Тема: Лабораторная диагностика бешенства. Исследование на бешенство Этот гост находится в

Бешенство является одним из наиболее опасных и тяжелых инфекционных заболеваний вирусной этиологии. Возбудитель бешенства (вирус Neuroiyctes rabid) вызывает тяжелые и необратимые поражения центральной нервной системы. Вирус проявляет устойчивость к антибиотикам, воздействию низких температур, зато разрушается при прогревании и взаимодействии с щелочами. Большинство случаев заражения оканчиваются смертельным исходом.

Различают бешенство природного типа, механизм передачи которого связан с активностью диких животных (летучих мышей, волков, лисиц, скунсов, енотовидных собак и др.) и городской тип заболевания (животные, задействованные в сельском хозяйстве, кошки, собаки). Наибольшая смертность приходится на процент людей, инфицированных в результате укусов бродячих или домашних собак .

Заражение бешенством происходит посредством укуса животного или попадания на открытую рану его инфицированной слюны. После внедрения вируса он с большой скоростью распространяется по всем сообщениям и системам организма человека. По нервным стволам он проникает в центральную и периферийную нервную систему, поражая все ее отделы. Характеристика вируса свидетельствует о том, что он распространяется также гематогенным и лимфогенным путем.

«Животные — главный источник бешенства»

Симптомы

Инкубационный период данного недуга составляет приблизительно 1-2 месяца (в редких случаях доходит до года). Срок зависит от места повреждения, его удаленности от мозга пациента, количества молекул вируса, попавших в рану. Из травмированной области вирус бешенства попадает в мозговое вещество, где вызывает энцефалит. Скорость перемещения вируса по нервным волокнам – 3 мм/час.

Различают три стадии бешенства у человека. Каждая из них характеризуется специфическими симптомами.

Начальный или продромальный период

Его продолжительность составляет от 24 часов до 3 суток. Характерны такие симптомы:

Первые сигналы поступают со стороны раны. Если к данному моменту место укуса животного уже успело зарубцеваться, то пациент все равно чувствует жжение или зуд. Эпидермис воспаляется;
Появляется температура субфибрильного характера (37-37,3°С). Выше заданной отметки она пока не колеблется;
Присоединяются признаки общего недомогания – головная боль, слабость, тошнота, переходящая в рвоту;
Часто укус приходится на область лица. В этом случае болезнь проявляет себя различными психологическими отклонениями. Возникают зрительные или обонятельные галлюцинации. Больного преследуют несуществующие образы, запахи. Резкая смена настроения вызывает депрессивное состояние, замкнутость или, наоборот, агрессию, тревожность;
Отсутствие аппетита, нарушения сна. Ночные кошмары способствуют появлению бессонницы.

Стадия возбуждения

На этом этапе происходит активное распространение вируса по всем системам человека. Продолжительность его колеблется от 2 до 3 суток . Типичными считаются следующие симптомы:

Характерный признак прогрессирования заболевания – гидрофобия при бешенстве. При желании сделать глоток жидкости у пострадавшего возникает неконтролируемый спазм глотательных и дыхательных мышц. Их сжатие настолько сильное, что могут возникать рвотные позывы.
Состояние больного характеризуется повышенной чувствительностью к громким звукам, яркому свету и другим внешним раздражителям. Их действие вызывает агрессию, галлюцинации, сильное возбуждение, бред. Периодически могут возникать приступы, во время пика которых у человека на несколько секунд прекращается сердцебиение, отсутствует дыхание. Как только приступ бешенства проходит, пациент снова становится адекватным, речь его понята окружающим.
Пульс инфицированного во время панической атаки учащается, из ротовой полости обильно вытекает слюна.
Возникают судороги. Они затрагивают, в первую очередь, лицевые мышцы.
Температура тела повышается даже до 40°С.

Стадия параличей

На данной стадии заболевание полностью охватывает весь человеческий организм. Ее продолжительность составляет не более суток. Судороги и галлюцинации перестают беспокоить больного, он выглядит спокойным, что часто воспринимается окружающими как прогресс выздоровления. Через короткое время происходит значительный и резкий скачок температуры до 42°С . Артериальное давление при этом опускается ниже критической отметки, сердцебиение ускоряется. Летальный исход возникает вследствие паралича миокарда или дыхательного центра.

В большинстве клинических случаев весь цикл болезни инфицированного человека длится от 3 до 7 дней. Иногда смерть от бешенства происходит в первые сутки заражения, когда клиническая картина размыта, а заболевание стремительно прогрессирует.

Диагностика

Как показывает практика, лабораторная диагностика данного вируса у человека при жизни практически неосуществима. Анализ на бешенство чаще всего осуществляется на основе клинических симптомов. К ним относятся:

факт укуса или попадания на кожу человека слюны потенциально опасного животного;
болевые ощущения в месте укуса даже после полного заживления мягких тканей;
гидрофобия, светобоязнь;
спазмы основных групп мышц;
паралич;
нарушение дыхательной функции, глотания.

Анализ крови при бешенстве у человека позволяет выявить повышенное содержание лейкоцитов, аномально высокий уровень гемоглобина и количество эритроцитов. Исследование биоматериала крови также зафиксирует повышение гематокрита.

Высокоточным и высокочувствительным методом прижизненной диагностики бешенства считается ИФА-исследование кожного участка шеи, взятого методом биопсии (по линии роста волос). Метод позволяет достоверно и быстро определить антиген вируса бешенства, который локализуется в нервных окончаниях, прилегающих к волосяным фолликулам.

Лечение

Заболевание неизлечимо в том случае, если проявились его характерные признаки. Снизить дозу попавшего в организм вируса может постэкспозиционная профилактика (или ПЭП).

Ее основная цель – правильное и своевременное оказание первой помощи человеку, который пострадал от укуса или контакта, несущего угрозу инфицирования бешенством. Данные меры предотвратят проникновение вируса в клетки центральной нервной системы, которое обычно неминуемо приводит к гибели человека. Экстренная профилактика состоит из следующих операций:

Обильная дезинфекция (промывание) и местная обработка места укуса. Манипуляции должны быть произведены сразу же после контакта! Используют воду с мылом, йодсодержащие растворы.
Экстренное усиление иммунной защиты с помощью мощной и эффективной противовирусной вакцины, которая соответствует современным стандартам ВОЗ.
Введение АИГ (антирабического иммуноглобулина). Выполняют только в случае наличия определенных показаний.

Антитела к вирусу появятся в организме не ранее, чем через 2 недели после введения первой прививки. А наибольшее их количество будет отмечено через месяц после прививания. Если существует даже малый риск сокращения бессимптомного периода, то пациенту вводят АИГ. Как только курс будет завершен, иммунная система пострадавшего активизируется и начнет работу.

