Біочипи – високі технології у медичній діагностиці. Біочіпи: загальні відомості Біологічні мікрочіпи

Доповідь нижегородських учених з експрес-діагностики онкології за допомогою біочіпу визнається найкращою у секції «Цитологія» на 29-му Європейському конгресі з патології! – після цих слів вітати росіян кинулися колеги з Італії, Хорватії, Туреччини, Німеччини… Воно й зрозуміло – потрапити до числа найкращих на цьому конгресі – все одно, що отримати Оскар у кінематографі. Щороку за це право в Амстердамі борються головні медичні світила з усього світу.

Розробкою цього біочіпа ми займаємося з 2012 року, але свій нинішній вигляд він набув лише кілька років тому, коли з'явився інвестор, – розповідає один із авторів проекту, керівник лабораторії молекулярної біології та біотехнології ННДІ ім. Блохіної Олег Уткін. – Аналогів цій тест-системі немає ніде у світі, достовірність діагнозу становить 95%.

Те, що у стінах нижегородського інституту йде розробка унікальної технології, одразу й не скажеш. Ні тобі таємних паролів на вході, ні автоматників на охороні. З усіх запобіжних заходів - тільки бахіли і обов'язковий білий халат на вході в лабораторію.

Ось це і є наш біочіп, - показує мені Олег крихітну, ледь помітну на долоні скляну платівку. Дивлячись на цю крихту, важко віриться, що вона здатна виявити практично будь-який вид раку всього за півтори години. За цю технологію багато президентів віддали б півцарства та доньку на додачу.

Принцип дії цієї системи простий: беремо будь-який біоматеріал – серозну рідину, сечу чи післяопераційний матеріал – і вносимо до осередків биочипа. Загалом у чіпі 15 секторів, у кожному з яких міститься помічений флуоресцентним розчином білок. Якщо буде виявлено якісь ознаки онкології, то клітини в осередку покажуть свічення під флюоресцентним мікроскопом.

До речі, на відміну від решти методів діагностики, біочіп не тільки просигналізує про сам факт онкологічного захворювання, а й визначить його різновид і де є метастази, - тим самим допоможе лікареві дати прогноз перебігу хвороби і підбору персональної терапії. На сьогоднішній день тест-система здатна діагностувати чи не всі види раку: легень, молочної залози, шлунка, товстої кишки, яєчників… Залежно від підозрюваного різновиду онкології змінюватиметься і набір білків у біочипі.

Зараз існує вісім різновидів таких тест-систем - від звичайної скринінгової, яка просто виявляє наявність онкології до заточених під кожну патологію, - пояснюють розробники. – Що найголовніше – для проведення досліджень не потрібно ні дорогих лабораторій, ні величезного штату висококваліфікованих лікарів. Внести біоматеріал до нашої тест-системи може будь-який лаборант, після чого лікар-онколог вже може зробити висновок.

За цю розробку вченим уже вручили національну премію "Покликання". ФОТО: Прес-служба НижДМА

Ці биочипы прості у експлуатації, а й у виробництві. У невеликій лабораторії щодня можна робити тисячі таких систем. Звідси і їхня дешевизна – один такий чіп поліклініці коштуватиме трохи більше тисячі рублів. А для самого пацієнта діагностика і зовсім буде безкоштовною – вона має увійти до системи ЗМС.

Ми вже отримали всі необхідні патенти – російський та зарубіжний, – розповідає Олег Уткін. – Але щоб біочіпи надійшли до поліклініки, нам необхідний реєстраційний висновок Росздраву. Сподіваємося найближчим часом отримати його. Після цього за пару місяців зможемо запустити масове виробництво.

Зі свого боку російське МОЗ вручило нижегородським розробникам престижну національну премію «Покликання», що присуджується найкращим лікарям Росії, у номінації «За створення нового методу діагностики».

ДОВІДКА «КП»

У розробці біочіпа беруть участь провідні вчені трьох російських дослідницьких центрів: ФБУН «ННДІЕМ ім. академіка І.М. Блохіна», ФДБУ «РОНЦ ім. Н.М. Блохіна», ФДБОУ ВО «НижДМА». Цією технологією вже зацікавилися вчені з Росії, Японії, Швейцарії, Китаю, Білорусі, Казахстану та Вірменії.

Біочип – це організоване розміщення молекул ДНК чи білка на спеціальному носії – «платформі».

Платформа являє собою платівку площею всього 1 см2 або трохи більше. Вона зроблена зі скла або пластику, або з кремнію. На ній у строго визначеному порядку може бути розміщено безліч молекул ДНК чи білка. Звідси і присутність у терміні слова - "мікро".

На біочіпі можна проводити аналіз молекул різних речовин. Для цього на ньому закріплюють «дізнаються» молекули. Кожну з таких молекул позначають терміном - "молекула-зонд", а кожну з досліджуваних молекул -

"Молекула-проба".

Молекула-зонд биочипе визначається самим дослідником, тобто. він планує, яку молекулу потрібно шукати серед молекул у досліджуваному матеріалі – рідини тощо. Якщо мікрочіпі досліджується ДНК – це ДНК-чип, якщо молекула білка – білковий чіп.

Як фіксуються молекули-зонди на біочіпі?

У багатьох країнах молекули-зонди прикріплюють до скляної пластинки, тобто. до підкладки за допомогою лазерів. У нашій країні молекули-зонди розміщуються в комірки з гелю, діаметром менше 100 мікрон кожна, комірки фіксовані до платівки у процесі виготовлення мікрочіпа. Кількість осередків на чіпі сягає вже кілька тисяч.

У осередках молекули-зонди хімічно прив'язані й у функціонально активному стані.

Оскільки клітини заповнені гелем тривимірної структури, вони утримують більше молекул-зондов, ніж чіпи, у яких молекули- зонди просто прикріплені до пластинки. Важливо і те, що хімічна реакція між молекулою-зондом і молекулою-пробою, що вноситься в комірку з гелю, протікає як і в рідинах, а значить, як і в живому організмі.

Вивчення геному та протеома кожного типу клітини в нормі та за будь-якої хвороби дозволить з'ясувати – який ген чи гени викликають ту чи іншу хворобу.

