Оборудования для биочипов молекулярной диагностики. Диагностические биочипы. Атака на туберкулез

Корреспондент телеканала «МИР 24» Ольга Климкина рассказывает о новейшей российской медицинской разработке. Речь идет о специальном биочипе, который позволит диагностировать рак за рекордно короткое время. Систему должен одобрить Росздрав, после этого тогда начнутся клинические испытания.

Российские ученые разработали специальный биочип, который позволит диагностировать рак за рекордно короткое время. Систему должен ободрить Росздрав, после этого тогда начнутся клинические испытания. Новый метод оценила корреспондент телеканала «МИР 24» Ольга Климкина.
Два года исследований, проб и ошибок. Результат — в лаборатории онкоцентра имени Блохина. Вот так выглядит биочип, и вот так выглядит транспортно-питательная среда. К ним подводят специальный сканер. Все вместе единый комплекс, который может помочь победить рак. Для Марины Савостиковой, одного из авторов разработки, это борьба не только профессиональная, но и личная. Сама дважды пережила страшное заболевание. Она знает: исход зависит от вовремя поставленного диагноза.

«Можем сказать: боже мой, у вас аденомокарценома. И у вас аденомокарценома легкого. Или, допустим, коллега, вам надо исключать колоректальный рак», — пояснила к.м.н., заведующая лабораторией ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина Марина Савостикова.

Над тем, чтобы с такой легкостью определять диагноз, трудились ученые в Москве в онкоцентре имени Блохина и Институте микробиологии и эпидемиологии и в Нижнем Новгороде в Медицинской академии. В итоге создали биочип — пластину с 15 ячейками. В каждой находятся разные антитела. Они реагирует на определенный вид рака в клетках. Плюс специальные красители, которые показывают реакцию.

«В данный момент у нас плевральная жидкость от женщины 1929 года рождения и от другой женщины с карценомой яичников. Мы будем проводить их исследование на биочипах», — указывает врач.
Для постановки диагноза требуется не кровь, а выпотная жидкость, которая скапливается в больном организме. Из нее берут образцы, перемешивают, помещают в центрифугу и отбирают осадок.

«Вартексируем, перемешиваем, чтобы клеточная взвесь, которую мы наносим на биочип, имела равномерное распределение во всех ячейках», — отметила научный сотрудник ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина Елена Фурминская.
После нагреть его до 37 градусов и на суд врача под флюоресцентный микроскоп. На экране красные и зеленые пятна. Для специалиста рак выглядит именно так.

Не так страшен рак, как его малюют

«Это комплекс рака серозного яичников. Вот единичные клетки, нам их надо было подтвердить, и мы их подтвердили», — указала Марина Савостикова.
Пока это не официальный диагноз, а только результат исследований. Разработчики ждут одобрения Росздравнадзора и планируют начать клинические испытания уже в апреле. После этого биочипы могут появиться в любой российской поликлинике.

Ежегодно в России от рака умирает более 300 тысяч человек. Получается, что каждый день в стране погибает почти тысяча больных. Если у пациента выявили первую стадию, с вероятностью в 93% он выживет, пишет Российский онкологический портал.

Открытие функционального значения тысяч генов и молекулярных механизмов действия множества ферментов стало революционным событием в биологии, оказавшим и продолжающим оказывать огромное влияние на развитие медицины XXI в. Перед учеными и медиками открылись уникальные возможности для выяснения причин многих инфекционных и наследственных заболеваний, а также разработки эффективных методов их лечения. В свою очередь, развитие новых диагностических методов потребовало и создания новых технологий многопараметрического анализа биологических образцов, с помощью которых можно одновременно исследовать множество белковых и ДНК-маркеров различных заболеваний, функционально-значимых биологических макромолекул и их комплексов. Так появилась технология биологических микрочипов, способных, подобно микрочипам электронным, извлекать и обрабатывать огромные массивы информации из одного небольшого образца биологического материала, полученного от конкретного пациента.

За последние десятилетия был накоплен огромный объем знаний о молекулярных основах биохимических процессов в живых организмах. Это дало возможности не только точно диагностировать то или иное заболевание, но и оценить вероятность его возникновения еще до проявления у пациента клинических симптомов, а также подобрать эффективную терапию. Подавляющую часть такой информации получают с помощью лабораторной диагностики, на которую в мире ежегодно расходуется свыше 100 млрд долларов. В России в 1970 г. она насчитывала 81 биохимический / молекулярный тест, в 2000 г. - 170, а сегодня число тестов измеряется тысячами!

Большинство важнейших современных методов молекулярной диагностики основано на анализе данных, полученных при исследовании структуры геномов человека и микроорганизмов. В первую очередь речь идет о полимеразной цепной реакции (ПЦР). Обычно ДНК содержится в образцах в минимальных количествах, однако с помощью ПЦР можно в миллионы раз «размножить» в исследуемой пробе биоматериала определенные фрагменты этих макромолекул. «Мишенями» могут служить бактериальные или вирусные гены, генетические маркеры раковых опухолей и т. п. С помощью этого метода можно определить наличие, к примеру, возбудителя болезни, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул его ДНК.

