Лейкоциты. Определение лейкоцитов Методики определения и нормы лейкоцитов в крови

При определении количества лейкоцитов кровь разводят в пробирке в 21 (≈20) раз разводящей жидкостью, которая состоит из 3-5% раствора уксусной кислоты, подкрашенной метиленовым синим (жидкость Тюрка). Лейкоциты подсчитывают в 100 больших (1600 маленьких) квадратах сетки Горяева, неразделенных линиями.

Количество лейкоцитов в 1 л крови вычисляют по формуле:

где х - количество лейкоцитов в 1 л исследуемой крови; а - количество лейкоцитов, найденное при подсчете; 1 / 400 мкл - объем малого квадрата; 20 - степень разведения крови; 1600 - число малых квадратов; 10 6 - коэффициент для пересчета по международной системе единиц СИ.

Для работы необходимы : микроскоп, счетная камера, стеклянные палочки, пипетки от гемометра Сали, мундштук, пипетка на 1·10 3 л (1 мл), пробирки длиной 1·10 -1 м (10 см) и диаметром 1·10 -2 м (1 см), скарификаторы, спирт, вата, спиртовой раствор йода, разводящая жидкость.

Ход работы . 1. В предварительно высушенную, чистую пробирку отмерить 4·10 -4 л (0,4 мл) разводящей жидкости и закрыть ее пробкой.

2. Сделать укол скарификатором в мякоть пальца и набрать пипеткой от гемометра Сали 20 мм 3 крови.

3. Выдуть кровь в пробирку с разводящей жидкостью, промыть ею пипетку, содержимое пробирки закрыть пробкой и осторожно перемешать при вертикальном положении пробирки.

4. Заполнить счетную камеру.

5. Под большим увеличением микроскопа сосчитать лейкоциты в 100 больших (1600 маленьких) квадратах.

6. Вычислить количество лейкоцитов в 1 л крови по формуле.

Задание 2. Определение гемоглобина в крови с помощью гемометра Сали

Метод основан на калориметрическом принципе, т. е. на сравнении цвета исследуемого и стандартного растворов.

Гемометр Сали состоит из штатива с матовым стеклом и трех пробирок. Две из них запаяны и содержат стандартный раствор солянокислого гематина (соединение гемоглобина с соляной кислотой). Стандартный раствор солянокислого гематина (гемина) обычно готовят из крови, содержащей в 1 л 166,7 или 173 г гемоглобина (указывают в паспорте прибора). В третьей - градуированной пробирке гемометра производят определение содержания гемоглобина в исследуемой крови.

Градуированная пробирка гемометра имеет одну шкалу, которая показывает количество гемоглобина в граммах на 100 мл крови, т. е. концентрацию гемоглобина в грамм-процентах (г%). Для того чтобы перевести полученную цифру в единицы системы СИ (г/л) необходимо умножить ее на 10.

Для работы необходимы : гемометр Сали, скарификатор, 0,1N раствор соляной кислоты, дистиллированная вода, спирт, вата, спиртовой раствор йода.

Ход работы . 1. В градуированную пробирку гемометра налить до метки 3 г% (в гемометре старого типа до метки 10) 0,1N раствор соляной кислоты.

2. Пипеткой от гемометра набрать точно 20 мм 3 крови и выдуть ее на дно пробирки. Не вынимая пипетку из пробирки, сполоснуть ее соляной кислотой. Встряхивая пробирку, тщательно перемешать ее содержимое. Смеси дают постоять 5-10 мин.

3. Через 5-10 мин прибавлять по каплям дистиллированную воду до тех пор, пока цвет исследуемой жидкости не будет одинаковым с окраской стандартного раствора.

4. Отметить по шкале, на каком делении стоит уровень раствора солянокислого гематина. Полученную цифру умножить на 10. Эти цифры укажут количество гемоглобина в исследуемой крови в граммах.

