Иммуноблотинг [от англ. blot, пятно] - метод идентификации Аг (или AT) с помощью соответствующих известных сывороток (или Аг). На практике применяют для идентификации Аг ВИЧ. Первоначально электрофорезом в полиакриловом геле выделяют Аг вируса (на практике эту процедуру не проводят, а используют коммерческий реагент). Затем на полосы преципитата накладывают носитель (нитроцеллюлозную плёнку или активированную бумагу) и продолжают электрофорез. После чего на плёнку наносят сыворотку пациента и инкубируют.

После отмывания несвязавшихся AT (при их наличии) проводят ИФА - на плёнку наносят антисыворотку к Ig человека, меченную ферментом, и хромогенный субстрат, изменяющий окраску при взаимодействии с ферментом. При наличии комплексов Аг-АТ-антисыворотка к lg на носителе появляются окрашенные пятна (рис. 10-20).

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ ) разработана А. Кунсом (1941) и основана на применении AT, меченных флюорохромными красителями. Такие AT, связывая различные Аг, вызывают свечение иммунных комплексов в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. На практике применяют несколько вариантов РИФ .

Впервые предложена Coombs в 1942 г. РИФ основана на выявлении антигенов в клиническом материале, препаратах клеток крови и др. с помощью моноклональных антител или сывороток, меченных флуорохромом (прямая РИФ). Первые (диагностические) антитела можно выявлять антииммуноглобулиновой сывороткой, меченной флуорохромами (непрямая РИФ). Существуют модификации РИФ для выявления антител к инфекционным агентам в сыворотке крови или антител в сыворотке крови.

Популярность РИФ объясняется экономичностью, наличием широкого спектра диагностических наборов, быстротой получения ответа. Сегодня в этой реакции используются как поликлональные сыворотки, так и моноклональные антитела, меченные флюоресцеина изотиоцианатом (ФИТЦ). Для уменьшения неспецифического свечения фона применяют обработку препаратов бычьим сывороточным альбумином, меченным родамином или синькой Эванса.

Чаще всего РИФ используют для быстрого обнаружения возбудителя в патологическом материале. В этом случае из исследуемого материала готовят мазок на предметном стекле, как для обычной микроскопии. Препарат фиксируют метиловым спиртом, ацетоном или другим химическим фиксатором. На поверхность фиксированного мазка наносят меченные ФИТЦ сыворотки или моноклональые антитела (в случае непрямой РИФ препарат сначала обрабатывают сывороткой против искомого антигена, а затем мечеными антителами к иммуноглобулинам, использованным на первом этапе). Поскольку РИФ является разновидностью гетерогенного анализа, один этап отделяется от другого промывкой.

Учет результатов реакции осуществляется с помощью люминесцентного микроскопа, в оптическую систему которого устанавливается набор светофильтров, обеспечивающих освещение препарата ультрафиолетовым или сине-фиолетовым светом с заданной длинной волны. Исследователь оценивает характер свечения, форму, размер объектов и их взаимное расположение.

При постановке РИФ для обнаружения антител готовят мазки из эталонного штамма возбудителя. Исследуемую сыворотку наносят на мазок. Если в ней присутствуют искомые антитела, то они связываются с антигенами микробных клеток. Промывка препарата буферным раствором позволяет удалить несвязавшиеся антитела. Затем препарат обрабатывают меченой сывороткой против иммуноглобулинов человека. В случае положительного результата реакции при микроскопии мазка в люминесцентном микроскопе наблюдают специфическое свечение эталонной культуры.

Основным недостатком РИФ является ее субъективность.

Классическими критериями специфичности этой реакции являются:

· характерная морфология, размеры и расположение возбудителя в мазке;

· периферический характер свечения объекта;

· цвет флюоресценции;

· интенсивность флюоресценции.

