2 типа определение днк типирование. Какие типы ВПЧ существуют: особенности, симптомы и диагностика. Какие технологии применяются

Сегодня изучено более ста разновидностей вируса ВПЧ, половина из них вызывает развитие образований на кожных покровах и слизистых оболочках интимных органов человека. Статистика говорит о том, что 80% населения Земли инфицировано. Это значит, что в клетках организма содержится ВПЧ разной степени онкогенности.

Наличие папилломавируса у пациента может привести к развитию серьезных осложнений, сложно предугадать, как поведет себя тот или иной тип возбудителя. Вот почему так важно знать особенности каждого генотипа, дабы эффективно вести борьбу с этой инфекцией.

Многие типы вируса папилломы человека являются совершенно безопасными для их носителя, возникают незначительные папилломы и бородавки, которые успешно устраняются косметологическими методами.

Другие типы папиллом относятся к онкогенной группе, провоцируют активное видоизменение клеток, что ведет к диагностированию рака у носителя. Разделение ВПЧ по типам позволяет разработать максимально правильную тактику лечения, на основе анализов на выявление микроорганизмов.

Человек может быть носителем нескольких ДНК ВПЧ, вирусы могут стабилизироваться, прекратить свое размножение или наоборот – процесс развития онкогенных клеток будет прогрессировать, а это значит, что остановить их негативное влияние на организм будет сложно.

Онкогенная группа

Генотипирование ВПЧ – важная процедура в диагностике выявления заболевания, это дополнительная возможность прогнозировать протекание нарушения. Всего в практической медицине подразделение папилломавируса происходит по трем группам.

Безопасные вирусы, не вызывают развитие рака, а значит, паниковать не стоит, главное, в дальнейшем не стать носителем других инфекций, регулярно сдавать анализы на обнаружение инфекции и не запускать состояние иммунной системы.
Низкая степень вероятности развития раковых клеток при выявлении папилломавируса 6,11,42- 44. В редких случаях может произойти мутации клеток, видоизменяясь в онкогенные.
Самая опасная группа, у женщин повышается риск развития ракового процесса, у мужчин – причина рака мочевого пузыря. Это ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 59, 68.

Повышенное внимание к состоянию своего здоровья должны уделять пациенты с папилломавирусами 66 и 56, чаще всего такое носительство инфекции протекает бессимптомно, а потому выявить заболевание проблематично. Для каждого типа вируса важно проследить за признаками ВПЧ, провести специальное обследование и при необходимости начать квалифицированное лечение.

Особенности каждого типа вируса

Классификация вирусов помогает определить степень сложности заболевания, которое может спровоцировать такая инфекция. Обычные бородавки вызываются вирусом 2 типа, передается бытовым путем, при контакте с носителем, чаще всего страдают дети и подростки.

Защитные силы организма позволяют справиться иммунной системе с инфекцией, образования исчезают бесследно, главное не травмировать кожу в месте развития папиллом, дабы не вызвать вторичное заражение.

При инфицировании ВПЧ 3 и 5 появляются небольшие наросты на лице и ладонях. Такие высыпания еще называют юношескими, а значит, организм может самостоятельно справиться с этой инфекцией без медикаментозного вмешательства.

При обнаружении подошвенных бородавок можно уверенно говорить про наличие в организме папилломавируса 1 и 2 типов. Чаще всего страдают женщины, из-за ношения узкой обуви на высоком каблуке. Кожа на бородавке со временем утолщается, наросты размножаются по телу.

Образования ВПЧ 1 типа прорастают внутрь, доставляют дискомфорт при ходьбе, ноют и болят, особенно ночное время. Папилломавирус второго генотипа проявляется мозаичными наростами, которые не вызывают болевых ощущений, только эстетический дискомфорт.

Остроконечные кондиломы у женщин располагаются на слизистых оболочках половых органах и гениталиях, а у мужчин – на головке пениса и крайней плоти. Это опасные вирусы 6 и 11 типа.

Если обнаружен папилломавирус с малым онкогенным риском, это значит, что речь идет о присоединении инфекции 20, 21, 14, 25, 27 типа. Чаще всего это доброкачественные образования, не имеющие рецидивного характера.

Во время родовой деятельности матери ребенок может заразиться ларингеальным папилломатозом, ВПЧ типа 11. Такая форма заболевания наблюдается у детей до пяти лет, при обильном обнаружении образований может возникнуть риск удушья.

Определение опасности 16 и 18 типа ВПЧ

С помощью анализа гемотест можно сделать наиболее точный прогноз протекания болезни, значит выявить сразу несколько генотипов вируса, поставить правильный диагноз и начать своевременное лечение.

Если обнаружено сочетание 16 и 18 типов, то это будет свидетельствовать о наличии высокой степени онкогенности - потребуется кольпоскопическое обследование.

Благодаря гемотесту ВПЧ можно исключить возможность рецидива с летальным исходом.

При диагностировании женщин с раком шейки матки можно точно сказать, что причиной мутации является вирус 16 типа. Под воздействие благоприятных факторов (ослаблению иммунной системы, наличия других инфекций половых органов) папилломавирус начинает свое губительное воздействие на клетки, меняя их ДНК.