Проводится также интенсивное симптоматическое лечение. Больному в период проявления явных признаков бешенства прописывают лекарства для снятия болевых ощущений, сердечные стимуляторы, снотворные и успокоительные препараты. На последних стадиях возникает необходимость подключения к аппарату искусственной вентиляции легких.

Несмотря на разработанные по новейшим технологиям препараты и таблетки от бешенства для людей, пострадавшие продолжают погибать от страшного вируса. Медики уверены, что в этом виновата беспечность людей и их недостаточная осведомленность об опасности заболевания.

В период лечения больному запрещены любые алкогольные напитки, переохлаждение, пребывание в условиях повышенных температур (на открытом солнце, в бане). Крайне нежелательны тяжелые физические нагрузки. Все эти факторы связаны со снижением скорости выработки антител, падением защитных сил организма.

Профилактика

Мерами, которые предупреждают бешенство домашних животных, являются:

соблюдение установленных правил содержания собак, их регистрация, выгул в наморднике, содержание в вольерах;
обязательная (принудительная) вакцинация против бешенства, которая проводится один раз в год.

Профилактическая иммунная терапия показана лицам, профессиональная деятельность которых связана с дикими или домашними животными (охотники, ветеринарные врачи, работники служб отлова животных).

Если вас все-таки укусило уличное или домашнее животное, состояние здоровья которого вам неизвестно, следует принять следующие профилактические меры:

промыть рану теплым раствором с хозяйственным мылом.
обработать края поврежденных мягких тканей аптечным спиртом.
наложить свободную повязку и обратиться за квалифицированной помощью.

В травмпункте врач примет решение, нужна ли пациенту вакцинация. Ее выполнение обязательно в следующих случаях:

попадание слюны животного на слизистые оболочки человека;
укусы любой тяжести и глубины, которые приходятся на область головы, лица, рук;
глубокие или множественные укусы домашнего животного;
любые травмы или повреждения, нанесенные диким животным (в том числе и ослюнение).

Бешенство (Rabies) – инфекционное заболевание, опасное для животных и человека. Данное заболевание встречается во всех странах мира. Характеризуется 100% летальным исходом.

Возбудитель – РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Рабдовирусов. Данный вирус имеет тропность к нервной ткани. В наибольших титрах обнаруживается в головном мозге больных животных. Кроме того, находят вирусы и в спинном мозге, слюнных и слезных железах.
Различают:

«дикий» вирус, который циркулирует в естественных условиях и характеризуется высокой патогенностью для человека и животных.
И «фиксированный», полученный в лабораторных условиях, не патогенный для животных и человека при экстраневральном введении.

Вирус бешенства не устойчив к высоким температурам: при 60С о инактивируется через 10 минут, при 100С о - почти мгновенно. Но вот в замороженном мозге может сохранять жизнеспособность до нескольких месяцев. Также сохраняется несколько месяцев в гниющих тканях. Устойчив к действию растворов йода. Но быстро инактивируется дезрастворами на основе формалина, хлорамина и щелочи.

Эпизоотологические данные.

К вирусу бешенства восприимчивы все теплокровные. Наибольшей чувствительностью обладают дикие собачьи (такие как: лисицы, песцы, волки, енотовидная собака, шакалы), куньи, грызуны кошки. Менее восприимчивы птицы.

В дикой природе резервуарами вируса бешенства являются хищные животные и летучие мыши, в городе - бродячие собаки.
Источником заражения являются больные животные, у которых вирус выделяется со слюной. Наличие вируса в слюне отмечают уже за 8-10 дней до появления признаков болезни. Заражение происходит при укусе, при попадании слюны на слизистые оболочки или на поврежденные участки кожи.

Патогенез .

После проникновения в организм вирус начинает размножаться в месте внедрения. И через 24 часа начинает проникать в нервную ткань. В нервах он продвигается в направлении спинного и головного мозга со скоростью 7 см/день. Добравшись до мозга вирус начинает усиленно размножаться, затем по нервам вирус попадает во все органы и в первую очередь в слюнные железы и глаза. Инкубационный период (от момента заражения до появления клинических признаков) составляет в среднем 14 – 60 дней, иногда может достигать 6-12 месяцев.
Клинические признаки.

Различают 3 вида течения болезни.

Классическое трехэтапное течениеили буйная форма . Вначале отмечается изменение поведения животного (1 этап), оно становится очень ласковым или наоборот пугливым, необщительным. Этот этап может длиться от нескольких часов до 4 дней. Затем наступает следующий этап - возбуждения (2 этап), который продолжается 1-4 дня. Животные становятся агрессивными, склонны к блуждающим передвижениям и нападением на животных и людей. Развивается анорексия, беспокойство, слюнотечение. И за 3-4 дня до смерти развиваются паралитическая, или депрессивная, стадия, характеризующаяся прогрессирующими параличами.
Паралитическая, или тихая, форма. Характеризуется развитием параличей без предшествующей стадии возбуждения. При этой форме отмечают слюнотечение, отвисание нижней челюсти, затрудненное глотание, анорексию. Затем развивается паралич мышц туловища и конечностей. Смерть животного наступает через 3-4 дня.
«Атипичное бешенство». Это хроническое субклиническое (без развития симптомов) течение болезни, которое может длиться до 3 месяцев.

Диагноз .

Предварительный диагноз ставят на основании анамнеза и клинических симптомов. При подозрении на бешенство после смерти животного в лабораторию направляют труп животного. При невозможности этого – голову или головной мозг. При взятии материла необходимо соблюдать строгие меры предосторожности!
Лабораторная диагностика бешенства включает в себя несколько методов исследования.

Обнаружение телец Бабеша-Негри. Для постановки диагноза на бешенство в лаборатории проводят гистологическое исследование головного мозга умершего животного. Отмечают наличие рабических узелков в структурах дна четвертого желудочка мозга и наличие в головном мозге телец Бабеша-Негри (цитоплазматические эозинофильные включения, состоящий из частиц вируса бешенства). Их можно обнаружить в гипокампе, корковых и стволовых структурах мозга, в мозжечке и дорсальных ганглиях спинного мозга и эпителии роговицы глаза. Однако если тельца Бабеша-Негри не обнаруживаются, бешенство не исключается.
Выявление антигена методом флюоресцирующих антител (МФА) или методом иммунофлюоресцентного анализа (ИФА). Кроме этих реакций в настоящее время идет разработка нового метода диагностики в полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Биологическая проба с заражением новорожденных мышат вирусом из взвеси головного мозга, слюнных желез.

Согласно законодательству РФ, в случаях покусов людей собаками или другими животными (кроме явно больных бешенством) пострадавшие должны немедленно обратиться в медицинские учреждения. А покусавшие их животные должны быть доставлены в ближайшее государственное ветеринарное учреждение для осмотра специалистами и карантина в течение 10 дней.

