Могут ли перисинусоидальные клетки быть региональными стволовыми клетками печени? Фундаментальные исследования Кто сказал, что вылечить тяжелые заболевания печени невозможно

Вверху - схематическое изображение клетки Ито (HSC) по соседству с ближайшими гепатоцитами (PC), ниже синусоидальных эпителиальных клеток печени (EC). S - синусоид печени; KC - клетка Купфера. Внизу слева - клетки Ито в культуре под световым микроскопом. Внизу справа - электронная микроскопия позволяет разглядеть многочисленные жировые вакуоли (L) клеток Ито (HSC), в которых хранятся ретиноиды.

Клетки Ито (синонимы: звёздчатая клетка печени , жирозапасающая клетка , липоцит , англ. Hepatic Stellate Cell, HSC, Cell of Ito, Ito cell ) - перициты , содержащиеся в , способные функционировать в двух различных состояниях - спокойном и активированном . Активированные клетки Ито играют главную роль в - формировании рубцовой ткани при повреждениях печени .

В неповрежденной печени, звёздчатые клетки находятся в спокойном состоянии . В таком состоянии клетки имеют несколько выростов, охватывающих синусоидный капилляр . Другой отличительной чертой клеток является присутствие в их цитоплазме запасов витамина А (ретиноида) в форме жировых капель. Спокойные клетки Ито составляют 5-8 % численности всех клеток печени.

Выросты клеток Ито подразделяются на два типа: перисинусоидальные (субэндотелиальные) и интергепатоцеллюлярные . Первые выходят из тела клетки и простираются вдоль поверхности синусоидного капилляра , охватывая его тонкими пальцеобразными ответвлениями. Перисинусоидальные выросты покрыты короткими ворсинками и имеют характерные длинные микровыбросы, простирающиеся ещё дальше по поверхности эндотелиальной трубки капилляра. Интергепатоцеллюлярные выросты, преодолев пластинку гепатоцитов и достигнув соседнего синусоида, делятся на несколько перисинусоидальных выростов. Таким образом, клетка Ито в среднем охватывает чуть больше двух соседних синусоидов.

При повреждении печени клетки Ито переходят в активированное состояние . Активированный фенотип характеризуется пролиферацией, хемотаксисом , сокращаемостью, потерей запасов ретиноида и образованием клеток, напоминающих миофибробластные . Активированные звёздчатые клетки печени также демонстрируют повышенное содержание новых генов , таких как, ICAM-1 , хемокины и цитокины . Активация свидетельствует о начале ранней стадии фиброгенеза и предшествует повышенному продуцированию ЕСМ -белков. Финальная стадия заживления печени характеризуется усиленным апоптозом активированных клеток Ито, вследствие чего их количество резко сокращается.

Для визуализации клеток Ито при микроскопии применяется окрашивание хлоридом золота . Установлено также, что надёжным маркером для дифференциации этих клеток от других миофибробластов является экспрессия ими белка рилин .

История [ | ]

В 1876 году Карл Фон Купфер описал клетки, названные им «Sternzellen» (звёздчатые клетки). При окрашивании оксидом золота, в цитоплазме клеток были заметны включения. Ошибочно сочтя их фрагментами эритроцитов, захваченных путём фагоцитоза, Купфер в 1898 году пересмотрел свои взгляды о «звёздчатой клетке» как об отдельном типе клеток и отнес их в разряд фагоцитов . Однако в последующие годы регулярно появлялись описания клеток, похожих на Купферовские «звёздчатые клетки». Им присваивались различные названия: интерстициальные клетки, парасинусоидные клетки, липоциты, перициты. Роль этих клеток оставалась загадкой на протяжении 75 лет, пока профессор (Toshio Ito) не обнаружил в перисинусоидальном пространстве печени человека некие клетки, содержащие вкрапления жира. Ито назвал их «shibo-sesshu saibo» - жиропоглощающие клетки. Поняв, что вкрапления были жиром, выработанным клетками из гликогена , он сменил название на «shibo-chozo saibo» - жирозапасающие клетки. В

Основным источником эндотоксина в организме является грамотрицательная флора кишечника. В настоящее время не вызывает сомнений тот факт, что печень является основным органом, осуществляющим клиренс эндотоксина . Эн­ дотоксин захватывается в первую очередь клет­ ками Купфера (КК), взаимодействуя с мембран­ным рецептором CD 14. С рецептором может связываться как сам липополисахарид (ЛПС), так и его комплекс с липид А-связывающим бел­ ком плазмы . Взаимодействие ЛПС с макро­фагами печени запускает каскад реакций, в ос­нове которых лежат выработка и высвобожде­ние цитокинов и других биологически активных медиаторов .