Однако возможности методов, базирующихся на ПЦР, ограничены в случае, когда речь идет об одновременном анализе десятков и сотен различных биомаркеров. И здесь на первый план выходит уже успешно зарекомендовавшая себя технология биологических микрочипов (биочипов). Достоинство этой технологии в том, что тест проводится в формате «один образец - один реакционный объем биочипа», т. е. образец не нужно разделять на несколько частей и их отдельно анализировать. Такой формат намного повышает чувствительность анализа и снижает его трудоемкость и стоимость, что дает возможность клинико-диагностическим лабораториям тестировать десятки и сотни образцов за одну рабочую смену.

Сегодня ведущие научные журналы регулярно публикуют обзоры, посвященные биологическим микрочипам, которые производят многие десятки компаний, а объем продаж составляет сотни миллионов долларов в год. Вместе с тем сама идея создания биочипов родилась лишь четверть века назад, и одним из мест рождения этой технологии стал Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук.

С самого начала подход российских исследователей отличался удачным выбором ключевых технологических решений, благодаря которым технологии биочипов ИМБ РАН продолжают оставаться конкурентоспособными в мировой науке. Многие из этих подходов (например, замена радиоактивных меток на флуоресцентные, применение гидрогеля и элементов сферической формы) стали использовать в своей работе другие исследователи, занимающиеся разработкой биочипов. А с 2000 г. в ИМБ РАН при поддержке Международного научно-технического центра начались работы по созданию биочипов для медицинской диагностики возбудителей социально значимых заболеваний.

Биочипы в деле

Главным элементом любого биочипа служит матрица из сотен и тысяч микроячеек, каждая из которых содержит так называемые молекулярные зонды - молекулы, способные специфично связываться только со строго определенными биологическими молекулами или их фрагментами. Зондами могут служить олигонуклеотиды, участки геномной ДНК, РНК, антитела, олигосахариды, различные низкомолекулярные соединения и др. Каждая ячейка биочипа служит своего рода отдельной «нанопробиркой», где иммобилизованный зонд распознает в анализируемом образце только свою мишень. Таким образом удается проводить параллельное распознавание сразу множества мишеней, например, генов, ответственных за лекарственную устойчивость возбудителя болезни.

Принципиальное отличие технологии матричных биочипов, разработанной в ИМБ РАН, в том, что зонды располагаются не на плоской подложке, а в заполимеризованных «каплях» гидрогеля полусферической формы. Размещение молекулярных зондов в трехмерном объеме, а не на плоскости, дает ряд существенных преимуществ. Оно позволяет в десятки и сотни раз увеличить емкость биочипа на единицу поверхности и, соответственно, чувствительность измерений. Кроме того, гель - насыщенное водой желеобразное вещество, исключает возможность взаимодействия зондов друг с другом и с твердой поверхностью подложки, а также обеспечивает отличную изоляцию отдельных ячеек на биочипе.

Для регистрации результатов анализа используют флуоресцентные метки, которые вводят в молекулы образца. Если зонд специфично распознает и свяжется с мишенью, в ячейке возникает флуоресценция . Интенсивность свечения ячеек биочипа измеряется с помощью специальных аппаратно-программных комплексов-анализаторов, которые и выдают отчет о присутствии в исследуемом образце специфичных молекулярных мишеней, информирующих о наличии микроорганизмов или генных мутаций, онкомаркеров или аллергенов и т. п.

Оригинальная технология создания таких гелевых чипов, разработанная в ИМБ РАН, была запатентована и сертифицирована по европейским стандартам. Биочипы, созданные по этой технологии, занимают отдельную нишу диагностических микроматриц и применяются в российских клиниках. Коммерческие микроматрицы, произведенные ведущими научно-производственными корпорациями Германии и США применяются, в основном, в исследовательских целях.

Россия - пионер «биочипостроения»

Большие матрицы с ДНК и белками, иммобилизованными на фильтре или зафиксированными в лунках планшета, были известны достаточно давно. Но идея о создании микрочипов современного формата появилась лишь в конце прошлого века. Первая работа по ДНК-микрочипам и одна из первых - по белковым чипам были опубликованы группой академика А. Д. Мирзабекова из московского Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта АН СССР (Khrapko et al. , 1989; Arenkov et al., 2000).

Эта революционная идея родилась как предложение для нового метода секвенирования ДНК с использованием гибридизации - процесса объединения двух комплементарных одноцепочечных молекул ДНК в двуцепочечную. Работы по совершенствованию методик секвенирования были стимулированы все более возраставшим интересом к проблеме расшифровки генома человека.

