, до складу яких входить сигнальний білок кіназу, пов'язаний з мембраною. Кіназа визначає інформаційний пептид, а потім фосфорилює та активує білок-регулятор, що зв'язується з ДНК та регулює транскрипцію. Сигнальні пептиди цієї системи закодовані у хромосомі, а рецепторні білки – у плазмідах. Таким чином, за допомогою подібної комунікації транслокуються плазміди, що несуть гени стійкості до антибіотиків, гени гемолізинів, бактеріоцинів та гени вірулентності.
  3. Зустрічається у всіх мікроорганізмів, а сигнальні молекули представлені бутиролактоном, хінолом, гідроксикетонами, люциферазою. У бактерій є сенсорні рецепторні білки, які пов'язують аутоіндуктори, утворюючи комплекс, що взаємодіє з мембранозв'язаною кіназою. Кіназа фосфорилюється, фосфат переноситься на цитоплазматичний білок, потім регуляторний білок, який зв'язується з ДНК. Надалі відбувається активація генів, що кодують регуляторні РНК, що веде до припинення експресії компонентів клітинних структур, що реалізують міжвидові міжклітинні комунікації.

Така складна система регуляції, що базується на продукції сигнальних молекул-індукторів, здійснюється на різних рівнях впливу: транскрипційному, трансляційному, посттрансляційному. Завдяки «почуттю кворуму» у популяції біоплівки постійно відбувається два види селекції – позитивна та негативна, тобто зберігаються клітини з вигідними властивостями та знищуються бактерії з «непотрібними» фенотипами (Тец, 2012).

Участь ТА системи (система токсин-антитоксин) в освіті біоплівки

Говорячи про біоплівки, варто відзначити, що не кожен мікроорганізм здатний до їх утворення. Процес синтезу екзополісахаридного матриксу обумовлений певними факторами. Згідно з останніми результатами дослідження Страсбурзького університету ім. Луї Пастера можна стверджувати, що для утворення біоплівки потрібна наявність спеціалізованого білка. Наприклад, для утворення спільноти Staphylococcus aureusпотрібна наявність SasG-білка (у комплексі з Zn 2+). SasG-білок являє собою РНК-зв'язуючий білок, який активізує:

1) зростання поверхневих структур бактерій - джгутиків, пилок;

2) синтез позаклітинних полісахаридів;

3) забезпечує формування толерантності.

За секрецію SasG-білка відповідає набір двох або більше тісно пов'язаних генів, які разом кодують і білок, і відповідний йому блокатор.

Ця система отримала назву TA-модуль. Вона локалізована у плазміді. Це досить складна система, яка забезпечує не лише можливість бактерій утворювати біоплівки, а й забезпечує її життєздатність загалом. Відповідно до роботи (Yamaguchi, 2011), якщо дочірня клітина позбавлена ​​плазміди, то нестабільний антитоксин (блокатор), успадкований із цитоплазмою материнської клітини, руйнується, а стабільний токсичний білок вбиває клітину.

Крім цього, ТА-модуль відповідає за:

1) регуляцію генів: деякі токсини діють як загальні репресори експресії генів, тоді як інші специфічніші;

2) контроль зростання: як зазначалося, бактеріостатичні токсини не вбивають клітину-господаря, а обмежують її зростання;

3) стійкість клітини: у деяких популяціях бактерій є субпопуляція клітин, що має стійкість до дії безлічі класів антибіотиків. Субпопуляція контролюється системами токсин-антитоксин. Ці повільнорослі витривалі клітини страхують популяцію від повного вимирання.

4) програмовану загибель клітини і виживання її «близьких родичів» - різний рівень стійкості клітин популяції до стресовим умовам, що зумовлює програмовану загибель деяких клітин, яка запобігає вимирання всієї популяції (померла клітина стає джерелом харчування інших).

5) протидія бактеріофагам: коли бактеріофаг порушує транскрипцію та трансляцію клітинних білків, активація систем токсин-антитоксин обмежує реплікацію фага.

Клінічний аспект вивчення біоплівок

В даний час достовірно доведено роль мікробних біоплівок у виникненні та розвитку багатьох інфекційних захворювань. Це інфекції серцевих клапанів та суглобових протезів, інфекції ранових поверхонь. Рани є ідеальним субстратом для мікробної контамінації з подальшим утворенням біоплівок. Біоплівки у рані створюють середовище з певним мікрокліматом, котрим характерно низький вміст кисню. Біоплівки затримують міграцію та проліферацію кератиноцитів, інгібуючи цим захисні імунні механізми, а зовні створюють захисний шар, непроникний для протимікробних препаратів місцевої дії (Чеботар, 2012а).

Характерними біоплівковими інфекційними патологіями є гінгівіти (запалення ясен), стоматити (запалення слизової рота), утворення зубного каменю. Отити - найчастіше зустрічається отоларингологічна проблема - також супроводжуються утворенням біоплівок, причому не тільки бактеріальних, а й грибкових.

Крім ранових інфекцій, біоплівки відіграють роль у хронізації захворювань сечовидільної системи, катетер- та імплант-асоційованих інфекцій (катетери, водії ритму, серцеві клапани, ортопедичні пристрої), захворювань ССС (синуситах, ендокардитах). Іншими словами, біоплівки відіграють найважливішу роль у патогенезі широкого спектру як поверхневих, так і глибоких інфекційних захворювань. Всі ці захворювання важкі для лікування, мають високу частоту рецидивів і деякі з них можуть спричинити летальні наслідки.