На ДНК-чіпі з'ясовується причина виникнення хвороби: дефекти у структурі гена чи генів, чи зміни активності гена за нормальної його структурі.

На білковому чіпі визначаються наслідки «поломок» у гені щодо змін його продукту – білків у клітині. Зміни у гені клітини чи білку – це їх мітка чи маркер (від англ. mark – знак, мітка).

Звідси: ген із міткою – це ген-маркер, а білок із міткою – це білок-маркер. Ці маркери дозволяють виявляти у пацієнта дефектну або хвору клітину, характерну для конкретної хвороби, у тому числі ракову стовбурову клітину. При діагностиці хвороби ген-маркер та білок-маркер для контролю порівнюють із нормальним геном клітини та його продуктом – білками.

Зрозуміло, що на ДНК-чіпі молекулою-зондом є ген-маркер, а для контролю в окремому осередку – нормальний ген, в білковому мікрочіпі як молекула-зонд може бути або антитіло, або антиген.

Способи виготовлення біочипів

1. Молекули ДНК або білка попередньо синтезують, а потім розміщують на матриці. Недолік цього: невисока щільність молекули- зонда на матриці – до 1000 молекул і трудомісткий процес їх синтезу.

Копії гена-маркера можна отримати ПЛР-ММК методом такого методу для копій білка-маркера немає. Його копії можна створювати вбудовуванням гена іРНК білка-маркера в бактерію: E. coli або в клітини дріжджів.

2. Для ДНК-чіпів синтез олігонуклеотидів виробляють безпосередньо на матриці. Такі чіпи мають набагато більшу щільність молекул-зондів.

3. Нанесення олігонуклеотидів у строго визначене місце матриці струминним принтером.

У нашій країні біочіпи – ДНК-чіп та білковий чіп готують за першим способом.

Біочип - новий пристрій для медицини XXI століття. За молекулами-маркерами він дозволяє:

1) діагностувати будь-яку хворобу: до її початку або на самому її початку;

2) знаходити в організмі той чи інший вірус, бактерії та ракові клітини;

3) білковим чіпом можна знаходити ліки серед низькомолекулярних сполук у ряді аналізованих матеріалів;

4) вирішення цих завдань на биочипах можна зробити за лічені години, а чи не дні тощо.

Принцип дії біочіпів та етапи аналізу

1. ДНК-чіп.

Ми знаємо, що молекула ДНК і двох комплементарних ланцюгів. Основа кожного ланцюга – це послідовність із чотирьох азотистих основ: аденін (А), гуанін (Г), тимін (Г) та цитозин (Ц).

При цьому послідовність основ одного ланцюга визначає послідовність основ в іншій: А-Т та Г-Ц. Коли між цими комплементарними основами спонтанно утворюються водневі зв'язки, два ланцюги з'єднуються, тобто. гібридизуються у подвійну спіраль та утримують ланцюги разом. Саме на здатності комплементарних основ зв'язуватися один з одним: А з Т, а Г з Ц заснований на принцип дії ДНК-чіпа.

Етапи аналізу за допомогою ДНК-чіпа

1. У осередках чіпа фіксовані копії відомого гена-маркера як одного ланцюга цього гена, тобто. його «половинки» – кДНК.

2. З плазми від пацієнта виділяється копія гена-маркера, тобто. іРНК.

3. На молекулі иРНК з допомогою ферменту зворотної транскриптази синтезують інший ланцюг гена-маркера, тобто. другу його «половинку» – кДНК. ПЛР-ММК розмножують цю кДНК – це молекули-проби, і їх мітять флуоресцентним барвником.

4. Роботом поміщають молекули-проби у певні осередки на чіпі з копією генів-маркерів ракової стовбурової клітини.

Якщо кДНК генів зі зразка плазми комплементарна з кДНК у відповідних осередках, між ними відбудеться гібридизація, і такі осередки почнуть світитися. Чіп сканують лазером, стежачи за інтенсивністю сигналу флуоресценції у кожному осередку. Тобто гени-маркери у плазмі є, а отже, в організмі пацієнта є ракові стовбурові клітини.

Якщо немає гібридизації між цими молекулами, отже, немає гена-маркера ракової стовбурової клітини у цьому зразку плазми.

Коли є ген із мутацією, тоді буде гібридизація його кДНК на чіпі з кДНК молекули-зонда, що має цю мутацію. Якщо це ген-супресор wt53, це також може вказувати на наявність в організмі пацієнта ракової стовбурової клітини або клітин.

Ракова клітина виникає зі стовбурової клітини тканини через включення до неї генів фетальних білків. Тому в молекулах-пробах плазми пацієнта будуть кДНК цих генів та відсутність їх у контролі.

Чим менше у зразку плазми від пацієнта титр епімутантних та мутантних генів-маркерів, тим менше ракових клітин у його організмі.

Виявлення ракових клітин у зразку плазми крові або інших біологічних рідин від пацієнта – сеча, слина, слізна рідина та ін. за генами-маркерами, дає можливість поставити діагноз раку, а по генах-маркерах властивості інвазії ракової клітини – мікрометастази раку. І це задовго до виявлення їх стандартними методами – УЗД, рентгенографія, комп'ютерна томографія та ін.

Біочипом генам-маркерам можна виявляти загрозу хвороби. Так, якщо виявлено гени-маркери, але ще немає їх продуктів – білків у клітині, то це виявлення передхвороби. Стосовно раку – це передракові клітини. Так як в цьому випадку біочіп дозволяє виявити тільки ймовірність хвороби, то такий чіп поки що не піддається сертифікації.

Плазма крові пацієнта – це головний резервуар, куди проникають гени-маркери з дефектних або хворих клітин, що гинуть, при конкретній хворобі з різних органів, у тому числі з ракових клітин. Такі клітини в організмі можуть гинути за рахунок некрозу та апоптозу, а їх гени через міжклітинну рідину потім проникають у кров.