При исследовании крупных объектов (трихомонады, клетки человека, клетки пораженные бактериями или вирусами) эти критерии позволяют получить достоверный результат. В то же время, элементарные тельца хламидий и микоплазмы имеют размеры, лежащие на пределе разрешающей способности люминесцентного микроскопа. При этом оценка морфологии микроорганизмов затруднена, а свечение теряет периферический характер. Остающихся критериев явно недостаточно для уверенной идентификации наблюдаемого микроорганизма. В связи с вышесказанным, субъективный характер учета реакции предъявляет особые требования к квалификации персонала, проводящего исследования.

2.2. Флуоресцентный иммуноанализ с временным разрешением (ФИА ВР, Etkins R. et Wallac O., 1984)

Эта разновидность ФИА основана на принципах сорбции одного из реагентов на твердой фазе и применении технологии «сэндвича», т.е. двойного распознавания, подобно тИФА. Однако важным отличием метода является применение в качестве метки хелатов лантаноидов (редкоземельных элементов европия, самария, тербия и диспрозия). Преимущества ФИА ВР – это высокая чувствительность, технология постановки, подобная ИФА, и потенциальная возможность значительного усиления полезного сигнала вследствие весьма высокого отношения сигнал/шум. Специфическая флуоресцентная метка флуоресцирует неизмеримо сильнее и дольше, чем фоновая флуоресценция. Кроме того, метка обладает способностью восстанавливать способность к свечению (для учета применяют импульсное возбуждающее излучение с периодом в 1с - более 1000 импульсов), что приводит к накоплению (усилению) полезного сигнала. Описываемая система реализована фирмой PerkinElmer, США, под названием Delfia и обладает чувствительностью более 10 -17 М при определении антигенов.

2.3. Проточная цитофлуориметрия

РИФ

Реакция иммунофлюоресценции основана на взаимодействии противохламидийного АТ с родоспецифическим хламидийным антигеном. Существует два типа реакции иммунофлюоресценции - прямой и непрямой. В первом случае непосредственно специфическое антитело мечено флюорохромом и реакция проходит в один этап, что значительно сокращает сроки исследования. Во втором случае специфическое антитело не имеет метки, а для выявления комплекса АГ-АТ, образовавшегося на первом этапе, используют вторые меченые антитела, специфичные к антихламидийным антителам. Результат реакции оценивают визуально при помощи люминисцентного микроскопа.

Помимо импортных появились отечественные наборы для диагностики хламидийной инфекции реакцией прямой иммунофлюоресценции, которые практически не уступают по специфичности и чувствительности, но имеют значительно более низкую цену.

Материалом для исследования служат мазки-отпечатки, приготовленные с соблюдением правил. Мазки для РИФ готовятся на специальных деколированных стеклах в пределах ограниченной площадки диаметром 8 - 10 мм. После этого их высушивают на воздухе и фиксируют, погружая на 5 - 10 минут в холодный 96% (лучше абсолютный) этиловый спирт или нанося на препарат 0.1 - 0.15 мл охлажденного безводного ацетона до полного его испарения. Фиксированные препараты можно исследовать сразу или при необходимости хранить при комнатной температуре в течение суток или при -20°С в течение 2 недель (при этом необходимо исключить доступ влаги при хранении и доведении препарата до комнатной температуры перед исследованием при помощи полиэтиленового пакета и селикагеля).

При проведении прямой РИФ на препарат наносят раствор меченых антител в количестве, необходимом для полного покрытия мазка (25 - 30 мкл). Препарат инкубируют в горизонтальном положении во влажной камере в течение 15 минут при +37°С. Подсыхание реагента недопустимо во избежание ложноположительных результатов. Далее мазок промывают в проточной воде 30 сек, прополаскивают в дистиллированной воде, высушивают и готовят к микроскопии.