Задание 3. Определение СОЭ по методу Панченкова

Для определения скорости оседания эритроцитов (СОЭ) используют унифицированный метод Панченкова.

В крови, предохраненной от свертывания, происходит оседание форменных элементов, в результате чего кровь разделяется на два слоя: верхний - плазма и нижний - осевшие на дно сосуда клетки крови.

Скорость, с которой оседают эритроциты, колеблется в больших пределах в зависимости от состава крови и состояния организма.

СОЭ выражают в миллиметрах в 1 ч (мм/ч). Она равняется у взрослых и здоровых мужчин 1-10 мм/ч, у здоровых (небеременных) женщин 2-15 мм/ч, у новорожденных 0,5 мм/ч.

СОЭ увеличивается при некоторых инфекционных заболеваниях, злокачественных новообразованиях, воспалительных процессах, диабете, а также при ряде физиологических состояний организма, например при беременности (достигая 45 мм/ч на IX месяце беременности). Уменьшение СОЭ отмечается при полицитемии (заболевание, сопровождающееся значительным увеличением количества эритроцитов), при брюшном тифе, вирусном гепатите и т. д.

СОЭ исследуют с помощью аппарата Панченкова. Прибор состоит из штатива и стеклянных капилляров, градуированных от 0 до 100 мм (метка 0 находится в верхней части капилляра).

Капилляр заполняют разведенной в отношении 1:4 нитратной кровью и помещают в гнездо штатива (в строго вертикальном положении) на 1 ч, после чего измеряют в миллиметрах слой плазмы над осевшими клетками крови.

Для работы необходимы : прибор Панченкова, часовое стекло, скарификатор, 5% раствор цитрата натрия, спирт, вата, спиртовой раствор йода.

Ход работы . 1. Промыть капилляр Панченкова 5% раствором цитрата натрия. Набрать этого раствора до метки 50 (Р) и выдуть его на часовое стекло.

2. Дважды набрать в капилляр кровь до метки 0 (К), используя принцип капиллярности. Выдуть кровь на часовое стекло и смешать ее с раствором цитрата натрия.

3. Промыть капилляр раствором цитрата натрия, заполнить его полученной нитратной кровью точно до метки 0 (К) и поместить в штатив строго вертикально.

4. Через 1 ч определить, на сколько миллиметров осели эритроциты.

Задание 4. Определение времени свертывания крови

Метод подсчета в камере. Взятие и разведение крови производят пробирочным методом. В пробирку (лучше видалевскую) вносят 0,4 мл разводящей жидкости и 0,02 мл капиллярной крови. Полученное разведение практически считается равным 1: 20. В качестве разводящей жидкости обычно употребляют 3-5%-ный раствор уксусной кислоты, подкрашенной метиленовым синим (уксусная кислота лизирует эритроциты, метиленовый синий окрашивает ядра лейкоцитов). Перед заполнением камеры Горяева пробирку с разведенной кровью тщательно встряхивают. Камеру заполняют так же, как для подсчета эритроцитов.

Лейкоцитов гораздо меньше, чем эритроцитов (1-2 на большой квадрат), поэтому для точности подсчет производят в 100 больших квадратах (неразграфленных). Расчет: в 100 больших квадратах (1600 малых) сосчитано а лейкоцитов. Помня, что объем малого квадрата равен 1/4000 мм3, а кровь разведена в 20 раз, рассчитывают количество лейкоцитов в 1 мкл крови: 4000 ґ 20 и делят на 1600 = а х 1/2. Практически для получения действительного содержания лейкоцитов в 1 мкл крови достаточно полученное при подсчете число разделить пополам и приписать 2 нуля.
В среднем ошибка метода составляет ± 7%.

Более точным (ошибка 2-3%) и совершенным является подсчет лейкоцитов с помощью электронных аппаратов. Подсчет лейкоцитов в счетчиках частиц производят по тому же принципу, что и эритроцитов. Предварительно кровь разводят и смешивают с каким-либо лизирующим эритроциты реактивом. В автоанализаторе “Техникон” в качестве такового применяют раствор уксусной кислоты, в аппаратах “Культер” и “Целлоскоп” - сапонин или сапоглобин, которые добавляют разведенными (1: 500, 1: 700) в изотоническом растворе хлорида натрия (6 капель на 20 мл разведения).