Для профилактики распространения бешенства предусмотрена ежегодная обязательная вакцинация собак и кошек антирабическими вакцинами.

В настоящее время для ввоза животных в ряд стран требуется документ подтверждающий количество валидных антител к вирусу бешенства. Для эффективной защиты от бешенства минимальный уровень вируснейтрализующих антител в крови должен составлять не менее 0,5 МЕ/мл. Данный вид исследования не является диагностическим и предназначен только для определения напряженности иммунитета против бешенства.
В Москве сдать кровь для определения титра антител к вирусу бешенства можно в Центре Молекулярной Диагностики, расположенном на Звенигородском шоссе, д.5. ЦДМ получил международную аккредитацию на проведение данного теста и выдает Международные сертификаты, действительные в течение всей жизни животного при соблюдении сроков ревакцинации.

Определение титров антител проводят не ранее чем через 30 дней после вакцинации. Поэтому если Вы планируете выезжать со своими питомцами в страны ЕС или другие страны, то необходимо заранее позаботиться о вакцинации и сдаче крови на этот тест (результаты выдаются через 7-14 дней).

Врач-лаборант ветеринарной лаборатории
«БиоВетЛаб» Лазарева Н.В.

Бешенство - острая инфекционная болезнь, протекающая с тяжелым поражением нервной системы, как правило, с летальным исходом. Восприимчивы человек и все млекопитающие животные.

Бешенство распространено повсеместно. Возбудителя инфекции передают собаки, кошки, дикие грызуны и хищники, а также кровососущие летучие мыши-вампиры.

Продолжительность инкубационного периода зависит от места и силы укуса, количества и вирулентности попавшего в рану вируса, резистентности покусанного животного. Инкубационный период длится от 1-3 нед до года и даже более.

Болезнь протекает остро. Клинические признаки ее в основном одинаковы у всех животных, но наиболее типичны они у собак, у которых может наблюдаться как буйное, так и тихое (паралитическое) течение болезни. У крупного рогатого скота бешенство может протекать атипично (потеря аппетита, атония рубца, паралич глотки, слюнотечение). Стадии возбуждения может не быть.

Патологоанатомические изменения неспецифичны. У мясоедных (в основном у собак) в желудке можно обнаружить инородные предметы.

Вирус бешенства обладает выраженной нейропробазией. Проникая с периферии (место укуса) по нервным стволам в центральную нервную систему центростремительно, он распространяется в организме центробежно по периферическим нервам и попадает в разные органы, включая слюнные железы.

Вирус относится к семейству Rhabdoviridae, родуLyssavirus . Вирионы имеют форму стержня с обрубленным концом. Вирион вируса - РНК-содержащий со спиральным типом симметрии, имеет липопротеидную оболочку. Низкие температуры консервируют вирус. Температура 60 °С убивает его через 5-10 мин, солнечный свет - за 5-7 дней. Растворы формалина, фенола, соляной кислоты (5%-ные) инактивируют вирус за 5-10 мин.

Вирион вируса бешенства содержит гликопротеидный (наружный) и нуклеокапсидный (внутренний) антигены. Гликопротеидный антиген индуцирует образование вируснейтрализующих антител, а нуклеокапсидный - комплементсвязывающих и преципитирующих антител.

В организме вирус локализуется главным образом в центральной нервной системе, а также в слюнных железах и слюне.

Культивируется на мышах, кроликах, морских свинках и других животных, а также в первичных культурах клеток (почки хомячка, эмбриона овец, телят и др.) и перевиваемых клетках. Размножение вируса в культурах клеток не всегда проявляется ЦПД. К вирусу бешенства после предварительной адаптации восприимчивы и куриные эмбрионы. Вирус индуцирует образование цитоплазматических телец-включений, которые чаще всего обнаруживают в клетках аммонова рога, мозжечка, коры головного мозга.

Источником инфекции являются больные животные. Они передают вирус во время укуса. Плотоядные животные могут заражаться при поедании головного и спинного мозга погибших от бешенства животных. Доказана возможность заражения бешенством аэрогенным путем (в местах, где имеются летучие мыши). До 60-х годов основным источником распространения бешенства были собаки и кошки, позднее лисицы, волки, корсаки и другие дикие животные.

Диагноз на бешенство ставят на основании эпизоотологических, клинических данных и результатов лабораторных исследований, имеющих решающее значение.

При работе с больными животными и инфекционным материалом необходимо строго соблюдать меры личной безопасности: надевать резиновые перчатки, халаты с нарукавниками, резиновый или полиэтиленовый фартук, резиновые сапоги, защитные очки, защитную маску на лицо.

Вскрывать подозрительных на заболевание бешенством животных в полевых условиях запрещено.

Получение пат.материала . Для исследования на бешенство направляют в лабораторию свежие трупы мелких животных целиком, а от крупных и средних животных - голову с двумя первыми шейными позвонками. Трупы мелких животных перед отправкой на исследование обрабатывают инсектицидами.

Патологический материал упаковывают в пластмассовые мешки, вкладывают в плотно закрывающиеся ящики с влагопоглощающей прокладкой, пропитанной дезинфектантом. Материал и сопроводительное письмо, в котором указаны отправитель и его адрес, вид животного, анамнестические данные и обоснование подозрений в заболевании животного бешенством, дата и подпись врача.

Лабораторная диагностика . Она включает: обнаружение вирусного антигена в РИФ и РДП, телец Бабеша-Негри и биопробы на белых мышах.

РИФ. Для данной реакции биопромышленность выпускает флуоресцирующий антирабический гамма-глобулин.

Методика постановки РИФ . На обезжиренных предметных стеклах готовят тонкие отпечатки или мазки из различных отделов головного мозга левой и правой стороны (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок, продолговатый мозг). Готовят не менее двух препаратов каждого отдела мозга. Можно также исследовать спинной мозг, подчелюстные, слюнные железы. Для контроля делают препараты из мозга здорового животного (обычно белой мыши).

Препараты высушивают на воздухе, фиксируют в охлажденном ацетоне (минус 20 °С от 4 до 12 ч), высушивают на воздухе наносят Флуоресцирующий гамма-глобулин, помещают во влажную камеру при 37 °С на 25-30 мин, затем тщательно промывают физиологическим раствором или фосфатным буфером с рН 7,4, споласкивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают под люминесцентным микроскопом.

В препаратах, содержащих антиген вируса бешенства наблюдаются разной величины и формы флуоресцирующий желто-зеленым цветом гранулы в нейронах , но чаще вне клеток.

В контроле подобного свечения не должно быть , нервная ткань обычно светится тусклым сероватым или зеленоватым цветом. Интенсивность свечения оценивают в крестах.

Отрицательным считают результат при отсутствии специфической флуоресценции.

Материал от животных, вакцинированных против бешенства, нельзя исследовать в РИФ в течение 3 мес. после прививки, так как может быть флуоресценция антигена вакцинного вируса.