Это значит, что вирус генотипа 16 влияет на развитие предракового состояния, вызывает дисплазию шейки матки, обильно формируются папилломы и кондиломы по всему телу пациентки. У мужчин эти опасные штаммы вируса способны вызывать болезнь Боуэна, повреждение слизистой оболочки полового органа.

Благодаря высокоразрешающему анализу на ДНК ВПЧ (27 типов) можно выявить опасные патологические видоизменения в организме, вызваны наличием различных типов вируса папилломы.

При дисплазии шейки матки помимо 16 и 18 вируса еще встречаются 32, 30, 57, 61 и другие онкогенные типы. Если во время обследования анализы подтвердили наличие только одного типа ВПЧ высокого риска, а наростов при этом нет, это значит, что можно говорить о самоудалении инфекции из организма.

Другие типы накожных наростов

ВПЧ 49 штамма проявляется разрастаниями одиночных плоских образований, которые можно легко удалить с помощью лазерного аппарата. Этот генотип не является онкогенным, вторично не возникает.

Обнаружение вируса 57 штамма у женщины свидетельствует о предраковом состоянии пациентки, если имеются наросты на лице, то они удаляются с помощью импульсного потока, после чего не остается следов и рубцовой ткани.

Наросты ВПЧ 27 типа у мужчин и женщин можно убрать жидким азотом, появление вторичной инфекции исключено. Штаммы с номерами 51, 52, 56 являются онкогенными, а это значит, что дальнейшие изменения в структуре ДНК может стать причиной появления рака.

У мужчин развитие онкологии полового органа и анального отверстия. Только своевременная медикаментозная терапия может замедлить эти процессы и оставить губительное деление клеток ДНК.

ВПЧ 37 типа выступает одной из причин развития кератоакантомы, что свидетельствует о возникновении доброкачественной опухоли на коже, места локализации – лицо, открытые участки тела, в исключительных случаях – закрытые зоны.

Анализы на выявление ВПЧ 38 типа могут свидетельствовать о развитии меланомы, это злокачественные наросты, которые отличаются агрессивностью и стремительным фактором развития, а это значит, что игнорировать симптоматику нельзя, так как заболевание может оказать негативное влияние на все органы и системы человека.

Анализ на ВПЧ разновидности

Существует несколько лабораторных методик, которые с точностью смогут определить, сколько штаммов вируса присутствуют в организме мужчины и женщины. Для этого применяются такие виды диагностики как полимерная цепная реакция, анализ генотипирования. ПЦР проводится для определения типа вируса, а результаты этого исследования имеют вид таблицы со списком видов ВПЧ, пометками обнаруженных из них и указанием вирусной нагрузки.

Материал для анализа у женщин – мазок из цервикального канала. При беременности анализ на папиллому проводить необязательно, потому что нет угрозы для матери и плода. Мужчинам при подозрительных образованиях нужно обратиться к урологу. Только такое особое внимание к своему здоровью поможет избежать серьезных последствий для женщин после инфицирования организма.

Когда нужно делать диагностику ВПЧ женщинам?

Не стоит допускать ярко выраженные симптомы заболевания, важно регулярно проходить профилактический осмотр у гинеколога один-два раза в год, обязательно сдавать анализы на выявление инфекции после первого года половой жизни.

Заключение

Все классификации выявления ВПЧ в организме претерпевают изменения, ведь вирусы мутируют, вызывают осложнения, не поддаются лечению, повторно возникают после удаления, усложняется процесс диагностирования и расшифровки анализов.

Специфика подобных новообразований еще до сих пор точно не изучена, сколько еще времени потребуется, чтобы снизить риск опасности после заражения онкогенными штаммами и полностью удалить вирус из организма неизвестно.

Для пациентов с любым типом ВПЧ требуется индивидуальный терапевтический подход, чтобы успешно приостановить распространение вируса в организме нужно регулярно обследоваться у профильных специалистов, соблюдать указанные рекомендации, вести здоровый образ жизни.

Главная опасность ВПЧ для женщин и мужчин – это образование злокачественной опухоли, потому такая классификация вируса производится с учетом степени его онкологической опасности.

Берегите себя и будьте здоровы!

Результаты, полученные при исследовании структуры и организации геномной ДНК животных, растений и микроорганизмов, наложили глубокий отпечаток на методологию их систематизации. Проблема адекватного отнесения конкретного организма к той или иной группе не является чисто академической. Основанная на точных критериях систематика живых организмов, определяющая эволюционное родство между ними, помимо чисто теоретического представляет и большой практический интерес. В частности, знание источника различных штаммов патогенных микроорганизмов, вызывающих больничные инфекции, позволило бы выработать эффективные меры защиты против их распространения.

Недавно были обнаружены генетические маркеры в виде специфических последовательностей ДНК, которые дают возможность выявлять родственные отношения между особями одного и того же вида путем внутри- и межпопуляционных исследований. Такого рода исследования популяций человека особенно важны с практической точки зрения. В настоящее время молекулярно-генетические методы позволяют осуществлять идентификацию личности в судебно-медицинских исследованиях, а также решать в спорных случаях проблему определения отцовства.