Подсчет лейкоцитарной формулы крови производят в окрашенных мазках периферической крови. Считать лучше ближе к концу мазка в самом тонком месте, не менее 200 клеток (исключение составляют выраженные лейкопении), а затем выводят процентное соотношение отдельных видов лейкоцитов. Подсчет рекомендуется производить в одном порядке: половину клеток считать в верхней, половину - в нижней части мазка, не заходя на самый край и середину, по зигзагу (3-4 поля зрения вдоль мазка, 3-4 поля под прямым углом к середине мазка, затем 3-4 поля в сторону параллельно краю, вновь под прямым углом вверх и так далее в одну сторону).

Приготовление мазков.
Тщательно вымытым и обезжиренным предметным стеклом (его краем) прикасаются к капле крови на месте укола. Мазок делают шлифовальным стеклом, поставив его под углом в 45° к предметному стеклу впереди капли. Подведя стекло к этой капле, ждут, пока кровь расплывется вдоль его ребра, затем быстрым легким движением проводят шлифовальное стекло вперед, не отрывая от предметного раньше, чем иссякнет вся капля.

Правильно сделанный мазок имеет желтоватый цвет (тонкий), не достигает краев стекла и заканчивается в виде следа (усов).

Окрашивание сухих мазков производят после предварительной фиксации. Лучшая фиксация достигается в абсолютном метиленовом спирте (3-5 мин) или в смеси Никифорова из равных частей абсолютного этилового спирта и эфира (30 мин).

К основным гематологическим краскам относят метиленовый синий и его производное - азур I (метиленовый азуровый) и азур II (смесь равных частей азура I и метиленового синего), к кислым - водорастворимый желтый эозин.

● Окраска по Романовскому-Гимзе.
Краска Романовского-Гимзе (заводского приготовления) имеет следующий состав: азур II - 3 г, водорастворимый желтый эозин - 0,8 г, метиловый спирт - 250 мл и глицерин - 250 мл. Рабочий раствор краски приготавливают из расчета 1,5-2 капли готовой краски на 1 мл дистиллированной воды. Краску наливают на мазок возможно более высоким слоем; длительность окраски - 30-35 мин. По истечении этого срока мазки промывают водой и высушивают на воздухе. При этом способе удается хорошо дифференцировать ядро, но гораздо хуже - нейтрофильную зернистость цитоплазмы, поэтому его широко используют для окраски мазка периферической крови.

● Комбинированная окраска Мая-Грюнвальда-Романовского-Гимзе по Паппенгейму. На фиксированный мазок наливают пипеткой готовый краситель - фиксатор Мая-Грюнвальда, представляющий собой раствор эозинметиленового синего в метиленовом спирте, на 3 мин. Через 3 мин к покрывающей раствор краске добавляют равное количество дистиллированной воды и продолжают окрашивание еще 1 мин.
После этого краску смывают и мазок высушивают на воздухе. Затем высушенный мазок докрашивают свежеприготовленным водным раствором краски Романовского в течение 8-15 мин. Этот метод считается наилучшим, особенно для окраски мазков костно-мозговых пунктатов.

Увеличение числа лейкоцитов в периферической крови выше нормального уровня называют лейкоцитозом, уменьшение - лейкопенией. Лейкоцитоз (лейкопения) редко характеризуется пропорциональным увеличением (уменьшением) числа лейкоцитов всех видов, например лейкоцитоз при сгущении крови. В большинстве случаев имеется увеличение числа (уменьшение) какого-либо одного типа клеток. Увеличение или уменьшение числа отдельных видов лейкоцитов в крови может быть относительным или абсолютным в зависимости от общего содержания лейкоцитов - нормального, повышенного или пониженного. Изменение числа, соотношения отдельных форм и морфологии лейкоцитов зависит от вида и вирулентности возбудителя, характера, течения и распространенности патологического процесса, индивидуальной реакции организма.