В то время в научной среде широко дискутировался вопрос, должна ли эта задача решаться масштабированием существующих подходов или нужно разрабатывать новые, более эффективные. Ученые сначала пошли по первому пути. Так, в 1977 г. появился «метод Сенгера», основанный на ферментативном синтезе комплементарной последовательности ДНК на матрице анализируемой одноцепочечной ДНК, а его разработчики получили в 1980 г. Нобелевскую премию. В своей нобелевской речи один из лауреатов, американский биохимик У. Гилберт, отметил, что «идея метода пришла только после второго визита А. Мирзабекова» в его лабораторию (Gilbert, 1984).

При секвенировании гибридизацией «расшифровка» ДНК идет не отдельными буквами-нуклеотидами, а «словами» определенной величины, и такой словарь может содержать тысячи слов. Стала очевидной необходимость создания микрочипов: в это время и вышла первая статья ученых из ИМБ, где были описаны приготовление и свойства гелевых микрочипов (Khrapko et al., 1989).

Технология производства гелевых биочипов прошла несколько этапов развития. Технология первого поколения, еще достаточно громоздкая и несовершенная, была разработана и запатентована в ИМБ в 1989–1993 гг., а впоследствии реализована в совместной лаборатории, организованной институтом и Аргоннской национальной лабораторией (США), и лицензирована американскими компаниями Motorola и Packard Instruments . Однако из-за технологических проблем фирмы стали производить биочипы, матрица которых представляла собой поверхность, сплошь покрытую полиакриламидным гелем.

В ИМБ РАН технология гелевых биочипов продолжала развиваться. Современная, достаточно простая, универсальная и дешевая технология позволяет производить даже в лабораторных условиях сотни и тысячи олигонуклеотидных, ДНКовых или белковых микрочипов в день (Колчинский и др., 2004).

Туберкулез и лекарственная устойчивость

Первой в мире тест-системой на основе биочипов, зарегистрированной для медицинского применения, стал разработанный в ИМБ в 2004 г. набор «ТБ-Биочип-1». С его помощью можно определить наличие в геноме микобактерии туберкулеза 47 мутаций, приводящих к устойчивости к двум основным противотуберкулезным препаратам - рифампицину и изониазиду .

Почему внимание исследователей привлек именно туберкулез? Дело в том, что многие десятилетия для борьбы с этой болезнью использовали комбинированное лечение сразу несколькими химиопрепаратами, чтобы повысить его эффективность. При монотерапии больные быстро приобретали устойчивость к лекарству. Однако такая стратегия привела к тому, что уже в конце прошлого века в мире, в том числе и в России, начал повсеместно распространяться туберкулез со множественной лекарственной устойчивостью . Именно этот фактор в наши дни чаще всего является причиной неудачного исхода лечения и возникновения рецидива болезни, от которой ежегодно в мире умирает более 3 млн человек.

Изониазид и рифампицин относятся к популярным и наиболее эффективным препаратам первого (основного) ряда. И если выделенный от пациента возбудитель окажется устойчивым к этим лекарствам, нужно обращаться к химиопрепаратам второго (резервного) ряда, к которым будет чувствительна эта бактериальная популяция. Сегодня одними из наиболее перспективных препаратов для лечения таких форм туберкулеза являются фторхинолоны . Поэтому следующей тест-системой в ряду диагностических тестов ИМБ стал «ТБ-Биочип-2», с помощью которого можно выявить лекарственную устойчивость к различным классам этих препаратов (Грядунов и др., 2009).

Все более широкое распространение форм туберкулеза со множественной лекарственной устойчивостью явилось стимулом для дальнейшей «эволюции» тест-системы. Требовалось, во-первых, максимально охватить весь спектр генетически детерминированной резистентности к широкому ряду противотуберкулезных препаратов. Во-вторых, возникла необходимость определять генотип и соответственно принадлежность выделенного штамма к основным семействам, циркулирующим на территории РФ, что важно не только для эпидемиологического мониторинга структуры популяции возбудителей туберкулеза, но и для назначения адекватной терапии.

Так в 2012–2013 гг. в результате масштабных геномных исследований был создан не имеющий мировых аналогов набор реагентов «ТБ-ТЕСТ», позволяющий одновременно идентифицировать 120 генетических локусов, отвечающих за развитие устойчивости к препаратам первой и второй «линии обороны»: рифампицину, изониазиду, этамбутолу, фторхинолонам и инъекционным препаратам (амикацину и капреомицину) (Zimenkov et al., 2016). Такая диагностика позволяет дифференцированно назначать высокие дозы химиопрепаратов или, напротив, удалять те или иные лекарства из схем терапии.

Чтобы получить государственную регистрацию в Росздравнадзоре, тест-система прошла все виды испытаний и экспертиз и с 2014 г. разрешена к применению в медицинской практике РФ. В настоящее время «ТБ-ТЕСТ» приходит на смену наборам «ТБ-Биочип».