Генетическим, или ДНК-типированием, называют определение особенностей генотипа организма путем анализа ДНК его генома. Иными словами, в процессе ДНК-типирования определяют особенности первичной структуры ДНК исследуемого организма в конкретных генетических локусах. Абсолютно консервативных генетических локусов, по-видимому, не существует. Мутационные изменения генома непрерывно накапливаются на протяжении филогенетического (исторического, эволюционного) развития вида. Но такого же рода изменения неуклонно происходят в геномах отдельных особей, принадлежащих одной или разным популяциям. Естественно, что проще всего обнаруживаются межвидовые различия в последовательностях нуклеотидов исследуемых участков генома, поскольку эти различия, как правило, значительны, и именно они определяют эволюционное расстояние между видами (их дивергированность ).

Таким образом, у каждого вида организмов имеется большое число внутривидовых различий в первичной структуре ДНК отдельных генетических локусов. Генетические локусы, выполняющие одну и ту же функцию (содержащие один и тот же ген или несколько генов), но различающиеся по первичной структуре ДНК, называют полиморфными , а само явление существования в популяции полиморфных локусов получило название генетического полиморфизма .

Днк-типирование микроорганизмов

Наиболее часто в настоящее время используют два способа ДНК-типирования патогенных микроорганизмов, в основе которых лежит метод ПЦР. В первом случае используют один или несколько коротких праймеров произвольной первичной структуры длиной в 6–15 нуклеотидов, которые из-за своих малых размеров обладают низкой специфичностью в отношении конкретных генетических локусов и способны гибридизоваться со многими сайтами геномной ДНК. Во втором случае применяют специфические олигонуклеотидные праймеры длиной в 20–27 нуклеотидов, последовательности которых фланкируют исследуемую последовательность нуклеотидов в бактериальном геноме.

Рис. II.35. Схема ДНК-типирования микроорганизмов с использованием ПЦР и праймеров произвольной структуры

а – штаммоспецифические различия, обусловленные разной локализацией участков ДНК, взаимодействующих с праймерами. В ДНК штаммов 2 и 3 отсутствует участок, который имеется в ДНК штамма 1, что приводит к исчезновению соответствующей полосы продукта ПЦР на электрофореграмме;б – результаты амплификации ДНК, содержащей сайты связывания праймеров постоянной локализации. ДНК штаммов 2 и 3 содержат делеции разной длины между сайтами связывания праймеров. Альтернативно, ДНК штаммов 1 и 2 могут содержать вставки, отсутствующие у ДНК штамма 3. Это находит отражение в длинах продуктов ПЦР, разделяемых электрофорезом. А, Б – сайты связывания праймеров на ДНК

Генетическое типирование микроорганизмов с использованием праймеров произвольной первичной структуры. Использование коротких олигонуклеотидных праймеров произвольной структуры основано на том, что в больших геномах для них имеются множественные сайты посадки, а следовательно, и инициации ПЦР. Чем короче такие праймеры, тем большее количество сайтов посадки для них должно существовать. Одним из ограничений дальнейшего участия таких праймеров в ПЦР будет расстояние между двумя сайтами посадки для противоположно направленных праймеров. Чем длиннее ПЦР-продукт, который должен образовываться в результате функционирования таких праймеров, тем менее надежно работает вся система типирования. На практике длина образующихся с произвольными праймерами продуктов ПЦР находится в пределах 0,2–2,0 т.п.о.

В зависимости от локализации на ДНК мест посадки для пары коротких праймеров могут образовываться два типа продуктов ПЦР. В первом случае различия в длинах продуктов ПЦР обусловлены присутствием на ДНК типируемых микроорганизмов разного числа сайтов связывания для одного или обоих праймеров (рис. II.35,а ). Во втором случае такие различия определяются длинами сегментов ДНК (ампликонов ), заключенных между парами мест посадки праймеров при неизменном их числе в конкретных генетических локусах (см. рис. II.35,б ). На практике могут одновременно реализовываться обе эти возможности. Во время генетического типирования эукариот указанными методами иногда сразу функционируют до 100 ампликонов, тогда как у бактерий это число достигает лишь 20.

Несмотря на то что при обсуждаемом подходе последовательности праймеров выбираются произвольно, получаемая картина амплификации, как правило, является видо- и штаммоспецифичной. При этом количество сайтов связывания на одной и той же ДНК для праймеров одинаковой длины, но с разной первичной структурой может существенно варьировать. На рис. II.35 показаны такие свойства двадцати 10-нуклеотидных праймеров, испытанных на ДНК человека, бобов и S. aureus. Видно, что использование праймера AGGGGTCTTG, например, приводит к амплификации 8 ампликонов в ДНК человека, 3 ампликонов в ДНК соевых бобов и не выявляет ни одного ампликона в ДНК S. aureus, тогда как при использовании праймера AATCGGGCTG удается обнаруживать до 40 ампликонов в ДНК человека и соевых бобов и до 20 ампликонов в бактериальной ДНК. Таким образом, при использовании обсуждаемого метода в ДНК-типировании самым важным этапом является подбор праймеров или их комбинаций для наиболее эффективного определения принадлежности организма к тому или иному виду, штамму или линии.