При підозрі на наявність біоплівкоутворюючих мікроорганізмів in vivoвраховуються такі фактори:

1) відшарування біоплівок у кровотоку або сечовивідному тракті може призводити до формування емболів;

2) біоплівки грамнегативних бактерій можуть продукувати ендотоксин (ліпополісахарид), що веде до інфекційно-токсичного шоку та ДВС-синдрому;

3) бактерії в біоплівках можуть обмінюватися плазмідами резистентності (передача резистентності від виду на вигляд);

4) бактерії в біоплівці не піддаються впливу імунної системи господаря;

5) біоплівки можуть знижувати чутливість бактерій до антимікробного агента.

Останні три пункти вказують на те, що біоплівки мають високу резистентність до антибіотиків. Однак щодо них доречніше вжити термін толерантність. Прикладом виникнення феномена толерантності може бути SasG-білок Staphylococcus aureus. Його біосинтез провокує збій у постреплікаційному циклі, при якому порушується функціонування бактеріального ферменту гірази (аналог топоізомерази-4 у бактерій). Це призводить до виникнення персистерів.

Персистери - унікальні клітини бактеріальних спільнот, які, володіючи тим самим набором генів, що й інші мікроорганізми співтовариства, багаторазово стійкі до зовнішніх факторів на відміну від клітин, що їх оточують (Ульянов, 2014). Персистери відрізняються від звичайних бактерій своєю фізіологією: навіть у сприятливих умовах вони формують навколо себе екзополісахаридний матрикс, часто ростуть набагато повільніше за звичайні бактерії, і, як уже було сказано, відрізняються високою резистентністю до зовнішніх факторів. Персистери становлять невелику частину бактеріального співтовариства, але їх кількість зростає у стаціонарній фазі зростання. Цікаво, що дочірні клітини мають таку ж резистентність до зовнішніх факторів, як і батьківські клітини-персистери.

Розглянемо механізм резистентності персистерів. Припустимо, що на бактеріальну колонію діє зовнішній фактор – наприклад, антибіотик. Антибіотик інгібує активність гірази (топоізомерази-4), внаслідок чого в бактеріальній клітині виникають дволанцюжкові розриви ДНК, але тільки в тих ділянках, де гіраза активна, тобто в районі «реплікативної вилки». Якщо клітини захищені позаклітинною полімерною речовиною, кількість таких місць не більше двох-чотирьох, то клітинні системи захищають бактерію від загибелі, відновлюючи пошкодження. У звичайних швидкорослих бактеріальних клітин подібних розривів багато і ДНК при застосуванні антибіотика деградує, тоді як ДНК персистерів зберігається. Дія антибіотиків може бути різною, але вони всі зустрічаються з однією і тією ж проблемою: повільно розвиваються, добре захищені персистори менш схильні до стресу і встигають «законсервуватися», перш ніж їм буде завдано незворотної шкоди.

Наведена інформація не вичерпує даних про особливості мікробних біоплівок. Слід зазначити, що, незважаючи на великий теоретичний матеріал та важливість проблеми, залишаються невирішеними питання, пов'язані з біоплівкоутворювальною активністю патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів у складі нозокоміальної мікрофлори медичних стаціонарів різного профілю. Відсутні препарати, що володіють ефективністю проти біоплівок та мікрофлори у складі позаклітинних матриксів, а також засоби боротьби зі зрілими біоплівками. Ця проблема потребує подальших розробок.

Бібліографія


1. Yamaguchi Y., Inouye M. Regulation of growth and death in Escherichia coli за допомогою токсин-антитоксинних систем. Nature Reviews Microbiology 2011, 9 (11): 779-790.

2. Афіногенова А.Г., Доровська О.М. Мікробні біоплівки ран: стан питання // Травмотологія та ортопедія. - 2011. - №3. - С.119-125.

3. Балко А.Б., Балко О.І., Авдєєва Л.В. Формування біоплівки штамами Pseudomonas aeruginosa // Мікробіологічний журнал. - 2013. - №2. - С.50-56.

4. Мальцев С.В., Мансурова Г.Ш. Що таке біоплівка? //Практична медицина. - 2011. - №53. - С.7-10.

5. Тец В.В., Тец. Г.В. Мікробні біоплівки та проблеми антибіотикотерапії // Практична пульмонологія. - 2013. - №4. - С. 60-64.

6. Туркутюков В.Б., Ібрагімова Т.Д., Фомін Д.В. Молекулярні особливості морфології біоплівок, що формуються штамами неферментуючих грамнегативних бактерій // Тихоокенський медичний журнал. - 2013. - №4. - С.44-47.

7. Ульянов В.Ю., Определенцева С.В., Швиденко І.Г., Норкін І.А., Коршунов Г.В., Гладкова О.В. Біологічна кінетика біоплівок клінічних штамів Staphylococcus aureus та Pseudomonas aeruginosa, виділених у хворих з бронхолегеневими ускладненнями при травматичній хворобі спинного мозку // Клінічна лабораторна діагностика. - 2014. - №8. - С.43-47.

8. Фролова Я.М. Біологічні властивості біоплівок токсигенних штамів Corinobacterium Diphtheriae gravis TOX+: дис. … канд.біол.наук: 12.06.2015 / Фролова Яна Миколаївна. - Ростов, 2015. - 118 с.

9. Чеботар І.В. Механізм антибіопленочного імунітету // Вісник Російської академії медичних наук. - 2012. - Т.67. - №12. - С.22-29.

10. Чеботар І.В., Кончалова О.Д., Бугрова М.Л. Везикулярні структури у системі «Нейтрофіл – Біоплівка Staphylococcus aureus» // Інфекційна імунологія. - 2012а. - №61. - С.35-39.