Низький титр генів-маркерів у плазмі крові пацієнта щодо аналізу на ДНК-чіпі та відсутності їх продукту – білків, може означати передхворобу, а за наявності їх – хворобу. У такому ж значенні це стосується і раку. Це могло б означати ранню діагностику раку – її II рівень.

2. Білковий чіп.

Будова чіпа для аналізу білків те саме, що й у ДНК-чіпів. Лише ті чіпи, на яких проходить ферментативна реакція, мають більш рідкісне розташування осередків, а ті, на яких йде ДНК-реакція, – частіше.

Білки-маркери – це продукт «поломок» гена або генів, вони перетворюють нормальну клітину на дефектну або хвору клітину при конкретній хворобі. Ці білки з'являються на поверхні клітин та є білками-антигенами і для кожної хвороби вони свої.

На раковій стовбурній клітині з'являються фетальні білки та білки-рецептори, яких немає на нормальній стовбуровій клітині. Чи є вони білками-антигенами – питання не вирішено.

У білковому чіпі як молекула-зонд, тобто. білка-маркера дефектної або хворої клітини може бути білок-антиген, тоді у сироватці від пацієнта визначають антитіла до нього. Якщо молекулою-зондом береться антитіло, то сироватці крові від пацієнта шукають білок-антиген.

У зв'язку з розшифровкою геному людини потрібен аналіз функцій величезної кількості білків у клітинах різного типу, зокрема раніше невідомих. Тисячі білків можуть бути фіксовані в різних осередках мікрочіпа і одночасно аналізовані на здатність пов'язувати відомий ліганд, каталізувати ту чи іншу ферментативну реакцію, взаємодіяти з антитілами, низькомолекулярними сполуками та ін.

У раковій клітині важливо вивчати крім білків-маркерів, білків-рецепторів та антитіл до них, білки властивості інвазії, фактор росту ендотелію судин-1 та білок-рецептор до нього на поверхні гемопоетичної клітини та ін.

Принцип дії білкового чіпа

Він також заснований на комплементарності молекул, що беруть участь, але білкових.

1. Антиген зі своїм антитілом. Антиген – це будь-яка речовина, до складу якої зазвичай входить якийсь білок, здатний викликати імунну реакцію.

Антитіло – це молекула білка, що секретується однією з клітин імунної системи. Форма цієї молекули та розподіл електричного заряду по її поверхні роблять її здатною пов'язувати антиген, комплементарний їй за формою та розподілом заряду.

Вперше ще 1942 р. нобелівський лауреат Л. Полінг та його колеги висунули вірний постулат, що тривимірна структура антигену та його антитіла

Комплементарні і, таким чином, «несуть відповідальність» за утворення комплексу – антиген-антитіло.

2. Субстрат із своїм ферментом. За підсумками гіпотези топохімічного відповідності специфічність дії ферменту пов'язані з впізнаванням тієї частини субстрату, яка змінюється при каталізі. Між цією частиною субстрату та субстратним центром ферменту виникають точкові контакти та водневі зв'язки.

3. Білок із низькомолекулярною сполукою. Для пригнічення білка необхідний зв'язок між ними - комплементарної поверхні з'єднання з активними ділянками молекули білка,

4. Фермент із низькомолекулярною сполукою. Ферменти та інші білки створюють всі властивості ракової клітини, тому є основними мішенями для ліків. Для блокади ферменту низькомолекулярною сполукою також необхідна між ними комплементарність: поверхня молекули сполуки при цьому має бути копією поверхні ділянки субстрату, яка не змінюється під час каталізу.

Етапи аналізу за допомогою білкового чіпа

1. У осередках чіпа фіксований відомий білок-антитіло до білка, який створює дефектну або хвору клітину конкретної хвороби. Білок, що шукається, - це білок-маркер.

2. Із сироватки крові від пацієнта береться зразок сироватки для аналізу. До зразка додають флуоресцентний барвник – кожна молекула білка-маркера отримує цю речовину.

3. За допомогою робота краплі сироватки із зразка поміщають у певні осередки чіпа. Молекули-зонди шукають комплементарні молекули серед молекул-проб. Якщо є така молекула, вона зв'язується з молекулою-зондом в осередку чіпа; між ними відбувається хімічна реакція і вона починає світитися.

4. Осередки, в яких з'явилося яскраве свічення, вкажуть на присутність білка-маркера, що шукається. Так як цей білок-маркер із дефектної або хворої клітини при конкретній хворобі, це вкаже на початок у пацієнта цієї хвороби. Точно також виявляють присутність в організмі пацієнта ракової клітини по їх білках-маркерам.

Якщо в клітинках чіпа фіксований білок-антиген, тоді в сироватці крові пацієнта шукають антитіла до білка-маркера. Якщо в сироватці виявляться антитіла до білка-маркера, це вказуватиме на наявність в організмі пацієнта ракових клітин, тобто. пацієнт хворий. А щодо білків-маркерів властивості інвазії ракової клітини, наприклад, за наявності білка Mts1 та інших, можна реєструвати десь в організмі у пацієнта мікрометастази ракових клітин.

Ми вже знаємо, що білки, які утворюються у ракових клітинах, але відсутні у нормальних, це білки-маркери чи антигени. Наявність таких білків - ознака того, що ген, що викликає переродження нормальної клітини на ракову, почав свою руйнівну роботу. Виявлення ракової клітини(-ок) за білками-маркерами дозволяє поставити діагноз раку або його мікрометастазів задовго до виявлення його симптомів у пацієнта. Титр білка-маркера у сироватці крові пацієнта визначає кількість ракових клітин у його організмі. Низький титр білків-маркерів із ракових клітин у сироватці крові, а також в інших рідинах пацієнта – ознака малої кількості ракових клітин в організмі пацієнта. Це могло б стати ранньою діагностикою раку – II її рівень.

Отже, у ХХІ столітті принаймні виявлення генів-маркерів і білків-маркерів, які викликають конкретну хворобу, діагностика її, зокрема і раку, стане ранньою, тобто. на двох рівнях: 1) «до початку» – за генами-маркерами та 2) «на самому початку» – за білками-маркерами.