В РИФ не подлежат исследованию ткани, консервированные глицерином, формалином, спиртом и

т. д., а также материал, имеющий признаки даже незначительного загнивания.

РДП в агаровом геле . Метод основан на свойстве антител и антигенов диффундировать в агаровом геле и при встрече образовывать видимые визуально линии преципитации (комплекс антиген +антитело). Применяют для обнаружения антигена в мозге животных, павших от уличного вируса бешенства, или при экспериментальной инфекции (биопроба).

«дикий» вирус, который циркулирует в естественных условиях и характеризуется высокой патогенностью для человека и животных.
И «фиксированный», полученный в лабораторных условиях, не патогенный для животных и человека при экстраневральном введении.

Эпизоотологические данные.

Патогенез .

Различают 3 вида течения болезни.

Классическое трехэтапное течениеили буйная форма . Вначале отмечается изменение поведения животного (1 этап), оно становится очень ласковым или наоборот пугливым, необщительным. Этот этап может длиться от нескольких часов до 4 дней. Затем наступает следующий этап - возбуждения (2 этап), который продолжается 1-4 дня. Животные становятся агрессивными, склонны к блуждающим передвижениям и нападением на животных и людей. Развивается анорексия, беспокойство, слюнотечение. И за 3-4 дня до смерти развиваются паралитическая, или депрессивная, стадия, характеризующаяся прогрессирующими параличами.
Паралитическая, или тихая, форма. Характеризуется развитием параличей без предшествующей стадии возбуждения. При этой форме отмечают слюнотечение, отвисание нижней челюсти, затрудненное глотание, анорексию. Затем развивается паралич мышц туловища и конечностей. Смерть животного наступает через 3-4 дня.
«Атипичное бешенство». Это хроническое субклиническое (без развития симптомов) течение болезни, которое может длиться до 3 месяцев.

Диагноз .

Обнаружение телец Бабеша-Негри. Для постановки диагноза на бешенство в лаборатории проводят гистологическое исследование головного мозга умершего животного. Отмечают наличие рабических узелков в структурах дна четвертого желудочка мозга и наличие в головном мозге телец Бабеша-Негри (цитоплазматические эозинофильные включения, состоящий из частиц вируса бешенства). Их можно обнаружить в гипокампе, корковых и стволовых структурах мозга, в мозжечке и дорсальных ганглиях спинного мозга и эпителии роговицы глаза. Однако если тельца Бабеша-Негри не обнаруживаются, бешенство не исключается.
Выявление антигена методом флюоресцирующих антител (МФА) или методом иммунофлюоресцентного анализа (ИФА). Кроме этих реакций в настоящее время идет разработка нового метода диагностики в полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Биологическая проба с заражением новорожденных мышат вирусом из взвеси головного мозга, слюнных желез.

Врач-лаборант ветеринарной лаборатории
«БиоВетЛаб» Лазарева Н.В.

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ. МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION. METROLOGY AND CERTIFICATION

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

ЖИВОТНЫЕ

Издание официальное

Стандартмнформ

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 - 92 «Межгосударственная система стандартизации. Основ* ныв положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки. принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 июня 2013 г. № 57-П)

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166)004-97	Код страны no МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
		Минэкономики Республики Армения
Беларусь		Госстандарт Республики Беларусь
Киргизия		Кыргызстандарт
		Молдова-Стандарт
		Госстандарт
Узбекистан		Узсгандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 сентября 2013 г. № 1127-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 26075-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2015 год

5 ВЗАМЕН ГОСТ 26075-54

Информация об изменениях х настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ЖИВОТНЫЕ

Методы лабораторной диагностики бешенства

Methods of Laboratory Diagnostic of Rabies

Дата введения - 2015 - 01 - 01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы лабораторной диагностики бешенства:

Метод флуоресцирующих антител (МФА);

Метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1);

Биопроба на белых мышах:

Метод иммукоферментного анализа (ИФА);

Реакция диффузионной преципитации (РДП).

Примечания

1 Данные методы применимы ко всем представителям рода Lyssavwus.

2 Уличный вирус бешенства относится к микроорганизмам 2 класса патогенности (представляет смертельную опасность для человека и животных).

3 При необходимости генотипирования вируса бешенства с помощью готовых тест- систем применяют метод обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции (от-ПЦР).

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ ИСО/МЭК 17025 - 2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 12.0.004 - 90 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения

ГОСТ 12.1.005-68 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.008 - 76 Система стандартов безопасности труда. Биологическая безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.4.011 - 89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация

ГОСТ 17.0.0.01 - 76 Система стандартов в области охраны природы и улучшения использования природных ресурсов. Основные положения

ГОСТ 177-88 Водорода перекись. Технические условия ГОСТ 2603 - 79 Реактивы. Ацетон. Технические условия ГОСТ 2768 - 84 Ацетон технический. Технические условия ГОСТ 4204 - 77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия ГОСТ 6709 - 72 Вода дистиллированная. Технические условия.

ГОСТ ISO 7218 - 2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ГОСТ 8074 - 82 Микроскопы инструментальные. Типы, основные параметры и размеры. Технические требования.

ГОСТ 9147 - 80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрелзратое. Технические условия ГОСТ 12026 - 76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия ГОСТ 13739-78 Масло иммерсионное для микроскопии. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 21241-69 Пинцеты медицинские. Общие технические условия.

ГОСТ 22967 - 90 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 24661 - 91 (ИСО 7866 84) Шприцы инъекционные однократного применения

ГОСТ 25046 - 81 (ИСО 7864-81) Иглы инъекционные однократного применения. Основные размеры. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 25336 - 82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29230 - 91 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и ло выпускам ежемесячного информационного указателя «На-циональные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины, определения и сокращения

3.1 В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1.1 бешенство: Инфекционное заболевание человека и животных, вызываемое представителями семейства Rhabdoviridae рода Lyssavirus (рабДовирус), и приводящее к летальному исходу в 100 % случаев.

3.1.2 вирус бешенства: Возбудитель инфекционного заболевания человека и животных.

3.1.3 антиген вируса бешенства: Поверхностные белковые структуры вируса бешенства, на которые вырабатываются антитела.

3.1.2 метод флуоресцирующих антител (МФА): Метод выявления антигена вируса бешенства меченными флуоресцеиниэотиоциаиатом антирабическими антителами, с образованием характерных светящихся комплексов-включений, обнаруживаемых в поле зрения люминесцентного микроскопа.

3.1.3 метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1): Метод выделения антигена вируса бешенства. основанный на размножении вируса в культуре клеток и его идентификации методом флуоресцирующих антител.

3.1.3 биопроба: Метод выделения вируса бешенства на белых мышах путем введения им суспензии патологического материала с последующей идентификацией вируса методом флуоресцирующих антител.