Генетическое типирование микроорганизмов с использованием геномных фингерпринтов. При другом подходе к генетическому типированию с использованием ПЦР исследуют полиморфизм конкретных локусов, для которых хотя бы частично известна первичная структура. Синтезируют специфические олигонуклеотидные праймеры, сайты связывания которых фланкируют исследуемую последовательность ДНК с длиной 1,5–2,5 т.п.о. После проведения ПЦР особенности первичной структуры продуктов ПЦР определяют с помощью рестрикционного анализа. Положение сайтов рестрикции в анализируемой последовательности нуклеотидов может иметь видо- или штаммоспецифический характер и служить точным генетическим маркером того или иного микроорганизма.

С помощью этого метода, который по своей сути является разновидностью рассмотренного выше способа определения ПДРФ, идентифицируют близкородственные, сходные по фенотипу штаммы возбудителей заболеваний, исследуют генетическую структуру популяций микроорганизмов и механизмы их адаптивной изменчивости.

Рис. II.35. Схема ДНК-типирования микроорганизмов с использованием ПЦР и праймеров произвольной структуры

а – штаммоспецифические различия, обусловленные разной локализацией участков ДНК, взаимодействующих с праймерами. В ДНК штаммов 2 и 3 отсутствует участок, который имеется в ДНК штамма 1, что приводит к исчезновению соответствующей полосы продукта ПЦР на электрофореграмме; б – результаты амплификации ДНК, содержащей сайты связывания праймеров постоянной локализации. ДНК штаммов 2 и 3 содержат делеции разной длины между сайтами связывания праймеров. Альтернативно, ДНК штаммов 1 и 2 могут содержать вставки, отсутствующие у ДНК штамма 3. Это находит отражение в длинах продуктов ПЦР, разделяемых электрофорезом. А, Б – сайты связывания праймеров на ДНК

11.2.2. Идентификация личности на основе минисателлитной ДНК: определение отцовства

Определение отцовства представляет собой серьезную социальную, юридическую и медицинскую проблему. Решение этой задачи часто требуется в судах, при разрешении частных споров, для пренатальной (внутриутробной) диагностики, генетических консультаций и при пересадках органов. Например, только в США в 1990 г. было проведено более 120000 тестов на определение отцовства, и это число быстро возрастает. Мировой рынок таких диагностических тест-систем оценивался в 1994 г. более чем в 1 млрд долларов и сейчас является крупнейшим рынком среди молекулярно-генетических диагностикумов.

С использованием диагностических тест-систем на основе минисателлитных ДНК определение отцовства получило прочную научную основу. С этой целью в настоящее время используют два подхода. При одном из них применяют олигонуклеотидные зонды, специфичные в отношении многих минисателлитных локусов, при другом – наборы зондов (или праймеров), специфичных в отношении отдельных полиморфных локусов VNTR (подробнее о VNTR см. раздел 1.3.1).

Теоретические аспекты возможности определения отцовства. Возможность определения отцовства, так же как и отнесение биологических образцов, содержащих ДНК, к тому или иному человеку, основано на наличии в геноме человека четких генетических маркеров в виде определенных последовательностей ДНК, набор которых уникален для конкретного индивидуума. Теоретически такими маркерами могли бы быть любые последовательности нуклеотидов ДНК, для которых характерна большая изменчивость в популяциях человека. Как было уже отмечено выше, тандемно повторяющиеся последовательности минисателлитов (VNTR) являются одними из наиболее полиморфных последовательностей нуклеотидов в геноме человека. Поэтому неудивительно, что именно они были использованы для идентификации личности. Наличие сочетания генетических маркеров среди VNTR, общих для мужчины, женщины и спорного ребенка, в ряде случаев может однозначно указывать на родственные связи между ними.

Отсутствие общих генетических маркеров у обследуемых ребенка и мужчины однозначно исключает последнего как отца ребенка. Однако обнаружение у них общих маркеров еще не может быть доказательством того, что подозреваемый мужчина является отцом. Доказательства отцовства основываются на простых статистических расчетах, в которых учитываются частоты встречаемости в популяции общих аллелей исследуемых VNTR-локусов. Рассчитывается отношение (X/Y) вероятности (X) получения наблюдаемого набора маркеров возможного настоящего отца к вероятности (Y) обнаружения этого набора маркеров у любого, выбранного наугад человека, принадлежащего этой популяции. Такое отношение вероятностей получило название индекса отцовства (paternity index – PI).

При расчетах PI возникает еще одна проблема, связанная с определением вероятности (X) того, что обследуемый мужчина является отцом. Значение такой вероятности необходимо иметь до проведения каких-либо диагностических тестов. Обычно используемое значение 0,5 нельзя считать достаточно обоснованным во всех конкретных случаях. К счастью, при очень больших значениях PI (>10 4), которые обычно получаются при таких исследованиях ДНК, выбор этой исходной вероятности оказывается практически несущественным. Как правило, это получается вследствие низких значений вероятности Y.