Имеется много публикаций о роли макрофа­ гов печени (КК) в захвате и клиренсе бактери­ального ЛПС, однако взаимодействие эндотелия с другими мезенхимальными клетками, в част­ности, с перисинусоидальными клетками Ито, практически не изучено.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Белым крысам-самцам массой 200 г внутрибрюшинно в 1 мл стерильного физиологического раствора вводили высокоочищенный лиофилизированный ЛПС Е. coli штамм 0111 в дозах 0.5, 2.5, 10, 25 и 50 мг/кг. На сроках 0.5, 1, 3, 6, 12, 24, 72 ч и 1 нед под наркозом извлекали внут­ренние органы и помещали их в забуференный 10% формалин. Материал заливали в парафино­вые блоки. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали иммуногистохимическим стрептавидин-биотиновым методом антителами к десмину , α - гладко-мышечному актину (А-ГМА) и ядерному антиге­ ну пролиферирующих клеток ( PCNA , " Dako "). Десмин использовали в качестве маркера перисинусоидальных клеток Ито, А-ГМА - в качест­ ве маркера миофибробластов , PCNA - проли­ферирующих клеток. Для выявления эндотокси­на в клетках печени использовали очищенные анти- R е-гликолипидные антитела (Институт об­щей и клинической патологии КДО, Москва).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При дозировке 25 мг/кг и выше через 6 ч после введения ЛПС наблюдали шок со смертельным исходом. Острое воздействие ЛПС на ткань пе­чени вызывало активацию клеток Ито, которая проявлялась увеличением их количества. Число десминположительных клеток увеличивалось с 6 ч после инъекции ЛПС и достигало максимума к 48-72 ч (рис. 1, а, б).

Рис. 1. Срезы печени кры­сы, обработанные LSAB -ме-ченными антителами к десмину (а, б) и α - гладкомышечному актину (в), х400 (а, б), х200 (в).

а - до введения эндотокси­ на, единичные десминположительные клетки Ито в перипортальной зоне; б - 72 ч после введения эндотокси­на: многочисленные десминположительные клетки Ито; в - 120 ч после введения эн­ дотоксина: α - гладкомышечный актин присутствует толь­ ко в гладкомышечных клет­ ках сосудов.

Через 1 нед число десминположительных клеток снижалось, но ос­ тавалось выше контрольных показателей. При этом ни в одном случае мы не наблюдали появления А-ГМА-положительных клеток в синусои­ дах печени. Внутренним положительным контролем при окрашивании антителами к А-ГМА служило выявление гладкомышечных клеток кро­ веносных сосудов портальных трактов, содержа­щих А-ГМА (рис. 1, в). Следовательно, несмотря на увеличение количества клеток Ито, однократ­ ное воздействие Л ПС не приводит к трансформации (трансдифференцировке ) их в миофибробласты .

Рис. 2. Срезы печени крысы, обработанные LSAB -меченными ан­тителами к PCNA . а - до введения эн­дотоксина: единичные пролиферирующие гепатоциты , х200; б - 72 ч после введения эндотоксина: много­численные пролифе­рирующие гепатоциты ,х400.

Увеличение количества десминположительных клеток начиналось в пределах портальной зоны. С 6 ч до 24 ч после введения ЛПС перисинусоидальные клетки обнаруживались только вокруг портальных трактов, т.е. в 1-й зоне ацинуса . На сроках 48-72 ч, когда наблюдалось мак­ симальное количество десминположительных кле­ ток, они появлялись и в других зонах ацинуса ; тем не менее большая часть клеток Ито распо­лагалась все же перипортально .

Возможно, это связано с тем, что перипор­тально расположенные КК первыми захватывают эндотоксин, поступающий из кишечника по во­ротной вене либо из системного кровотока. Ак­тивированные КК вырабатывают широкий спектр цитокинов , которые, как предполагается, запус­кают активацию клеток Ито и трансдифференцировку их в миофибробласты . Очевидно, именно поэтому первыми на выброс цитокинов реагируют клетки Ито, расположенные вблизи активированных макрофагов печени (в 1-й зоне ацинуса ). Однако в нашем исследовании мы не наблюдали их трансдифференцировки в миофиб­робласты , и это позволяет предположить, что выделяемые КК и гепатоцитами цитокины мо­гут служить фактором, поддерживающим уже начавшийся процесс трансдифференцировки , но они, вероятно, не способны запускать его при однократном воздействии ЛПС на печень.