Определенного фиксированного количества лейкоцитов, которое считалось бы нормой для всех людей, нет. Эта цифра меняется в зависимости от возраста человека: чем старше человек, тем меньше становится количество лейкоцитов в его крови. Нормальным количеством лейкоцитов считается 9-30х109/л. У эта цифра в три раза меньше - 4-9х109/л. Показатель количества данных частиц в крови может немного отклонятся от нормы в зависимости от функционального состояния организма и даже времени суток.

Очень важно следить в период беременности за уровнем содержания лейкоцитов в моче. Высокие показатели говорят о наличии в организме женщины, вынашивающей ребенка, воспалительных процессов, к примеру, пиелонефрита или цистита.

Не стоит забывать, что конечный результат анализа зависит от его правильного проведения. Поэтому врачи, прежде чем назначать какие-либо сильнодействующие препараты беременной женщине, проводят повторный анализ.

Для считывания количества лейкоцитов в крови, спермограмме или моче проводится следующая процедура. Определенную порцию жидкости размещают в аппарат – центрифугу. Полученный осадок наносят на стекло и рассматривают под микроскопом. Для подсчета количества лейкоцитов осадок окрашивают с помощью специального красителя. После чего подсчитывается видимое количество лейкоцитов в поле зрения.

Если анализ показал отклонение от нормального уровня содержания лейкоцитов, необходимо выяснить причину повышения количества частиц. Некоторые болезни диагностируются с помощью проверки уровня содержания лейкоцитов.

Камера Горяева – это приспособление для измерения числа клеток и частиц в определённом объёме жидкости (кровь, моча), состоящее из специального толстого предметного и покровного стёкла.

Предметное стекло имеет углубленную площадку посередине, на которую нанесена сетка из 225 больших квадратов. Из этих квадратов 25 равномерно разделены на 16 меньших квадратов. Благодаря такому объёму сетки подсчёт выполняется точнее, нежели в других ручных счётных устройствах.

Камера Горяева

Обслуживание камеры

После использования инструмента предметное стекло дезинфицируют путём погружения в 4% раствор формалина на час или в 70% раствор этилового спирта на полчаса. После этого камеру тщательно промывают дистиллированной водой. Излишек жидкости убирают мягкой салфеткой. Стоит обратить внимание на то, что камеру нельзя протирать ватным тампоном из-за цепляющихся к ней волокон. Хранится стекло в сухом месте.

Правило Егорова

Во время использования камеры в подсчитываются те ФЭ, которые располагаются внутри квадрата сетки и на верхней и левой линии его периметра. При этом частицы, касающиеся правой и нижней линии периметра во время расчёта данной клетки не включаются.

Определение лейкоцитов в крови

Методика подсчёта лейкоцитов

Подсчёт количества лейкоцитов начинается с разведения крови в 3-5% растворе этановой кислоты с метиловой синью в 20 раз. Рабочий материал перед применением протирают марлей насухо.

Покровное стекло нужно протереть до возникновения цветных колец Ньютона. Далее, камеру заполняют разведённой кровью, при этом первые две капли выпускают на фильтровальную бумагу. Жидкость попадает в камеру благодаря капиллярному свойству воды. Важно проследить, чтобы в желобки при заполнении ничего не затекало. Если это произошло, жидкость аккуратно убирают фильтровальной бумагой. Затем оставляют сетку в покое на минуту, ожидая, пока ФЭ остановят своё движение.

Подсчёт лейкоцитов осуществляется в пределах ста больших квадратов при малом увеличении, то есть при окуляре 10х и объективе 8х, по правилу Егорова. Полученная цифра используется в формуле.