3.1.4 метод иммуноферментного анализа (ИФА): Метод выявления антигена вируса бешенства. основанный на его специфическом взаимодействии с антирабическим антителом, иммобилизованном на твердом носителе, с последующим выявлением связавшегося антигена с помощью второго меченного ферментом антитела путем окрашивания продукта реакции хромогеном.

3.1.5 реакция диффузионной преципитации (РДП): Метод выявления вируса бешенства, основанный на способности антител и вирусного антигена бешенства диффундировать в агаровом геле и при специфическом взаимодействии образовывать комплекс «антиген-антитело», наблюдаемый невооруженным глазом в виде линии преципитации.

3.1.6 метод обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции (от-ПЦР): Метод выявления генома вируса бешенства путем перевода специфической последовательности РНК вируса в ДНК с последующим многократным копированием полученной ДНК и обнаружением продуктов реакции, осуществляемый in vitro.

3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:

ФАГ- флуоресцирующий антирабический иммуноглобулин;

АнГ- антирабический глобулин;

КФГ - контрольный флуоресцирующий глобулин;

ФБР - фосфатно-буферный раствор;

НГУК-1-невринома Гассерова узла крысы;

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцинат:

РНК - рибонуклеиновая кислота:

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота:

ССЫ31 - культура клеток мышиной нейробластомы:

ОФД -ортофенилдиамин;

ТМБ - тетраметилбензидин.

4 Условия выполнения исследований и требования безопасности

4.1 Условия выполнения исследований

4.1.1 Общие требования проведения микробиологического анализа и работы с микроорганизмами I - II групп патогенности - ло ГОСТ ISO 7218.

4.1.2 Общие требования к помещениям - по ГОСТ ISO 7218.

4.1.3 Требования к персоналу - по ГОСТ ISO 7218, ГОСТ ИСО/МЭК 17025. (1).

К проведению исследований допускаются квалифицированные сотрудники, имеющие опыт работы с микроорганизмами I - II групп патогенности, изучившие методики микробиологических работ. вакцинированные против бешенства.

4.2 Требования безопасности

4.2.1 Общие требования безопасности при проведении работ согласно ГОСТ 12.1.008.

4.2.2 Средства защиты работающих должны соответствовать требованиям ГОСТ 12.4.011.

4.2.3 Воздух рабочей зоны должен соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.005.

4.2.4 Обучение персонала безопасности труда в соответствии с ГОСТ 12.0.004.

4.2.5 Утилизацию полученного для исследования материала, а также использованных индивидуальных средств защиты, инструментов и т.д. проводят путем кипячения в течение 30 мин или автоклавирования в течение 15 мин при давлении (0.11 ± 0.20) МПа.

5 Средства измерений, оборудование, материалы, реактивы и животные

5.1 Для проведения исследований используют:

Спектрофотометр сканирующий со спектральным диапазоном измерения длин волн от 190 до 1100 нм с погрешностью не более ± 0,5 нм и диапазоном измерения оптической плотности (ОП) от 0.1 до 3.0;

Планшеты для иммунологических реакций 96-луночные:

Термостат, обеспечивающий поддержание температуры от 20 "-С до 50 °С:

Холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры от О °С до 10 °С по ГОСТ 16317:

Центрифугу лабораторную;

Баню водяную;

Микроскоп люминесцентный инвертированный по ГОСТ 8074:

Ступки фарфоровые с пестиком по ГОСТ 9147 или гомогенизатор по ГОСТ ИСО/МЭК 17025;

Стекла предметные по ГОСТ 9284:

Пробирки стеклянные по ГОСТ 25336;

Чашки Петри по ГОСТ 25336;

Кювету по ГОСТ 25336;

Пипетки вместимостью 1.0; 2,0 и 10.0 см 3 по ГОСТ 29230;

Пипетки автоматические вместимостью от 0,05 до 0,20 см 3 с наконечниками:

Пинцеты медицинские по ГОСТ 21241:

Шприцы инсулиновые вместимостью 1,0 см 3 по ГОСТ 22967 или ГОСТ 24861;

Иглы инъекционные ло ГОСТ 25046:

Стекла культуральные на восемь лунок;

Клетки для содержания мышей;

Ацетон по ГОСТ 2603 или ГОСТ 2768;

Флуоресцирующий антирабический иммуноглобулин (ФАГ);

Антирабический глобулин (АнГ);

Контрольный флуоресцирующий глобулин (КФГ);

Масло нефлуоресцирующее иммерсионное ло ГОСТ 13739;

Воду дистиллированную по ГОСТ 6709;

Раствор фосфатно-буферный молярной концентрации 0.01моль/дм 3 (ФБР). pH 7,2 - 7.4;

- раствор натрия хлорида стерильный 0.9 %-ный изотонический:

Культуру клеток мышиной нейробластомы ССЫ31 или неериномы Гассерова узла крысы -

Пенициллин;

Стрептомицин;

Среду Игла МЕМ с двойным набором аминокислот и витаминов (ДМЕМ), pH 7,2;

Раствор трипсина 0,25 %-ный;

Сыворотку эмбриональную крови крупного рогатого скота для культур клеток 10 %-ную;

Глютамин 3 %-ный;

Перекись водорода 3 %-ную по ГОСТ 177;

Набор препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом ИФА;

Раствор серной кислоты молярной концентрации 2 моль/дм 3 по ГОСТ 4204;

Бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026;

Штамп для приготовления лунок;

Мертиолят;

Агар «Дифко» или аналогичный;

Раствор метилового оранжевого 1 %-ный в 50 %-ном этиловом спирте:

Антигены положительный и отрицательный;

Сыворотку антирабическую или иммуноглобулин;

Мышей белых клинически здоровых массой 6 - 8 г.

5.2 Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов и материалов по качеству не ниже указанных выше. Допускается использование посуды одноразового применения.

6 Отбор проб

6.1 Для проведения исследований на наличие вируса бешенства в лабораторию направляют патологический материал - свежий труп или голову мелких животных, голову или головной мозг крупных животных.

6.2 Отобранный для исследований патологический материал упаковывают во влагонепроницаемую тару и доставляют в лабораторию в металлических контейнерах. Замороженный материал помещают в криоконтейнер.

6.3 Патологический материал сопровождают документом, содержащим следующие данные; наименование и адрес отправителя, вид животного, анамнестические и клинико-элиэоотологические данные.

6.4 Пабораторные исследования проводят сразу же при получении патологического материала.

6.5 Для исследования отбирают от крупных животных кусочки ткани из каждого отдела головного мозга (аммоновы рога, мозжечок, кору больших полушарий, продолговатый мозг) размером 0.5 - 1.0 см. мозг мелких животных, например мышей, исследуют целиком.