Гени-маркери та білки-маркери в дефектній чи хворій клітині – це цілі чи мішені для нових ліків. На їх основі створюватимуться ліки та інші засоби, у тому числі – вакцини. За рахунок комплементарності до молекул-мішеней ліки діятимуть вибірково, не пошкоджуючи нормальні клітини.

Лікар, діючи на гени-маркери хвороби, зможе її запобігти, а на білки-маркери клітин її можна буде вилікувати в самому «зародку».

Цими двома шляхами лікар отримає, так би мовити, повну владу будь-якої хвороби на клітинному рівні.

Пошук генів-маркерів і білків-маркерів у різних середовищах організму пацієнта швидко і точно можна виконувати на біочіпах, а гени-маркери, крім цього, можна виявляти за допомогою найточніших методів: ПЛР-ММК та МС-ПЛР. Це означатиме революцію у медицині.

Вчені виявлять гени-маркери та білки-маркери, що викликають конкретну хворобу, у тому числі виникнення ракової клітини. Тоді стане можливим розробити для ранньої діагностики будь-якої хвороби мінімум наборів: генів-маркерів та білків-маркерів. Вони будуть доповнюватися та уточнюватись у міру отримання нових знань. Це буде генний та білковий «профілі» хвороби, які будуть перенесені на біочіпи.

Тестування людини на маркери певної хвороби за допомогою ДНК-чіпа та білкового чіпа має кілька переваг.

Негативний результат – принесе людині радість і може позбавити його обстеження стандартними методами: ультразвукове дослідження, рентгенографія та ін.

Позитивний результат – дасть людині можливість, а також час на те, щоб вжити заходів для зниження ризику виникнення хвороби, або за її початку – розпочати відповідне лікування.

Особливого значення має рання діагностика раку. Це пов'язано з тим, що, по-перше, причина раку - ракова клітина, а вона з клітини свого організму-господаря і, по-друге, аж донедавна не було відомо абсолютних відмінностей ракової клітини від нормальної клітини.

Досі вважається, що для кожного типу ракової клітини характерні «свої» гени та білки. Але геном у клітині кожного типу – той самий. Якщо прийняти, що з кожного типу клітин ракова клітина – «своя», тоді чому властивості ракової клітини будь-якого типу – однакові?

Тип клітини створюється репресією одних генів – через метилювання та експресією інших генів – за рахунок деметилювання їх промотору.

Тепер також доведено, що клітина будь-якого типу стає раковою за рахунок дерепресії у ній генів фетальних білків. Тобто формування типу клітини та виникнення ракової клітини з нормальної клітини – це незалежні один від одного процеси. З цих двох фактів можна припустити, що загальні гени-маркери та їх продукт – білки для будь-якого типу ракової стовбурової клітини мають бути.

Загальними генами та їх продуктами – білками можуть стати: ген та його фермент – теломераза, ген та білок під кодовим позначенням «5Т4», ген oct-4 та білок Oct-4, ген Nanog та білок, ген mts 1 та білок Mts 1, ген остеопонтин та білок та ін.

Якщо це підтвердиться, то це стане справжнім проривом у вирішенні багатьох, якщо не всіх проблем раку:

Рання та точна діагностика ракової стовбурової клітини будь-якого типу на основі загального гена-маркера та його продукту – білка-маркера;

Універсальні ліки та засоби, у тому числі вакцина, проти рако-стовбурової клітини та її метастазів.

Відкриття функціонального значення тисяч генів і молекулярних механізмів дії безлічі ферментів стало революційною подією в біології, що надала і продовжує впливати на розвиток медицини XXI ст. Перед вченими та медиками відкрилися унікальні можливості для з'ясування причин багатьох інфекційних та спадкових захворювань, а також розробки ефективних методів їхнього лікування. У свою чергу, розвиток нових діагностичних методів зажадав і створення нових технологій багатопараметричного аналізу біологічних зразків, за допомогою яких можна одночасно досліджувати безліч білкових та ДНК-маркерів різних захворювань, функціонально значущих біологічних макромолекул та їх комплексів. Так з'явилася технологія біологічних мікрочіпів, здатних, подібно до мікрочіпів електронних, витягувати та обробляти величезні масиви інформації з одного невеликого зразка біологічного матеріалу, отриманого від конкретного пацієнта.

За останні десятиліття було накопичено величезний обсяг знань про молекулярні основи біохімічних процесів у живих організмах. Це дало змогу не тільки точно діагностувати те чи інше захворювання, але й оцінити ймовірність його виникнення ще до прояву пацієнта у клінічних симптомах, а також підібрати ефективну терапію. Переважну частину такої інформації одержують за допомогою лабораторної діагностики, на яку у світі щорічно витрачається понад 100 млрд. доларів. У Росії у 1970 р. вона налічувала 81 біохімічний/молекулярний тест, у 2000 р. – 170, а сьогодні кількість тестів вимірюється тисячами!

Більшість найважливіших сучасних методів молекулярної діагностики ґрунтується на аналізі даних, отриманих при дослідженні структури геномів людини та мікроорганізмів. Насамперед йдеться про полімеразної ланцюгової реакції(ПЛР). Зазвичай ДНК міститься у зразках у мінімальних кількостях, проте за допомогою ПЛР можна у мільйони разів «розмножити» у досліджуваній пробі біоматеріалу певні фрагменти цих макромолекул. «Мішенями» можуть бути бактеріальні чи вірусні гени, генетичні маркери ракових пухлин тощо. п. З допомогою цього можна визначити наявність, наприклад, збудника хвороби, навіть якщо у пробі присутні лише кілька молекул його ДНК.

Однак можливості методів, що базуються на ПЛР, обмежені у разі, коли йдеться про одночасний аналіз десятків та сотень різних біомаркерів. І тут на перший план виходить технологія, що вже успішно зарекомендувала себе. біологічних мікрочіпів(Біочипів). Достоїнство цієї технології в тому, що тест проводиться у форматі «один зразок – один реакційний обсяг биочипа», тобто зразок не потрібно розділяти на кілька частин та їх окремо аналізувати. Такий формат набагато підвищує чутливість аналізу та знижує його трудомісткість та вартість, що дає можливість клініко-діагностичним лабораторіям тестувати десятки та сотні зразків за одну робочу зміну.