Усиление пролиферативной активности кле­ток также наблюдалось преимущественно в 1-й зоне ацинуса . Вероятно, это говорит о том, что все (или практически все) процессы, направлен­ные на ауто - и паракринную регуляцию межкле­точных взаимодействий, протекают в перипортальных зонах. Увеличение количества пролиферирующих клеток наблюдали с 24 ч после вве­дения ЛПС; число положительных клеток уве­личивалось вплоть до 72 ч (максимум пролифе­ративной активности, рис. 2, а, б). Пролиферировали как гепатоциты , так и синусоидные клетки. Однако окрашивание на PCNA не дает возможности идентифицировать тип пролифери рующих синусоидных клеток. По данным лите­ратуры, действие эндотоксина приводит к увели­чению количества КК . Полагают, что это про­ исходит как за счет пролиферации макрофагов печени, так и за счет миграции моноцитов издругих органов . Выбрасываемые КК цитоки­ны могут повышать пролиферативную способ­ность клеток Ито. Поэтому логично предполо­жить, что пролиферирующие клетки представле­ны перисинусоидальными клетками Ито. Заре­гистрированное нами увеличение их числа необ­ходимо, по-видимому, для повышения синтеза ростовых факторов и восстановления межкле­точного матрикса в условиях повреждения. Это может быть одним из звеньев компенсаторно-восстановительных реакций печени, поскольку клетки Ито являются основным источником компонентов межклеточного матрикса, фактора стволовых клеток и фактора роста гепатоцитов , которые участвуют в репарации и дифференцировке эпителиальных клеток печени . Отсутст­ вие же трансформации клеток Ито в миофибро­бласты свидетельствует о том, что одного эпизо­да эндотоксиновой агрессии недостаточно для развития фиброза печени.

Таким образом, острое воздействие эндоток­сина вызывает увеличение числа десминположи­тельных клеток Ито, что является косвенным признаком повреждения печени. Количество перисинусоидальных клеток возрастает, видимо, в результате их пролиферации. Однократный эпи­зод эндотоксиновой агрессии вызывает обрати­мую активацию перисинусоидальных клеток Ито и не приводит к их трансдифференцировке в миофибробласты . В связи с этим можно пред­положить, что в механизмах активации и транс­дифференцировки клеток Ито задействованы не только эндотоксин и цитокины , но и какие-то иные факторы межклеточных взаимодействий.

ЛИТЕРАТУРА

1. Маянский Д.Н., Виссе Э., Декер К. // Новые рубежи гепатологии . Новосибирск, 1992.

2. Салахов И.М., Ипатов А.И., Конев Ю.В., Яков­лев М.Ю. // Успехи соврем, биол. 1998. Т. 118, Вып . 1. С. 33-49.

3. Яковлев М.Ю. // Казан. м ед. журн. 1988. № 5. С. 353-358.

4. Freudenberg N ., Piotraschke J ., Galanos C . et al . // Virchows Arch . [ B ]. 1992. Vol . 61. P . 343-349.

5. Gressner A . M . // Hepatogastronterology . 1996. Vol. 43. P. 92-103.

6. Schmidt C, Bladt F., Goedecke S. et al. // Nature. 1995. Vol. 373, N 6516. P. 699-702.

7. Wisse E., Braet F., Luo D. et al. // Toxicol . Pathol . 1996. Vol. 24, N 1. P. 100-111.

Intercellular communication might be realized by paracrine secretion and direct cell-to-cell contacts. It is known that hepatic perisinusoidal cells (HPC) establish regional stem cells niche and determine their differentiation. At the same time HPC remain poorly characterized on molecular and cellular level.

The aim of project was to study interactions between rat hepatic perisinusoidal cells and various stem cells such as mononuclear cell fraction of human umbilical cord blood (UCB-MC) and rat bone-marrow derived multipotential mesenchymal stromal cells (BM-MMSC).

Materials and methods. Rat BM-MSC and HPC, human UCB-MC cells were derived using standard techniques. To study HPC paracrine regulation we co-cultured UCB-MC or BM-MMSC cells with HPC using Boyden chambers and conditioned HPC cells media. Differentially labeled cells were co-cultured and their interactions were observed by phase-contrast fluorescent microscopy and immunocytochemistry.

Results. During the first week of cultivation there was autofluorescence of vitamin A because of fat-storing ability of PHC. BM-MMSC demonstrated high viability in all co-culture models. After 2 day incubation in conditioned media co-culture of BM-MMSC with HPC we observed changes in morphology of MMSC - they decreased in size and their sprouts became shorter. The expression of α-Smooth Muscle Actin and desmin was similar to myofibroblast - an intermediate form of Ito cells culture in vitro. These changes could be due to paracrine stimulation by HPC. The most profound effect of HPC on UCB-MC cells was observed in contact co-culture, thereby it is important for UCB-MC cells to create direct cell-to-cell contacts for maintaining their viability. We did not observe any cell fusion between HPC /UCB and HPC /BM-MMSC cells in co-cultures. In our further experiments we plan to study growth factors produced by HPC for hepatic differentiation of stem cells.