От гепатита до рака и аллергий

Еще одной актуальной проблемой мирового здравоохранения является лечение больных гепатитом С. Возбудитель этого вирусного заболевания может долгое время размножаться в печени, ничем не выдавая себя, а первые признаки болезни обнаруживаются лишь спустя пару месяцев после заражения. Еще недавно гепатит С считался практически неизлечимой болезнью, а основным терапевтическим средством служила комбинация из интерферона и рибавирина , которая зачастую оказывалась неэффективной и имела много негативных побочных эффектов.

Сегодня созданы новые антивирусные препараты, обладающие так называемым прямым противовирусным действием и блокирующие ключевые внутриклеточные этапы размножения возбудителя. Но вся сложность в том, что вирус гепатита С имеет 7 вариантов генотипа, при этом каждый генотип имеет еще несколько подтипов. Более того, разные генотипы / подтипы обладают и разной чувствительностью к традиционным и новым препаратам, и выбор противовирусной терапии должен проводиться в соответствии с генотипическими особенностями возбудителя.

В ИМБ РАН совместно с лабораторией вирусологии госпиталя Университета г. Тулузы (Франция) был разработан и запатентован не имеющий мировых аналогов подход, основанный на использовании платформы гидрогелевых биочипов для типирования вируса гепатита С на основе анализа области NS5B вирусного генома. Тест-система «HCV-Биочип», способная определять 6 генотипов и 36 подтипов этого вируса, успешно прошла клинические испытания в России и Франции (Gryadunov et al., 2011).

Важнейшим направлением приложения технологии гидрогелевых биочипов служит анализ мутаций и полиморфизмов ДНК самого человека: ДНК-маркеров, ассоциированных с возникновением различных неинфекционных заболеваний.

Среди онкологических заболеваний у детей ведущее место занимают лейкозы. Тест-система «ЛК-Биочип» способна идентифицировать в образцах крови 13 наиболее клинически значимых хромосомных транслокаций (переносов фрагмента одной хромосомы на другую), характерных для некоторых типов острых и хронических лейкозов. Каждая из этих транслокаций определяет свой вариант развития лейкоза и важна для выбора стратегии лечения. Эта тест-система применяется в Национальном научно-практическом центре детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева (Москва), где анализируются образцы из 18 региональных гематологических центров РФ (Gryadunov et al. , 2011).

Для ранней диагностики рака молочной железы и яичников создана тест-система «РМЖ-Биочип», которая позволяет определять мутации в генах BRCA1/2, ассоциированные с высокой (до 80%) вероятностью возникновения наследственных форм этих заболеваний.

В настоящее время в ИМБ РАН разрабатываются варианты тест-систем на основе биочипов для определения чувствительности злокачественных клеток к противоопухолевой терапии. Например, с помощью биочипа для индивидуального подбора препаратов, эффективно воздействующих на молекулярные мишени в опухолевых клетках меланомы, можно выявить мутации генов, которые определяют целесообразность использования таких препаратов таргетной («молекулярно-прицельной») терапии поздних стадий и рецидивов меланомы, как траметиниб , иматиниб и вемурафениб (Emelyanova et al., 2017).

Трехмерная структура гидрогеля, в котором на биочипах зафиксированы молекулярные зонды, позволяет сохранить без изменений достаточно «чувствительную» нативную структуру белковых молекул. Поэтому такие биочипы можно использовать также для исследования белок-белковых взаимодействий, что требуется, к примеру, при проведении различных видов иммунохимического анализа.

В ИМБ РАН удалось перевести такой классический анализ в формат микрочипа и адаптировать его для диагностики аллергических заболеваний. Совместно с германской биотехнологической компанией Dr. Fooke Laboratorien GmbH , предоставившей наборы природных и рекомбинантных аллергенов, была разработана и запатентована тест-система «Аллерго-Биочип» для параллельного количественного определения больших панелей аллерген-специфичных антител Е и G4 в сыворотке крови (Feyzkhanova et al., 2017).

Важно, что для анализа антител на 30 и более аллергенов на биочипе требуется очень небольшой (всего 60 мкл) объем сыворотки крови - ровно столько, сколько требуется для анализа на один аллерген традиционным иммуноферментным методом! Такое отличие особенно значимо в педиатрии. Лабораторный вариант этой тест-системы уже проходит доклинические испытания в Детской городской клинической больнице № 13 им. Н. Ф. Филатова (Москва).

Двенадцать специализированных тест-систем, созданных на основе технологии гидрогелевых биочипов в ИМБ РАН, получили разрешение к применению как медицинские изделия для лабораторной диагностики. Эти тест-системы успешно используются более чем в 50 научно-исследовательских и медицинских центрах РФ, стран СНГ и ЕС.

Технологии биочипов, разработанные в ИМБ РАН, защищены 42 отечественными и международными патентами. И эти технологии продолжают интенсивно развиваться. Разрабатываются новые подходы, позволяющие упростить и ускорить методики, интегрировать в единую процедуру все стадии проведения анализа: от обработки биологического образца до количественной идентификации в режиме реального времени.