Х = (n × 250 × 20) / 100 или Х = n × 50

Х – количество лейкоцитов.

n – число, полученное в результате подсчёта в камере.

Количество лейкоцитов определяют, принимая во внимание число больших квадратов сетки – 100 и разведение крови – 20.

Как происходит подсчет лейкоцитов

Норма лейкоцитов и отклонения

Норма лейкоцитов у людей составляет 4,0 – 9,0 × 10⁹/л. Или, по-другому, в 1 кубическом мм крови располагается примерно 6000 белых кровяных клеток.

На отклонения от нормы могут влиять внешние физиологические факторы:

приём пищи перед сдачей крови;
стресс;
беременность или менструация у женщин;
переохлаждение или перегрев;

Если количество белых кровяных клеток превышает 9,0 × 10⁹/л (повышены лейкоциты), такое состояние называется лейкоцитозом. Подобную картину можно увидеть при злокачественных заболеваниях крови, инфекциях, поражениях радиацией и отравлениях.

Лекарственные препараты тоже способны увеличить количество лейкоцитов. Некроз тканей, обильные кровотечения, в том числе в результате операций, почечная кома, болезни сердца – всё это может привести лейкоцитозу.

Падение количества лейкоцитов ниже 3,9 × 10⁹/л называется лейкопенией. Однако у некоторых людей фиксируется постоянное число лейкоцитов в количестве 3,5 × 10⁹/л. Принято считать, что у таких людей сохраняется резерв этих клеток в тканях в 50 раз больше, нежели в крови. Еще встречается функциональная лейкопения после введения анальгетиков, сульфаниламидов и других лекарственных препаратов, после долгой мышечной работы, в результате поражения инфекциями и вирусами (тиф, грипп, корь).

Лейкоцитарная формула

Все виды лейкоцитов составляют лейкоцитарную формулу. По ней можно выявить определённые патологии. Нормы формулы меняются в зависимости от возраста и периода жизни человека. Сдвиг хорошо заметен у женщин во время беременности или после родов.

Применяются разные способы подсчёта соотношения видов этих клеток, но все они связаны с тем, что более тяжелые клетки (базофилы, например) располагаются ближе к краю мазка, а лимфоциты, как легкие клетки, остаются в середине.

Метод Филипченко. В данном способе подсчёт осуществляется по поперечной прямой границы одного конца к другому. Мазок при этом мысленно разделяют на три части.
Метод Шиллинга. Лейкоциты подсчитывают в четырех участках мазка.

Полученные данные записываются в таблицу. Индивидуально количество каждого вида белых клеток крови высчитывается по формулам. Отмечаются те элементы, которые попали в поле зрения. Счёт ведётся до того, момента, пока сумма всех подсчитанных клеток не составит 100.

Методика подсчёта лейкоцитов в моче

В моче подсчитывается количество лейкоцитов в камере Горяева по Нечипоренко. Этот анализ нужен для мониторинга заболеваний почек. Периодическое исследование мочи помогает проследить за правильностью лечения и эффективностью назначенной терапии.

Сбор мочи

В изучение идёт только первая утренняя моча в середине мочеиспускания. Для пациента важно следовать основным правилам сбора этого биоматериала. Специальной дополнительной подготовки для исследования не требуется.

Методика расчета

10 мл свежесобранной мочи центрифугируют в течение трёх минут при 2,5 тыс. оборотов в минуту. Перед этим необходимо проследить, чтобы моча, во избежание частичного распада клеток, имела слабокислую реакцию.

При помощи пипетки с узким оттянутым концом убирают верхний слой. В пробирке оставляют от 0,5 мл мочи до 1 мл в зависимости от объёма осадка.

Осадок аккуратно перемешивают с надосадочной жидкостью. Полученным раствором заполняют счётную камеру Горяева по схожему принципу, что используется при подсчёте ФЭ крови. Камеру оставляют в покое от 3 до 5 минут.

Полученная цифра используется в формуле:

Х = (а/0,9) × (1000/V)

Х – число лейкоцитов в 1 мл мочи.