Введение.

Особый интерес среди многообразия клеток печени представляют перисинусоидальные клетки печени (клетки Ито) . Благодаря секреции факторов роста и компонентов межклеточного матрикса они создают микроокружение гепатоцитов, а в ряде научных исследований была показана способность звездчатых клеток печени к формированию микроокружения для прогениторных клеток (в том числе, гемопоэтических) и влиять на их дифференцировку в гепатоциты. Межклеточные взаимодействия этих популяций клеток могут осуществляться путем паракринной секреции факторов роста или непосредственных межклеточных контактов, однако молекулярные и клеточные основы этих процессов остаются до конца неизученными.

Цель исследования.

Изучение механизмов взаимодействия клеток Ито с гемопоэтическими (ГСК) и мезенхимальными (ММСК) стволовыми клетками в условиях in vitro.

Материалы и методы.

Клетки Ито печени крыс выделены двумя различными ферментативными методами. Одновременно из костного мозга крыс получены стромальные ММСК. Мононуклеарная фракция гемопоэтических стволовых клеток выделена из пуповинной крови человека. Паракринные влияния клеток Ито были исследованы при культивировании ММСК и ГСК в среде, в которой росли клетки Ито, и при совместном культивировании клеток, разделённых полупроницаемой мембраной. Влияние межклеточных контактов было изучено при совместном ко-культивировании клеток. Для лучшей визуализации каждая популяция была мечена индивидуальной флуоресцентной меткой. Морфологию клеток оценивали методами фазово-контрастной и флуоресцентной микроскопии. Фенотипические признаки культивируемых клеток изучали методами иммуноцитохимического анализа.

Результаты.

В течение недели после выделения перисинусоидальных клеток нами отмечена способность их к аутофлюоресценции благодаря жиронакапливающей способности. Далее клетки перешли в промежуточную фазу своего роста и приобрели звёздчатую форму. На начальных этапах ко-культивирования клеток Ито с ММСК костного мозга крысы жизнеспособность ММСК сохранялась во всех вариантах культивирования. На вторые сутки при культивировании ММСК в культуральной среде клеток Ито происходило изменение морфологии ММСК - они уменьшались в размерах, отростки укорачивались. Экспрессия альфа-гладкомышечного актина и десмина в ММСК увеличивалась, что свидетельствовало об их фенотипическом сходстве с миофибробластами - промежуточной стадией роста активированных клеток Ито in vitro. Полученные нами данные свидетельствуют о влиянии паракринных факторов, выделяемых клетками Ито, на свойства ММСК в культуре.

На основании ко-культивирования кроветворных стволовых клеток с клетками Ито показано, что гемопоэтические стволовые клетки сохраняют жизнеспособность только при контактном ко-культивировании с клетками Ито. По данным флуоресцентного анализа смешанных культур феномен слияния клеток разных популяций выявлен не был.

Выводы. Для сохранения жизнеспособности кроветворных стволовых клеток решающим фактором является наличие непосредственных межклеточных контактов с клетками Ито. Паракринная регуляция была отмечена только при культивировании ММСК в питательной среде, в которой росли клетки Ито. Изучение влияния конкретных факторов, вырабатываемых клетками Ито, на дифференцировку ГСК и ММСК в культуре клеток планируется провести в следующих исследованиях.

Шафигуллина А.К., Трондин А.А., Шайхутдинова А.Р., Калигин М.С., Газизов И.М., Ризванов А.А., Гумерова А.А., Киясов А.П.
ГОУ ВПО «Казанский Государственный Медицинский Университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Строение эндотелиальных клеток, клеток Купфера и Ито , мы рассмотрим на примере двух рисунков.

На рисунке справа от текста, изображены синусоидные капилляры (СК) печени - внутридольковые капилляры синусоидного типа, увеличивающиеся от входных венул к центральной вене. Печеночные синусоидные капилляры формируют анастомотическую сеть между печеночными пластинками. Выстилка синусоидных капилляров образована эндотелиальными клетками и клетками Купфера.

На рисунке слева от текста, изображена печеночная пластинка (ПП) и два синусоидных капилляра (СК) печени срезаны вертикально и горизонтально, чтобы показать перисинусоидальные клетки Ито (КИ). На рисунке отмечены также срезанные желчные канальцы (ЖК).

Отростки клеток Купфера проходят без каких-либо соединительных устройств между эндотелиальными клетками и часто пересекают просвет синусоидов. Клетки Купфера содержат овальное ядро, много митохондрий, хорошо развитый комплекс Гольджи, короткие цистерны гранулярной эндоплазматической сети, множество лизосом (Л), остаточные тела и редкие кольцевые пластинки. Клетки Купфера также включают большие фаголизосомы (ФЛ), которые часто содержат отжившие свой срок эритроциты и инородные вещества. Также могут быть выявлены, особенно при суправитальной окраске, включения гемосидерина или железа.