Для исследования МФА и методом выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или НГУК-1) пригодны только свежие или свежезамороженные пробы ткани головного мозга. Не допускаются для исследований пробы мозга животных, разлагающиеся (в стадии загнивания), консервированные глицерином, фиксированные метиловым спиртом, формалином или другими средствами, способствующими возникновению неслецифической флуоресценции.

Для постановки биопробы допускается использовать пробы мозга, консервированные в 30 % -50 %*ном растворе глицерина. Использование других консервантов не допускается. Для сохранности патологический материал может быть заморожен при температуре не выше минус 10 в С.

7 Метод флуоресцирующих антител (МФА)

7.1 Сущность метода

Сущность метода флуоресцирующих антител заключается в специфическом взаимодействии флуоресцирующих антирабических антител с гомологичным антигеном вируса бешенства. Образующийся при этом комплекс «антиген-антитело», меченный ФИТЦ. обнаруживается визуально по характерному свечению в поле зрения при рассмотрении под люминесцентным микроскопом.

7.2 Подготовка к исследованию

7.2.1 Подготовка проб

7.2.1.1 Из кусочков ткани, отобранных по 6.5, готовят не менее трех препаратов (отпечатков или мазков) из каждого отдела мозга на тщательно обезжиренных предметных стеклах. Если состояние патолсгического материала позволяет, то готовят отпечатки, в остальных случаях делают мазки.

7.2.1.2 Приготовление отпечатков

Кусочки ткани, отобранные по 6.5. кладут на фильтровальную бумагу, сложенную в четыре -шесть слоев. Мозг мелких животных разрезают поперек, захватывая все его отделы, и кладут его пиниетом срезом вверх на фильтровальную бумагу, сложенную в четыре - шесть слоев. К поверхности среза прикасаются предметным стеклом, слегка надавливая его до получения на стекле тонкого отпечатка.

7.2.1.3 Приготовление мазков

Кусочек ткани из каждого отдела мозга (у мелких животных весь мозг целиком), отобранный по 6.5. растирают в фарфоровой ступке пестиком до образования гомогенной массы, из которой делают мазки на предметных стеклах.

7.2.1.4 Для контроля делают мазки или отпечатки из мозга здоровых, не болевших бешенством и не вакцинированных против бешенства, белых мышей, какописано в 7.3.1.2 и 7.3.1.3.

7.2.1.5 После приготовления мазки или отпечатки высушивают на воздухе в течение 20-30 мин. фиксируют в охлажденном ацетоне при температуре 4’Св течение 4 - 12 ч или при температуре минус 20 *С в течение 1 ч. после чего извлекают из ацетона и высушивают на воздухе в течение 10 - 15 мж.

7.2.2 Подготовка реактивов

ФАГ. АнГ и КФГ растворяют дистиллированной водой до указанного на этикетке ампулы первоначального объема. Срок хранения растворенных ФАГ. АнГ и КФГ при температуре (5 ± 2) в С - не более двух недель.

Непосредственно для исследования необходимое количество растворенных ФАГ. АнГ и КФГ разводят ФБР до рабочего разведения, указанного на этикетке ампулы. Рабочие разведения растворенных ФАГ. АнГ и КФГ используют в день приготовления.

7.3 Проведение исследования

Предметные стекла с препаратами (мазками или отпечатками) по 7.2.1 помещают во влажную камеру (чашку Петри или кювету с увлажненным дном). Затем на один из трех приготовленных препаратов наносят ФАГ в рабочем разведении равномерно на всю поверхность мазка или отпечатка при помощи пипетки. На второй препарат наносят рабочее разведение КФГ. Закрывают камеру с препаратами. помещают в термостат при температуре (37 ± 1) *С и выдерживают в течение 30

мин. Параллельно окрашивают контрольные препараты. По окончании окрашивания препараты трехкратно промывают, погружая их каждый раз на 10 мин в сосуд с ФБР. ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе в течение 20 - 30 мин.

На третий препарат наносят рабочее разведение АнГ. помещают в термостат при температуре (37 ± 1) *С и выдерживают в течение 30 мин. Затем препарат трехкратно промывают, погружая каждый раз на 10 мин в сосуд с ФБР. ополаскивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе в течение 20 - 30 мин и окрашивают рабочим разведением ФАГ. как описано выше.

7.4 Обработка результатов

8 окрашенных препаратах не пораженная вирусом бешенства мозговая ткань светится тусклым. серовато-желтым цветом.

Антиген вируса бешенства выявляется в нейронах и вне клеток в виде ярких зеленых гранул различной формы и величины - от едва заметных до имеющих размер в диаметре 15 - 20 мкм. Иногда отмечается большое количество мелких ярких зеленых частиц (размером до 1 мкм) округлой и овальной формы.

Диагноз бешенство считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа в исследуемом препарате обнаруживают типичные желтовато-зеленые гранулы. При этом в контрольных препаратах (в мазках или отпечатках из мозга здоровых не болевших бешенством белых мышей, окрашенных ФАГ), а также в исследуемых препаратах, окрашенных КФГ и предварительно обработанных АнГ и окрашенных ФАГ. подобных образований быть не должно.

О результатах исследования сообщают компетентным органам в соответствии с порядком, действующим на территории государства, принявшего стандарт.

8 случае отрицательного результата проводят исследования по 8 или 9.

8 Метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1)

8.1 Сущность метода

Сущность метода заключается е выделении вируса бешенства в культуре клеток мышиной

нейробластомы CCL-131 или НГУК-1 с последующей его идентификацией методом флуоресцирующих антител.

Метод является альтернативным биопробе на белых мышах по 9.

8.2 Подготовка к исследованию

8.2.1 Подготовка проб

Равные части ткани, стерильно отобранные из каждого участка головного мозга мелкого животного (аммоновы рога, мозжечок, кора больших полушарий, продолговатый мозг), или кусочки ткани из каждого отдела головного мозга крупного животного, отобранные по 6.5. измельчают ножницами и растирают в ступке или гомогенизаторе, постепенно добавляя стерильный 0.9 %-ный изотонический раствор натрия хлорида до получения 10 %-ной суспензии. В суспензию мозга добавляют пенициллин и стрептомицин по ЮС ЕД/см 3 и 1 мг/см 3 соответственно.

Полученную суспензию тщательно перемешивают и центрифугируют в течение 5-10 мин при скорости 2000 об/мин. Над осадочную жидкость переносят в стерильную пробирку и хранят при температуре не выше 4 °С до использования.