При проведении непрямой РИФ на препарат наносят необходимое количество раствора антихламидийных антител и проводят первую инкубацию в тех же условиях, что и при проведении прямой РИФ. Затем препарат промывают, высушивают на воздухе и наносят второй реагент - меченые антитела к хламидийным АТ и проводят вторую инкубацию так же во влажной камере при +37°С 15 минут. После промывания препарат высушивают и готовят к микроскопии. Готовые препараты рекомендуется просматривать сразу. При необходимости возможно хранение окрашенных препаратов в течение 1 - 2 суток при +2-8°С в темном месте без доступа влаги.

Микроскопию проводят с использованием иммерсионной системы. Возможны два варианта иммерсионной микроскопии:

1. Масляная иммерсия: На готовые высушенный препарат наносят 20 - 25 мкл монтирующей жидкости (глицерин, забуференный фосфатным буфером с рН 7.2 - 7.6), покрывают его обезжиренным покровным стеклом, на которое затем наносят каплю нефлюоресцерующего иммерсионного масла и микроскопируют объективом (маркировка “Л” - люминисцентный) с увеличением 90 и окуляром с увеличением 5.

2. Водная иммерсия: на готовый препарат наносят каплю 20 мкл фосфатного буфера с рН 7.4 и микроскопируют объективом для водной иммерсии (маркировка - белая полоса и “Л” - люминисцентный) с увеличением 60 и окуляром с увеличением 5. Водная иммерсия дает более ровное, яркое и четкое свечение.

РИФ позволяет выявлять антигенные структуры как элементарных, так и ретикулярных телец. ЭТ расположены преимущественно внеклеточно, округлой формы с ровными краями, мелкие (размер 1:100 - 1:150 по отношению к окружающим их клеткам), однородной структуры, имеют яркое специфическое изумрудно-зеленое свечение, которое при работе микровинтом может давать дифракционные кольца (кольца Дилекторского). РТ встречаются значительно реже, располагаются преимущественно внутриклеточно, имеют менее однородную структуру, более полиморфны, но также с четкими краями и обладают ярким специфическим изумрудно-зеленым свечением. Любой другой флюоресцирующий материал неправильной формы, неровными нечеткими краями, имеющий неяркую зеленую окраску, либо свечение другого цвета относится к артефактам. Интенсивность, яркость и оттенок специфического свечения зависит от рН монтирующей жидкости или буфера используемого для микроскопии. Большая интенсивность свечения ФИТЦ в щелочной среде увеличивает чувствительность метода, но ведет к увеличению числа объектов с неспецифическим свечением, а, следовательно, к ложноположительным результатам. В кислой среде интенсивность свечения ФИТЦ падает, что может дать ложноотрицательный результат. Сопутствующая микрофлора, а также ядра окружающих клеток неспецифически окрашиваются в различные оттенки оранжевого цвета бромистым индием, их цитоплазма - в различные оттенки кирпично-коричневого цвета синькой Эванса.

Для получения достоверного результата рекомендуется просматривать многие поля зрения препарата. Результат считается положительным в том случае, если препарат содержит клетки эпителия и удается обнаружить не менее 6 элементарных телец, имеющих все вышеперечисленные признаки.

Обнаружение меньшего количества возбудителя делает результат сомнительным и требует повторного исследования, желательно на фоне провокации (пищевая - алкоголь, медикаментозная - инъекция пирогенала, механическая - массаж уретры на буже). Контроль излеченности следует проводить не ранее чем через две недели, так как возможно сохранение не элиминированного антигенного материала нежизнеспособного возбудителя, что будет давать ложноположительные результаты. Получение 3 отрицательных результатов исследования у мужчин в течение месяца и у женщин в течение 3 менструальных циклов, отсутствие клинических проявлений хламидийной инфекции свидетельствует о выздоровлении.

РИФ при правильной подготовке пациента, соблюдении правил взятия материала и постановки реакции является высокочувствительным и специфичным методом диагностики урогенитального хламидиоза и позволяет выявлять возбудителя у 90 - 95% больных. Данный метод относительно дешев, прост в выполнении, высокоинформативен, не требует специального дорогостоящего оборудования, позволяет быстро получить результат (0.5 - 1 час) и визуально контролировать качество взятия материала для исследования.