Сьогодні провідні наукові журнали регулярно публікують огляди, присвячені біологічним мікрочіпам, які виробляють багато десятків компаній, а обсяг продажів становить сотні мільйонів доларів на рік. Водночас сама ідея створення біочіпів народилася лише чверть століття тому, і одним із місць народження цієї технології став Інститут молекулярної біології ім. В. А. Енгельгардта Російської академії наук.

З початку підхід російських дослідників відрізнявся вдалим вибором ключових технологічних рішень, завдяки яким технології биочипов ІМБ РАН продовжують залишатися конкурентоспроможними у світовій науці. Багато з цих підходів (наприклад, заміна радіоактивних міток на флуоресцентні, застосування гідрогелю та елементів сферичної форми) стали використовувати у своїй роботі інші дослідники, які займаються розробкою біочіпів. А з 2000 р. до ІМБ РАН за підтримки Міжнародного науково-технічного центру розпочалися роботи зі створення біочіпів для медичної діагностики збудників соціально значущих захворювань.

Біочипи у справі

Головним елементом будь-якого биочипа служить матриця із сотень і тисяч мікроосередків, кожна з яких містить звані молекулярні зонди - молекули, здатні специфічно зв'язуватися лише з суворо певними біологічними молекулами чи його фрагментами. Зондами можуть служити олігонуклеотиди, ділянки геномної ДНК, РНК, антитіла, олігосахариди, різні низькомолекулярні сполуки та ін. Таким чином, вдається проводити паралельне розпізнавання відразу безлічі мішеней, наприклад, генів, відповідальних за лікарську стійкість збудника хвороби.

Принципова відмінність технології матричних біочіпів, розробленої в ІМБ РАН, в тому, що зонди розташовуються не на плоскій підкладці, а в полімеризованих «краплях» гідросфери напівсферичної форми. Розміщення молекулярних зондів у тривимірному обсязі, а не на площині, дає низку істотних переваг. Воно дозволяє в десятки та сотні разів збільшити ємність биочипа на одиницю поверхні та, відповідно, чутливість вимірювань. Крім того, гель - насичена водою желеподібна речовина, що виключає можливість взаємодії зондів один з одним і з твердою поверхнею підкладки, а також забезпечує відмінну ізоляцію окремих осередків на биочипі.

Для реєстрації результатів аналізу використовують флуоресцентні мітки, які вводять молекули зразка. Якщо зонд специфічно розпізнає і зв'яжеться з мішенню, в осередку виникає флуоресценція. Інтенсивність світіння осередків біочіпа вимірюється за допомогою спеціальних апаратно-програмних комплексів-аналізаторів, які і видають звіт про присутність у досліджуваному зразку специфічних молекулярних мішеней, що інформують про наявність мікроорганізмів або генних мутацій, онкомаркерів або алергенів і т.п.

Оригінальна технологія створення таких гелевих чіпів, розроблена в ІМБ РАН, була запатентована та сертифікована за європейськими стандартами. Біочипи, створені за цією технологією, займають окрему нішу діагностичних мікроматриць і застосовують у російських клініках. Комерційні мікроматриці, вироблені провідними науково-виробничими корпораціями Німеччини та США, застосовуються в основному в дослідницьких цілях.

Росія - піонер «біочіпобудови»

Великі матриці з ДНК та білками, іммобілізованими на фільтрі або зафіксованими у лунках планшета, були відомі досить давно. Але ідея створення мікрочіпів сучасного формату з'явилася лише наприкінці минулого століття. Перша робота з ДНК-мікрочіпів і одна з перших - з білкових чіпів були опубліковані групою академіка А. Д. Мірзабекова з московського Інституту молекулярної біології ім. В. А. Енгельгардта АН СРСР (Khrapko et al . , 1989; Arenkov et al., 2000).

Ця революційна ідея народилася як пропозиція для нового методу секвенування ДНК з використанням гібридизації – процесу об'єднання двох комплементарних одноланцюгових молекул ДНК у дволанцюжкову. Роботи щодо вдосконалення методик секвенування були стимульовані дедалі більшим інтересом до проблеми розшифрування геному людини.

На той час у науковому середовищі широко дискутувалося питання, чи має це завдання вирішуватися масштабуванням існуючих підходів чи потрібно розробляти нові, ефективніші. Вчені спочатку пішли першим шляхом. Так, у 1977 р. з'явився «метод Сенгера», заснований на ферментативному синтезі комплементарної послідовності ДНК на матриці аналізованої одноланцюжкової ДНК, а його розробники отримали в 1980 Нобелівську премію. У своїй нобелівській промові один із лауреатів, американський біохімік У. Гілберт, зазначив, що «ідея методу прийшла тільки після другого візиту А. Мірзабекова» до його лабораторії (Gilbert, 1984).

При секвенуванні гібридизацією «розшифрування» ДНК йде не окремими літерами-нуклеотидами, а «словами» певної величини, і такий словник може містити тисячі слів. Стала очевидною необхідність створення мікрочіпів: у цей час і вийшла перша стаття вчених з ІМБ, де було описано приготування та властивості гелевих мікрочіпів (Khrapko et al., 1989).

Технологія виробництва гелевих биочипів пройшла кілька етапів розвитку. Технологія першого покоління, ще досить громіздка та недосконала, була розроблена та запатентована в ІМБ у 1989–1993 рр., а згодом реалізована у спільній лабораторії, організованій інститутом та Аргонською національною лабораторією (США), та ліцензована американськими компаніями Motorolaі Packard Instruments. Однак через технологічні проблеми фірми стали виробляти біочіпи, матриця яких являла собою поверхню, суцільно вкриту поліакриламідним гелем.

У ІМБ РАН технологія гелевих біочіпів продовжувала розвиватися. Сучасна, досить проста, універсальна та дешева технологія дозволяє виробляти навіть у лабораторних умовах сотні та тисячі олігонуклеотидних, ДНКових чи білкових мікрочіпів на день (Колчинський та ін., 2004).