а – подсчитанное количество, делённое на объём камеры в 1 мкл осадка мочи.

v – Количество мочи, взятой для исследования.

1000 – количество осадка.

Это важно! Норма лейкоцитов: в 1 мл мочи не более 2 × 10³ белых кровяных клеток.

Еще:

Разновидности лейкоцитов в крови, в чем их важность для человека?

Лейкоциты или белые кровяные тельца представляют собой клетки иммунной системы, которые защищают человеческий организм от инфекций и вирусов. Именно они представляют собой главный барьер, который является препятствием для проникновения в организм тех или иных инфекций. В состав данных клеток входят особые ферменты, которым свойственно как бы переваривать различные микроскопические организмы. Помимо этого именно эти клетки помогают не только связывать, но еще и расщеплять инородные белковые компоненты, а также продукты распада, которые формируются в человеческом организме в результате их жизнедеятельности. Увеличение числа данных кровяных телец в крови в большинстве случаев является сигналом того, что в человеческом организме поселилась инфекция. Снижение уровня лейкоцитов в крови практически всегда отмечается при ослаблении иммунной защиты организма. Норма содержания лейкоцитов в крови, в случае если человек полностью здоров, количество белых кровяных телец в его крови должно равняться 4,0-9,0 х 109/л.

Метод подсчета количества лейкоцитов

Определение количества лейкоцитов в счетной камере: Подсчет лейкоцитов под микроскопом проводят после лизирования эритроцитов в 100 больших квадратах счетной сетки и пересчитывают на 1 л крови, исходя из объема квадратов и разведения крови. Подсчет лейкоцитов должен быть произведен в течение 2-4 ч после взятия крови.

Реактивы : 3-5% раствор уксусной кислоты, подкрашенный несколькими каплями раствора метиленового синего (для окраски ядер лейкоцитов). Раствор голубого цвета, длительно годен к употреблению.

Ход определения : В пробирку с 0,4 мл уксусной кислоты набирают из пальца 20 мкл крови (разведение 1:20). Можно использовать стабилизированную антикоагулянтом венозную кровь. Выдувают кровь из пипетки на дно пробирки, затем тщательно перемешивают, повторно набирая и выдувая. Заполненную камеру оставляют в горизонтальном положении на 1 мин (для оседания лейкоцитов). Лейкоциты подсчитывают в 100 больших квадратах с малым увеличением (окуляр 10х, объектив 8х). Для большей точности счет лейкоцитов проводят по всей сетке в больших квадратах, неразделенных на малые квадраты и полосы, начиная с левого верхнего угла сетки.

Расчет числа лейкоцитов проводят по формуле:

Х - число лейкоцитов в 1 мкл крови,

а - число лейкоцитов в 100 больших

квадратах,

20 - разведение крови,
100 - число подсчитанных квадратов,
250-объем одного большого квадрата 1/250.

Таким образом, количество лейкоцитов, подсчитанных в 100 больших квадратах, умножают на 50.

При наличии в периферической крови ядросодержащих клеток красного ряда, они не лизируются и подсчитываются вместе с лейкоцитами. В этом случае, чтобы определить истинное количество лейкоцитов, из общего числа посчитанных клеток вычитают количество клеток красного ряда.

Основные источники ошибок при подсчете лейкоцитов в камере:

1. Неправильное соотношение объемов крови и уксусной кислоты, взятые в пробирку.
2. Неправильно подготовленный раствор уксусной кислоты
3. Длительное нахождение пробы при температуре выше 28°С, что может ускорить лизис лейкоцитов в образце и привести к занижению результата.
4 Неправильное заполнение камеры Горяева. Как и при подсчете эритроцитов, камеру необходимо оставлять на 1 минуту для оседания клеток.
5 Недостаточно хорошо отмытая после предыдущего определения камера Горяева.

Оставшиеся в камере лейкоциты могут завышать результаты анализа.