Поверхность клеток Купфера демонстрирует непостоянные уплощенные цитоплазматические складки, называемые ламеллоподиями (ЛП) - пластинчатыми ножками, а также отростки, называемые филоподиями (Ф), и микроворсины (Мв), покрытые гликокаликсом. Плазмолемма формирует червеобразные тельца (ЧТ) с центрально расположенной плотной линией. Эти структуры могут представлять конденсированный гликокаликс.

Клетки Купфера - это макрофаги, весьма вероятно, формирующие самостоятельный род клеток. Они обычно происходят от других клеток Купфера вследствие митотического деления последних, но могут также происходить из костного мозга . Некоторые авторы полагают, что они являются активизированными эндотелиальными клетками.

Иногда случайное автономное нервное волокно (НВ) проходит через пространство Диссе. В некоторых случаях волокна имеют контакт с гепатоцитами. Края гепатоцитов отграничены межгепатоцитными углублениями (МУ), усеянными микроворсинками.

Отростки охватывают синусоидные капилляры печени и в некоторых случаях проходят через печеночные пластинки, вступая в контакт с соседними печеночными синусоидами. Отростки не постоянны, разветвлены и тонки; они могут быть также уплощенными. Накапливая группы липидных капель, они удлиняются и приобретают вид виноградной кисти.

Считается, что перисинусоидальные клетки Ито - это слабодифференцированные мезенхимные клетки, которые могут рассматриваться как гемопоэтические стволовые клетки, так как они могут в патологических условиях трансформироваться в жировые клетки, активные кровяные стволовые клетки или в фибробласты.

В нормальных условиях клетки Ито вовлечены в аккумуляцию жира и витамина А так же, как и в продукцию внутридольковых ретикулярных и коллагеновых волокон (KB).

Для цитирования: Курышева М.А. Фиброз печени: прошлое, настоящее и будущее // РМЖ. 2010. №28. С. 1713

Фиброз печени - это локальное или диффузное увеличение количества соединительной ткани, внеклеточного матрикса (коллагеновой волокнистой ткани в перисинусоидном пространстве) и основной путь прогрессирования хронических диффузных заболеваний печени. На ранних стадиях фиброза нет клинических проявлений, и лишь при гистологическом исследовании биоптата выявляется чрезмерное накопление соединительной ткани. В дальнейшем фиброз ведет к образованию узлов регенератов, сосудистых анастомозов - формированию цирроза печени . Нецирротический фиброз печени встречается редко и в настоящей работе не рассматривается.

Процессы фиброза в печени изучались в течение многих лет (табл. 1), но только после открытия роли звездчатых клеток в процессах фиброзирования были получены новые возможности для антифибротической терапии.

Патогенез фиброза печени
Синусоидальные клетки - эндотелиальные, клетки Купфера, звездчатые клетки (клетка Ито, стеллатная клетка, ретиноидзапасающая клетка, липоцит), вместе с обращенным в просвет синусоидов участком гепатоцитов образуют функциональную единицу. Кроме клеток, в области синусидов располагается внеклеточный матрикс (ВКМ), видимый только при заболеваниях печени. Все клетки, образующие синусоид, могут участвовать в образовании ВКМ. В норме существует равновесие между факторами фиброгенеза и антифибротическими факторами. Основную роль в фиброзировании играют клетки Ито, вырабатывающие профибротические и антифибротические факторы. К антифибротическим факторам относят матриксные металлопротеазы (ММП), участвующие в разрушении белков ВКМ (коллагеназы, желатиназы, стромолизины). Активность ММП подавляется тканевыми ингибиторами матриксных металлопротеаз (ТИМП), которые также продуцируются клетками Ито .
При повреждении печени выделяются биологически активные вещества, активирующие макрофаги и эндотелий синусоидов, выделяющих IL-1, TNFα , оксид азота, эндотелин, действующих на клетки Ито. Звездчатые клетки при активации вырабатывают тромбоцитактивирующий фактор PDGF и трансформирующий фактор роста TGFβ 1. Под действием TGFβ 1 клетки Ито начинают активировать сами себя, мигрируют в участки воспаления. Происходит изменение фенотипа клеток Ито - они трансформируются в миофибробласты, продолжающие выработку TGFβ 1, и начинают вырабатывать ВКМ. Нарушение равновесия между фибротическими и антифибротическими факторами ведет к увеличению в 3-10 раз компонентов ВКМ, изменению его состава (преобладанию коллагена I и III типа). Пере-распределение матрикса в пространство Диссе, его расширение, капилляризация синусоидов сопровождается нарушением обмена между гепатоцитами и кровью, шунтированием крови из-за развития ложных долек и развитием цирроза печени. В случае прекращения действия медиаторов воспаления клетки Ито вновь начинают продуцировать профибротические вещества и происходит уменьшение компонентов ВКМ в пространстве Диссе. Таким образом, фиброз на ранних стадиях развития - процесс обратимый .
Патогенез фиброза печени при хронических вирусных гепатитах связан с индукцией инфицированными гепатоцитами активности воспалительных клеток, что ведет к стимуляции клеток Ито. При алкогольной болезни печени ацетальдегид и свободные радикалы кислорода активируют клетки Ито. Кроме этого, этанол способствует росту грамнегативной микрофлоры в кишечнике, повышению уровня липополисахаридов в портальной крови и активации клеток Купфера, продукцирующих TNFα , действующих на клетки Ито. Патогенез фиброза печени при неалкогольной жировой болезни печени связан с гипергликемией и инсулинорезистентностью, ведущих к повышению уровня свободных жирных кислот и стеатозу печени, а свободные радикалы и провоспалительные цитокины - к апоптозу гепатоцитов и активации воспалительных клеток с прогрессированием фиброза печени. При первичном билиарном циррозе билиарные клетки секретируют фиброгенные медиаторы, активирующие клетки Ито, запускающие фиброгенез .