Туберкульоз та лікарська стійкість

Першою у світі тест-системою на основі біочіпів, зареєстрованою для медичного застосування, став розроблений в ІМБ у 2004 р. набір ТБ-Біочип-1. З його допомогою можна визначити наявність у геномі мікобактерії туберкульозу 47 мутацій, що призводять до стійкості до двох основних протитуберкульозних препаратів. рифампіцинуі ізоніазиду.

Чому увагу дослідників привернув саме туберкульоз? Справа в тому, що багато десятиліть для боротьби з цією хворобою використовували комбіноване лікування одразу кількома хіміопрепаратами, щоб підвищити його ефективність. При монотерапії хворі швидко набували стійкості до ліків. Однак така стратегія призвела до того, що вже наприкінці минулого століття у світі, у тому числі і в Росії, почав повсюдно поширюватися туберкульоз множинною лікарською стійкістю. Саме цей фактор у наші дні найчастіше є причиною невдалого результату лікування та виникнення рецидиву хвороби, від якої щороку у світі помирає понад 3 млн людей.

Ізоніазид та рифампіцин відносяться до популярних та найбільш ефективних препаратів першого (основного) ряду. І якщо виділений від пацієнта збудник виявиться стійким до цих ліків, слід звертатися до хіміопрепаратів другого (резервного) ряду, до яких буде чутлива ця бактеріальна популяція. Сьогодні одними з найперспективніших препаратів для лікування таких форм туберкульозу є фторхінолони. Тому наступною тест-системою у низці діагностичних тестів ІМБ став «ТБ-Біочип-2», за допомогою якого можна виявити лікарську стійкість до різних класів цих препаратів (Грядунов та ін., 2009).

Дедалі ширше поширення форм туберкульозу з множинною лікарською стійкістю стало стимулом подальшої «еволюції» тест-системи. Потрібно було по-перше максимально охопити весь спектр генетично детермінованої резистентності до широкого ряду протитуберкульозних препаратів. По-друге, виникла необхідність визначати генотип і відповідно належність виділеного штаму до основних сімейств, що циркулюють біля РФ, що важливо як епідеміологічного моніторингу структури популяції збудників туберкульозу, а й призначення адекватної терапії.

Так у 2012–2013 роках. в результаті масштабних геномних досліджень було створено набір реагентів «ТБ-ТЕСТ», що не має світових аналогів, що дозволяє одночасно ідентифікувати 120 генетичних локусів, що відповідають за розвиток стійкості до препаратів першої та другої «лінії оборони»: рифампіцину, ізоніазиду, етамбутолу, фторхінолону. (амікацину та капреоміцину) (Zimenkov et al., 2016). Така діагностика дозволяє диференційовано призначати високі дози хіміопрепаратів або, навпаки, видаляти ті чи інші ліки із схем терапії.

Щоб отримати державну реєстрацію в Росздравнадзорі, тест-система пройшла всі види випробувань та експертиз та з 2014 р. дозволена до застосування в медичній практиці РФ. В даний час "ТВ-ТЕСТ" приходить на зміну наборам "ТВ-Біочип".

Від гепатиту до раку та алергій

Ще однією актуальною проблемою світової охорони здоров'я є лікування хворих на гепатит С. Збудник цього вірусного захворювання може тривалий час розмножуватися в печінці, нічим не видаючи себе, а перші ознаки хвороби виявляються лише через кілька місяців після зараження. Ще недавно гепатит С вважався практично невиліковною хворобою, а основним терапевтичним засобом служила комбінація з інтерферонуі рибавірину, яка найчастіше виявлялася неефективною та мала багато негативних побічних ефектів.

Сьогодні створені нові антивірусні препарати, що мають так зване прямою противірусною дієюта блокуючі ключові внутрішньоклітинні етапи розмноження збудника Але вся складність у тому, що вірус гепатиту С має 7 варіантів генотипу, причому кожен генотип має ще кілька підтипів. Більш того, різні генотипи / підтипи мають і різну чутливість до традиційних і нових препаратів, і вибір противірусної терапії повинен проводитися відповідно до генотипних особливостей збудника.

В ІМБ РАН спільно з лабораторією вірусології госпіталю Університету м. Тулузи (Франція) був розроблений і запатентований підхід, що не має світових аналогів, заснований на використанні платформи гідрогелевих біочіпів для типування вірусу гепатиту С на основі аналізу області NS5B вірусного геному. Тест-система «HCV-Біочип», здатна визначати 6 генотипів та 36 підтипів цього вірусу, успішно пройшла клінічні випробування в Росії та Франції (Gryadunov et al., 2011).

Найважливішим напрямом застосування технології гідрогелевих биочипов служить аналіз мутацій і поліморфізмів ДНК самої людини: ДНК-маркерів, асоційованих із виникненням різних неінфекційних захворювань.

Серед онкологічних захворювань у дітей чільне місце посідають лейкози. Тест-система «ЛК-Біочип» здатна ідентифікувати у зразках крові 13 найбільш клінічно значущих хромосомних транслокацій(перенесення фрагмента однієї хромосоми на іншу), характерних для деяких типів гострих і хронічних лейкозів. Кожна з цих транслокацій визначає свій варіант розвитку лейкозу та важлива для вибору стратегії лікування. Ця тест-система застосовується у Національному науково-практичному центрі дитячої гематології, онкології та імунології ім. Дмитра Рогачова (Москва), де аналізуються зразки із 18 регіональних гематологічних центрів РФ (Gryadunov et al . , 2011).

Для ранньої діагностики раку молочної залози та яєчників створено тест-систему «РМЗ-Біочип», яка дозволяє визначати мутації в генах BRCA1/2, асоційовані з високою (до 80%) ймовірністю виникнення спадкових форм цих захворювань.

В даний час в ІМБ РАН розробляються варіанти тест-систем на основі біочіпів для визначення чутливості злоякісних клітин до протипухлинної терапії. Наприклад, за допомогою біочіпу для індивідуального підбору препаратів, які ефективно впливають на молекулярні мішені в пухлинних клітинах меланоми, можна виявити мутації генів, які визначають доцільність використання таких препаратів. таргетної(«молекулярно-прицільної») терапії пізніх стадій та рецидивів меланоми, як траметиніб, іматинібі вемурафеніб(Emelyanova et al., 2017).