8.2.2 Подготовка культуральных стекол

Суточную культуру клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или НГУК-1) снимают с культурального флакона при помощи 0,25 %-ного раствора трипсина и разводят средой ДМЕМ с 10 %-ной эмбриональной сывороткой крови крупного рогатого скота и 3 %-ным глютамином до концентрации 2 * 10 s клеток/см 3 . В лунки культурального стекла вносят по 0.1 см 3 полученной суспензии клеток, накрывают крышкой и помещают во влажный СО г -инкубатор с содержанием СО г 5 % при температуре (37±1)°С на 18-20ч

8.3 Проведение исследования

В две лунки культурального стекла по 8.2.2 вносят по 0.05 см 3 суспензии из каждого отдела головного мозга. На каждом стекле оставляют две лунки для положительного и отрицательного контроля. В качестве положительного контроля используют суспензию мозга мыши, зараженной вирусом бешенства - штаммом CVS. В качестве отрицательного контроля вносят суспензию мозга клинически здоровой мыши. Культуральное стекло помещают во влажный СОг-инкубатор с содержанием СОг 5 % при температуре (37 ± 1) *С на 42 - 48 ч.

По окончании инкубации с помощью автоматической пипетки из лунок культурального стекла удаляют среду, один раз промывают клетки ФБР (с помощью автоматической пипетки вносят по 0.2 см 3 раствора е каждую лунку) и подсушивают в ламинарном потоке воздуха в течение 20 - 30 мин. Затем в каждую лунку вносят по 0.1 см 3 охлажденного до температуры минус 20 *С ацетона и оставляют при комнатной температуре на 30 мин.

После фиксации клеток культуральное стекло переворачивают и встряхивают для удаления ацетона, а затем высушивают в ламинарном потоке воздуха в течение 20 - 30 мин. С помощью скальпеля и пинцета удаляют пластиковую насадку и подсушивают стекло еще в течение 5-10 мин. В каждую лунку добавляют по 0.05 - 0.10 см 3 ФАГ в рабочем разведении (подбирают опытным путем), приготовленном в ФБР. помещают во влажную чашку Петри и инкубируют при температуре (37 ± 1) в С в течение 30 мин.

По окончании окрашивания стекла трехкратно промывают, погружая их каждый раз на 10 мин в сосуд с ФБР. Затем препараты ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе в течение 20-30 мин.

На окрашенные препараты наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают в люминесцентном микроскопе.

8.4 Обработка результатов

В окрашенных препаратах не пораженная вирусом бешенства культура клеток светится тусклым. серовато-желтым цветом (отрицательный контроль). Антиген вируса бешенства выявляется в цитоплазме культуры клеток в виде ярких зеленых гранул различной формы и величины с четкими очерченными краями (положительный контроль).

Диагноз на бешенство считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа в исследуемом препарате обнаруживают типичные желто-зеленые гранулы.

Если в культуре клеток вирус бешенства не выявлен, то ставится отрицательный диагноз.

Результаты выделения вируса бешенства в культуре клеток окончательные, дальнейшие исследования не проводят.

9 Бислроба на белых мышах

9.1 Сущность метода

Сущность метода заключается в выделении вируса бешенства путем интрацеребрального введения патологического материала белым мышам с последующей идентификацией вируса методом флуоресцирующих антител по 7.

9.2 Подготовка проб к исследованию - по 6.2.1.

9.3 Проведение исследования

Пять - шесть белых мышей заражают 10 %*ной суспензией патологического материала им-трацеребрально в объеме 0.02 - 0,03 см 3 . Зараженных мышей помещают в отдельную клетку, на ко* торую наклеивают этикетку с указанием даты заражения, количества мышей, способа заражения и номера экспертизы патологического материала. Наблюдение за животными проводят не менее 30 дней. Количество здоровых, больных и погибших мышей регистрируют в журнале.

9.4 Обработка результатов

При оценке результатов учитывают наличие клинических признаков у зараженных мышей (взьерошенность шерсти, поедаемость корма, нарушение координации движения, параличи, тремор, прострация). Гибель мышей в первые двое суток после заражения не учитывают. Пробы мозга от больных и погибших животных, начиная с третьих суток, исследуют МФА по 7.

Биопробу считают положительной, если, начиная с третьих суток после заражения, заболела и погибла хотя бы одна мышь и в пробе мозга с помощью МФА обнаружены специфические включе* кия вируса бешенства.

Отрицательный диагноз может быть дан только по истечении 30 сут наблюдения при условии, что все зараженные животные останутся живыми и здоровыми.

Результаты биопробы считаются окончательными, дальнейшие исследования не проводят.

10 Метод иммуноферментного анализа (ИФА)

10.1 Сущность метода

8 основе ИФА лежит специфическое взаимодействие антигена вируса бешенства с антиге* лом. иммобилизованным на твердом носителе. Связанный антиген выявляется с помощью второго антирабического антитела, меченного пероксидазой. продукт реакции которой окрашивается при до* бавлении хромогена. Интенсивность окрашивания продукта реакции прямо пропорциональна количеству антигена.

10.2 Подготовка к исследованию

10.2.1 В качестве исследуемого материала (антиген) используют пробы ткани головного мозга павших, вынужденно убитых, подозреваемых в заболевании бешенством или экспериментально зараженных вирусом бешенства животных.

10.2.2 Приготовление исследуемого антигена

Пробы ткани головного мозга, полученные по 6.5, измельчают, растирают в ступке и готовят 10 %*ные суспензии в С.9 %-ном изотоническом растворе хлористого натрия, прогревают в водяной бане при температуре 60 *С в течение 15 мин и центрифугируют в течение 5-10 мин при скорости 2000 об/мин. Надосадочную жидкость используют в качестве исследуемого антигена.

10.2.3 Подготовка реагентов

все растворы и реагенты перед постановкой реакции необходимо выдержать не менее 30 мин при температуре (22 ± 1) *С.

Подготовку компонентов набора проводят согласно инструкции по применению.

10.3 Проведение исследования

10.3.1 ИФА проводят в сэндвич-варианте с использованием компонентов, входящих в набор для выявления антигена возбудителя бешенства в патологическом материале.

Для проведения ИФА используют планшеты для иммунологических реакций с плоским дном.

Объем ингредиентов, вносимых поэтапно в лунки планшета, равен между собой и составляет

10.3.2 Сенсибилизация планшета

6 лунки полистиролового планшета вносят АнГ в рабочем разведении, указанном на этикетке. Планшет с АнГ накрывают крышкой и инкубируют в термостате при температуре (37 ± 0.5) *С в течение 3 ч или при температуре 4 *С в течение 18 ч. По окончании инкубации лунки планшета трехкратно промывают отмывающим буферным раствором. При каждой отмывке содержимое лунок вытряхивают. а остатки раствора удаляют постукиванием о фильтровальную бумагу.