Обратимость фиброза печени
Долгое время фиброз печени считался необратимым патологическим состоянием. Однако еще 50 лет назад были описаны случаи обратного развития фиброза после эффективной терапии гемохроматоза и болезни Вильсона-Коновалова, а в последующем неоднократно публиковались данные об обратном развитии фиброза при аутоиммунном гепатите в результате иммуносупрессивной терапии, вторичном билиарном ЦП после хирургической декомпрессии желчевыводящих путей, неалкогольном стеатогепатите при уменьшении массы тела, алкогольном гепатите при абстиненции .
Обратимость фиброза наблюдалась при длительном воздержании от приема алкоголя, когда через 4-6 недель было выявлено уменьшение содержания коллагена IV типа, ламинина и гиалуроновой кислоты в стенках синусоидов при биопсии и в сыворотке крови - происходила регрессия процесса «капилляризации синусоидов». Были отмечены также изменения, отражающие функцию клеток Ито - повышение уровня ММП-2 и снижение уровня ее ингибитора ТИММП-2. Через определенные временные интервалы наблюдалось уменьшение количества миофибрилл актина в стенках синусоидов, что свидетельствует о падении активности звездчатых клеток Ито и переключение их от синтеза экстрацеллюлярного матрикса к его деградации .
В то же время только с внедрением в клиническую практику противовирусной терапии концепция фиброза печени, как динамического процесса с возможностью как прогрессирования, так и регресса, была признана научно доказанным фактом.
Достигнутый прогресс привел к ясному пониманию того, что фиброз печени обратим, и к реалистичным ожиданиям того, что эффективная антифибротическая терапия существенно изменит ведение пациентов с болезнями печени и обеспечит благоприятный прогноз даже при уже развившемся циррозе печени.
Диагностика фиброза печени
Золотым стандартом диагностики фиброза печени является проведение биопсии с гистологическим исследованием. Гистологическая оценка проводится по шкалам Desmet (1984) в модификации Серова; шкале JSHAK или METAVIR. В зависимости от локализации и распространенности различают следующие формы фиброза печени: венулярный и перивенулярный (в центре долек и стенках центральных вен - характерен для хронического алкогольного гепатита); перицеллюлярный (вокруг гепатоцитов при хронических вирусных и алкогольных гепатитах); септальный (концентрическое разрастание фиброзной ткани вокруг желчных канальцев - при вирусном гепатите); портальный и перипортальный (при вирусном, алкогольном, аутоиммунном гепатитах); перидуктальный фиброз (вокруг желчных канальцев при склерозирующем холангите); смешанный (представлены разные формы фиброза).
В связи с инвазивностью, с достаточно большой погрешностью гистологического исследования, связанной с «ошибками попадания» иглы при пункционной биопсии печени, различием в интерпретации результатов, для ранней диагностики патологических процессов в настоящее время уделяют большое внимание неинвазивным методам диагностики фиброза. К ним относят биопрогностические лабораторные тесты; эластометрию печени и МР эластографию; УЗИ, КТ, МРТ печени, УЗДГ сосудов печени и селезенки с расчетом индексов фиброза и портальной гипертензии .
Маркеры фиброза разделяют на прямые (биомаркеры), отражающие метаболизм ВКМ, и непрямые, свидетельствующие о печеночной недостаточности. К прямым маркерам относят карбокситерминальный пептид проколлагена I типа, аминотерминальный пептид проколлагена III типа, ТИМП-1, 2, коллаген IV типа, гиалуроновую кислоту, ламинин, ММП-2. Определение этих веществ используется в клинических исследованиях.
Для клинической практики предложены разные расчетные прогностические индексы для оценки тяжести фиброза печени по непрямым маркерам: APRI, ELF, FIB-4, FibroFast, FibroIndex, FibroMeter, FPI, Forns , GUCI, Hepascore, HALT-C, MDA, PGA, PGAA.
Для оценки выраженности фиброза печени используют системы Фибро-тест и Акти-тест, рассматривая их в качестве альтернативы биопсии. Фибро-тест включает 5 биохимических показателей: альфа 2-макроглобуллин (активирует клетки Ито), гаптоглобин (отражает стимуляцию клеток печени интерлейкинами), аполипопротеин А1, гамма-глутамилтранспептидаза, общий билирубин. Акти-тест (оценивается вирусная некровоспалительная активность) в дополнение к перечисленным компонентам включает аланиновую аминотрансферазу - АлАТ. ФиброМакс является сочетанием пяти неинвазивных тестов: ФиброТест и АктиТест, Стеато-Тест (диагностируется стеатоз печени), НешТест (диагностируется неалкогольный стеатогепатит), АшТест (диагностируется тяжелый алкогольный стеатогепатит). В ФиброМаксе определяется альфа 2-макроглобуллин, гаптоглобин, аполипопротеин А1, гамма-глутамилтранспептидаза, общий билирубин, АлАТ, АсАТ, глюкоза, триглицериды, холестерин. По полученным данным, с учетом возраста и пола пациента рассчитывается стадия фиброза и уровень активности гепатита. Лими-тируют использование тестов признаки холестаза, от-рицательно влияющие на диагностическую значимость тестов, и высокая стоимость исследования .
Действие аппарата, основанного на ультразвуковой эластографии печени при пропускании волн (вибрации) через печень и улавливании их датчиком, позволяет оценить степень фиброза в печени на ранних стадиях. Аппарат малоинформативен при ожирении и асците.
Магнитно-резонансная элластография - прямой метод определения плотности печени, позволяющий определить F0 в сравнении со здоровыми добровольцами, что до сих пор не удавалось продемонстрировать с помощью других методов оценки фиброза.
В перспективе можно определить наличие и темп прогрессирования фиброза в зависимости от этиологического фактора. Решение этих проблем дает возможность диагностировать ранние стадии фиброза, а следовательно, эффективно лечить.