Методы, использующие принципы молекулярной биологии

В группу входят методы ДНК-зондов и полимеразной цепной реакции (ПЦР), которые позволяют выявить генетический материал возбудителя в исследуемом биоматериале. Наборы для диагностики хламидиоза ДНК-зондами находятся пока на стадии разработки и клинических испытаний.

ПЦР активно внедряется в практику лабораторной диагностики. Метод основан на выделении специфической последовательности ДНК или РНК возбудителя при помощи комплементарных праймеров, последующего ее многократного копирования и накопления для дальнейшего выявления обычными методами детекции (электрофорез или ИФА). Данный метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью, практически приближающейся к культуральному и позволяет обнаружить единичных возбудителей в исследуемом материале. Метод ПЦР требует специального дорогостоящего оборудования, отдельной специально оснащенной лаборатории, соответствующей подготовки и высокой квалификации медицинского персонала. Вместе с тем, отсутствие сертификации используемых в России праймеров и достаточного опыта применения метода ПЦР, специфичность исследуемого материала, частая его контаминация сопутствующей микрофлорой (что может давать ложноположительные результаты) не позволяет однозначно судить о его ценности при диагностике урогенитального хламидиоза.

Таким образом, в настоящее время наиболее доступным, простым и в то же время высокоинформативным методом диагностики урогенитального хламидиоза и установления излеченности является реакция прямой иммунофлюоресценции (РИФ). Контроль за динамикой течения заболевания и эффективностью лечения следует проводить, определяя титр антихламидийных антител в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) — серологическая реакция, позволяющая выявить антитела к известным антигенам. Метод заключается в микроскопии окрашенных мазков.

Данную реакцию используют в иммунологии, вирусологии и микробиологии. Она позволяет определить наличие вирусов, бактерий, грибов, простейших и ИКК. РИФ очень широко применяется в диагностической практике для обнаружения вирусных и бактериальных антигенов в инфекционном материале. Метод основан на способности флюорохрома вступать в связь с белками, не нарушая при этом их иммунологической специфичности. В основном применяется при диагностике инфекций мочеполовых путей.

Различают следующие методы проведения реакции иммунофлюоресценции: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод заключается в окрашивании материала флюорохромами. Благодаря способности антигенов микробов или тканей светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа, они определяются как клетки с ярко окрашенной каймой зеленного цвета.

Непрямой метод заключается в определении комплекса антиген+антитело. Для этого опытный материал обрабатывается антителами антимикробной кроличьей сыворотки, предназначенной для диагностики. После того как антитела свяжутся с микробами, их отделяют от не связавшихся и обрабатывают антикроличьей сывороткой, помеченной флюорохромом. После этого комплекс микроб+анимикробные антитела+анитикроличьи антитела определяется с помощью ультрафиолетового микроскопа также, как и при прямом методе.

Реакция иммунофлюоресценции незаменима при диагностике сифилиса. Под воздействием флюорохрома возбудитель сифилиса определяется как клетка с желто-зеленой каймой. Отсутствие свечения означает, что пациент не заражен сифилисом. Этот анализ часто назначается при положительной реакции Вассермана. Данный метод очень эффективен при диагностике, так как позволяет определить возбудителя на ранних стадиях заболевания.

Кроме того, что РИФ позволяет диагностировать сифилис, его также применяют для определения наличия таких возбудителей как хламидии, микоплазма, трихомонады, а также возбудителей гонореи и генитального герпеса.

Для проведения анализа используют мазки или венозную кровь. Процедура взятия мазка совершенно безболезненная и не представляет никакой опасности. К сдаче данного анализа необходимо подготовиться. За двенадцать часов до него не рекомендуется пользоваться средствами гигиены, такими как мало или гели. Также иногда по показаниям врача проводиться провокация. Для этого рекомендуют прием острой пищи или алкоголя или проводится инъекция провоцирующего вещества, например гоновакцина или пирогенал. Помимо этого промежуток между приемом антибактериальных препаратов и сдачей анализа должен быть не менее четырнадцати дней.