Определение отцовства с использованием олигонуклеотидных зондов, специфичных в отношении нескольких VNTR-локусов. В 1985 г. И.О. Джеффрисом и соавторами впервые было показано, что олигонуклеотидные зонды, комплементарные последовательностям миоглобинового гена человека, одновременно обладают способностью гибридизоваться по Саузерну с множественными локусами минисателлитной ДНК. Профили гибридизации оказались специфичными для отдельных индивидуумов. Совокупность электрофоретически разделяющихся рестрикционных фрагментов анализируемой ДНК, выявляемых после проведения гибридизации с мечеными зондами, которые специфичны в отношении полиморфных минисателлитных локусов, получила название ДНК-фингерпринтов, или генетических отпечатков пальцев . С помощью таких и других аналогичных олигонуклеотидных зондов удается выявлять на одной электрофореграмме до 15–20 различных фрагментов ДНК одного индивидуума, молекулярная масса которых превышает 3,5 т.п.о., а также много более мелких фрагментов, которые не учитываются при определении отцовства этим методом.

Рис. II.36. Примеры исключения и доказательства отцовства с помощью ДНК-типирования

Результаты гибридизации по Саузерну с зондом F10 показывают полную идентичность фрагментов ДНК у ребенка и отца (дорожки 2 и 3), что рассматривается как доказательство отцовства, либо выявляют, по крайней мере, 6 дополнительных фрагментов ДНК у ребенка, обозначенных стрелками, которые отсутствуют у отца (дорожки 5 и 6 – исключение отцовства)

На рис. II.36 показаны результаты одного из таких опытов. Интерпретация ДНК-фингерпринтов, полученных при анализе множественных локусов, основана на трех постулатах. Прежде всего, предполагается, что фрагменты ДНК, видимые на фингерпринтах, являются аллельными продуктами отдельных генетических локусов человека и передаются потомству независимо друг от друга. Во-вторых, считается, что для каждого генетического локуса частоты встречаемости в популяции отдельных аллелей следуют нормальному распределению Пуассона. И, наконец, принимается, что фрагменты ДНК, электрофоретическая подвижность которых совпадает, представляют один и тот же аллель конкретного локуса. Накопленный опыт работы с ДНК-фингерпринтами показывает, что первое допущение соблюдается достаточно хорошо: аллелизм (парность гомологичных генов, определяющих разные фенотипические признаки у диплоидных организмов) и генетическое сцепление между исследуемыми локусами наблюдаются редко. Невыполнение второго предположения не сказывается серьезно на результатах тестирования, поскольку выводы делаются без учета частоты встречаемости отдельного аллеля на основе совпадения структуры (фрагментов ДНК) многих локусов. Третий постулат является более спорным, однако его применение придает значениям индекса отцовства стабильность.

С этими исходными условиями статистическая оценка ДНК-фингерпринтов множественных локусов основывается только на одном параметре: средней доле фрагментов ДНК (x ), которые совпадают у людей без родственных связей. Такой параметр в большей степени зависит от техники лабораторных исследований, чем от свойств обследуемой популяции. Это прежде всего способность используемой системы к электрофоретическому разделению индивидуальных фрагментов ДНК (т.е. разрешающая способность используемого метода), принципы выбора конкретных фрагментов ДНК для анализа, а также критерии принятия решения об идентичности сравниваемых фрагментов ДНК. Следовательно, параметр x может варьировать при сравнении результатов, получаемых в разных лабораториях, но эти различия будут постоянно сохраняться для различных популяций и субпопуляций. Действительно, при использовании, например зондов 33.6 и 33.15, оказалось, что x один и тот же у неродственных индивидуумов, в парах муж–жена и в различных этнических группах.

Рис. II.37. Сравнение информативности двух минисателлитных зондов при идентификации личности

Частоты встречаемости минисателлитных локусов D1S7 (а ) и D1S80 (б ) определенного размера в популяции оценивали гибридизацией по Саузерну после расщепления ДНК рестриктазой Hae III (а ) или ПЦР (б ). Для локуса D1S7 характерно квази-непрерывное унимодальное распределение, тогда как локус D1S80 характеризуется меньшей гетерозиготностью (84%) с небольшим числом дискретных аллелей, для которых характерно мультимодальное распределение

Определение отцовства с использованием ДНК-зондов, специфичных в отношении только одного локуса. ДНК-фингерпринты, получаемые при одновременном исследовании многих локусов, отражают скорее фенотип индивидуума, чем его генотип. Действительно, получаемая в итоге картина заключает в себе множество полос ДНК, в том числе и неразделившиеся, а также слабо разделившиеся фракции. Такая электрофореграмма напоминает сложный фенотипический признак, например форму лица человека, которая является результатом экспрессии громадного числа генов. В отличие от этого с помощью ДНК-зондов, представляющих собой клонированные последовательности минисателлитов и взаимодействующих только с одним локусом, можно получать истинную информацию о генотипе изучаемого организма. Таким образом, имея дело с отдельными полиморфными локусами человека, исследователи получают в свои руки систему кодоминантных аллелей (т.е. аллелей, совместно участвующих в формировании фенотипических признаков), наследуемых по законам Менделя. Именно понимание наследования таких минисателлитных локусов и привело к широкому распространению однолокусного метода определения отцовства.