Лечение
Антифибротическая терапия неотрывно связана с этиологическим и патогенетическим лечением хронических гепатитов (табл. 2). В большинстве случаев препараты для устранения этиологического факторов гепатитов являются и антифибротическими средствами. Выявлено антифибротическое действие у противовирусных препаратов, пентоксифиллина, фосфатидилхолина, глюкокортикостероидов, донаторов оксида азота, витамина Е, антагонистов эндотелиновых рецепторов, антагонистов ангиотензиновых рецепторов, ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента, силимарина. Проводится поиск препаратов, тормозящих фиброгенез для применения в ситуациях, когда воздействие на причинный фактор затруднено: антиоксидантов (бетаин, пробукол, N-ацетилцистеин), гепатопротекторов (силимарин, УДХК, S-аденозилметионин, эссенциальные фосфолипиды), снижающие активность фактора некроза опухоли (пентоксифиллин, адипонектин, инфликсимаб).
Идет поиск препаратов с направленным антифибротическим действием:
- элиминация повреждающего агента (интерлейкин 10, ингибиторы TNF - противовоспалительный эффект; антиоксиданты - подавление фибротических процессов в ответ на оксидативный стресс);
- подавление профибротической активности звездчатых клеток (интерфероны, фактор роста гепатоцитов, агонисты PPARγ );
- поддержание активной антифибротической активности звездчатых клеток (антагонисты TGFβ 1 - уменьшают синтез матрикса и усиливают его распад; антагонисты PDGF, оксид азота, ингибиторы АПФ - подавляют пролиферацию клеток Ито);
- влияние на секрецию коллагенов звездчатыми клетками печени (ингибиторы АПФ, ингибиторы полигидроксилаз, интерферон γ - уменьшают фиброз; антагонисты эндотелиновых рецепторов - уменьшают фиброз и портальную гипертензию);
- действие на апоптоз клеток Ито (гилотоксин, NGF - фактор роста нейронов - стимулируют апоптоз);
- усиление распада коллагенового матрикса (металлопротеиназы, антагонисты тканевого ингибитора ММП; антагонисты TGFβ 1 — снижают активность TИМП и повышают активность ММП; релаксин — снижает активность ТИМП и повышают активность ММП) .
Перспективным представляется использование с антифибротической целью лекарственного препарата силимарин (Легалон). Силимарин - официальное на-именование группы из четырех изомеров флавонолигнана (силибинин, изосилибинин, силикристин и силидианин), выделенных из экстрактов плодов расторопши пятнистой (Cardui mariae fructus) и входящих в состав Легалона 70 и 140 (доза силимарина).
При проведении клинических исследований было выявлено, что наряду с противовоспалительным, антиоксидантным, антитоксическим, гиполипидемическим и антиканцерогенным действием силимарин обладает выраженным антифибротическим эффектом. Это связано с влиянием на трансформирующий фактор роста β и экспрессию генов в клетках Ито, а также с повышением клиренса свободных радикалов и непосредственным подавлением синтеза коллагена .
Связь фармакодинамики силимарина/силибинина с клиническим действием Легалона® приведена в таблице 3. Указанные механизмы действия определяют терапевтическое значение Легалона® при диффузных заболеваниях печени. В многочисленных исследованиях показана высокая эффективность Легалона® при длительном его применении в подавлении воспалительно-некротической реакции в печени, торможении развитие фиброза и снижении риска злокачественной трансформации гепатоцитов при циррозах печени .
На модели алкогольного фиброза печени у обезьян при морфологическом исследовании печени и изучении сывороточных маркеров фиброза было выявлено, что у животных, получавших силимарин, значительно меньше прогрессировал фиброз и реже развивался цирроз печени .
Действие Легалона при фиброзе печени было изучено у 792 пациентов с хроническими заболеваниями печени, в том числе циррозом. В качестве маркера фиброгенеза был выбран показатель Р-III-NP. Период наблюдения в среднем составил 107 дней. При исходно повышенном уровне Р-III-NP через 3 месяца лечения Легалоном уровень Р-III-NP снизился до нормального .
Результаты 5 международных плацебо-контролируемых исследований (участвовало 600 пациентов) показали, что 4-летняя выживаемость пациентов с алкогольным циррозом печени на фоне приема Легалона оказалась статистически значимо выше по сравнению с группой пациентов, получавших плацебо. При анализе подгрупп выявлено, что лечение Лега-лоном было эффективным при алкогольном циррозе независимо от его тяжести и стадии цирроза, а в подгруппе с циррозом стадии А по Чайд-Пью независимо от его этиологии. В подгруппе пациентов с алкогольным циррозом на фоне вирусного гепатита за время наблюдения не было зафиксировано ни одного смертельного исхода, в то время как в группе плацебо - 4 смерти от декомпенсации цирроза .
Фиброз в настоящее время называют краеугольным камнем хронической патологии печени. Именно он обусловливает формирование цирроза печени, поэтому ранняя диагностика и лечение фиброза чрезвычайно актуальны в настоящее время и являются задачей будущих научных исследований.