Ядро системы - гидрогелевый биочип - будет в дальнейшем модифицироваться в зависимости от назначения диагностического теста, в то время как остальные компоненты уже сейчас являются унифицированными. Такие «лаборатории на чипе» позволят значительно улучшить качество лабораторной диагностики, снизить вероятность заражения медперсонала и в конечном счете повысить эффективность и сократить стоимость лечения.

Литература
1. Грядунов Д. А., Зименков Д. В., Михайлович В. М. и др. Технология гидрогелевых биочипов и ее применение в медицинской лабораторной диагностике // Медицинский алфавит. 2009. № 3. С. 10–14.
2. Заседателев А. С. Биологические микрочипы для медицинской диагностики // Наука и технологии в промышленности. 2005. № 1. С. 18–19.
3. Колчинский А. М., Грядунов Д. А., Лысов Ю. П. и др. Микрочипы на основе трехмерных ячеек геля: история и перспективы // Молекулярная биология. 2004. Е. 38. № 1. С. 5–16.
4. Arenkov P., Kukhtin A., Gemmell A., et al. Protein microchips: use for immunoassay and enzymatic reactions // Analytical Biochemistry . 2000. V. 278. N. 2. P. 123–131.
5. Emelyanova M., Ghukasyan L., Abramov I. et al. Detection of BRAF, NRAS, KIT, GNAQ, GNA11 and MAP2K1/2 mutations in Russian melanoma patients using LNA PCR clamp and biochip analysis // Oncotarget . 2017. V. 32. N. 8. P. 52304–52320.
6. Feyzkhanova G., Voloshin S., Smoldovskaya O. et al. Development of a microarray-based method for allergen-specific IgE and IgG4 detection // Clinical proteomics . 2017. doi: 10.1186/s12014-016-9136-7.
7. Gryadunov D., Dementieva E., Mikhailovich V. et al. Gel-based microarrays in clinical diagnostics in Russia // Expert review of molecular diagnostics. 2011. N. 11. P. 839–853.
8. Khrapko K. R., Lysov Yu. P., Khorlyn A. A. An oligonucleotide hybridization approach to DNA sequencing // FEBS Letters . 1989. V. 256. N. 1-2. P. 118–122.
9. Zimenkov D. V., Kulagina E. V., Antonova O. V., et al. Simultaneous drug resistance detection and genotyping of Mycobacterium tuberculosis using a low-density hydrogel microarray // Journal of antimicrobial chemotherapy . 2016. V. 71. N. 6. P. 1520–1531.

Биочип для ранней диагностики рака

Ученые Национальной лаборатории Аргонн Исследовательского центра ядерной энергетики (г. Чикаго, штат Иллинойс) разработали биочип, позволяющий диагностировать определенные типы рака до появления его симптомов.

Компания Eprogen лицензировала эту технологию и использует для поиска новых биомаркеров рака. Опухоли, даже на самых ранних, бессимптомных стадиях, вырабатывают белки, попадающие в кровоток и запускающие иммунные реакции, в частности, синтез антител. Специалисты компании утверждают, что сравнение профилей аутоантител здоровых людей и онкологических пациентов является перспективным методом поиска ранних индикаторов заболеваний.

Используемый ими процесс, получивший название двумерное фракционирование белков, позволяет сортировать тысячи различных белков злокачественных клеток по различиям их электрического заряда и гидрофобности. С помощью этого метода исследователи получают 960 белковых фракций, которые помещают в биочип, содержащий 96-луночные пластинки. После этого биочип обрабатывают заранее известными аутоантителами, синтезируемыми иммунной системой онкологических пациентов.

Использование аутоантител больного для диагностики позволит врачам подбирать лечение согласно его индивидуальному профилю аутоантител. Уникальность нового метода заключается в том, что ученые используют реальные данные о заболевании человека для получения новой, более подробной диагностической информации, которую специалисты могут использовать для изучения и лечения рака.

По словам разработавшего технологию специалиста Национальной лаборатории Аргонн Дэниеля Шабакера (Daniel Schabacker), биочипы уже продемонстрировали большой потенциал в диагностической медицине. Кроме Eprogen, технологию лицензировали еще три компании. Одна из них, Akonni Biosystems, уже разработала на ее основе несколько десятков тестов, выпускаемых под торговой маркой TruArray. Еще одна компания, Safeguard Biosystems, лицензировала биочипы для создания ветеринарных диагностических наборов.

Например, при диагностике заболеваний верхних дыхательных путей содержащиеся в мазке из полости рта пациента антитела или ДНК связываются с нанесенными на биочип молекулами. После обработки лунки биочипа, в которых произошло такое связывание, начинают светиться. Специальная программа расшифровывает сканированное с помощью компьютера изображение, рассчитывает статистическую вероятность присутствия того или иного инфекционного агента и предоставляет информацию врачу.