В настоящее время получены сотни клонов минисателлитной ДНК и на их основе разработаны комбинации зондов, пригодные для определения отцовства. При выборе зондов для таких минисателлитных локусов обычно руководствуются следующими критериями: зонды должны обладать строгой локус-специфичностью, а тестируемые локусы быть несцепленными (передаваться потомству независимо друг от друга) и обладать достаточной, но не чрезмерной генетической стабильностью. В частности, среди наиболее широко используемых зондов MS1 (D1S7) соответствует генетическому локусу, гетерозиготному в 99% случаев, однако он мутирует с очень высокой частотой (0,05 на гамету) и поэтому, несмотря на высокую информативность, не используется при определении отцовства (рис. II.37,а ). В то же время для локуса D1S80 со значительно меньшей вариабельностью (84% гетерозигот) характерно образование кластеров в частотах распределения фрагмента ДНК по длине (см. рис. II.37,б ). Поэтому небольшие ошибки в определении длины аллелей могут привести к значительным ошибкам в оценке частоты их встречаемости. Такие локусы достаточно легко изменяются в результате генетического дрейфа и инбридинга.

В настоящее время разработана теория, указывающая на то, сколько локусов должно быть типировано для получения правильного ответа об отцовстве при известных значениях гетерозиготности этих локусов в популяции. Например, если используются локусы, гетерозиготность которых составляет 90%, для установления отцовства необходимо проанализировать шесть таких локусов. В США в настоящее время для этих целей обычно используется набор из трех–пяти однолокусных зондов. Однолокусные зонды обладают низкой разрешающей способностью относительно братьев и сестер (сибсов ). В частности, с помощью одного такого зонда можно лишь с вероятностью 75% обнаружить генетические различия между сибсами, и эта вероятность увеличивается до 99,6% при использовании четырех зондов. Данный факт приобретает особую важность, когда при определении отцовства необходимо сделать выбор между братьями.

Особенности определения отцовства по отдельным локусам с использованием ПЦР. В качестве альтернативы однолокусным зондам в последнее время для определения отцовства часто используют ПЦР. Отдельные мини- и микросателлитные локусы могут быть амплифицированы с помощью праймеров, комплементарных уникальным последовательностям ДНК, фланкирующим эти повторяющиеся последовательности. При идентификации личности метод ПЦР, который по своей сути является одной из разновидностей однолокусной методики, поскольку имеет дело с отдельными локусами, обладает, по крайней мере, двумя преимуществами перед однолокусными зондами. Во-первых, популяционный полиморфизм длин ДНК аллелей, исследуемых с использованием этого метода, носит более дискретный характер, чем у аллелей, изучаемых с помощью однолокусных зондов (см. рис. II.37,а ,б ). Это обстоятельство облегчает последующее вычисление индекса отцовства. Во-вторых, метод ПЦР обладает гораздо большей чувствительностью и может быть использован при анализе образцов, содержащих <1 нг геномной ДНК и полученных из разных источников (см. раздел 11.1.1).

К недостаткам ПЦР в применении к определению отцовства следует отнести низкую информативность полиморфных микросателлитов и коротких минисателлитов. Это связано с тем, что они обладают <90% гетерозиготности, небольшим числом аллелей и имеют тенденцию к образованию кластеров по размерам (см. рис. II.37,б ). Кроме того, на распределение таких последовательностей в геноме оказывают влияние инбридинг и принадлежность индивидуумов к определенным этническим группам. Количество локусов минисателлитов, которое необходимо исследовать методом ПЦР для определения отцовства, приближается к 11, а микросателлитов – к 18.

Для типирования с помощью ПЦР наиболее часто используются три минисателлитных локуса человека: в гене аполипопротеина B (APOB), D17S5 (известный также как локус D17S30) и D1S80. Все три локуса легко амплифицируются (максимальный размер их аллельных вариантов не превышает 1 т.п.о.) и легко обнаруживаются с помощью электрофореза. Однако для них характерны низкий уровень гетерозиготности и малая изменчивость (что выражается в небольшом числе известных аллелей). Мутации в этих микросателлитах возникают очень редко.

Одним из путей повышения информативности полиморфизмов микросателлитов при ДНК-типировании является одновременная амплификация двух тесно сцепленных микросателлитных локусов, сочетания которых формируют множество гаплотипов . Например, одновременная амплификация двух GATA-повторов, локализованных в интроне 40 гена фактора фон Виллебранда, которые разделены последовательностью длиной в 212 п.о., обнаружила суммарный уровень гетерозиготности объединенного локуса ~93%. При этом уровни гетерозиготности индивидуальных локусов составляли лишь 72 и 78% соответственно.

В заключение необходимо еще раз отметить, что по своей логике современные методы определения отцовства, основанные на ДНК-типировании, несколько противоречивы. Если отрицательное заключение об отцовстве, основанное на несовпадении аллелей анализируемых мини- или микросателлитных локусов, абсолютно и не подлежит сомнению, то положительный вывод может быть сделан лишь с некоторой долей вероятности, которая основана на частоте встречаемости конкретных аллелей анализируемых локусов в популяции. С другой стороны, в результате методических ошибок легко могут быть сделаны ложноотрицательные выводы, однако положительное заключение об отцовстве в результате лабораторной методической ошибки практически исключено.