Тривимірна структура гідрогелю, в якому на біочипах зафіксовані молекулярні зонди, дозволяє зберегти без змін досить чутливу нативну структуру білкових молекул. Тому такі биочипы можна використовувати також дослідження білок-білкових взаємодій, що потрібно, наприклад, під час проведення різних видів імунохімічного аналізу.

В ІМБ РАН вдалося перевести такий класичний аналіз у формат мікрочіпа та адаптувати його для діагностики алергічних захворювань. Спільно з німецькою біотехнологічною компанією Dr. Fooke Laboratorien GmbH, що надала набори природних та рекомбінантних алергенів, було розроблено та запатентовано тест-систему «Аллерго-Біочип» для паралельного кількісного визначення великих панелей алерген-специфічних антитіл Е та G4 у сироватці крові (Feyzkhanova et al., 2017).

Важливо, що для аналізу антитіл на 30 і більше алергенів на біочіпі потрібно дуже невеликий (всього 60 мкл) об'єм сироватки крові - стільки, скільки потрібно для аналізу на один алерген традиційним імуноферментним методом! Така відмінність особливо значуща у педіатрії. Лабораторний варіант цієї тест-системи вже проходить доклінічні випробування у Дитячій міській клінічній лікарні №13 ім. Н. Ф. Філатова (Москва).

Дванадцять спеціалізованих тест-систем, створених на основі технології гідрогелевих біочіпів в ІМБ РАН, отримали дозвіл на застосування як медичні вироби для лабораторної діагностики. Ці тест-системи успішно використовуються більш ніж у 50 науково-дослідних та медичних центрах РФ, країн СНД та ЄС.

Технології біочіпів, розроблені в ІМБ РАН, захищені 42 вітчизняними та міжнародними патентами. І ці технології продовжують інтенсивно розвиватись. Розробляються нові підходи, що дозволяють спростити та прискорити методики, інтегрувати у єдину процедуру всі стадії проведення аналізу: від обробки біологічного зразка до кількісної ідентифікації в режимі реального часу.

Ядро системи - гідрогелевий биочип - надалі модифікуватиметься залежно від призначення діагностичного тесту, тоді як інші компоненти вже є уніфікованими. Такі «лабораторії на чіпі» дозволять значно покращити якість лабораторної діагностики, знизити ймовірність зараження медперсоналу та зрештою підвищити ефективність та скоротити вартість лікування.

Література
1. Грядунов Д. А., Зіменков Д. В., Михайлович В. М. та ін. Технологія гідрогелевих біочіпів та її застосування в медичній лабораторній діагностиці // Медичний алфавіт. 2009. № 3. С. 10-14.
2. Засідателев А. С. Біологічні мікрочіпи для медичної діагностики // Наука та технології в промисловості. 2005. № 1. С. 18-19.
3. Колчинський А. М., Грядунов Д. А., Лисов Ю. П. та ін. Мікрочіпи на основі тривимірних осередків гелю: історія та перспективи // Молекулярна біологія. 2004. Є. 38. № 1. С. 5-16.
4. Arenkov P., Kuchtin A., Gemmell A., et al. Protein microchips: використовується для імуноassay і enzymatic reactions // Analytical Biochemistry. 2000. V. 278. N. 2. P. 123-131.
5. Emelyanova M., Ghukasyan L., Abramov I. та ін. Визначення BRAF, NRAS, KIT, GNAQ, GNA11 і MAP2K1/2 mutations в Російській melanoma пацієнтів, використовуючи LNA PCR clamp and biochip analysis // Oncotarget. 2017. V. 32. N. 8. P. 52304-52320.
6. Feyzhahanova G., Voloshin S., Smoldowska O. et al. Розробка microarray-базованого методу для allergen-specific IgE and IgG4 detection // Clinical proteomics. 2017. doi: 10.1186/s12014-016-9136-7.
7. Gryadunov D., Dementieva E., Mikhailovich V. et al. Gel-based microarrays in clinic diagnostics in Russia // Expert review of molecular diagnostics. 2011. N. 11. P. 839-853.
8. Khrapko K. R., Лисов Ю. P., Khorlyn A. A. An oligonucleotide hybridization approach to DNA sequencing // FEBS Letters. 1989. V. 256. N. 1-2. P. 118-122.
9. Zimenkov D. V., Kulagina E. V., Antonova O. V., et al. Симптоматична реагування на респіраторну інфекцію і генотип Mycobacterium tuberculosis, використовуючи low-density hydrogel microarray // Journal of antimicrobial chemotherapy. 2016. V. 71. N. 6. P. 1520-1531.

Російські вчені з МФТІ та ще кількох академічних інститутів створили чіп, який дозволяє з високою точністю визначати один із найпоширеніших раків – колоректальний (так називають злоякісні пухлини товстої та прямої кишки).

ЩО АМЕРИКАНЦЯМ ЗАПРОСТО...

Вкрай важливо, що новий тест дуже простий, кров для нього беруть із вени так само, як для звичайного так званого біохімічного аналізу. Тому він буде добре підходити для скринінгу – швидкого та простого відбору пацієнтів навіть із ранніми формами раку. Зараз у світі для цього рекомендують колоноскопію, яку після 50 років потрібно проводити не рідше одного разу на десятиліття. Це дуже складна і дуже приємна процедура, коли він гнучкий ендоскоп вводять через пряму кишку в товстий кишечник. У це профілактичне дослідження людям старше п'ятдесяти поставлено потік. Кожен епізодично отримує поштою запрошення на таку діагностичну процедуру.

У нас таке дослідження проводять за показаннями, коли є симптоми захворювання товстого кишечника. Якщо хтось хоче просто провести таке профілактичне дослідження, як це роблять у США, щоб не проморгати хворобу, це можна зробити на платній основі в індивідуальному порядку. Можливо, всім поголовно його й не варто робити, але тим, хто має фактори ризику розвитку колоректального раку, це дослідження зайвим не буде.