Разработка диагностических средств, подобных TruArray, способна совершить революцию в диагностике, т.к. она позволяет одновременно проводить диагностику большого количества заболеваний. Одним из уникальных свойств метода является возможность одновременного тестирования на инфекции бактериальной и вирусной природы.

Проведение анализа с помощью биочипа занимает около 30 минут и обеспечивает конфиденциальность и высокую точность диагностики, т.к. врач, не выходя из кабинета, может практически на глазах пациента определить характер заболевания и стадию его развития.

У пациентов с сахарным диабетом мелкие плотные частицы Х-ЛПНП содержат гликозилированный Апо В

Charlton-Menys (University of Manchester, Великобритания) оценили степень гликозилирования различных субфракций липидов у 44 добровольцев с СД. Оказалось, что средний уровень гликозилированного Апо В составил 3,0 мг/дл, причем 84,6% гликозилированного Апо В были в составе Х-ЛПНП, а 67,8% - в составе наиболее атерогенной субфракции, а именно мелких плотных частиц Х-ЛПНП.

Уровень мелких плотных частиц Х-ЛПНП в наибольшей степени коррелирует с толщиной интима-медиа сонных артерий

Tetsuo Shoji (Osaka City University Graduate School of Medicine, Япония) с соавторами определи уровни липидов у 326 пациентов, обследованных по поводу индекса массы тела сонных артерий. Исследователи показали выраженную корреляцию уровня мелкого плотного Х-ЛПНП с толщиной интимы-медиа сонных артерий (коэффициент корреляции 0,441). Корреляция других липидов с толщиной интимы-медии оказалась следующей: аполипопротеин В (0,279), Х-ЛПНП 0,249), и триглицериды (0,175). У пациентов с высоким уровнем С-реактивного белка уровни мелких плотных Х-ЛПНП оказались ниже, чем у пациентов с низкими уровнями С-реактивного белка.

Atherosclerosis 2008; Advance online publication.

СПИД, туберкулез, лейкоз, гепатиты В и С, оспа, сибирская язва, чума, онкологические заболевания, холера, дифтерия, столбняк, стафилококковые инфекции – в борьбе с этими заболеваниями способен помочь универсальный инструмент диагностики – , созданный российскими учеными.

Каков диагноз, таково лечение. Эта истина очевидна даже дилетантам. Если бы медики имели возможность проводить индивидуальный анализ множества генов, внутриклеточных белков клетки и клеточных секреций каждого пациента, результаты оказались бы чрезвычайно информативными и эффективными. Однако такой многопараметрический анализ – задача сложная и очень дорогая. Поэтому для исследовательских групп и клиник так необходима доступная молекулярная диагностика, основанная на принципиально новом подходе, обеспечивающем быстрое и достоверное выяснение причин широкого круга заболеваний.

Этим запросам соответствует технология биологических микрочипов (биочипов), разработанная в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН (ИМБ) под руководством академика Андрея Мирзабекова (1937-2003).

Биочипы, подобно электронным микрочипам, обрабатывающим массивы цифровой информации, предназначены для молекулярного считывания и обработки больших объемов биологической информации при проведении многопараметрического анализа микрообразца биологического материала.

Основой биочипов является матрица из множества полусферических гидрогелевых ячеек (диаметром около 100 микрон), каждая из которых содержит молекулярные зонды, специфичные к одной из множества биологических молекул или их фрагментов (например, к последовательностям ДНК или РНК, белкам). На одном квадратном сантиметре может быть размещено до тысячи ячеек биочипа, предназначенных для разных целей: для выявления мутаций, связанных с предрасположенностью к различным наследственным и онкологическим заболеваниям; для обнаружения бактерий и вирусов; идентификации мутаций микроорганизмов, ведущих к появлению лекарственно-устойчивых форм инфекционных заболеваний.

Для проведения анализа образец крови пациента или другой исследуемой жидкости проходит предварительную обработку, в ходе которой находящиеся в нем молекулы метятся флуоресцирующим красителем (светящимся при облучении светом определенной длины волны). Затем образец наносится на биочип, помещенный в специальную микрокамеру. Каждый тип молекул образца взаимодействует со специфичными к ним зондами, локализованными в индивидуальных ячейках микрочипа, что может быть зарегистрировано по интенсивности свечения соответствующей ячейки биочипа. По картине свечения множества ячеек биочипа специальный прибор-анализатор определяет количественно наличие характеристических последовательностей ДНК, РНК или набора белков в исследуемом образце. В ИМБ были разработаны анализаторы для научных исследований, способные анализировать биочипы содержащие тысячи ячеек, и портативные клинические анализаторы для рутинных медицинских применений, позволяющие анализировать биочипы с одной-двумя сотнями ячеек.