Литература
1. Шерлок Ш, Дули Дж. Заболевания печени и желчных путей: Практическое руководство. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2002. 864 с.
2. Bataller R., Brenner D. A. Liver fibrosis. J. Clin. Invest. 2005; 115(2):209-218.
3. Iredale J. P. Models of liver fibrosis: exploring the dynamic nature of inflammation and repair in a solid organ. J. Clin. Invest. 2007; 117(3):539-548.
4. Parsons C. J, Takashima M., Rippe RA. Molecular mechanisms of hepatic fibrogenesis. J Gastroenterol Hepatol. 2007; 22(1):79-84.
5. Сторожаков Г.И., Ивкова А.Н. Патогенетические аспекты фиброгенеза при хронических заболеваниях печени. Клин. перспективы гастроэнтерологии, гепатологии 2009; 2:3-10.
6. Павлов Ч.С., Золотаревский В.Б., Томкевич М.С. Возможности обратимости цирроза печени. Росс. журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии 2006; 1:20-29.
7. Северов М.В. Обратимость фиброза и цирроза печени при HCV-инфекции. Гепатологический форум 2008; 1:2-6.
8. Павлов Ч.С., Глушенков Д.В., Ивашкин В.Т. Современные возможности эластометрии, фибро- и акти-теста в диагностике фиброза печени. Росс. журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии 2008; 4:43-52.
9. Rockey D.C. Antifibrotic therapy in chronic liver disease Clin. Gastroenterol. Hepatol. 2005; 3:95-107.
10. Dehmlow C., Erhard J. Hepatology 1996; 23:749-754.
11. Lieber et al. Gastroenterol. 2003; 37:336-339.
12. Schuppan, Z. Allg. Med. 1998; 74:577-584.