При оценке результатов следует учитывать тот факт, что свечение наблюдается не только у живых бактерий, но и у мертвых, особенно это относится к хламидиям. После курса антибиотиков мертвые клетки хламидий также обладают свечением.

При правильной подготовке пациента и соблюдении техники взятия мазка, данный анализ позволяет определить заболевания на ранних стадиях, что очень важно для своевременного лечения. Положительными сторонами данного метода является короткие сроки получения результата, простота выполнения и небольшая стоимость анализа.

К недостаткам можно отнести то, что для проведения анализа необходимо достаточно большое количество исследуемого материала. Кроме того, оценку результатов может проводить только опытный специалист.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) — серологическая реакция, позволяющая выявить антитела к известным антигенам. Метод заключается в микроскопии окрашенных мазков.

Данную реакцию используют в иммунологии, вирусологии и микробиологии. Она позволяет определить наличие вирусов, бактерий, грибов, простейших и ИКК. РИФ очень широко применяется в диагностической практике для обнаружения вирусных и бактериальных антигенов в инфекционном материале. Метод основан на способности флюорохрома вступать в связь с белками, не нарушая при этом их иммунологической специфичности. В основном применяется при диагностике инфекций мочеполовых путей.

Различают следующие методы проведения реакции иммунофлюоресценции: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод заключается в окрашивании материала флюорохромами. Благодаря способности антигенов микробов или тканей светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа, они определяются как клетки с ярко окрашенной каймой зеленного цвета.

Непрямой метод заключается в определении комплекса антиген+антитело. Для этого опытный материал обрабатывается антителами антимикробной кроличьей сыворотки, предназначенной для диагностики. После того как антитела свяжутся с микробами, их отделяют от не связавшихся и обрабатывают антикроличьей сывороткой, помеченной флюорохромом. После этого комплекс микроб+анимикробные антитела+анитикроличьи антитела определяется с помощью ультрафиолетового микроскопа также, как и при прямом методе.

Реакция иммунофлюоресценции незаменима при диагностике сифилиса. Под воздействием флюорохрома возбудитель сифилиса определяется как клетка с желто-зеленой каймой. Отсутствие свечения означает, что пациент не заражен сифилисом. Этот анализ часто назначается при положительной реакции Вассермана. Данный метод очень эффективен при диагностике, так как позволяет определить возбудителя на ранних стадиях заболевания.

Кроме того, что РИФ позволяет диагностировать сифилис, его также применяют для определения наличия таких возбудителей как хламидии, микоплазма, трихомонады, а также возбудителей гонореи и генитального герпеса.

Для проведения анализа используют мазки или венозную кровь. Процедура взятия мазка совершенно безболезненная и не представляет никакой опасности. К сдаче данного анализа необходимо подготовиться. За двенадцать часов до него не рекомендуется пользоваться средствами гигиены, такими как мало или гели. Также иногда по показаниям врача проводиться провокация. Для этого рекомендуют прием острой пищи или алкоголя или проводится инъекция провоцирующего вещества, например гоновакцина или пирогенал. Помимо этого промежуток между приемом антибактериальных препаратов и сдачей анализа должен быть не менее четырнадцати дней.

При оценке результатов следует учитывать тот факт, что свечение наблюдается не только у живых бактерий, но и у мертвых, особенно это относится к хламидиям. После курса антибиотиков мертвые клетки хламидий также обладают свечением.

При правильной подготовке пациента и соблюдении техники взятия мазка, данный анализ позволяет определить заболевания на ранних стадиях, что очень важно для своевременного лечения. Положительными сторонами данного метода является короткие сроки получения результата, простота выполнения и небольшая стоимость анализа.

К недостаткам можно отнести то, что для проведения анализа необходимо достаточно большое количество исследуемого материала. Кроме того, оценку результатов может проводить только опытный специалист.