На сегодняшний день в ИМБ созданы диагностические варианты биочипов, позволяющие выявлять вирусы многих опасных болезней. При диагностике туберкулеза с одновременным выявлением его лекарственно-устойчивых форм, время анализа сокращается с 2-х месяцев до 1 дня. Это позволяет оперативно назначать резервные терапевтические средства тем больным, у которых обнаруживаются формы туберкулеза, устойчивые к обычно применяемым лекарствам (более 10% случаев). Как показали результаты анализа более 3000 пациентов, надежность метода превышает 90%. Впервые в мире метод быстрой идентификации лекарственно-устойчивых форм туберкулеза, основанный на оригинальной отечественной технологии биочипов, был сертифицирован для медицинского применения (МЗиСР РФ). Эта методика уже используется в 8-ми региональных медицинских центрах России, а также в нескольких научно-исследовательских Институтах, занимающихся проблемами идентификации возбудителей инфекционных заболеваний.

Созданы варианты биочипов, обнаруживающих и типирующих продукты хромосомных перестроек, приводящих к лейкозу, идентифицирущих вирусы СПИДа, гепатитов В и С. Разрабатываются биочипы для обнаружения стафилококкового, холерного, дифтерийного, столбнячного и сибиреязвенного токсинов, а также возбудителей сибирской язвы и чумы, которые могут быть использованы при биотерроризме. Созданы биочипы для определения видовой принадлежности вирусов оспы и их дискриминации от возбудителей других заболеваний, сходных по первоначальным клиническим проявлениям (герпес, ветряная оспа). Разработаны биочипы для выявления предрасположенности пациентов к некоторым онкологическим заболеваниям, определения индивидуальной чувствительности к лекарственным препаратам, используемым в противоопухолевой терапии.

Новый универсальный инструмент диагностики уже востребован в медицинских учреждениях страны. Основной потребитель на сегодняшний день - Министерство здравоохранения России. Оно выступает заказчиком биочипов, предназначенных для быстрой диагностики различных форм туберкулеза. Неудивительно, что врачи в первую очередь обратили внимание на технологию, позволяющую более эффективно бороться с этим опасным заболеванием. В настоящее время наличие туберкулеза обнаруживается с помощью рентгеновского обследования, после чего больного начинают лечить лекарствами «первого ряда» - стандартным набором, применяемым, как правило, для всех больных туберкулезом. Параллельно проводят бактериологический анализ устойчивости возбудителя туберкулеза у данного больного к применяемым лекарствам. Этот анализ занимает около 3-х месяцев, после чего выясняется, что примерно у 10-ти процентов больных – лекарственно устойчивая форма туберкулеза, с необходимостью перехода на лечение препаратами «резервного ряда». Последствия – ослабленное ошибочной терапией здоровье больного, бессмысленный расход средств на лекарства и на содержание больного в больнице, распространение лекарственно устойчивых форм туберкулеза вследствие контакта пациентов с разными формами этого заболевания. Очевидно, что самая главная проблема в излечении туберкулеза сегодня – как можно скорее определить, какая именно форма болезни развивается у больного. Технология биологических микрочипов позволяет сделать этот анализ за один день.

Продвижением новой технологии на рынок медицинских услуг занимается принадлежащая Институту молекулярной биологии компания "БИОЧИП-ИМБ", которая заключила контракт с Министерством здравоохранения РФ на поставку биочипов в сеть туберкулезных клиник страны. Согласно пилотному проекту, компания "БИОЧИП-ИМБ" уже внедрила технологию в восьми медицинских центрах страны, расположенных в Москве, Екатеринбурге, Новосибирске, Казани, Петербурге и Саратове.

Как видим, поле использования биологических микрочипов огромно, и создатели уникального диагностического инструмента постоянно расширяют сферы его применения. Коллектив Лаборатории Института создает биочипы для типирования вируса гриппа, идентификации и опознания личности, а также для исследования специфичности ДНК-белковых взаимодействий.

(По материалам беседы с зав. лаб. биологических микрочипов проф. А.Заседателевым и д.б.н. В.Е.Барским).

Елена Укусова, Центр "Открытая экономика"

Технология белковых биочипов, заменяющих целые иммунроргические лаборатории, дает возможность в тысячи раз увеличить производительность большинства диагностических методов – за короткое время определять несколько тысяч аллергенов, онкогенов, различных биологически активных веществ, и даже генетических дефектов – и резко снизить себестоимость анализов.

Прообразом современных «живых чипов» послужил саузернблот, изготовленный в 1975 г. Э. Саузерном. Он использовал меченую нуклеиновую кислоту для определения специфичес­кой последовательности среди фрагментов ДНК, зафиксирован­ных на твердой подложке. В России ученые начали активно раз­рабатывать тему биочипов только в конце 1980-х гг. в институте молекулярной биологии под руководством А. Д. Мирзабекова.