10.3.3 Внесение антигенов

8 ряды планшета А. 8 и С вносят отмывающий буфер. В лунки планшета вносят контрольные положительный (лунка А1) и отрицательный (лунка А2) антигены, входящие в состав набора, а также исследуемые пробы (лунки АЗ. А4 и тщ.) и титруют по вертикали, получая разведения от 1: 2 до 1: 8. При большом количестве проб заполняют и другие ряды планшета. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в гермостате при температуре (37 ± 0.5) *С в течение 1 ч. По окончании инкубации проводят трехкратную отмывку лунок планшета от не связавшихся с иммуноглобулином антигенов, как описано в 10.3.2.

10.3.4 Внесение антирабического лероксидазного конъюгата

В лунки планшета вносят антирабический пероксидазный конъюгат в рабочем разведении, после чего накрывают крышкой и инкубируют в термостате при температуре (37 ± 0.5) в С в течение 1 ч. Затем лунки планшета трехкратно отмывают, как описано в 10.3.2.

10.3.5 Внесение субстратной смеси

Для проявления реакции в лунки планшета вносят готовую субстратную смесь. Реакцию проявляют в течение 15 - 30 мин при температуре (22 ± 0.5) *С в темноте. Реакцию останавливают добавлением раствора серной кислоты молярной концентрации 2 моль/дм 3 .

10.4 Обработка результатов

Учет реакции проводят визуально или на сканирующем спектрофотометре в соответствии с инструкцией по применению набора.

Если в субстратной смеси в качестве хромогена используют ОФД. то измерение оптической плотности проводят при 490 нм. если используют ТМБ. то при 450 км.

Реакцию учитывают только в том случае, если в лунках с контрольным отрицательным антигеном специфическое окрашивание отсутствует при интенсивном окрашивании в лунках с контрольным положительным антигеном. При визуальном учете пробу считают положительной, если хотя бы в одном (первом) разведении наблюдается специфическое окрашивание.

При спектрофотометрическом учете результата ИФА проводят расчет коэффициента специфичности К сп. который равен отношению оптической плотности (ОП) продукта реакции в лунках с контрольным положительным антигеном или исследуемым материалом (ОП«) к оптической плотности субстратной смеси в лунках с контрольным отрицательным антигеном (ОПг). Реакцию считают положительной. если коэффициент специфичности более 2.1 и отрицательной, если менее 2.1.

ОП1 * 0,641, ОПг а 0,120, К сп = 5,34 - реакция положительная или ОП1 = 0,180, ОПг в 0,120 К с „ * 1,5 - реакция отрицательная.

В случае положительной реакции диагноз считают установленным. Отрицательный результат должен быть подтвержден другими методами по 7 - 9.

11 Реакция диффузионной преципитации (РДП)

11.1 Сущность метода

Сущность метода РДП заключается в способности антител и вирусного антигена диффундировать в агаровом геле и при специфическом взаимодействии образовывать комплекс «антиген-антитело», наблюдаемый невооруженным глазом в виде линии преципитации.

11.2 Подготовка к исследованию

11.2.1 Подготовка проб

Подготовка проб к исследованию - по 8.2.1.

Для исследования допускаются несвежие пробы мозга животных, контаминированные бактериальной микрофлорой.

11.2.2 Подготовка агара

Для приготовления агара смешивают 1.5 г агара «Дифко». 1 см 3 1 %-ного раствора метилового оранжевого в 50 %-ном этиловом спирте. 0.01 г мертиолята. 100 см 3 изотонического раствора натрия хлорида. Полученную смесь кипятят до полного расплавления агара, разливают по пробиркам, автоклавируют при давлении 0.5 атм в течение 30 мин и хранят в холодильнике при температуре 4 в С.

11.2.3 Подготовка предметных стекол (чашек Петри)

Реакцию ставят либо на предметных стеклах, либо на чашках Петри. На обезжиренное стекло наносят каплю расплавленного агара, равномерно распределяют ее по стеклу и оставляют при комнатной температуре на 20 - 30 мин для застывания агара. Затем наносят на стекло 2.5 см 3 расплавленного агара, образуя слой толщиной около 2 мм. и оставляют на 20 - 30 мин. 8 застывшем слое агара с помощью специального штампа или металлической тонкостенной трубочки диаметром 4 - 5 мм делают лунки. Столбики агара осторожно извлекают, не повреждая и не допуская отслаивания от стекла тонкого слоя агарового геля, с помощью глазного пинцета или другого инструмента.

Чашки Петри готовят аналогично, внося в них 10 - 15 см 3 расплавленного агара для получения слоя толщиной 2-3 мм.

11.3 Проведение исследования

Непосредственно перед постановкой реакции готовят разведения антирабической сыворотки (иммуноглобулина), для чего в четыре пробирки вносят по 1.0 см 3 изотонического раствора натрия хлорида. В первую пробирку добавляют 1.0 см 3 антирабической сыворотки, получая разведение 1: 2.

перемешивают, и переносят 1.0 см 3 смеси во вторую пробирку и т. д. Таким образом, получают четыре пробирки с разведениями 1: 2.1:4.1: 8 и 1:16.

8 приготовленные лунки вносят по 0.05 - 0,07 см 3 пробы мозга (каждую пробу в отдельную лунку), полученной по 8.2.1. и разведения антирабической сыворотки или иммуноглобулина (1: 2; 1: 4; 1: 8:1:16) согласно рисунку 1.

Рисунок 1 - Схема внесения материала

Ар - эммонов рог; Пм - продолговатый мозг; А+ - положительный контрольный антиген; М -мозжечок; К - кора больших полушарий; А- - отрицательный контрольный антиген.

возможно применение других схем внесения материала, но при этом обязательно использование положительного и отрицательного антигенов.

Предметные стекла с исследуемым материалом помещают в чашки Петри с увлажненным дном или влажный эксикатор, а затем в термостат при температуре (37 ± 1) *С на 48 ч (чашки Петри накрывают крышкой и помещают в термостат).

Реакцию учитывают через 6. 24 и 48 ч.

11.4 Обработка результатов

Реакцию считают положительной при появлении даже одной линии преципитации любой интенсивности между лунками, содержащими исследуемый материал и антирабическую сыворотку (иммуноглобулин).

При этом между положительным антигеном и антирабической сывороткой (иммуноглобулином) должна наблюдаться заметная линия преципитации, а между отрицательным антигеном и антирабической сывороткой (иммуноглобулином) линии преципитации быть не должно.

8 случае положительной реакции диагноз считают установленным. Отрицательный результат должен быть подтвержден другими методами по 7 -10.

библиография

ЕС Guide to Good Manufacturing Practice for Medicinal Products for Human and Veterinary Use

УДК 619:616.98:579.852.1:615371 МКС 11.220

Ключевые слова: бешенство, диагностика, метод флуоресцирующих антител, иммуноферментный анализ, биопроба, реакция диффузионной преципитации

Подписано в печать 01.04.2014. Формат 60x84V

Уел. пвч. л. 1,40. Тираж 31 экэ. Зак. 1363.

Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта

ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ»

123995 Москва. Гранатный пер., 4.