Высокая информативность многолокусных ДНК-фингерпринтов подтверждена большим числом генетических и популяционных исследований. Эмпирические данные, полученные при обследовании тысяч семей, показали, что с помощью многолокусных зондов можно разрешать все спорные случаи отцовства. Использование однолокусных зондов затруднено невозможностью создания полной классификации соответствующих аллелей в популяции из-за кажущегося непрерывного распределения их по размерам. Однако и в этом случае на практике проблема полностью решается с помощью набора из пяти–шести однолокусных зондов. Применение ПЦР ограничивается большой эволюционной консервативностью амплифицируемых мини- и микросателлитных локусов и, как следствие, малым суммарным числом аллелей. Однако ПЦР бывает очень полезна на первых этапах исследования из-за методической простоты постановки опытов, особенно в условиях малой доступности исходного биологического материала. Все три группы методов хорошо дополняют друг друга и в разных сочетаниях в спорных случаях позволяют однозначно идентифицировать личность человека.

Даже если две раковые клетки выглядят под микроскопом одинаково, они могут быть очень разными, потому что в них произошли разные мутации, у них различается молекулярно-генетический профиль. За счет этого они будут по-разному себя вести и неодинаково реагировать на одно и то же лекарство.

Генетическое типирование помогает составить «молекулярный портрет» опухоли, подобрать наиболее эффективные препараты, назначить оптимальную схему лечения для конкретного случая. Такой подход не просто позволяет выиграть драгоценное время, он помогает сделать лечение персонализированным, повышает шансы на успех при разных видах рака.

При помощи современных технологий можно проанализировать большинство лекарственных препаратов и наиболее распространенные онкозаболевания. В итоге врач понимает, какое лечение принесет наилучший эффект у конкретного пациента.

Тест OncoDEEP - это комплексное молекулярно-генетическое исследование, в котором сочетаются самые современные технологии: Секвенирование Следующего Поколения (NGS) ИГХ, FISH, анализ метилирования, транслокаций, и многое другое. Материал для исследования получают при помощи классической (образец ткани опухоли) или жидкостной (образец крови) биопсии.
OncoDEEP позволяет определить чувствительность опухоли к разным видам терапии и подобрать персонализированное лечение, сопоставив результаты с данными мировой литературы и доказательной базы.

В настоящее время генетическое типирование успешно применяют для подбора лечения при меланоме, раке молочной железы, толстой и прямой кишки, яичников, легкого, а также при ряде других онкозаболеваний.

Мы помогаем онкологам и химиотерапевтам составить максимально эффективный план лечения посредством трехэтапной диагностики:

биопсия опухоли;
анализ крови;
подключение к платформе обработки и анализа данных, получаемых от врачей и пациентов со всего мира.

Данная платформа позволяет получить персонифицированное заключение, в котором отражена взаимосвязь терапии и генного ответа как реакции на назначенное лечение. Это дает врачу возможность быстро получать обратную связь и менять протокол в соответствии с полученной информацией.

Молекулярно-генетическое типирование помогает:

повысить эффективность химиотерапии и таргетной терапии;
более точно прогнозировать поведение опухоли и процесс метастазирования;
сэкономить время.

Для кого предназначено генное типирование?

Для взрослых пациентов с обширным опухолевым процессом всех типов. Метод помогает повысить эффективность терапии в следующих случаях:

если лечение уже проводилось, но не дало результатов;
при метастатических опухолях;
при редких, агрессивных типах рака.

Какие технологии применяются?

Исследование проводится на одном из двух видов препаратов:

FFPE-блоки - фиксированные в формалине и парафинизированные образцы тканей;
Микропрепараты - предметн6ые стекла с образцами ткани.

В медицинском центре «Медицина 24/7» есть оборудование, которое позволяет проводить все необходимые исследования с использованием новейших технологий биосеквенирования в сочетании с иммуногистохимическим исследованием и анализом биомаркеров, специфичных для данного вида опухоли.

ДНК-ТИПИРОВАНИЕ (молекулярно-генетическая индивидуализация организмов, ДНК-индивидуализация), способ исследования генетического материала, направленный на выявление и оценку индивидуальных генетических особенностей биологического объекта. Цель такого исследования - установление сходства (или различий) разных организмов для определения степени их родства.