Биочип представляет собой матрицу - пластинку со сторо­ной 5-10 мм, на которую можно нанести до нескольких тысяч различных микротестов; ее еще называют платформой. Чаще всего используют стеклянные или пластиковые платформы, на которые наносятся биологические макромолекулы (ДНК, бел­ки, ферменты), способные избирательно связывать вещества в анализируемом растворе.

В зависимости от того, какие макромолекулы используют­ся, выделяют различные виды биочипов, ориентированные на разные цели. Основная доля производимых в настоящее время биочипов приходится на ДНК-чипы (94%), т. е. матрицы, несу­щие молекулы ДНК. Оставшиеся 6% - белковые чипы.

Биологические микрочипы во многом схожи с электронными: и те, и другие собирают и обрабатывают огромное количе­ство информации на малой поверхности. И те, и другие состоят из огромного количества идентичных миниатюрных элементов, размещенных рядом друг с другом, хотя ячейки биочипа по по­лупроводниковым меркам просто огромны. При этом действие электронного чипа основано на ответе «да-нет», а биологичес­кий чип позволяет выбрать из миллионов или миллиардов воз­можностей единственно верную. Компьютерный чип произво­дит миллионы математических операций в секунду, но и на био­чипе за пару секунд проходят тысячи биохимических реакций.

Разработанный в России биочип-это стеклянная пластинка, на которую нанесены десятки едва видимых глазом полу­сферических гидрогелевых ячеек диаметром менее 100 микрон каждая, и содержащих известные вещества-маркеры. При вза­имодействии биочипа с исследуемым образцом, предваритель­но обработанным светящимся (флуоресцентным) красителем, в соответствующих ячейках происходит химическая реакция, и тогда эти ячейки начинают светиться-тем сильнее, чем ин­тенсивнее процесс.

Принцип действия биологических чипов основан на способ­ности комплементарных оснований образовывать химические связи: в ходе реакции происходит взаимодействие комплементарных цепей ДНК, одна из них (ДНК-проба) с известной пос­ледовательностью нуклеотидов зафиксирована на подложке (пластине), а другая одноцепочечная ДНК-мишень (зонд), меченная флуоресцентной меткой, вносится в ДНК-чип.

По сути, именно в выявления и сопоставлении наиболее ярко светящихся ячеек и заключается работа прибора-анализатора биочипов. Так определяются различные характеристики образца, например, присутствие в организме тех или иных возбудителей инфекций или наличие в геноме каких-либо из­мененных генов.

Особенность российских биочипов в том, что их ячейки за­полнены гелем трехмерной структуры. Такие гели удержива­ют большее количество пробы, нежели двумерные, и потому чувствительность отечественных биочипов выше, а, следова­тельно, ниже требования к регистрирующей аппаратуре. Не­маловажно и то, что реакции в объемном геле протекают так же, как и в жидкостях, а значит, как и в живом организме. Это позволяет получить результат, максимально приближенный к реальности.

На Западе исследователи пошли по другому пути и разрабо­тали для создания ДНК-чипов процесс фотолитографии, ана­логичный процессу производства кремниевых процессоров. Например, «Affimetrix» (США) создал GeneChip-технологию, основанную на высокоплотных чипах, содержащих ДНК-последовательности, и предназначенную для анализа генетической информации человека. Такие чипы обладают гораздо большей емкостью, стоят значительно дороже, что пока позволяет ис­пользовать их исключительно в крупных исследовательских центрах или в коммерческих клиниках.

Еще одним методом конструирования биочипов является использование «технологии струйного принтера» для нанесе­ния необходимого нуклеотида в строго определенное место мат­рицы. Он менее дорог, во при этом не позволяет достичь высо­кой скорости синтеза.

Сейчас число размещаемых на российском биочипе ячеек достигает уже нескольких тысяч, однако чаще используются биочипы с гораздо меньшим числом ячеек. Тем не менее про­стой чип может выявить все известные на сегодняшний день формы возбудителя туберкулеза, а также определить, каким именно антибиотиком нужно лечить конкретную форму не за несколько недель, как традиционным способом, а всего в тече­ние нескольких суток.

При помощи белковых чипов с молекулами, «чувствитель­ными» к различным низкомолекулярным соединениям, уже в самое ближайшее время можно будет определить наличие ши­рокого спектра лекарственных веществ, гормонов, наркотиков, ядов, пестицидов практически в любом анализируемом мате­риале.

Контрольные вопросы и задания

1. Что такое реакции иммунитета?

2. В чем заключается сущность реакции агглютинации?

3. Какие варианты реакции преципитации существуют?

4. Охарактеризуйте реакцию связывания комплемента.

5. Что такое метод флюоресцирующих антител?

6. В чем сущность иммуноферментного метода?

7. Опишите особенности радиоиммунологического анализа.

8. Что такое реакции иммунитета?

9. В чем заключается сущность реакции агглютинации?

10. Дайте определение радиоиммунологического анализа?