Чому рання діагностика раку товстої та прямої кишки така важлива? По-перше, це захворювання одне з найпоширеніших – у розвинених країнах ця злоякісна пухлина стоїть на 3-му місці серед усіх видів раку. По-друге, хвороба дуже тяжка і важко лікується. Незважаючи на великі досягнення в її лікуванні, результати далеко не найкращі: п'ятирічний виживання після хорошої терапії буває приблизно у 60-65% пацієнтів. І по-третє, якщо пухлину виловити на ранніх стадіях, то результати будуть набагато кращими. Для цього потрібний скринінг. І краще простий і не дуже скрутний, як колоноскопія.

НАУКА - ПРАКТИКА

Над пошуком такої методики працює чимало вчених у світі. Наприклад, у США нещодавно з'явився метод діагностики за складним аналізом випорожнень. Але наші вчені запропонували ще вдале рішення. Про-цедура дослідження зведена до забору крові з вени, як це роблять за біохімічного аналізу крові. Російський биочип побудований зовсім інших принципах, ніж американський набір для діагностики. Відомо, що в крові є маркери, які можуть свідчити про наявність пухлини. Вони тим чи іншим чином пов'язані з обміном речовин у злоякісних клітинах та з відповіддю організму на пухлину. І таких маркерів багато. Біда в тому, що вони дуже примхливі: можуть бути не тільки при колоректальному раку, а й за інших пухлин і навіть за інших станів. Тобто їх специфічність для цього виду раку не завжди достатня для впевненої постановки діагнозу. Наші вчені знайшли вихід із цієї проблеми: вони зробили комбінований чіп, який визначає одразу не один маркер, а багато. Завдяки цьому точність діагностики підвищилася багаторазово.

Не наводитимемо назви маркерів, які визначаються при використанні чіпа. Для нас набагато важливіша чутливість запропонованого тесту – вона становить 88%. Тобто він визначає наявність пухлини у 88% хворих із 100. Це дуже добрий показник.

Звіт про дослідження вітчизняного чіпа опубліковано днями у впливовому міжнародному журналі Cancer Medicine, і є всі підстави вважати, що незабаром така корисна діагностична система надійде у практичну охорону здоров'я. І найголовніше, за цим принципом можна розробити діагностичні чіпи і для інших видів раку.

Матеріал підготував Олег Дніпров

Фото THESTAR.COM

ФАКТОРИ РИЗИКУ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКУ:

• наявність таких хвороб, як дивертикули товстої кишки та неспецифічний виразковий коліт (хвороба Крона);
• вік старше 50 років;
• наявність цієї пухлини у кровних родичів;
• великий вміст жирів та м'яса у харчуванні;
• пристрасть до алкоголю;
• куріння;
• цукровий діабет, ожиріння, низька фізична активність.

Вчені з Московського фізико-технічного інституту та інших російських наукових центрів створили незвичайний биочип (мікросхему, використовує біологічно активні молекули) для діагностики раку товстої кишки. На даний момент виявити це захворювання вкрай складно, через що його лікування зазвичай починають надто пізно. Новинка описана у статті, що вийшла в журналіCancer Medicine.

Рак кишківника на початкових стадіях протікає зовні безсимптомно і часто виявляється тільки після появи непрямих слідів ракової пухлини. Як відомо, у міру розвитку пухлини її здатність чинити опір лікам та іншим видам терапії різко зростає, через що рак, помічений на ранніх стадіях, як правило, лікується, тоді як на пізніх – досить рідко. Тому лише 36% пацієнтів із цим захворюванням встигають прожити п'ять років після встановлення діагнозу. Погіршує ситуацію те, що даний вид раку - третій за поширеністю серед усіх пухлин, що знову реєструються.

Для вирішення проблеми його ранньої діагностики російські вчені розробили тривимірний біочіп на основі гідрогелю. Він є рядом пов'язаних мікропластинок, на які нанесені структури з гідрогелю, подібні до мікрогнездів. У "гніздах" знаходяться молекулярні зонди - біоактивні молекули, які взаємодіють із речовинами сироватки крові, якщо в ній містяться ті сполуки, на пошук яких націлені зонди-молекули.

Новинка реагує на комплекс ознак, що говорять про наявність раку кишечника. Вона відстежує аутоантитіла – ті антитіла імунної системи, що націлені на пошук та знищення ракових клітин. Самі по собі вони часто зустрічаються в кровотоку, адже в людини систематично з'являються ракові клітини, більшість з яких знищується імунітетом ще до того, як встигнуть розмножитися і утворити пухлину. Коли аутоантитіла націлені на боротьбу з тим чи іншим конкретним різновидом раку, вони реагують на властиві саме цьому виду раку глікани. Так називають біополімери, складені з моносахаридів і які грають важливу роль у взаємодії клітин між собою. У здорових та ракових клітин глікани злегка відрізняються за складом. Саме такі "неправильні" глікани і шукає аутоантитіло, щоб ідентифікувати та атакувати ракову клітину.

Автори нової роботи зазначають, що їхній биочип знаходить у сироватці кровіне тільки асоційовані з раком кишечника аутоантитіла, а й ряд інших "міток" цього захворювання. Зокрема, йдеться про білки-маркери, що виділяються раковими клітинами, і імуноглобулінах (антитіла) G, A та M.

Такий комплексний підхід при експериментальній перевірці дозволив досягти результатів, що набагато перевершують усі існуючі методи діагностики раку кишечника. У відповідному експерименті взяли участь 33 пацієнти з відповідним захворюванням. Як контрольні групи виступили 69 здорових людей і 27 осіб із запальними захворюваннями кишечника. Чутливість нового біочіпа дорівнювала 87% - саме таку частку осіб з раком товстого кишечника йому вдалося розпізнати. Хоча ця цифра може не здатися високою, існуючі на сьогодні методи (безгліканові) мають чутливість лише у 21%, що у кілька разів нижче, ніж у нового біочіпу.

Автори роботи вважають, що розроблений ними метод є надзвичайно перспективним для діагностики раку кишківника. Вони сподіваються, що вже незабаром створені на його основі тест-системи з'являться у клінічних лабораторіях нашої країни.