Метод ДНК-типирования основан на существовании различий в структуре ДНК у разных индивидуумов. Это касается так называемых гипервариабельных участков, обладающих структурным полиморфизмом (имеют несколько аллельных форм). В их формировании главную роль играют относительно короткие нуклеотидные последовательности, получившие название минисателлитные и микросателлитные ДНК, состоящие соответственно из 15-70 и 2-5 пар нуклеотидов. Эти последовательности рассеяны по геному в виде блоков (локусов) и имеют тандемную организацию (многократно следуют друг за другом). Число тандемных повторов (и, следовательно, длина самих локусов) варьирует в пределах от 2-4 до нескольких тысяч. Наличие повторяющихся элементов в таких гомологичных сателлитных блоках и обусловливает структурный полиморфизм этих локусов, проявляющийся, в частности, как феномен полиморфизма длины рестриктазных фрагментов (ПДРФ). Такие фрагменты образуются после ферментативного расщепления ДНК рестриктазами (внутри повторов расщепления не происходит из-за особенностей их нуклеотидного состава). В первоначальных вариантах ДНК-типирование фрагменты ДНК разделяли электрофорезом в агарозном геле, а затем получали отпечаток этого геля на мембранном фильтре. Последний инкубировали в растворе, содержащем специально подобранные зонды - фрагменты ДНК, меченные радиоизотопом. Содержащие комплементарные зонду участки исследуемой ДНК связывались (гибридизовались) с ним и выявлялись с помощью радиоавтографии. Таким образом на радиочувствительной плёнке в виде набора полос идентифицировались сразу все микро- и минисателлиты геномной ДНК, гомологичные используемому зонду. По аналогии с анализом дактилоскопического оттиска (рисунком папиллярных линий) появился термин «генетическая, или геномная, дактилоскопия». Каждый индивидуум имеет свой геномный «отпечаток», который характеризуется определённым числом полос (до нескольких десятков), их расположением на дорожке и интенсивностью почернения каждой из полос. Чем больше родство, тем больше совпадений. Вся картина обнаруживает даже более высокую индивидуальную специфичность, чем папиллярные узоры, и поэтому может служить «генетическим удостоверением» личности. У кровных родственников число совпадающих полос заметно больше, у близнецов они идентичны.

Разработка метода (конец 1980-х годов) полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволила размножать (амплифицировать) любую последовательность ДНК, получать десятки и сотни миллионов её копий и использовать для молекулярно-генетического анализа исчезающе малые количества биологического материала. Появилась возможность сравнивать длину отдельных целых локусов минисателлитных ДНК, не подвергая их предварительному ферментативному расщеплению, т. е. осуществлять анализ полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ). После разделения продуктов ПЦР электрофорезом их положение в геле выявляют с помощью специальных красителей, флуоресцентных меток и др. Разработаны также так называемые мультиплексные амплификационные системы, которые позволяют одновременно анализировать ПДАФ сразу нескольких локусов (их может быть более десяти). В этом случае амплификационный профиль ДНК, создаваемый уже суммой локусов, оказывается чрезвычайно полиморфным (является комбинацией нескольких независимых полиморфных элементов), но обеспечивает очень высокую достоверность анализа.

Вариабельность в структуре полиморфных генов мини- и микросателлитных ДНК может быть обусловлена также точечными нуклеотидными заменами. Такие локусы различаются только по нуклеотидному составу. В этом случае определяют первичную структуру амплифицированных фрагментов (смотри Секвенирование). Наиболее разработанным методом ДНК-типирования, основанным на секвенировании фрагментов, является анализ митохондриальной ДНК (мтДНК), которая характеризуется высоким уровнем полиморфизма, наличием большого числа копий, отсутствием рекомбинации и материнским характером наследования (зародыш получает митохондрии только из яйцеклетки). Всё это позволило широко использовать мтДНК в популяционных и филогенетических исследованиях, а в некоторых случаях сделало её единственно возможным инструментом для ДНК-типирования; например, когда ДНК, содержащаяся в образце, сильно деградирована, а хромосомная ДНК не может быть амплифицирована. Наследование по материнской линии и отсутствие рекомбинации позволяют использовать мтДНК в качестве так называемого «трассирующего» родословного генетического маркера. Это особенно важно при установлении родства в тех случаях, когда генетическая дистанция, разделяющая родственников, оказывается больше, чем одно поколение. Ярким примером использования мтДНК для ДНК-типирования явилась работа российских, британских и американских учёных по идентификации останков российской императорской семьи в 1992-98 годах. Позднее анализ мтДНК был многократно использован для индивидуализации костных и мумифицированных останков, возраст которых исчисляется десятками, сотнями и даже десятками тысяч лет.

Методом ДНК-типирования пользуются в криминалистике для идентификации личности и установления родственных отношений, а также в медико-биологическом анализе. В генетике и селекции сельскохозяйственных животных и растений этот метод используют для паспортизации и отбора чистопородного потомства животных, типирования сортов растений, определения межвидовых и межсортовых различий, а в практической бактериологии и эпидемиологии - для идентификации бактериальных штаммов. ДНК-типирование можно использовать при изучении структурно-функциональных особенностей генетического аппарата и явлений геномной нестабильности при нормальном функционировании клеток и патогенезе, в популяционной и эволюционной генетике.

Лит.: DNA Fingerprinting: State of the science. В. а. о., 1993; Иванов П. Л. Молекулярно-генетическая идентификация останков царской семьи // Вестник РАН. 1994. Т. 64. № 10; он же. Использование индивидуализирующих систем на основе полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установления родства // Судебно-медицинская экспертиза. 1999. № 4; он же. Индивидуализация человека и идентификация личности: молекулярная биология в судебной экспертизе // Вестник РАН. 2003. Т. 73. № 12.